CN112708534A

CN112708534A - 一种生物反应载体及其制备方法

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Publication number: CN112708534A
Application number: CN202110076426.5A
Authority: CN
Inventors: 李勇; 吴斐然; 杜子谦; 段生宝; 王红梅; 陈晔洲; 丁少华; 魏双施; 田晶晶
Original assignee: Ji Hua Laboratory
Current assignee: Ji Hua Laboratory
Priority date: 2021-01-20
Filing date: 2021-01-20
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2041-01-20
Also published as: CN112708534B

Abstract

本发明公开一种生物反应载体及其制备方法，所述生物反应载体的制备方法，包括以下步骤：对蚕茧进行脱胶处理；将蚕茧用打浆机进行打浆，得到蚕丝浆；在蚕丝浆中加入分散剂，使用纸页成型机得半成品蚕丝膜；在真空、高温条件下抄造成生物反应载体。所述生物反应载体由天然蚕丝经造纸工艺制成，具有多层多孔的特点，并能特异性结合单克隆抗体。

Description

一种生物反应载体及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，主要涉及一种生物反应载体及其制备方法。

背景技术

生物反应载体在分子、免疫生物学实验技术和生物配子配体（抗原抗体和互补基因）检测方面起到了至关重要作用，生物反应载体的研究对生物学检测技术发展和应用具有重要意义。

目前，生物医学所采用的反应载体均为化学合成和修饰的高分子材料或纳米材料，其不仅可以连接蛋白质物质（如抗原、抗体等），还可以连接核酸类物质，与相应的配子配体反应后，即可通过指示物指示待检测标本中的目标分子及其含量。常用的生物反应载体主要是通过化学合成手段获得，包括微孔板、微珠及硝酸纤维素膜（NC膜）等。国外体外诊断试剂生产企业，如美国Magsphere公司、丹麦Nunc公司、德国Merck公司等，围绕上述反应载体建立了相关的核心技术平台，并开发了大量的检测试剂。

然而生物配子配体与上述反应载体的结合存在杂乱无序、低效率的缺陷，其根源在于包被的蛋白成分是通过非特异性吸附方式、无序的固定在反应载体表面，降低了后续生物反应过程中抗原、抗体结合效率，直接影响了分子、免疫生物学实验技术的敏感性、准确性和实用性。因而，开发一种能特异性结合配子/配体的高性能生物反应载体是一个崭新而又重要的发展趋势。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种生物反应载体及其制备方法，旨在解决现有生物反应载体与配子配体的结合存在低效率的问题。

本发明的技术方案如下：

一种生物反应载体的制备方法，其中，包括以下步骤：

对蚕茧进行脱胶处理；

加水，将蚕茧用打浆机进行打浆，得到蚕丝浆；

在蚕丝浆中加入分散剂，加水，使用纸页成型机得半成品蚕丝膜；

在真空、高温条件下抄造成生物反应载体。

所述的生物反应载体的制备方法，其中，所述生物反应载体的制备方法，还包括以下步骤：

在生物反应载体上偶连鼠源单克隆抗体。

所述的生物反应载体的制备方法，其中，偶连鼠源单克隆抗体过程具体如下：

在生物反应载体上加入加终浓度为15-25μg/mL鼠源单克隆抗体，室温振荡反应1-4小时后，1-5℃孵育过夜。

所述的生物反应载体的制备方法，其中，所述生物反应载体的制备方法中，每60-100g蚕茧加入20L水，每1L蚕丝浆加1-3L水，分散剂的添加量为蚕丝浆重量的0.5%-1%。

所述的生物反应载体的制备方法，其中，所述分散剂为羟乙基纤维素、拉米夫定中间体、聚氧化乙烯中的一种或两种以上混合物。

所述的生物反应载体的制备方法，其中，所述打浆过程包括以下步骤：

用瓦利打浆机进行打浆，刀片负重4.3kg-9.8kg，打浆时间360s-540s，打浆度25°SR-30°SR。

所述的生物反应载体的制备方法，其中，使用纸页成型机得半成品蚕丝膜的过程为将蚕丝浆搅拌分散均匀，排水，待表面液体排干后，使用真空脱水制得半成品蚕丝膜；

所述抄造的条件为压力6psi-12psi，温度90-110℃，时间5min-10min。

所述的生物反应载体的制备方法，其中，所述脱胶处理包括以下步骤：

将蚕茧浸泡在质量浓度为3-5%的碳酸钠溶液中，在80℃-100℃条件下搅拌洗涤30min-60min；将蚕茧捞出，再浸泡在质量浓度为3-5%的碳酸钠溶液中，在80℃-100℃条件下搅拌洗涤30min-45min；纯净水冲洗至少一次。

