RU2314125C1 - Способ получения инактивированной вакцины против вируса гепатита а - Google Patents
Способ получения инактивированной вакцины против вируса гепатита а Download PDFInfo
- Publication number
- RU2314125C1 RU2314125C1 RU2006113819/13A RU2006113819A RU2314125C1 RU 2314125 C1 RU2314125 C1 RU 2314125C1 RU 2006113819/13 A RU2006113819/13 A RU 2006113819/13A RU 2006113819 A RU2006113819 A RU 2006113819A RU 2314125 C1 RU2314125 C1 RU 2314125C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- solution
- cells
- vaccine
- carried out
- Prior art date
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области вирусологии. Способ включает выращивание вируса на клетках, лизис клеток, осветление вируссодержащей жидкости, ее концентрирование и доочистку, с последующим повторным осветлением вирусной фракции и сорбцией вирусного антигена. При этом лизис клеток осуществляют раствором неионного детергента Твин 80, а на стадии доочистки используют раствор сульфата стрептомицина. Способ позволяет повысить выход вирусного антигена. Изобретение может быть использовано в медицине. 4 з.п. ф-лы, 10 табл.
Description
Изобретение относится к вирусологии, в частности к производству вакцинных препаратов, и может быть использовано в медицинской и микробиологической промышленности.
Согласно требованию ВОЗ содержание клеточной ДНК в вакцинах, приготовленных на основе вирусных сборов, в частности, с перевиваемых клеточных линий жестко лимитировано величиной 100 пг на дозу для исключения потенциальной возможности ее онкогенного и трансформирующего действия.
Известен способ получения инактивированной вакцины к вирусу гепатита А на перевиваемой линии почек зеленой мартышки 4647. Вирус гепатита А (штамм HAS-15) адаптируют в течение 3-х пассажей к перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки 4647. Вируссодержащую жидкость используют в качестве инокулята для массового заражения монослоя тех же клеток в матрасах и роллерных флаконах. Вирус культивируют при 37°С в течение 20 дней с ежедневной сменой среды. Вируссодержащую надклеточную жидкость, полученную при сменах среды, замораживают. Суспензию клеток по окончании инкубации обрабатывают ультразвуком и ВГА дважды экстрагируют хлороформом. Водные фазы объединяют с вируссодержащей надклеточной жидкостью и концентрируют в 100 раз в системе тангенциального потока. Клеточную ДНК вирусного концентрата удаляют обработкой ДНКазой II. Очистку проводят на колонках с ДЕАЕ-серофазой 6В макропористым стеклом и биогелем Р-2. Вируссодержащие фракции объединяют, вирус инактивируют формалином (1:4000) и сорбируют на гидроокиси алюминия (Авторское свидетельство СССР №1389059, МПК А61К 39/29, заявлено 04.09.1986).
Недостатком данного способа является его сложность и длительность цикла получения вакцины, а также большие потери вирусного антигена в процессе его очистки (до 70,0-90,0%). Для удаления ДНК используют фермент дезоксирибонуклеазу. Препараты ДНКазы отечественного производства содержат примеси протеаз и неспецифических нуклеаз, а очищенные препараты зарубежного производства малодоступны и догоростоящи. Кроме того, обработка ДНКазой не дает 100% гарантии разрушения клеточной ДНК, необходимы контроль активности, специфичности и чистоты ДНКазы и количества остаточной клеточной ДНК в препаратах. Последний осуществляют методом гибридизации - сложным, трудоемким, дорогостоящим и требующим аттестованных помещений для работы с радиоактивными изотопами.
Известен способ получения вакцины против вируса гепатита А на диплоидной культуре клеток фибробластов человека. Изолят ВГА адаптируют в течение первых пассажей к первичной культуре клеток почки эмбриона человека, а затем этот штамм переадаптируют к диплоидной культуре клеток фибробластов человека. При переадаптации ВГА к культуре клеток фибробластов человека на первых пассажах вирус размножается очень медленно. Увеличение скорости роста достигается многократными пассажами. Полученный вирусный антиген после соответствующей очистки и инактивации инфекционной активности используют в качестве вакцины для человека и животных (патент США №4506016, МПК С12 7/08, опубл.1985).
Однако известный способ не может быть использован для производства вакцины в промышленных масштабах, предусматривает проведение не менее 10 пассажей вируса на клетках почки эмбриона человека и переадаптацию к клеткам фибробластов в течение 50-75 пассажей. Кроме того, использование известного способа связано с риском заражения персонала, так как приготовление вакцины осуществляют от начала и до конца с живым вирусом.
