CN105566449A - 一种抗口蹄疫的疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及兽用生物制品领域。更具体地，公开一种A型口蹄疫病毒样颗粒以及抗口蹄疫的疫苗组合物及其制备方法和用于预防和/或治疗由口蹄疫病毒导致的感染的相关疾病的应用。本发明的疫苗组合物包含O型口蹄疫病毒样颗粒和/或亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒和/或A型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制品领域。更具体地，本发明涉及一种抗口蹄疫的疫苗组合物。本发明还涉及将所述的疫苗组合物用于预防和/或治疗由口蹄疫病毒导致的感染的相关疾病的应用。
背景技术
口蹄疫(FMD)为一种急性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疾病，是哺乳类动物中感染性最强的疾病，其中偶蹄类动物染病更会造成全球重大的经济损失。遭受口蹄疫危害的动物包括牛、羊、山羊和猪。致病因子，口蹄疫病毒(FMDV)，是小核糖核酸病毒属家族的一种口疮病毒。该病毒分为7个血清型(A、O、C、Asial、SAT1、SAT2、和SAT3型)，其中A型口蹄疫病毒流行较为广泛，是仅次于O型口蹄疫的世界主要流行毒株。近年来，口蹄疫疫情频繁发生且呈全球化流行的态势，这不仅对世界畜产品经济构成了巨大的威胁，而且引发了人们对食品安全等社会公共卫生问题的担忧，造成发生疫情的国家及地区的畜产品贸易损失惨重。疫苗免疫是控制此病、保护家畜免受危害的有效措施。传统的疫苗包括灭活疫苗和减毒疫苗，他们虽然具有较好的免疫原性，也确实在FMD的预防和控制中起到了非常重要的作用。但是也存在以下几个缺点：1.病毒必须在高度密封的设备中生产，以防止污染周围环境；生产过程中，病毒有可能没有完全杀死或充分减毒，会导致疫苗中含有高毒性致病物质，进而导致被免疫动物发病而使疾病大规模流行。2.有效期很短，而且常常需要冷冻保存，这增大了疫苗在农村推广使用的难度。3.灭活苗免疫与感染FMD的动物区分不开，限制了动物出口。4.生产依赖于FMDV，故而不能彻底消灭FMDV。目前使用的灭活疫苗和减毒疫苗防控已不能适应当前畜牧业的健康发展。
基因工程疫苗相比来说安全稳定性比较好，同时能给被免疫的动物提供有效的保护效果。但是仅仅是用抗原决定簇的表达蛋白来做疫苗，由于其分子小，结构简单，往往并不能起到很好的免疫效果；只有将抗原决定簇与大分子物质(如脂质体或者蛋白等)一起免疫才能诱导机体产生有效的免疫反应。
病毒样颗粒(VLPs)是一种在体外或(和)体内表达时能够自主包装成病毒外壳结构的类病毒粒子，它们是具有病毒的相似外壳结构但不具有病毒复制能力的假病毒。VLPs疫苗能有效地激发机体产生抗感染，抗肿瘤免疫，基于病毒样颗粒设计的疫苗是一种较为理想的疫苗形式。然而，A型口蹄疫流行病毒的复制能力及病毒稳定性较低造成了其病毒样颗粒难以形成，且稳定性较差，不能诱导动物机体产生足够的免疫力。因此，筛选理想的毒株序列制备稳定的病毒样颗粒是当务之急，也符合国家提出的有效防控重大动物疫病，保障畜牧业健康可持续发展的需要。
此外，口蹄疫病毒各血清型之间的抗原性不同，彼此之间不能交互免疫，临床上A型、O型和Asial血清型口蹄疫病毒交互感染，迫切需要能同时防治三种血清型感染的新型疫苗。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，要解决的第一个技术问题是提供一种口蹄疫病毒样颗粒，其中，病毒样颗粒由A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成。
优选地，本发明提供的A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0氨基酸序列为SEQIDNO.14，VP3氨基酸序列为SEQIDNO.16，VP1氨基酸序列为SEQIDNO.18。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，包含A型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂。
优选地，本发明提供的预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物包含的A型口蹄疫病毒样颗粒由A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQIDNO.14，VP3氨基酸序列为SEQIDNO.16，VP1氨基酸序列为SEQIDNO.18。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供的预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物进一步包含O型口蹄疫病毒样颗粒。
优选地，本发明提供的预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物包含的O型口蹄疫病毒样颗粒由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQIDNO.2，VP3氨基酸序列为SEQIDNO.4，VP1氨基酸序列为SEQIDNO.6。
作为本发明的另外一种实施方式，本发明提供的预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物更进一步包含亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒。