取蚕茧，用水清洗浸泡0.5-3h，水浴50-70℃，1-3h；

将蚕茧浸泡在pH为7.2-7.4的混合缓冲液中，洗涤搅拌20~50min；其中，每克蚕茧加入4-8mL混合缓冲液；

加入甘油和酶的混合液，25-37℃下边搅拌边孵育20~50min；其中，每升混合缓冲液按20%-50%体积比加入的甘油、酶混合液；

加入蛋白酶抑制剂，作用3~10min，过滤蚕茧，去除滤液，用纯水洗涤蚕茧，得脱胶蚕茧；其中，每升混合缓冲液加入2-10克的蛋白酶抑制剂；

其中，所述pH为7.2-7.4的混合缓冲液为浓度为0.01M的PBS缓冲液、浓度为0.01M的tris-Hcl缓冲液、浓度为0.01M的硼酸盐缓冲液的混合缓冲液；

所述甘油和酶的混合液，按照质量份数计，组成如下：

甘油10-40份，脂肪酶10-20份，木瓜蛋白酶5-20份。

一种生物反应载体，其中，采用如上所述的生物反应载体的制备方法制备得到。

有益效果：本发明提供了一种生物反应载体及其制备方法，所述生物反应载体由天然蚕丝经造纸工艺制成，具有多层多孔的特点，并能特异性结合单克隆抗体。

附图说明

图1为实施例1的生物反应载体的电镜图。

图2为实施例2的生物反应载体的电镜图。

图3为未经处理蚕茧的电镜图。

图4为生物反应载体结合鼠源单克隆抗体的检测比色卡。

图5为不同载体间接Elisa法检测不同浓度梯度鼠源单克隆抗体的结果图。

图6为不同载体间接Elisa法检测不同浓度梯度鼠源单克隆抗体的结果图。

具体实施方式

本发明提供一种生物反应载体及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供一种生物反应载体的制备方法，所述生物反应载体由天然蚕丝经造纸工艺制成，具有多层多孔的特点，并能特异性结合单克隆抗体。

具体地，所述生物反应载体的制备方法，包括以下步骤：

对蚕茧进行脱胶处理；

加水，将蚕茧用打浆机进行打浆，得到蚕丝浆；其中，每60-100g蚕茧加入20L水；

在蚕丝浆中加入分散剂，加水，使用纸页成型机得半成品蚕丝膜；其中，每1L蚕丝浆加1-3L水；

在真空、高温条件下抄造成生物反应载体。

其中，所述脱胶处理可以包括以下步骤：

将蚕茧浸泡在质量浓度为3-5%的碳酸钠溶液中，在80℃-100℃条件下搅拌洗涤30min-60min；将蚕茧捞出，再浸泡在质量浓度为3-5%的碳酸钠溶液中，在80℃-100℃条件下搅拌洗涤30min-45min；纯净水冲洗3次。

本发明中还提供一种更为优选地脱胶处理方法，包括以下步骤：

取适当蚕茧，用水清洗浸泡0.5-3h，水浴50-70℃，1-3h，浸泡洗涤去除蚕茧表面杂质；

加入蛋白酶抑制剂PMSF，作用3~10min，过滤蚕茧，去除滤液，用纯水洗涤蚕茧3次后，得脱胶蚕茧；其中，每升混合缓冲液加入2-10克的蛋白酶抑制剂。所述蛋白酶抑制剂用于抑制木瓜蛋白酶，防止木瓜蛋白酶损伤蚕丝纤维。

其中，所述pH为7.2-7.4的混合缓冲液为浓度为0.01M的PBS缓冲液、浓度为0.01M的tris-Hcl缓冲液、浓度为0.01M的硼酸盐缓冲液的混合缓冲液。采用这种混合缓冲液，可以更好地维持纤维形态，保证蛋白酶活性，且能更好地将杂质分离。