Известен способ получения инактивированной вакцины против гепатита А, включающий размножение вируса штамма HAS-15 в диплоидной культуре клеток фибробластов человека Л-68 с последующим разрушением клеток, очисткой антигена молекулярно-ситовой хроматографией или ультрацентрифугированием в градиенте CsCl, концентрированием, инактивацией и сорбцией на носителе (патент РФ №1672635, МПК А61К 39/29, опубликован 30.01.1994). При этом способ значительно упрощается, сокращается технологический процесс получения вакцины, которая безопасна в онкогенном отношении и не требует специальной очистки от клеточной ДНК.
Однако указанный способ имеет низкую производительность и не пригоден для производства вакцины в промышленных масштабах, т.к. диплоидная культура клеток фибробластов человека Л-68 имеет ограниченный ресурс размножения (не более 25 пассажей) и низкую продуктивность по вирусному антигену гепатита А.
Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ приготовления инактивированной вакцины против вируса гепатита А, включающий выращивание вируса на клетках перевиваемой клеточной линии, лизис клеток обработкой ультразвуком, осветление вируссодержащей жидкости центрифугированием, концентрирование ее ультрацентрифугированием в слое сахарозы и доочистку вирусного продукта от клеточной ДНК и других примесей раствором макромолекулярного поликатиона (протаминсульфат) с последующим повторным осветлением вирусной фракции центрифугированием или хроматографией, инактивирование ее раствором формальдегида и сорбцию на гидроокиси алюминия (авторское свидетельство СССР №1532050, МПК А61К 39/00, опубл. 1989).
Однако в способе-прототипе наблюдаются высокие потери вирусного антигена (до 60,0-80,0%) вследствие неполного лизиса клеток ультразвуком и использования для удаления клеточной ДНК и других примесей протаминсульфата. Протаминсульфат осаждает не только ДНК, рибосомные нуклеиновые кислоты, мРНК, тРНК, но и частично на образовавшемся осадке адсорбируются вирусные белки. Кроме того, использование известного способа связано с риском заражения персонала, так как приготовление вакцины осуществляется от начала и до конца с живым вирусом.
Технический результат от использования предлагаемого способа заключается в увеличении выхода вирусного антигена в несколько раз и повышение иммуногенной активности вакцины, а также в том, что в одном из вариантов реализации способа уже на начальном этапе приготовления вакцины активность вируса гепатита А подавляется, что приводит к минимизации риска заражения персонала.
Технический результат достигается тем, что в способе получения инактивированной вакцины против гепатита А, включающем выращивание вируса на клетках перевиваемой клеточной линии, лизис клеток, осветление вируссодержащей жидкости центрифугированием, концентрирование ее ультрацентрифугированием в слое сахарозы и доочистку вирусного продукта раствором макромолекулярного поликатиона с последующим повторным осветлением вирусной фракции центрифугированием и сорбцию на гидроокиси алюминия, причем инактивирование вирусного антигена проводят на одном из этапов его получения, согласно изобретению лизис клеток осуществляют раствором неионного детергента Твин 80 в фосфатно-солевом буфере, а в качестве макромолекулярного поликатиона для доочистки вирусного продукта используют раствор сульфата стрептомицина в конечной концентрации в обрабатываемом продукте не более 1,0 мас.%.
Неионный детергент Твин 80 используют в виде 1%-ного раствора в 0,01М фосфатно-солевом буфере при рН 7,6, а лизис клеток осуществляют в термостатируемом шейкере при температуре 37°С в течение 1 часа.
Сульфат стрептомицина используют в виде 25,0%-ного раствора в конечной концентрации в обрабатываемом вируссодержащем продукте 0,5 мас.%, причем указанную смесь выдерживают в течение 15 минут при 4°С.
Инактивирование вирусного антигена раствором формальдегида проводят сразу после лизиса клеток неионным детергентом или перед сорбцией вирусного антигена на гидроокись алюминия. При инактивировании вирусного антигена после лизиса клеток уже на начальном этапе приготовления вакцины активность вируса гепатита А подавляется, что приводит к минимизации риска заражения персонала.
Инактивирование вирусной фракции раствором формальдегида осуществляют при его концентрации 0,1 мас.% в течение 14 суток при 37°С.
Экспериментально установлено, что при лизисе клеток неионным детергентом Твин 80 и осаждении клеточной ДНК из вируссодержащей суспензии сульфатом стрептомицина (вместо протаминсульфата) потери вирусного антигена сокращаются в несколько раз.