优选地，本发明提供的预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物包含的亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒由亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQIDNO.8，VP3氨基酸序列为SEQIDNO.10，VP1氨基酸序列为SEQIDNO.12。
优选地，本发明提供的预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，所述编码A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0的核苷酸序列为SEQIDNO.13，VP3的核苷酸序列为SEQIDNO.15，VP1的核苷酸序列为SEQIDNO.17。
优选地，本发明提供的预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，所述编码O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0的核苷酸序列为SEQIDNO.1，VP3的核苷酸序列为SEQIDNO.3，VP1的核苷酸序列为SEQIDNO.5。
优选地，本发明提供的预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，所述编码亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0的核苷酸序列为SEQIDNO.7，VP3的核苷酸序列为SEQIDNO.9，VP1的核苷酸序列为SEQIDNO.11。
作为本发明的另外一种实施方式，本发明提供的预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物包含氨基酸序列为SEQIDNO.2,4,6,8,10,12,14,16,18及核苷酸序列为SEQIDNO.1,3,5,7,9,11,13,15,17所示的变体。
“变体”旨在表示基本上类似序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸之内的一个或更多位点的一个或更多核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中一个或更多位点的一个或更多核苷酸的取代。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本发明的特定多核苷酸(即,参照多核苷酸)的变体也可通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由参照多核苷酸编码的多肽之间的百分率序列同一性来评价。“变体”蛋白旨在表示通过在天然蛋白中的一个或更多位点的一个或更多氨基酸的缺失或添加，和/或天然蛋白中的一个或更多位点的一个或更多氨基酸的取代而源于天然蛋白的蛋白。本发明包括的变体蛋白有生物学活性，即，它们有引发免疫应答的能力，能对FMDV攻击具有保护性反应的能力。
变体包括等位基因变体。术语"等位基因变体"指称含有导致蛋白的氨基酸序列变化及在天然的群(例如，病毒物种或变种)之内存在的多态性的多核苷酸或多肽。该天然的等位基因变异可一般导致多核苷酸或多肽的1％～5％变异。等位基因变体可通过在许多不同物种中测序目的核酸序列来鉴定，其可通过使用鉴定那些物种中的相同的遗传座位的杂交探针来容易进行。任何和全部该核酸变异及得到的氨基酸多态性或是天然的等位基因变异的结果且不改变目的基因的功能活性的变异旨在本发明的范围之内。
术语“预防”指通过其与FMDV相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟；术语“治疗”指通过与FMDV相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。
术语“保护性反应”意为在动物中预防FMDV相关疾病或由FMDV导致的感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。
本发明涉及的FMDV蛋白，其有利地激发动物中的保护性反应。具体地，本发明实施方式的蛋白序列包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
“基本上相同”可以理解为本发明的蛋白优选地具有这样的氨基酸序列，其与SEQIDNO：2,4,6,8,10,12,14,16,18中所示的序列的部分或全部具有至少70％同源性，或甚至优选地80％同源性，或甚至更优选地90％同源性，或最优选地95％同源性。
在本文中术语“同源性”还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简单替换/修饰。可以用BLAST-P(基本局部排比检索工具)，本领域技术人员公知的程序进行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和BLASTN程序。
术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝，皂苷(Saponine)(例如QuilA)，阿夫立定，DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，或(3)疫苗可以以水包油，油包水或水包油包水乳剂形式制成。
尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是Pluronic○R，尤其是L121(参照Hunter等，1995，“TheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants”(Steward-Tull，D.E.S主编)JohnWileyandSons，NY，51-94；Todd等，Vaccine，1997，15，564-570)。
特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。
优选地，本发明选用佐剂ISA206(法国赛比克公司)，制备水包油包水乳剂。
在最终疫苗组合物中，佐剂的浓度范围是从10％到60％V/V，优选从30％到50％V/V，更优选50％V/V。
本发明通过在结构蛋白VP0第178位氨基酸突变为半胱氨酸、VP1第17位氨基酸突变为天冬氨酸，在核苷酸水平上，相当于用编码半胱氨酸和天冬氨酸的密码子置换原来的密码子，提高了病毒样颗粒的稳定性，无论在热环境条件下，还是在酸环境条件下，其稳定性大大增强。不仅如此，意外发现，通过结构优化的病毒样颗粒制备的疫苗组合物在免疫持续期显著长于优化前的病毒样颗粒制备的疫苗组合物。
在一个实施方式中，本发明提供一种预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，由O型口蹄疫病毒样颗粒和亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒和A型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂组成；
所述O型口蹄疫病毒样颗粒由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQIDNO.2，VP3氨基酸序列为SEQIDNO.4，VP1氨基酸序列为SEQIDNO.6，但SEQIDNO.2第178位氨基酸突变为半胱氨酸，SEQIDNO.6第17位氨基酸突变为天冬氨酸；
所述的亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒由亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQIDNO.8，VP3氨基酸序列为SEQIDNO.10，VP1氨基酸序列为SEQIDNO.12，但SEQIDNO.8第178位氨基酸突变为半胱氨酸，SEQIDNO.12第17位氨基酸突变为天冬氨酸；
所述的A型口蹄疫病毒样颗粒由A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQIDNO.14，VP3氨基酸序列为SEQIDNO.16，VP1氨基酸序列为SEQIDNO.18，但SEQIDNO.14第178位氨基酸突变为半胱氨酸，SEQIDNO.18第17位氨基酸突变为天冬氨酸。
本发明的另一个目的是提供一种预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物的制备方法，包括：
(1)制备O型口蹄疫病毒样颗粒和/或亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒和/或A型口蹄疫病毒样颗粒的步骤；
(2)按比例混合病毒样颗粒，加入佐剂，乳化的步骤。
本发明疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物。例如，本发明的组合物还可以包含试剂，如：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))，抗氧化剂，表面活性剂，着色剂，挥发性油，缓冲剂，分散剂，推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
优选地，本发明疫苗组合物O型口蹄疫病毒样颗粒含量为50-150μg/ml；亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒含量为50-150μg/ml；A型口蹄疫病毒样颗粒含量为50-150μg/ml。
更优选地，所述疫苗组合物O型口蹄疫病毒样颗粒含量为100μg/ml；亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒含量为100μg/ml；A型口蹄疫病毒样颗粒含量为100μg/ml。
本发明具有以下突出的优点：
(1)本发明提供的疫苗组合物制备安全，无减毒疫苗、灭活疫苗可能引起的致病作用；
(2)本发明提供的病毒样颗粒结构，口蹄疫的表位被有效呈递在病毒样颗粒的表面，可以很好地刺激B、T细胞，引起免疫应答；
(3)本发明提供病毒样颗粒疫苗的结构在体内血清中的半衰期长，稳定性好，有效期长，持续刺激免疫反应，尤其是A型口蹄疫病毒样颗粒，解决了其稳定性较差的问题，能很好地对机体提供免疫保护；
(4)本发明还提供一种优化的病毒样颗粒结构，提高了病毒样颗粒的稳定性，不仅温度稳定性及酸性环境稳定性增加，而且意外发现，优化后的病毒样颗粒的疫苗组合物免疫持续期显著增长，能维持更长时间的免疫保护。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用PBS缓冲液如无特别说明，均采用pH7.4的PBS，配制方法：NaCl8.0g，KCl0.2g，KH2PO40.24g，Na2HPO4·12H2O3.628g，溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调pH值为7.4，蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min，室温保存。
