CN113311167A - 一种具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶的制备方法及试剂盒 - Google Patents
一种具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶的制备方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶的制备方法，包括：将琼脂糖凝胶移入砂蕊漏斗内，并采用HCl溶液进行洗涤，待用；将独角仙凝集素AlloA溶于偶联缓冲液，并与洗涤后的琼脂糖凝胶进行合并，室温反应4h；以偶联缓冲液洗去未经过偶联的独角仙凝集素AlloA，测定洗涤液中的独角仙凝集素AlloA含量，计得偶联率为95％；采用甘氨酸封闭剩余活化基因；采用偶联缓洗涤3次，得到偶联凝集素的琼脂糖凝胶。通过上述方案，本发明具有制备工艺简单、投入成本低廉、准确可靠等优点，在糖缺失性转铁蛋白(CDT)试剂检测技术领域具有很高的实用价值和推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及糖缺失性转铁蛋白(CDT)试剂检测技术领域，尤其是一种具 有偶联凝集素的琼脂糖凝胶的制备方法及试剂盒。
背景技术
本文所述的糖缺失性转铁蛋白(CDT)试剂盒是用于对酒精性肝病的诊断。 众所周知，过度饮酒可导致无法逆转的心理和生理损伤，也会造成家庭和社会 问题。例如嗜酒的孕妇可能使孩子患有胎儿乙醇综合征，每600个新生儿中 有1个将因此智力发育迟缓。在全球范围内，有害饮酒每年导致330万人死亡。 全球有5.1％的疾病是由于酒精消耗引起的。酒精性肝病是由于长期大量饮酒导 致的中毒性肝损伤。初期通常表现为脂肪肝，进而发展成酒精性肝炎、肝纤维 化，最终导致肝硬化。在我国，酒精已仅次于病毒，成为脂肪肝、肝炎、肝纤 维化、肝硬化的第二大病因。
目前，现有技术中判断酒精肝的实验室检测指标主要包括γ-谷氨酰转移酶(GGT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT) 和平均红细胞体积(MCV)，其检测指标、异常条件、恢复时间和效果评价 如下表：
目前，上述检测指标存在以下共同的缺点：
第一，虽然上述指标都对肝脏疾病有较好的特异性，但却无法区分不同的 病因，对酒精没有特异性；
第二，在饮酒导致肝脏损伤之前，这些指标的水平没有变化；
第三，上述3个标志物的半衰期较长，无法及时反映饮酒状况的变化。
目前，国外CDT主要在临床上运用于嗜酒者解毒治疗的监测，也被推荐 用于糖缺失糖蛋白综合征(CDG)的辅助诊断、判断急性胰腺炎的发病是否 与饮酒状态相关、无意识的颅内出血筛查等，尤其对于精神治疗或初级医疗部 门患者、创伤和术前患者，检测CDT可预测急性戒酒综合征的风险。另有研 究发现当酒精性肝病患者存在肝纤维化或脂肪肝时，CDT与其他生化指标(如 GGT、AST/ALT比值)联合应用可进一步提高FibroTest和SteatoTest的准确性。提示CDT还可辅助鉴别酒精性肝病是否同 时存在肝纤维化或脂肪肝。此外CDT还可用于鉴别非酒精性脂肪肝和酒精性 肝炎。由于缺乏准确诊断非酒精性脂肪肝的临床症状或生化标志物，因而在诊 断时若能有效排除酒精性肝炎是非常必要的。有研究表明，虽然AST、AS T/ALT比值、GGT、MCV和CDT在酒精性肝炎患者中均有所升高， 但仅有CDT在非酒精性脂肪肝患者中的水平低于Cut off值[12]。 说明CDT能有效鉴别酒精性和非酒精性肝病，对非酒精性脂肪肝有很高的排 除诊断价值。
本文所示的四唾液酸转铁蛋白的结构如图1所示，在转铁蛋白肽链上的2 个糖链结合位点分别可结合2支、3支或4支的糖链，每支糖链末端为一个带 有负电荷的唾液酸分子。饮酒后体内转铁蛋白所含的唾液酸分子减少，使三唾 液酸、双唾液酸、单唾液酸和无唾液酸的转铁蛋白亚型水平升高。无唾液酸转 铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白和双唾液酸转铁蛋白，目前将此类并称为CDT。