Лучшие варианты выполнения способа
Вариант 1. Описание способа получения вакцины при инактивировании антигена в конце технологического цикла. Способ получения инактивированной вакцины против гепатита А включает выращивание вируса на клетках перевиваемой клеточной линии и лизис клеток раствором неионного детергента Твин 80 в фосфатно-солевом буфере. Неионный детергент Твин 80 используют в виде 1%-ного раствора в 0,01М фосфатно-солевом буфере при рН 7,6, а лизис клеток осуществляют в термостатируемом шейкере при температуре 37°С в течение 1 часа. Вируссодержащую жидкость осветляют центрифугированием, а концентрирование осветленного продукта ультрацентрифугированием в слое сахарозы. Доочистку продукта производят раствором макромолекулярного поликатиона, в качестве которого для удаления клеточной ДНК используют раствор сульфата стрептомицина в конечной концентрации в обрабатываемом продукте не более 1,0 мас.%. Сульфат стрептомицина используют в виде 25,0%-ного раствора в конечной концентрации в обрабатываемом вируссодержащем продукте 0,5 мас.%. Причем указанную смесь выдерживают в течение 15 минут при 4°С. Далее повторно осветляют вируссодержащую фракцию центрифугированием с последующим инактивированием надосадочной жидкости раствором формальдегида. Инактивирование вирусной фракции раствором формальдегида осуществляют при его концентрации 0,1 мас.% в течение 14 суток при 37°С. Полученную вирусную субстанцию сорбируют на гидроокиси алюминия.
Вариант 2. Описание способа получения вакцины при инактивировании антигена в начале технологического цикла. Способ получения инактивированной вакцины против гепатита А включает выращивание вируса на клетках перевиваемой клеточной линии и лизис клеток раствором неионного детергента Твин 80 в фосфатно-солевом буфере. Неионный детергент Твин 80 используют в виде 1%-ного раствора в 0,01М фосфатно-солевом буфере при рН 7,6, а лизис клеток осуществляют в термостатируемом шейкере при температуре 37°С в течение 1 часа. Далее вируссодержащую жидкость инактивируют раствором формальдегида при его концентрации 0,1 мас.% в течение 14 суток при 37°С. Инактивированную вируссодержащую жидкость осветляют центрифугированием, а концентрирование осветленного продукта осуществляют ультрацентрифугированием в слое сахарозы. Доочистку продукта производят раствором макромолекулярного поликатиона, в качестве которого для удаления клеточной ДНК используют раствор сульфата стрептомицина в конечной концентрации в обрабатываемом продукте не более 1,0 мас.%. Сульфат стрептомицина используют в виде 25,0%-ного раствора в конечной концентрации в обрабатываемом вируссодержащем продукте 0,5 мас.%. Причем указанную смесь выдерживают в течение 15 минут при 4°С. Далее повторно осветляют вируссодержащую фракцию центрифугированием. Полученную вирусную субстанцию сорбируют на гидроокиси алюминия.
Пример 1. Реализация способа получения вакцины против гепатита А, инактивацию вируса в котором осуществляют в конце технологического цикла. Для получения вакцины вируса гепатита А (ВГА) имеется банк с производственным штаммом ЛБА-86 - HAS 15/4647 (ПШ), полученным из ИПВЭ РАМН, из которого в дальнейшем создается банк с посевным вирусом (ПВ) первого и второго пассажа.
Производственный штамм хранят при температуре от минус 18 до 20°С.
Посевной вирус 1-го пассажа получают путем заряжения культуры продуцента перевиваемых клеток 4647 посевным штаммом ВГА. Для культивирования используют среду MEM Игла с добавлением 2% сыворотки плода коров и 1% сыворотки новорожденных телят. Инкубацию осуществляют при 37°С. Срок культивирования составляет 14 суток со сменой среды через 7 суток. Посевной вирус 1-го пассажа представляет собой обломки клеток, содержащие ВГА, образовавшиеся в результате пятикратного оттаивания-замораживания вируссодержащих клеток. В полученном вируссодержащем материале методом ИФА определяют содержание вирусного антигена и инфекционный титр.
Для получения вируссодержащей жидкости для вакцины используют посевной вирус второго пассажа. Посевной вирус второго пассажа представляет собой разрушенные замораживанием-оттаиванием клетки с вирусом в культуральной жидкости. Посевной вирус 2-го пассажа получают путем заражения культуры продуцента посевным вирусом 1-го пассажа. Для культивирования используют среду MEM Игла с добавлением 2% сыворотки плода коров и 1% сыворотки новорожденных телят. Срок культивирования составляет 7 суток. Посевной вирус второго пассажа хранят при температуре от минус 18 до минус 20°С.