实施例1
具有序列SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17的口蹄疫的蛋白表达
1.用做模板的口蹄疫基因片段的制备
分别将序列SEQIDNO.1、3、5所示的O型口蹄疫VP0、VP3、VP1基因，序列SEQIDNO.7、9、11所示的亚洲1型口蹄疫VP0、VP3、VP1基因，序列SEQIDNO.13、15、17所示的A型口蹄疫VP0、VP3、VP1基因全长由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所合成的基因片段全长分别为909bp、660bp、639bp，909bp、657bp、627bp，909bp、663bp、636bp。在此人工合成的口蹄疫基因片段的基础上制备本发明的口蹄疫基因的模板。
2.口蹄疫基因表达载体的构建
以前一步骤所合成的口蹄疫基因模板。分别设计引物(见表1)，扩增获得O型口蹄疫VP0、VP3、VP1基因；亚洲1型口蹄疫VP0、VP3、VP1基因；A型口蹄疫VP0、VP3、VP1基因。
表1引物表
在PCR仪上按如下条件(见表2)进行PCR反应：
表2PCR扩增条件
分别将不同血清型的口蹄疫扩增得到的VP0、VP3、VP1基因DNA片段分别与pBLUE-TVector载体连接，将连接成功的重组克隆分别经BamHI/EcoRI、SacI/SalI、HindIII/XhoI酶切消化后得到的片段，与经过相同的酶切的pET28a载体连接，得到插入O型口蹄疫VP0、VP3、VP1基因的阳性克隆pET28a-O-VP0-VP3-VP1；插入亚洲1型口蹄疫VP0、VP3、VP1基因的阳性克隆pET28a-Asia1-VP0-VP3-VP1以及插入A型口蹄疫VP0、VP3、VP1基因的阳性克隆pET28a-A-VP0-VP3-VP1。将连接好的质粒转化到用CaCl2制备的DH5a感受态细胞中，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基上，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃230转/分钟，培养12小时过夜，提取质粒。
将上述的插入O型口蹄疫VP0、VP3、VP1基因的阳性克隆pET28a-O-VP0-VP3-VP1；插入亚洲1型口蹄疫VP0、VP3、VP1基因的阳性克隆pET28a-Asia1-VP0-VP3-VP1以及插入A型口蹄疫VP0、VP3、VP1基因的阳性克隆pET28a-A-VP0-VP3-VP1分别转化40μl以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可见时，挑取单克隆至含4ml卡那霉素抗性的液体LB培养基的试管，37℃，230转/分振荡培养12小时，从中取1ml菌液于-80℃冻干保存。
蛋白的大量表达
从-80℃中取出带有重组质粒pET28a-O-VP0-VP3-VP1、pET28a-Asia1-VP0-VP3-VP1和pET28a-A-VP0-VP3-VP1的大肠杆菌菌种分别接种卡那霉素抗性的50mlLB液体培养基，37℃，230转/分振荡培养12小时后，转接入1LLB液体培养基中，37℃大量表达，等OD600值达到0.6后，加入0.1mM的IPTG，诱导蛋白表达，20℃过夜。
使用发酵罐为上海保兴生物公司50L发酵罐，配制30L培养基装入发酵罐，121℃灭菌30分钟。第二天将5L种子液接入发酵罐，培养菌液浓度达到OD600大约10左右时将培养温度降至25℃，加入4gIPTG诱导培养12小时。终浓度大约为40左右(OD600)下罐，离心收集菌体大约2.5kg。
按照1g菌体对应10ml裂解液的比例重悬菌体，采用均质机以800bar压力破碎菌体4次。13500rpm，离心40min，留取上清，通过15％SDS-PAGE电泳检测，此时上清中三个血清型中的三个串联表达的蛋白其各自表达量均在20％左右。采用硫酸铵分级沉淀法进行蛋白粗纯，随后进行色谱纯化，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，显示目的蛋白均得到了纯化和富集。
通过磷钨酸负染及电镜观察可见三种不同类型的口蹄疫蛋白均形成了类病毒样颗粒，并且形成的类病毒样颗粒饱满，组装效率高，没有聚集。通过将这三种不同类型的口蹄疫病毒样颗粒置于4℃下放置3个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察可见病毒样颗粒依旧颗粒饱满，无聚集现象。说明本发明筛选的序列制备的三种不同类型的口蹄疫蛋白均形成了稳定的类病毒样颗粒。
实施例2
抗口蹄疫的疫苗组合物的制备
取实施例1制备的O型口蹄疫病毒样颗粒、亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒和A型口蹄疫病毒样颗粒，缓缓加入到佐剂中，加的过程不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为抗口蹄疫的疫苗组合物。具体配比见表3。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本实施例中，选用佐剂ISA206(法国赛比克公司)。
表3抗口蹄疫的疫苗组合物成分配比
| 疫苗1 | 疫苗2 | 疫苗3 | 疫苗4 | 疫苗5 | |
| O型(μg/ml) | 0 | 100 | 50 | 100 | 150 |