现有技术中对糖缺失性转铁蛋白(CDT)的分离方法包括：电泳法、色谱 法(离子交换)和免疫法。其中，电泳法是根据转铁蛋白和糖缺失转铁蛋白的 电荷不同，通过电泳技术进行分离提取。另外，色谱法(离子交换)是根据转 铁蛋白和糖缺失转铁蛋白的电荷不同，通过离子交换色谱法分离提取。免疫法 是使用针对糖缺失转铁蛋白的抗体进行检测。但是，电泳法和色谱法是属于电 荷分离法，而某些遗传变异会导致等电点偏移，因此其CDT测试结果为假阳性。 由于接近等电点，基于电荷的分离程序无法将CDT与非CDT转铁蛋白分离。 不仅如此，免疫法只有西门子一家公司有针对CDT的特异性抗体，成本高且有 独家限制，不适用大规模推广应用。
另外，在专利申请号为“200710090161.4”、名称为“一种分离肝癌α1-抗 胰蛋白酶异质体、转铁蛋白异质体的凝集素亲和层析离心柱方法”的中国发明 专利中，其该离心柱由上部分离管和下部收集管组成。上部分离管装有偶联小 扁豆凝集素(LCA)的亲合介质，上部分离管底部是一个滤布，下部收集管中装有 缓冲溶液。小扁豆凝集素(LCA)能与α1-抗胰蛋白酶异质体、转铁蛋白异质体相 结合。经过该装置的分离，获得与小扁豆凝集素相结合的α1-抗胰蛋白酶异质体、 转铁蛋白异质体。与本技术相比，该技术是用于分离肝癌相关糖链异常α1-抗胰 蛋白酶异质体。众所周知，每种凝集素都有其特异的或专一的糖链结合能力。 肝癌的α1-抗胰蛋白酶异质体、转铁蛋白异质体、甲胎蛋白异质体为α1-抗胰蛋 白酶、转铁蛋白、甲胎蛋白糖链岩藻糖基化。小扁豆凝集素(LCA)与岩藻糖有较 强的亲和力，只能分离提取糖链岩藻糖基化的α1-抗胰蛋白酶异质体、转铁蛋白 异质体、甲胎蛋白异质体。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶 的制备方法及试剂盒，本发明采用的技术方案如下：
一种具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将1-10g的活化琼脂糖凝胶6B移入砂蕊漏斗内，并采用0.1-100mM的HCl 溶液进行洗涤，待用；
将1-100mg的独角仙凝集素AlloA溶于1-20ml的偶联缓冲液，并与洗涤后 的琼脂糖凝胶6B进行合并，室温反应4h；
以10-500ml的偶联缓冲液洗去未经过偶联的独角仙凝集素AlloA，测定洗 涤液中的独角仙凝集素AlloA含量，计得偶联率为95％；
采用0.1-10mol/L的甘氨酸封闭琼脂糖凝胶6B剩余活化基团；
采用剂量为10-100mL、且浓度为0.01-0.2mol/L Tris-盐酸缓冲液洗涤封闭 后的琼脂糖凝胶6B 3次，得到偶联凝集素的琼脂糖凝胶6B。
进一步地，所述具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将2g的琼脂糖凝胶移入砂蕊漏斗内，并采用400mL 1mM的HCl溶液进行 洗涤，待用；
将10g的独角仙凝集素AlloA溶于5mL的偶联缓冲液，并与洗涤后的琼脂 糖凝胶进行合并，室温反应4h；
以20mL的偶联缓冲液洗去未经过偶联的独角仙凝集素AlloA，测定洗涤液 中的独角仙凝集素AlloA含量，计得偶联率为95％；
采用0.5mol/L的甘氨酸封闭琼脂糖凝胶6B剩余活化基团；
采用剂量为20mL、浓度为0.02mol/L的Tris-盐酸缓冲液洗涤封闭后的琼 脂糖凝胶6B 3次，得到偶联凝集素的琼脂糖凝胶。
优选地，所述ris-盐酸缓冲液内含有0.8mol/L的NaCl。
优选地，所述琼脂糖凝胶为经CNBr活化或环氧活化或NHS活化的琼脂糖 凝胶4B或脂糖凝胶6B或脂糖凝胶FF。
优选地，所述琼脂糖凝胶为琼脂糖凝胶6B。
进一步地，所述偶联缓冲液为凝集素的活性保护液；所述偶联缓冲液内含 有1mmol/L的CaCl2、1mmol/L的MgCl2、1mmol/L的MnCl2和20mmol/L的 Tris-HCL；所述偶联缓冲液的PH值为7.4。