Для получения вируссодержащей суспензии используют посевной вирус 2-го пассажа, инфекционный титр которого должен быть не ниже 105,5 ТкИД50/см3. Посевной вирус разводят средой Игла MEM до концентрации, обеспечивающей множественность заражения 0,01-0,1 ТкИД50/кл. Инкубацию осуществляют в течение 14 сут со сменой среды через 7 сут. По окончании инкубации культуральную жидкость удаляют, клетки, содержащие вирус, диспергируют 0,02% раствором Версена с добавлением 0,01% химопсина.
Клетки собирают в минимальном объеме раствора Версена с добавлением 5% сыворотки крови плода коров и передают для очистки и концентрирования ВГА.
Далее суспензию клеток центрифугируют при 3000 об/мин при 4°С и к осадку клеток добавляют пять объемов (по отношения к объему осадка) лизирующего раствора (1%-й раствор неионного детергента Твин-80 в 0,01М фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7,6), подогретого до 37°С. Лизис клеток проводят при 37°С в термостатированном шейкере в течение 1 часа. Клеточный лизат освобождают от ядер центрифугированием при 1700×g, в течение 10 мин при температуре 4°С. Надосадочную жидкость осветляют центрифугированием при 13000×g в течение 15 мин при температуре 4°С. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость подвергают доочистке от балластных высокомолекулярных клеточных компонентов в режиме ультрацентрифугирования, пропуская его через трехслойную сахарозную подушку, состоящую из 10, 20 и 30% пятимиллилитровых слоев сахарозы, используя ротор SW-28 на ультрацентрифуге "Beckman" в течение 12 часов при 80000×g. К полученному первичному концентрату вируссодержащей жидкости приливают раствор 25%-го сульфата стрептомицина до конечной концентрации 0,5% при перемешивании и выдерживают 15 мин при температуре 4°С. Осветляют концентрат центрифугированием при 13000×g, в течение 15 мин и 4°С на роторе SA-20. Осадок отбрасывают.
Для сбора очищенного ВГА из буферного раствора, содержащего 1% Твин 80, супернатант наслаивают на 8 мл 20%-й сахарозы и центрифугируют при 80000×g в течение 12 часов и 4°С. Осадок перерастворяют в 0,01М ФСБ. Осветляют концентрат центрифугированием при 13000×g, в течение 15 мин и 4°С, затем концентрат фильтруют через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Полученный вирусный концентрат инактивируют в присутствии 0,1%-го формальдегида в течение 14 суток при 37°С. После проверки препарата на полноту инактивации (специфическую безвредность) полуфабрикат вакцины сорбируют на геле алюминия гидроксида, доводят до конечного объема и разливают по ампулам или флаконам.
Пример 2. Реализация способа получения вакцины против гепатита А, инактивацию вируса в котором осуществляют в начале технологического цикла. Вируссодержащие клетки после культивирования, проводимого так же, как в примере 1, собирают в минимальном объеме раствора Версена с добавлением 5% сыворотки крови плода коров и передают для очистки и концентрирования ВГА.
Далее суспензию клеток центрифугируют при 3000 об/мин при 4°С и к осадку клеток добавляют пять объемов (по отношения к объему осадка) лизирующего раствора (1%-й раствор неионного детергента Твин 80 в 0,01М фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7,6), подогретого до 37°С. Лизис клеток проводят при 37°С в термостатированном шейкере в течение 1 часа.
Полученный клеточный лизат инактивируют в присутствии 0,1%-го формальдегида в течение 14 суток при 37°С. После проверки клеточного лизата на полноту инактивации (специфическую безвредность) его освобождают от ядер центрифугированием при 1700×g в течение 10 мин при температуре 4°С. Надосадочную жидкость осветляют центрифугированием при 13000×g в течение 15 мин при температуре 4°С. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость подвергают доочистке от балластных высокомолекулярных клеточных компонентов в режиме ультрацентрифугирования, пропуская его через трехслойную сахарозную подушку, состоящую из 10, 20 и 30% пятимиллилитровых слоев сахарозы, используя ротор SW-28 на ультрацентрифуге "Beckman" в течение 12 часов при 80000×g. К полученному первичному концентрату вируссодержащей жидкости приливают раствор 25%-го сульфата стрептомицина до конечной концентрации 0,5% при перемешивании и выдерживают 15 мин при температуре 4°С. Осветляют концентрат центрифугированием при 13000×g в течение 15 мин и 4°С на роторе SA-20. Осадок отбрасывают. Для сбора очищенного ВГА из буферного раствора, содержащего 1% Твин 80, супернатант наслаивают на 8 мл 20%-й сахарозы и центрифугируют при 80000×g в течение 12 часов и 4°С. Осадок перерастворяют в 0,01М ФСБ. Осветляют концентрат центрифугированием при 13000×g, в течение 15 мин и 4°С, затем концентрат фильтруют через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Полученный полуфабрикат вакцины сорбируют на геле алюминия гидроксида, доводят до конечного объема и разливают по ампулам или флаконам.