所述甘油和酶的混合液，按照质量份数计，组成如下：

甘油10-40份，脂肪酶10-20份，木瓜蛋白酶5-20份。

甘油用于保护酶活性，维持酶的作用活性，避免不利条件，如温度、pH等变化带来损失，保证杂质的去除效果。

采用以上试剂和方法处理蚕茧，得到的蚕茧脱胶效果好，蚕丝表面圆润光滑、无杂质，不会损伤丝素、降低纤维强伸度等物理性能，可以提供更多的蛋白偶联位点，更好地保护偶联的生物活性成分。

所述打浆过程包括以下步骤：

用瓦利打浆机进行打浆，刀片负重4.3kg-9.8kg，打浆时间360s-540s，打浆度25°SR-30°SR，经过打浆后蚕丝浆中蚕丝的纤维长度为0.1mm-5mm。

在此步骤中，用打浆机以物理方法处理蚕茧，用打浆机的剪切力与纤维之间的摩擦力适当切断蚕丝的天然长纤维，制备短纤维原料。而且，在打浆过程中，蚕丝纤维吸水润胀变软，可以提高柔软性与可塑性。

所述分散剂为羟乙基纤维素、拉米夫定中间体、聚氧化乙烯中的一种或两种以上混合物。在本发明实施例方案中，分散剂的添加量为蚕丝浆重量的0.5%-1%。加入分散剂有利于蚕丝均匀地分布在体系中，使抄造得到的生物反应载体厚度均匀。

使用纸页成型机得半成品蚕丝膜的过程为将蚕丝浆搅拌分散均匀，快速排水，待表面液体排干后，使用真空脱水50s制得半成品蚕丝膜。

所述生物反应载体的制备方法，还包括以下步骤：

在生物反应载体上偶连鼠源单克隆抗体：加终浓度为15-25μg/mL鼠源单克隆抗体，室温振荡反应1-4小时后，1-5℃孵育过夜。

所述生物反应载体是由蚕丝膜制成，蚕丝膜主要成分是蚕丝蛋白，可以跟相应的抗体结合。制备基于蚕丝膜成分的鼠源单克隆抗体可与蚕丝膜通过抗原抗体结合，成为功能化多层的生物反应载体，可偶联任何鼠源抗体作为检测捕获抗体，之后用于免疫检测等方面。

鼠源单克隆抗体的制备过程为本领域常规技术手段，可以取蚕丝蛋白抗原、羟乙基纤维素抗原、拉米夫定中间体抗原、聚氧化乙烯抗原一种或多种混合免疫小鼠，取小鼠脾细胞，与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，获得稳定的杂交瘤细胞细胞株。将该细胞接种小鼠腹腔并制备腹水，从腹水中提取特异性的鼠源单克隆抗体。

本发明中将造纸抄造技术转用到生物反应载体的制备中，使生物反应载体的制备方法大大简化，且生物反应载体可根据需要通过调节蚕丝浆液的蚕丝含量、抄造压力来调节厚度、孔隙率，使生物反应载体可以用作不同功能的反应载体。而且，制备得到的生物反应载体还具备以下优点：

1. 表面具有丰富的蛋白偶联位点可与抗原抗体特异性结合，克服传统方法非特异性结合、包被无序、效率低的缺点；

2. 具有多层孔隙膜结构，比表面积大，与反应物结合表面积远大于现有载体，大大增强了检测敏感性；

3. 使用天然蚕丝为原材料，其中丝素蛋白成分对偶联的生物活性成分有具有良好的保护作用，试剂稳定性更好；

4. 原料来源不受限制，成本低廉。

因此，本发明中还提供一种生物反应载体，所述生物反应载体采用如上所述的生物反应载体的制备方法制备得到。进一步地，所述生物反应载体孔径大小为50nm-200nm，孔隙率为1%-3%，厚度为0.2mm±0.02mm。

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

取适当50g蚕茧，浸泡在质量浓度为3%的碳酸钠溶液中，在100℃条件下搅拌洗涤30min；将蚕茧捞出，再浸泡在质量浓度为3%的碳酸钠溶液中，在100℃条件下再次搅拌洗涤30min；将蚕茧捞出，纯净水冲洗3次。

