JPH05505722A - 酵素脱リグニン活性を示す製剤、その産生方法及びその適用 - Google Patents

酵素脱リグニン活性を示す製剤、その産生方法及びその適用

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JPH05505722A JP91502633A JP50263391A JPH05505722A JP H05505722 A JPH05505722 A JP H05505722A JP 91502633 A JP91502633 A JP 91502633A JP 50263391 A JP50263391 A JP 50263391A JP H05505722 A JPH05505722 A JP H05505722A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素活性を示す製剤、即ち、少なくとも６５℃の温度及び少なくとも ９のｐＨで木材）くルプを脱リグニン化する（ｄａｌｉｇｎＮｙｉｎｇ）能力を 有する製剤に関する。更に、本発明は選択されたバチルス・ステアロサーモフィ ルス（Ｂａｃｉｌｌａ＋　ｓｔｅａｒｏｊｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株を好気的 に醗酵させることによる上記製剤の産生方法に関する。
更に、本発明は２種の単離されたバチルス・ステアロサーモフィルス株並びにそ れらの突然変異株及び変異体に関する。本発明は本発明の製剤の適用、即ち本発 明の製剤による木材パルプの処理からなるプロセス、本発明の製剤で処理された 木材パルプ及び毛羽パルプ並びに本発明の製剤で処理された木材パルプから得ら れるペーノクー、ボード及び毛羽にも関する。
背　景 パルプ及びペーパー産業において脱リグニン化及び漂白プロセスにおける化学物 質の使用を減らすために多大な努力が行われているが、その理由は漂白植物から の排出液中におけるこのような化学物質、特に有機塩素化合パルプ化及び漂白に おいて化学物質の使用を減らすための１つのアプローチはリグニン分解微生物の 使用に関するものであった。リグニン分解又はリグニン改質酵素も示唆された。
リグニン生物分解の包括的総説はＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｙｉｅｖ＋”　ｉｎ　 Ｂｉｏ＋ｅｃｈｎｏｌｏｇ７．ｙｏｌ、６．　ｌ５ｓｕｅ　１．１９８７．ｐｐ 、　１−６０．　Ｅｄ、５ｔｅｖａｒｔ、　Ｇ、　Ｇ、及びＲｕ５ｓｅｌｌ、　 １．、ＣＲＣ［’＋ｅｓ＋。
Ｉｎｃ、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏ「ｉｄａ　で公表された。
もう１つのアプローチはヘミセルロース結合を壊すためにヘミセルラーゼを用い ることによるリグニンの除去に関するものであった。Ｄｅｋｋｅ＋、　Ｒ，Ｆ、 　Ｈ，及びＲｉｃｈｚ＋ｄｓ。
Ｇ、　Ｎ、によるヘミセルラーゼの総説論文＝　［それらの産出、精製、性質及 び作用様式」はＡｄｙａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃａ＋ｈｏｈ７ｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍ ｉｓｔＢ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ＋ｊｒ７．ｔｏｌ、３２．１９７６、ｐｐ 、　２７７−３５２で公表された。
ヘミセルラーゼの中では、キシラナーゼが生物パルプ化及び生物漂白用に最も注 意を引いた１つである。フランス特許出願第２，５５７．８９４号明細書ではい かなるセルラーゼ活性も有さすにキシラナーゼを含有した酵素溶液による紙パル プの処理について開示している。その処理は２０−６０℃、特に４０℃で行われ 、実施例６ではｐＨが５であるべきことを示している。しかしながら、ペーパー 及びパルプ産業では経済的理由及び簡便性のためにより高い温度及びより高いｐ Ｈで木材パルプを処理することに関心があるが、その理由は一部の確立された漂 白プロセスが６５℃を超えた温度及び９を超えたｐＨで行われるからである。
我々の知識によれば、酵素活性を示しかつ少なくとも６５℃の温度及び少なくと も９のｐＨで木材パルプを脱リグニン化する能力を有する製剤による木材パルプ の処理については誰も報告していない。