Пример 3. Исследование иммуногенной активности вакцины. Проверку иммуногенной активности проводят на белых нелинейных мышах-самцах весом 15-20 г. Методом случайной выборки формируют опытные и одну контрольную группы по 10 мышей в каждой. Количество опытных групп должно соответствовать количеству используемых разведений.
Мышам опытных групп вводят разведения вакцины в объеме 1,0 мл подкожно в две точки, используя одно разведение препарата на одну опытную группу. Мышам контрольной группы по той же схеме и тем же способом вводят сорбент - гидроокись алюминия (0,35-0,65 мг/мл) в таком же объеме.
Через 28-30 дней от животных опытной и контрольной групп получают кровь и готовят из нее сыворотку в объеме не менее 0,1 мл. Каждый полученный образец сыворотки тестируют на наличие антител к вирусу гепатита А, используя для этого коммерческие иммуноферментные тест-системы для выявления антител к вирусу гепатита А с чувствительностью не менее 20 мМЕ/мл. Постановку и учет результатов осуществляют в соответствии с Инструкцией по применению тест-системы.
Расчет ИД50 осуществляют по результатам, полученным в опытных группах по методу Кербера. Величина ИД50 испытуемой вакцины должна составлять не менее 8 или не менее 20 ИФА ЕД. Отношение значений ИД50 испытуемой вакцины и ОСО-вакцины должно находиться в пределах от 0,68 до 1,66 при р=0,95.
Остаточную клеточную ДНК определяют методом, рекомендованным Европейской Фармакопеей, 1997 г. Метод основан на молекулярной ДНК-ДНК гибридизации меченного биотином зонда, полученного путем ник-трансляции чистого препарата тотальной клеточной ДНК с остаточной клеточной ДНК, присутствующей в анализируемом препарате и иммобилизованной на нитроцеллюлозном фильтре. Описанный способ получения вакцины позволяет:
1. Производить вакцину в промышленном масштабе, по качеству соответствующую Европейской Фармакопее.
2. Уменьшить минимум в два раза содержание клеточной ДНК и в несколько раз содержание общего белка.
3. Освободиться от клеточных компонентов и довести содержание остаточной клеточной ДНК до уровня 100 пг/мл.
4. Получить препарат с высокой иммуногенной активностью, нетоксичный для морских свинок и кроликов.
5. Выпускать препарат, сохраняющий свою стабильность в течение 2-х лет.
Получить длительный иммунитет после двукратной иммунизации.
В таблице 1 приведены сравнительные данные инактивированной вакцины против гепатита А.
| Таблица 1 | ||
| Сравнительные данные инактивированной вакцины против гепатита А | ||
| Показатель | Нормы по технологии-аналогу (авторское свидетельство СССР №1532050). | Нормы по заявляемой технологии |
| Белок по Лоури в 1 мл | 125 мкг/мл | Не более 9 мкг/мл |
| Белки крупного рогатого скота | 1 мкг/мл | Не более 50 нг/мл |
| Клеточная ДНК | 200 пг/мл | 100 пг/мл |
| Содержание Al(ОН)3 (по Al+3) | От 1 до 2 мг/мл | От 0,35 до 0,65 мг/мл |
В следующих таблицах (2-8) приведены данные по основным показателям по результатам проведенных исследований ряда производственных серий вакцины после хранения препарата в течение 24 месяцев.