一种采用具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶的制备方法制备的试剂盒，由上部 分离管和下部收集管组成；所述上部分离管装有偶联亲和素的亲合介质；所述 上部分离管的顶部设置有一滤膜；所述偶联亲和素为β-D-半乳糖苷特异性凝集 素；所述亲合介质为具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明巧妙的采用HCL对琼脂糖凝胶进行洗涤，其好处在于，在清洗 过程中保护琼脂糖凝胶的活性基团不降解，同时去除其他杂质。
(2)本发明巧妙地采用了独角仙凝集素AlloA并溶于偶联缓冲液，其中， 独角仙凝集素AlloA能特异性结合含有唾液酸(Sia)α2→6半乳糖(Gal)β1 →4N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基的正常转铁蛋白，把糖链缺失的糖缺失性 转铁蛋白分离提取出来，糖缺失性转铁蛋白为酒精性肝病的特异性标志物。
(3)本发明巧妙地采用清洗缓冲液洗去未偶联的独角仙凝集素AlloA，其 好处在于：洗去未偶联的独角仙凝集素AlloA，是为了去除未偶联的独角仙凝集 素AlloA竞争性结合正常转铁蛋白，导致偶联了独角仙凝集素AlloA的琼脂糖 凝胶不能捕获正常转铁蛋白，不能分离正常转铁蛋白和糖缺失性转铁蛋白。
(4)本发明采用甘氨酸封闭剩余活化基团，其好处在于：未反应完的活性 基团可以跟样本中的蛋白继续反应，把糖缺失性转铁蛋白结合到琼脂糖凝胶上， 从而不能分离，封闭剩余活化基团避免以上情况发生。
(5)本发明的亲和素为β-D-半乳糖苷特异性凝集素，其能与寡糖链中的 唾液酸(Sia)α2→6半乳糖(Gal)β1→4N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基 发生特异性结合，正常的转铁蛋白含有2个双天线糖链，其含有唾液酸(Sia) α2→6半乳糖(Gal)β1→4N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基，而糖缺失性转 铁蛋白缺失支链末端的唾液酸残基(SA)。
(6)本发明巧妙地采用了一层滤膜，其能阻挡偶联有凝集素的亲合介质穿 过而不阻挡液体和蛋白质穿过；
综上所述，本发明具有制备工艺简单、投入成本低廉、准确可靠等优点， 在糖缺失性转铁蛋白(CDT)试剂检测技术领域具有很高的实用价值和推广价 值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需使用 的附图作简单介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此 不应被看作是对保护范围的限定，对于本领域技术人员来说，在不付出创造性 劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为现有技术中的四唾液酸转铁蛋白的结构示意图。
图2为本发明的试剂盒的结构示意图。
图3为本发明中的CDT测试对比图。
上述附图中，附图标记对应的部件名称如下：
1、微量离心柱；2、滤膜；3、外管；4、偶联凝集素的琼脂糖凝胶；5、保 护缓冲液。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更为清楚，下面结合附图和实施例对 本发明作进一步说明，本发明的实施方式包括但不限于下列实施例。基于本申 请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的 所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例
如图2所示，本实施例提供了一种提取人血液样本中的糖缺失性转铁蛋白 (CDT)试剂盒，其由上部分离管和下部收集管组成，所述上部分离管装有偶 联亲和素的亲合介质，所述下部收集管中为收集糖缺失性转铁蛋白，所述分离 管底部有一滤膜，使得分离介质无法穿过的滤膜。