取50g脱胶蚕茧加入10L水，加入瓦利打浆机进行打浆，刀片负重9.8kg，打浆时间480s，打浆度28°SR。

在10L的蚕丝浆中加入50.25g羟乙基纤维素，将蚕丝浆加入至纸页成型器的搅拌容器中，气动搅拌20s及手动搅拌10s使纤维均匀分布，快速排水，待表面液体排干后，使用真空脱水50s制得半成品蚕丝膜。最后在干燥箱中100℃，压力12psi、时间5min真空高温抄造成蚕丝膜，即所述生物反应载体。

实施例2：

取适当50g蚕茧，用水清洗浸泡1h，水浴60℃，2h，浸泡洗涤去除蚕茧表面杂质。将浓度为0.01M、pH为7.2的PBS缓冲液、浓度为0.01M、pH为7.2的tris-Hcl缓冲液、浓度为0.01M、pH为7.2的硼酸盐缓冲液按照1:1:1的体积比混合制成混合缓冲液。将上述蚕茧用300ml混合缓冲液浸泡，洗涤搅拌30min。加入120ml甘油和酶的混合液，30℃下边搅拌边孵育30min。所述甘油和酶的混合液，按照质量份数计，组成包括甘油40份，脂肪酶20份，木瓜蛋白酶20份。加入1.8g蛋白酶抑制剂PMSF，作用5min后，过滤蚕茧，去除滤液，用纯水洗涤3次后，悬浮于水中，得脱胶蚕茧。

取50g脱胶蚕茧加入10L水，加入瓦利打浆机进行打浆，刀片负重9.8kg，打浆时间480s，打浆度28°SR，得蚕丝浆。

在10L蚕丝浆中加入50.25g羟乙基纤维素，混合均匀后，加入11L水，将蚕丝浆加入至纸页成型器的搅拌容器中，气动搅拌20s及手动搅拌10s使纤维均匀分布，快速排水，待表面液体排干后，使用真空脱水50s制得半成品蚕丝膜。最后在干燥箱中100℃，压力12psi、时间5min真空高温抄造成蚕丝膜，即所述生物反应载体。

观察实施例1和实施例2得到的生物反应载体形态，图1为实施例1的生物反应载体的电镜图，图2为实施例2的生物反应载体的电镜图，图3为未经处理蚕茧的电镜图。经过对比可以看出，采用本实施例2的处理方式最温和，脱胶效果好，蚕丝表面圆润光滑、无杂质，且具备天然蚕茧的膜渗透性、孔隙率、膜孔径等，且不会损伤丝素、降低纤维强伸度等物理性能。

实施例3

一、鼠源单克隆抗体的制备过程：

（1）小鼠免疫：天然蚕茧使用液氮研磨成粉末，无菌生理盐水稀释至0.5mg/ml，背部两地加腹腔注射入Balb/c小鼠，首次间隔10-14天后继续免疫，之后持续免疫3次，每次间隔1周。融合前2-3天经鼠尾静脉加强免疫。

（2）细胞融合：

取免疫后的小鼠脾脏，制备脾细胞悬液和培养好的NS1骨髓瘤细胞混合。采用50%PEG 4000作融合剂，将小鼠脾细胞和NS1骨髓瘤细胞进行融合。融合细胞悬于含20%新生牛血清的选择培养基内培养数日。

（3）克隆筛选：

将蚕丝蛋白用碳酸盐缓冲液稀释至10μg/ml，包被酶标板100μL/孔。4℃过夜。次日用磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤5次。加入待检的细胞培养上清，37℃孵育后采用间接ELISA法进行检测。Cutoff值设为阴性对照值的2.1倍，高于Cutoff值为阳性结果。选取检测结果阳性孔内的融合细胞经有限稀释法进行多次单克隆培养。待单细胞生长成亚克隆后再进行测定，阳性克隆扩大后液氮冷冻保存。

（4）单抗制备及纯化

培养经克隆筛选的杂交瘤细胞株，注射至经致敏的小鼠腹腔内，每只约10⁶-10⁷个细胞。观察小鼠腹腔，并在约5~10天内采集小鼠腹水。取小鼠腹水，边搅拌边缓慢加入等比例的饱和硫酸铵溶液，搅拌1h 后4℃静置过夜。次日将已沉淀的小鼠腹水离心，收集沉淀并用少量生理盐水溶解。然后采用G-25凝胶层析柱去除其中的硫酸铵。继续采用DEAE-52阴离子交换层析柱纯化单抗，并用不同浓度的NaCl溶液洗脱。采用 SDS-PAGE电泳和间接ELISA法进行纯化抗体的纯度和效价测定。获得鼠源单克隆抗体。