| Таблица 2 | ||||||
| Показатели иммуногенной активности вакцины | ||||||
| № серии | Дата изготовления | Специфическая активность (иммуногенность) ИД50 не более 20 ИФА Ед | ||||
| 0 месяцев | 18 месяцев | 24 месяца | ||||
| 18 | 15.04.02 | 4.68 | 5.01 | 5.96 | ||
| 19 | 16.05.02 | 4.05 | 4.07 | 4.34 | ||
| 20 | 13.06.02 | 6.21 | 7.01 | 7.08 | ||
| 21 | 09.07.02 | 9.12 | 9.33 | 12.56 | ||
| 22 | 06.08.02 | 5.96 | 6.17 | 6.21 | ||
| 23 | 09.09.02 | 7.08 | 8.13 | 8.53 | ||
| Таблица 3 | ||||||
| Токсичность | ||||||
| № серии | Дата изготовления | Токсичность | ||||
| 0 месяцев | 18 месяцев | 24 месяца | ||||
| 18 | 15.04.02 | Не токсична | Не токсична | Не токсична | ||
| 19 | 16.05.02 | Не токсична | Не токсична | Не токсична | ||
| 20 | 13.06.02 | Не токсична | Не токсична | Не токсична | ||
| 21 | 09.07.02 | Не токсична | Не токсична | Не токсична | ||
| 22 | 06.08.02 | Не токсична | Не токсична | Не токсична | ||
| 23 | 09.09.02 | Не токсична | Не токсична | Не токсична | ||
| Таблица 4 | ||||||
| Пирогенность | ||||||
| № серии | Дата изготовления | Пирогенность | ||||
| 0 месяцев | 18 месяцев | 24 месяца | ||||
| 18 | 15.04.02 | Не пирогенна | Не пирогенна | Не пирогенна | ||
| 19 | 16.05.02 | Не пирогенна | Не пирогенна | Не пирогенна | ||
| 20 | 13.06.02 | Не пирогенна | Не пирогенна | Не пирогенна | ||
| 21 | 09.07.02 | Не пирогенна | Не пирогенна | Не пирогенна | ||
| 22 | 06.08.02 | Не пирогенна | Не пирогенна | Не пирогенна | ||
| 23 | 09.09.02 | Не пирогенна | Не пирогенна | Не пирогенна | ||
| Таблица 5 | ||||||||||
| Содержание гидроксида алюминия | ||||||||||
| № серии | Дата изготовления | Содержание алюминия (мг/мл) | ||||||||
| 0 месяцев | 18 месяцев | 24 месяца | ||||||||
| 18 | 15.04.02 | 0.37 | 0.36 | 0.36 | ||||||
| 19 | 16.05.02 | 0.4 | 0.4 | 0.39 | ||||||
| 20 | 13.06.02 | 0.39 | 0.39 | 0.38 | ||||||
| 21 | 09.07.02 | 0.42 | 0.41 | 0.39 | ||||||
| 22 | 06.08.02 | 0.47 | 0.46 | 0.41 | ||||||
| 23 | 09.09.02 | 0.47 | 0.43 | 0.40 | ||||||
| Таблица 6 | ||||||||||
| Содержание формальдегида | ||||||||||
| № серии | Дата изготовления | Процентное содержание формальдегида | ||||||||
| 0 месяцев | 18 месяцев | 24 месяца | ||||||||
| 18 | 15.04.02 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | ||||||
| 19 | 16.05.02 | 0.01 | 0.009 | 0.008 | ||||||
| 20 | 13.06.02 | 0.015 | 0.014 | 0.013 | ||||||
| 21 | 09.07.02 | 0.017 | 0.013 | 0.01 | ||||||
| 22 | 06.08.02 | 0.017 | 0.014 | 0.012 | ||||||
| 23 | 09.09.02 | 0.014 | 0.013 | 0.01 | ||||||
| Таблица 7 | ||||||||||
| Водородный показатель (рН) | ||||||||||
| № серии | Дата изготовления | РН | ||||||||
| 0 месяцев | 18 месяцев | 24 месяца | ||||||||
| 18 | 15.04.02 | 7.15 | 7.2 | 7.2 | ||||||
| 19 | 16.05.02 | 7.2 | 7.21 | 7.22 | ||||||
| 20 | 13.06.02 | 7.35 | 7.4 | 7.4 | ||||||
| 21 | 09.07.02 | 7.2 | 7.3 | 7.42 | ||||||
| 22 | 06.08.02 | 7.3 | 7.35 | 7.35 | ||||||
| 23 | 09.09.02 | 7.4 | 7.42 | 7.45 | ||||||
| Таблица 8 | ||||||||||
| Содержание общего белка и клеточной ДНК | ||||||||||
| № серии | Дата выпуска | Содержание белка по Лоури (мкг/мл) | Содержание БСА (нг/мл) | Содержание остаточной клеточной ДНК (пг/мл) | ||||||