| 亚洲Ⅰ型(μg/ml) | 0 | 0 | 50 | 100 | 150 |
| A型(μg/ml) | 100 | 100 | 50 | 100 | 150 |
| 206佐剂(V/V％) | 50％ | 50％ | 50％ | 50％ | 50％ |
实施例3
抗口蹄疫的疫苗组合物的免疫原性试验
1.免疫程序
利用口蹄疫O型抗体ELISA检测试剂盒、亚洲I型ELISA抗体检测试剂盒和A型抗体ELISA检测试剂盒筛选以上三种抗体均为阴性的6月龄的健康黄牛30头，随机分为6组，每组5头。1-5组分别为本发明实施例2制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5免疫组，第6组为PBS对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射1ml，PBS对照组免疫等量的PBS。疫苗免疫前每头牛采血，免疫后每周采血，连续采血至免疫后21日。
2.抗体水平检测
对采集的血清分别使用口蹄疫亚洲I型ELISA抗体检测试剂盒、口蹄疫O型抗体ELISA检测试剂盒和口蹄疫A型抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有牛只的抗体均为阴性，免疫后7天不同疫苗免疫的牛只抗体水平均开始上升，免疫后21天均能达到1：128以上。PBS对照组牛只抗体为阴性，无变化。具体结果见表4-6。
表4不同疫苗免疫牛只后O型口蹄疫ELISA抗体水平
表5不同疫苗免疫牛只后亚洲I型口蹄疫ELISA抗体水平
表6不同疫苗免疫牛只后A型口蹄疫ELISA抗体水平
证明了本发明制备的病毒样颗粒能快速形成较高水平的特异性抗体，解决了A型口蹄疫病毒样颗粒难以形成造成免疫原性较差的问题，能对机体起到很好的免疫保护作用。
实施例4
抗口蹄疫的疫苗组合物的免疫原性比较试验
1.免疫程序
利用口蹄疫O型抗体ELISA检测试剂盒、亚洲I型ELISA抗体检测试剂盒和A型抗体ELISA检测试剂盒筛选以上三种抗体均为阴性的6月龄的健康黄牛15头，随机分为3组，每组5头。第1组为本发明实施例2制备的疫苗4免疫组，第2组为市售商品化口蹄疫全病毒三价灭活疫苗(金宇保灵生物药品有限公司生产，批号4235008)，第3组为PBS对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射，第1组免疫1ml，第2组免疫2ml，PBS对照组免疫2ml的PBS。疫苗免疫前每头牛采血，免疫后每周采血，连续采血至免疫后21日。
2.抗体水平检测
对采集的血清分别使用口蹄疫亚洲I型ELISA抗体检测试剂盒、口蹄疫O型抗体ELISA检测试剂盒和口蹄疫A型抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有牛只的抗体均为阴性，免疫后7天不同疫苗免疫的牛只抗体水平均开始上升，免疫后21天均能达到1：128以上。PBS对照组牛只抗体为阴性，无变化。详细抗体检测情况见表7-9，表明本发明疫苗组合物能产生更高的抗体水平。
表7不同疫苗免疫牛只后O型口蹄疫ELISA抗体水平
表8不同疫苗免疫牛只后亚洲I型口蹄疫ELISA抗体水平
表9不同疫苗免疫牛只后A型口蹄疫ELISA抗体水平
证明了本发明提供的疫苗组合物，其抗原表位被有效呈递在病毒样颗粒的表面，比全病毒疫苗能更好地刺激B、T细胞，引起免疫应答。与全病毒疫苗相比，本发明提供的疫苗组合物在体内血清中的半衰期长，稳定性好，有效期长，持续刺激免疫反应，其抗体水平远高于全病毒疫苗。
实施例5
抗口蹄疫的疫苗组合物病毒样颗粒结构的优化
将SEQIDNO.2第178位氨基酸Ser突变为Cys，SEQIDNO.6第17位氨基酸Asn突变为Asp，SEQIDNO.8第178位氨基酸Ser突变为Cys，SEQIDNO.12第17位氨基酸Asn突变为Asp，SEQIDNO.14第178位氨基酸Gln突变为Cys，SEQIDNO.18第17位氨基酸Asn突变为Asp。根据突变后的氨基酸序列参考实施例1的方法制备抗口蹄疫的O型口蹄疫病毒样颗粒、亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒和A型口蹄疫病毒样颗粒。
实施例6
优化的抗口蹄疫的疫苗组合物病毒样颗粒结构的稳定性检验
将实施例1及实施例5制备的病毒样颗粒分别置于50℃水浴中1小时及pH6.0条件下处理30分钟，然后在电镜下观察。结果显示优化的病毒样颗粒无论是在热环境下还是在酸性条件下，其病毒样颗粒大小均匀，呈空心形态；而未优化的病毒样颗粒出现聚团，颗粒大小不一。具体结果见表10。
表10口蹄疫病毒样颗粒稳定性检验
证明了本发明提供的优化后的疫苗组合物的病毒样颗粒结构的稳定性进一步增强，其有利地保障了疫苗组合物在不同环境下结构的稳定性，有利于储存与运输，保证了疫苗性状的稳定性。
实施例7
优化的抗口蹄疫的疫苗组合物的制备
取实施例5制备的O型口蹄疫病毒样颗粒、亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒和A型口蹄疫病毒样颗粒，按照实施例2的制备方法制备抗口蹄疫的疫苗组合物。具体配比见表11。
表11优化的抗口蹄疫的疫苗组合物的成分配比
| 疫苗6 | |
| O型(μg/ml) | 100 |
| 亚洲Ⅰ型(μg/ml) | 100 |
| A型(μg/ml) | 100 |
| 206佐剂(V/V％) | 50％ |
实施例8
优化的抗口蹄疫的疫苗组合物免疫持续期对比试验
1.免疫程序