二、在生物反应载体上偶连鼠源单克隆抗体：

取实施例2制备得到的生物反应载体与蚕丝单克隆抗体反应结合，具体步骤为：将生物反应载体裁剪成8mm的圆形膜，向加入圆形膜中加入终浓度20μg/mL的鼠源单克隆抗体，室温振荡反应2小时后在4℃下孵育过夜。

检测步骤：用酶标二抗检测，用PBST洗涤四次后，加入沉淀性TMB底物，完全显深紫色，其颜色深度为图4比色卡的左起第一个圆形膜的颜色深度，说明本次结合成功。

以鼠源单克隆抗体CS 2H3为实验组，以HIV Ag3为无关抗体阴性对照组，以PBS缓冲液为空白对照组，分别加入蚕茧主要成分进行反应，进行Elisa检测OD450值，结果如表1所示，说明制备所得CS 2H3(鼠源单克隆抗体)能与蚕茧主要成分特异反应。

表1

	丝素	蚕丝抗原	丝胶蛋白
				CS 2H3(鼠源单克隆抗体)	0.721	1.265	1.828
HIV Ag3（无关抗体阴性对照）	0.117	0.098	0.112
				PBS（空白）	0.137	0.078	0.105

三、在生物反应载体上偶连鼠源单克隆抗体：

以NC膜为对照组，以实施例2的生物反应载体为实验组，以空白酶标板为空白对照组，间接Elisa法检测不同浓度梯度鼠源单克隆抗体。

检测抗体结果如图5-6所示，图5中从左起第1-2列为放置了NC膜，第3-4列为放置了生物反应载体，第5-6列为空白酶标板；图6中从左起第1列为放置了NC膜，第2列为放置了生物反应载体，第3列为空白酶标板；图5和图6中，鼠源单克隆抗体的浓度为2倍稀释，由上至下依次递减，浓度分别为5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml、0.15625μg/ml、0.078125μg/ml、0μg/ml （PBS缓冲溶液）。

从图5和图6可以看出，实施例2的生物反应载体与鼠源单克隆抗体特异结合能力明显强于其他载体。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种生物反应载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

对蚕茧进行脱胶处理；

加水，将蚕茧用打浆机进行打浆，得到蚕丝浆；

在真空、高温条件下抄造成生物反应载体。

2.根据权利要求1所述的生物反应载体的制备方法，其特征在于，所述生物反应载体的制备方法，还包括以下步骤：

在生物反应载体上偶连鼠源单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的生物反应载体的制备方法，其特征在于，偶连鼠源单克隆抗体过程具体如下：

4.根据权利要求1所述的生物反应载体的制备方法，其特征在于，所述生物反应载体的制备方法中，每60-100g蚕茧加入20L水，每1L蚕丝浆加1-3L水，分散剂的添加量为蚕丝浆重量的0.5%-1%。

5.根据权利要求1所述的生物反应载体的制备方法，其特征在于，所述分散剂为羟乙基纤维素、拉米夫定中间体、聚氧化乙烯中的一种或两种以上混合物。

6.根据权利要求1所述的生物反应载体的制备方法，其特征在于，所述打浆过程包括以下步骤：

7.根据权利要求1所述的生物反应载体的制备方法，其特征在于，使用纸页成型机得半成品蚕丝膜的过程为将蚕丝浆搅拌分散均匀，排水，待表面液体排干后，使用真空脱水制得半成品蚕丝膜；

8.根据权利要求1所述的生物反应载体的制备方法，其特征在于，所述脱胶处理包括以下步骤：

9.根据权利要求1所述的生物反应载体的制备方法，其特征在于，所述脱胶处理包括以下步骤：

取蚕茧，用水清洗浸泡0.5-3h，水浴50-70℃，1-3h；

所述甘油和酶的混合液，按照质量份数计，组成如下：

甘油10-40份，脂肪酶10-20份，木瓜蛋白酶5-20份。

10.一种生物反应载体，其特征在于，采用如权利要求1~9任一所述的生物反应载体的制备方法制备得到。