| 51 | 11.03.05 | 0.055 | 3.9 | 55 | ||||||
| 52 | 13.04.05 | 0.086 | менее 3.9 | 47 | ||||||
| 53 | 05.05.05 | 0.086 | 3.9 | 47 | ||||||
| 54 | 27.05.05 | 0.086 | менее 3.9 | 47 | ||||||
| Таблица 9 | |||||
| Сравнительные характеристики вакцины, полученной по способу-прототипу и заявляемым способом | |||||
| № образца | Способ очистки от клеточной ДНК | Титр ВГА после очистки | Содержание антигена в 1 мл полуфабриката (ИФА Ед) | Содержание ДНК в полуфабрикате до разведения (нг) | Содержание клеточной ДНК в 1 мл готового препарата (нг) |
| 1 Прототип | 0,1% протамина сульфата | 1:16 | 320 | 200 | 100 |
| 2 Прототип | 0,05% протамина сульфата | 1:32 | 640 | 200 | 50 |
| 3 Прототип | 0,025% протамина сульфата | 1:32 | 640 | 200 | 50 |
| 4 Прототип | 0,015% протамина сульфата | 1:4 | 80 | 40 | 20 |
| 5 Заявл. способ | 0,05% стрептомицина сульфата | 1:128 | 2560 | 1,6 | 0,1 |
| 6 Заявл. способ | 0,25% стрептомицина сульфата | 1:256 | 5120 | 1,6 | 0,05 |
| 7 Заявл. способ | 0,25% стрептомицина сульфата | 1:256 | 5120 | 0,8 | 0,013 |
Примечание к таблице 9:
1. Образцы (с 1 по 4) вакцины получены по способу-прототипу (авторское свидетельство СССР №1532050).
2. Образцы (с 5 по 7) вакцины получены заявляемым способом. Причем образцы 5 и 6 вакцины получены при инактивации вирусного антигена формальдегидом в конце технологического процесса (перед сорбцией вирусного антигена на гидроокись алюминия), а образец 7 вакцины получен при инактивации вирусного антигена формальдегидом в начале технологического процесса (после лизиса клеток детергентом).
| Таблица 10 | |||||||||
| Результаты двухкратной иммунизации вакциной, полученной заявляемым способом | |||||||||
| Вакцина | Через 1 мес. после 1-го | Через 6 мес. после 1-го введения | Через 1 мес. после 2-го введения | ||||||
| к-во сывор | % серокон вер | СТГА(мМЕ/мл) | к-во сывор | % серокон версии | СТГА (мМЕ/мл) | к-во сывор | % серокон версии | СТГА (мМЕ/мл) | |
| Серия №16 | 60 | 75,0 | 106,7±42,3 | 54 | 88,8 | 115,4±52,9 | 54 | 96,2 | 589,4±146,3 |
| Серия №17 | 64 | 62,8 | 87,2±28,6 | 54 | 72,4 | 94,5±47,3 | 48 | 92,8 | 477,4±182,6 |
| Серия №6 (дети 3-9 лет) | 56 | 55,3 | 56,4±19,4 | - | - | - | 35 | 89,7 | 579,0±242,3 |
| Серия №31 (дети 15-16 лет) | 36 | 61,1 | 48,9±16,7 | 36 | 64,0 | 58,9±29,8 | 36 | 90,91 | 346±215,9 |
Технический результат от использования предлагаемого способа заключается в увеличении выхода вирусного антигена в 7-8 раз (таблица 9), а также в том, что в одном из вариантов реализации способа уже на начальном этапе приготовления вакцины активность вируса гепатита А подавляется, что приводит к минимизации риска заражения персонала. Более высокая иммуногенность вакцины, полученной заявляемым способом (таблица 2), позволяет получить устойчивый иммунитет уже после 2-кратной иммунизации (таблица 10). Вакцину, изготовленную по способу-прототипу, рекомендуется к использованию путем трехкратной иммунизации, что повышает нагрузку на иммунитет организма, которая может отрицательно сказаться на здоровье человека.