其中，本实施例的亲和素为β-D-半乳糖苷特异性凝集素，能与寡糖链中的 唾液酸(Sia)α2→6半乳糖(Gal)β1→4N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基 发生特异性结合，正常的转铁蛋白含有2个双天线糖链，其含有唾液酸(Sia)α2 →6半乳糖(Gal)β1→4N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基，而糖缺失性转铁 蛋白缺失支链末端的唾液酸残基(SA)。所述亲和素能特异性结合正常的转铁蛋 白，而不能结合糖缺失性转铁蛋白，包括独角仙凝集素AlloA、RCA凝集素及 其他能与β-连接的D-半乳糖具有特异性结合的凝集素。
本实施例的酒精性肝病的检测原理中：正常的转铁蛋白含有2个双天线糖 链，其含有唾液酸(Sia)α2→6半乳糖(Gal)β1→4N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc) 残基，酒精性肝病的糖缺失性转铁蛋白缺失支链末端的唾液酸残基(SA)。只有 能与β-D-半乳糖苷特异性结合的凝集素，能与寡糖链中的唾液酸(Sia)α2→6 半乳糖(Gal)β1→4N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基发生特异性结合，达到 分离转铁蛋白和糖缺失性转铁蛋白，提取糖缺失性转铁蛋白。例如独角仙凝集 素AlloA。
另外，小扁豆凝集素(LCA)不能与β-D-半乳糖苷特异性结合，其分离的是 岩藻糖基化的铁蛋白异质体及其他岩藻糖基化的蛋白异质体(如甲胎蛋白)， 不能区分正常转铁蛋白和糖缺失性转铁蛋白。故不能用于本技术用于糖缺失性 转铁蛋白分离提取，也不能用于酒精性肝病的诊断。且分离提取的程序也是不 一致的，小扁豆凝集素(LCA)是把需要的蛋白异质体结合而提取；独角仙凝集素 AlloA是把不需要的正常转铁蛋白结合保留在提取柱内，把糖基缺失的转铁蛋白 分离而提取。
在本实施例中，装有偶联凝集素的琼脂糖凝胶由以下步骤得到的：
本实施例采用经NHS活化的Sepharose 6B和独角仙凝集素AlloA，具体如 下：
(1)将2gSepharose 6B移入砂蕊漏斗，以400mL 1mM HCl洗涤；
(2)称取10mg独角仙凝集素AlloA，溶于5mL偶联缓冲液(0.1mol/L NaHCO3，0.8mol/L NaCl，pH 8.3)，与经洗涤的Sepharose 6B合并，室温反应4h；
(3)以20mL偶联缓冲液洗去未偶联的独角仙凝集素AlloA，测定洗涤液中 的独角仙凝集素AlloA含量，计得偶联率为95％；
(4)用0.5mol/L甘氨酸封闭剩余活化基因；
(5)用20mL 0.02mol/L Tris缓冲液(pH7.4，含0.8mol/L NaCl)洗涤3 次。
在本实施例中，将将偶联凝集素的琼脂糖凝胶0.5ml分装于微量离心柱中， 4℃暂存备用。
下面简要说明本试剂的使用过程：
(1)取糖缺失性转铁蛋白提取管，3000转离心10秒。
(2)将提取管取出，装入新的外管中，原外管及其中液体弃去。
(3)吸取血清100μl加入提取管介质上部，室温反应15分钟。
(4)盖上提取管盖子，3000转离心10秒，收集外管中洗脱的液体。
(5)外管中离心下来的液体即为含糖缺失性转铁蛋白(CDT)的样本，待 检。
本实施例为样本处理系统，提取液中含糖缺失性转铁蛋白(CDT)；样本中 的总转铁蛋白和提取液中的糖缺失性转铁蛋白(CDT)含量，采用转铁蛋白测定 试剂盒检测。
在本实施例中，糖缺失性转铁蛋白(CDT)计算：
CDT比率＝提取液CDT含量/样本中总转铁蛋白×100％。
结果判断：
阳性结果：糖缺失性转铁白(CDT)比率＞8％；
阴性结果：糖缺失性转铁白(CDT)比率≤8％。
为判断本发明糖缺失性转铁蛋白试剂与临床酒精性肝病检测结果的符合 率，取本实施例的试剂盒与德国西门子医学诊断产品有限公司Siemens HealthcareDiagnostics Products GmbH生产的糖缺失转铁蛋白测定试剂盒试 剂盒进行了对比检测实验。采用标本进行对比检测：20份已知酒精性肝病阳性 标本，20份体检健康血清。分别用本实施例的试剂盒与德国西门子医学诊断产 品有限公司Siemens HealthcareDiagnostics Products GmbH生产的糖缺失转 铁蛋白测定试剂盒试剂盒进行检测，结果见下表：