利用口蹄疫O型抗体ELISA检测试剂盒、亚洲I型ELISA抗体检测试剂盒和A型抗体ELISA检测试剂盒筛选以上三种抗体均为阴性的6月龄的健康黄牛15头，随机分为3组，每组5头。第1组为本发明实施例2制备的疫苗4免疫组，第2组为本发明实施例7制备的疫苗6免疫组，第3组为PBS对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射1ml，PBS对照组免疫等量的PBS。疫苗免疫前每头牛采血，免疫后每月采血，连续采血至免疫后6个月。
2.抗体水平检测
对采集的血清分别使用口蹄疫亚洲I型ELISA抗体检测试剂盒、口蹄疫O型抗体ELISA检测试剂盒和口蹄疫A型抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有牛只的抗体均为阴性，免疫后4个月疫苗4免疫的牛只抗体水平均开始下降，而疫苗6依然保持较高的抗体水平。PBS对照组牛只抗体为阴性，无变化。详细抗体检测情况见表12-14。
表12免疫持续期对比试验O型口蹄疫ELISA抗体水平
表13免疫持续期对比试验亚洲1型口蹄疫ELISA抗体水平
表14免疫持续期对比试验A型口蹄疫ELISA抗体水平
证明了本发明提供的优化的病毒样颗粒结构，提高了病毒样颗粒的稳定性，不仅温度稳定性及酸性环境稳定性增加，而且意外发现，优化后的病毒样颗粒的疫苗组合物免疫持续期显著增长，能维持更长时间的免疫保护。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种口蹄疫病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成。
2.根据权利要求1所述的病毒样颗粒，其特征在于，所述A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0氨基酸序列为SEQIDNO.14，VP3氨基酸序列为SEQIDNO.16，VP1氨基酸序列为SEQIDNO.18。
3.一种抗口蹄疫的疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物包含权利要求1或2所述的A型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物进一步包含O型口蹄疫病毒样颗粒。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的O型口蹄疫病毒样颗粒由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQIDNO.2，VP3氨基酸序列为SEQIDNO.4，VP1氨基酸序列为SEQIDNO.6。
6.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物进一步包含亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒由亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQIDNO.8，VP3氨基酸序列为SEQIDNO.10，VP1氨基酸序列为SEQIDNO.12。
8.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的O型口蹄疫病毒样颗粒含量为50-150μg/ml；亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒含量为50-150μg/ml；A型口蹄疫病毒样颗粒含量为50-150μg/ml。
9.一种抗口蹄疫的疫苗组合物，其特征在于，
所述的组合物由O型口蹄疫病毒样颗粒、亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒、A型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂组成；
所述O型口蹄疫病毒样颗粒由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQIDNO.2，VP3氨基酸序列为SEQIDNO.4，VP1氨基酸序列为SEQIDNO.6，但SEQIDNO.2第178位氨基酸突变为半胱氨酸，SEQIDNO.6第17位氨基酸突变为天冬氨酸；
所述的亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒由亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQIDNO.8，VP3氨基酸序列为SEQIDNO.10，VP1氨基酸序列为SEQIDNO.12，但SEQIDNO.8第178位氨基酸突变为半胱氨酸，SEQIDNO.12第17位氨基酸突变为天冬氨酸；
所述的A型口蹄疫病毒样颗粒由A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQIDNO.14，VP3氨基酸序列为SEQIDNO.16，VP1氨基酸序列为SEQIDNO.18，但SEQIDNO.14第178位氨基酸突变为半胱氨酸，SEQIDNO.18第17位氨基酸突变为天冬氨酸。
10.一种制备权利要求3-9所述疫苗组合物的方法，其中，所述的制备方法包括：
1)制备O型口蹄疫病毒样颗粒和/或亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒样颗粒和/或A型口蹄疫病毒样颗粒的步骤；
2)按比例混合病毒样颗粒，加入佐剂，乳化的步骤。
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