Claims (5)
1. Способ получения инактивированной вакцины против вируса гепатита А, включающий выращивание вируса на клетках перевиваемой клеточной линии, лизис клеток, осветление вируссодержащей жидкости центрифугированием, концентрирование ее ультрацентрифугированием в слое сахарозы и доочистку вирусного продукта раствором макромолекулярного поликатиона с последующим повторным осветлением вирусной фракции центрифугированием и сорбцию вирусного антигена на гидроокиси алюминия, причем инактивирование вирусного антигена проводят на одном из этапов его получения, отличающийся тем, что лизис клеток осуществляют раствором неионного детергента Твин 80 в фосфатно-солевом буфере, а в качестве макромолекулярного поликатиона для доочистки вирусного продукта используют раствор сульфата стрептомицина в конечной концентрации в обрабатываемом продукте не более 1,0 мас.%.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что неионный детергент Твин 80 используют в виде 1%-ного раствора в 0,01М фосфатно-солевом буфере при рН 7,6, а лизис клеток осуществляют в термостатируемом шейкере при температуре 37°С в течение 1 ч.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что сульфат стрептомицина используют в виде 25,0%-ного раствора в конечной концентрации в обрабатываемом вируссодержащем продукте 0,5 мас.%, причем указанную смесь выдерживают в течение 15 мин при 4°С.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что инактивирование вирусного антигена раствором формальдегида осуществляют сразу после лизиса клеток неионным детергентом или перед сорбцией на гидроокись алюминия.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что инактивирование вирусной фракции раствором формальдегида осуществляют при его концентрации 0,1 мас.% в течение 14 сут при 37°С.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006113819/13A RU2314125C1 (ru) | 2006-04-25 | 2006-04-25 | Способ получения инактивированной вакцины против вируса гепатита а |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006113819/13A RU2314125C1 (ru) | 2006-04-25 | 2006-04-25 | Способ получения инактивированной вакцины против вируса гепатита а |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2314125C1 true RU2314125C1 (ru) | 2008-01-10 |
Family
ID=39020095
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006113819/13A RU2314125C1 (ru) | 2006-04-25 | 2006-04-25 | Способ получения инактивированной вакцины против вируса гепатита а |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2314125C1 (ru) |
-
2006
- 2006-04-25 RU RU2006113819/13A patent/RU2314125C1/ru not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6048537A (en) | Method for preparing an influenza virus, antigens obtained and applications thereof | |
| CN104099301B (zh) | 柯萨奇病毒a16型病毒株、用途、疫苗及其制备方法 | |
| CN111420044B (zh) | 一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法 | |
| CN101695570A (zh) | 一种手足口病单、双价灭活疫苗及其制备方法 | |
| WO2018119746A1 (zh) | 重组ev71病毒样颗粒的纯化及其疫苗制备方法 | |
| EP2075005B1 (en) | Ipv-dpt vaccine | |
| CN106237323B (zh) | 猪蓝耳病纯化疫苗及其制备方法 | |
| CN111714626A (zh) | 一种采用mdck细胞系生产禽流感疫苗的方法及其制品 | |
| CN1843507B (zh) | 一种人用腮腺炎病毒组份疫苗及其制备方法和应用 | |
| RU2314125C1 (ru) | Способ получения инактивированной вакцины против вируса гепатита а | |
| CN112717128B (zh) | 一种预防手足口病的联合疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN102988970A (zh) | 口蹄疫纯化疫苗及其制备方法和应用 | |
| KR900007262B1 (ko) | 신(腎)증후성 출혈열 비루스 항원의 제조방법, 및 그 항원을 함유하는 백신 및 신증후성 출혈열 진단제 | |
| CN116615234A (zh) | 一种预防手足口病的联合疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN101306199A (zh) | 生产和纯化甲型肝炎灭活疫苗的方法 | |
| CN112791179B (zh) | 一种预防手足口病的联合疫苗及其制备方法和应用 | |
| RU2404804C2 (ru) | Инактивированная вакцина против вируса гепатита а | |
| CN1228085C (zh) | 森林脑炎纯化疫苗 | |
| CN114306587B (zh) | 一种低血清乙型脑炎灭活疫苗的制备方法及乙型脑炎灭活疫苗 | |
| CN116218791B (zh) | 一种基于体内外交叉的狂犬病疫苗病毒的培养方法、及应用 | |
| CN109602899B (zh) | 一种增强病毒抗原免疫原性的皮内注射技术及其在手足口病疫苗研究中的应用 | |
| RU2616245C2 (ru) | Композиция для профилактики заболеваний, вызываемых цитомегаловирусной инфекцией | |
| CN1443844A (zh) | 新的甲型肝炎病毒毒株,制备甲肝灭活疫苗的方法及所得疫苗 | |
| CN115429876A (zh) | 一种预防手足口病的联合疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN116350765A (zh) | 手足口病疫苗及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080426 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20100927 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110426 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20131127 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20141128 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160426 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20170208 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200426 |