另外，本实施例特提供药监局的注册备案号为“粤穗械备20202088号”， 以佐证上述数据的真实可靠性；
在本实施例中，采用SPSS17.0软件，对本实施例与同类产品结果进行线性 回归分析，作出散点如图3所示，求得回归方程：Y＝0.0362+0.9968x，相关系 数r＝0.9934，r≥0.975满足临床标准要求。
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但 凡采用本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化， 均应属于本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将1-10g的活化琼脂糖凝胶6B移入砂蕊漏斗内，并采用0.1-100mM的HCl溶液进行洗涤，待用；
将1-100mg的独角仙凝集素AlloA溶于1-20ml的偶联缓冲液，并与洗涤后的琼脂糖凝胶6B进行合并，室温反应4h；
以10-500ml的偶联缓冲液洗去未经过偶联的独角仙凝集素AlloA，测定洗涤液中的独角仙凝集素AlloA含量，计得偶联率为95％；
采用0.1-10mol/L的甘氨酸封闭琼脂糖凝胶6B剩余活化基团；
采用剂量为10-100mL、且浓度为0.01-0.2mol/L Tris-盐酸缓冲液洗涤封闭后的琼脂糖凝胶6B 3次，得到偶联凝集素的琼脂糖凝胶6B。
2.根据权利要求1所述的一种具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将2g的琼脂糖凝胶移入砂蕊漏斗内，并采用400mL 1mM的HCl溶液进行洗涤，待用；
将10g的独角仙凝集素AlloA溶于5mL的偶联缓冲液，并与洗涤后的琼脂糖凝胶进行合并，室温反应4h；
以20mL的偶联缓冲液洗去未经过偶联的独角仙凝集素AlloA，测定洗涤液中的独角仙凝集素AlloA含量，计得偶联率为95％；
采用0.5mol/L的甘氨酸封闭琼脂糖凝胶6B剩余活化基团；
采用剂量为20mL、浓度为0.02mol/L的Tris-盐酸缓冲液洗涤封闭后的琼脂糖凝胶6B 3次，得到偶联凝集素的琼脂糖凝胶。
3.根据权利要求1或2所述的一种具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶的制备方法，其特征在于，所述ris-盐酸缓冲液内含有0.8mol/L的NaCl。
4.根据权利要求1或2所述的一种具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶的制备方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶为经CNBr活化或环氧活化或NHS活化的琼脂糖凝胶4B或脂糖凝胶6B或脂糖凝胶FF。
5.根据权利要求4所述的一种具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶的制备方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶为琼脂糖凝胶6B。
6.根据权利要求1或2所述的一种具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶的制备方法，其特征在于，所述偶联缓冲液为凝集素的活性保护液；所述偶联缓冲液内含有1mmol/L的CaCl2、1mmol/L的MgCl2、1mmol/L的MnCl2和20mmol/L的Tris-HCL；所述偶联缓冲液的PH值为7.4。
7.一种采用1～6任一项所述的具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶的制备方法制备的试剂盒，其特征在于，由上部分离管和下部收集管组成；所述上部分离管装有偶联亲和素的亲合介质；所述上部分离管的顶部设置有一滤膜；所述偶联亲和素为β-D-半乳糖苷特异性凝集素；所述亲合介质为具有偶联凝集素的琼脂糖凝胶。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210827 |