発明の説明 本発明は製剤が少なくとも６５℃の温度及び少なくとも９のｐＨで木材パルプを 脱リグニン化する能力を有するような酵素活性を示す製剤を提供する。
本明細書及び添付された請求の範囲において、“木材パルプ”という表現は広義 に解釈され、このためそれは各種のリグノセルロース物質を含めた意味である。
本発明の一面は酵素活性を示す製剤に関するが、その製剤は寄託株ＮＣＩＭＢ４ ０２２１及びＮＣＩＭＢ４０２２２並びに上記法ＮｃｒＭＢ４０２２１及びＮＣ ｒＭＢ４０２２２と実賀上同−の上記製剤産生能力を有するそれらの突然変異株 及び変異体から選択されるバチルス・ステアロサーモフィルス株の適切な培地に おける好気性醗酵により得られ、上記製剤は少なくとも６５℃の温度及び少な（ とも９のｐＨで木材パルプを脱リグニン化する能力を有する。本発明のこの面の −・態様において、その製剤はバチルス・ステアロサーモフィルス株ＮＣＩＭＢ ４０２２２の突然変異株の、炭素源としてグルコースを含む適切な培地における 好気性醗酵により得られる。もう１つの態様において、本発明による製剤は下記 アミノ酸配列：　−Ｌｙ＋−Ａｓｎ−Ａｌａ−人＋ｐ−５ｅｔ−７７＋−Ａｌａ −Ｌｙｓ−Ｌ７ｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｔ−［１ｅ−３ｅｔ−＾１ａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ −Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−人５ｎ−Ｇｌｎ−人Ｂ−ＴＨ−Ｌｙｓ−人 ＋ｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈ＋−１１ｅ−Ｇ１７−Ａｌａ−Ａｌａ４ａｌ−Ｇｌ ｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−＾ｓｎ−又はそのホモログを含 有した酵素を含むが、完全な酵素は木材パルプ培地で酵素活性を示す。この関係 において、上記アミノ酸配列のホモログとは木材パルプ培地において完全酵素の 酵素活性の消失を生じない一部アミノ酸の置換え、伸長又は欠失を有した相同的 配列である。更に、上記アミノ酸配列のホモログは上記配列から誘導されるいず れかのＤＮＡ又はＲＮＡプローブにより認識されるヌクレオチドレベルにおいて 十分相同的であればいかなる配列であってもよい。本発明のこの面の更にもう１ つの態様において、製剤は清澄化された培養ブロスである。本発明のこの面の更 にもう１つの態様において、製剤は木材パルプ培地において酵素活性を示す培養 ブロスの部分的精製分画である。部分的精製分画は硫酸アンモニウム沈降で得ら れる。本発明のこの面のもう１つの態様において、製剤は陽イオン交換体の使用 で得られる清澄化培養ブロスの高度精製分画であり、その分画は木材バルブ培地 において酵素活性を示すキシラナーゼの形である。１つの具体的な態様において 、キシラナーゼはＳＤＳ　ＰＡＧＥ及びゲル濾過で決定された大体の分子量４１ ０００〜４２０００ドルトンを有し、下記の大体のアミノ酸組成がアミノ酸分析 により分子量たりのアミノ酸残基として決定された：　ＡＳＩ　５ｇ：Ｔｈ＋　 １２；　Ｓｅｔ　１０；Ｇｌ！４４；Ｐｒｏ　２４：Ｇｌｙ　２１）：Ａ！ｉ　 ３０；Ｃｙｓ　ｌ：Ｖａｌ　１８；Ｍｅｔ　２；ｌｉｔ　２６：Ｌｅｕ　１４： Ｔｙ＋２２；Ｐｈｅ　１６；Ｌｙｓ　３８＋Ｈｉａ　６：Ａ＋ｇ　１２゜本発明 のもう１つの面は、株ＮＣＩＭＢ４０２２１及びＮＣＩＭＢ４０２２２並びに上 記法ＮＣＩＭＢ４０２２１及びＮＣＩＭＢ４０２２２と実質上同一の上記製剤産 生能力を有するそれらの突然変異株及び変異体から選択されるバチルス・ステア ロサーモフィルス株が適切な培地において好気性醗酵に付され、上記製剤が少な くとも６５℃の温度及び少なくとも９のｐＨで木材パルプを脱リグニン化する能 力を有することを特徴とする、酵素活性を示す製剤の産生方法に関する。本発明 による方法の具体的な態様において、バチルス嫌ステアロサーモフィルス株ＮＣ ＩＭＢ４０２２２の変異株は炭素源としてグルコースを含む適切な培地において 好気性醗酵に付される。本発明のこの面のもう１つの態様において、醗酵ブロス は場合により遠心で清澄化される。更にもう１つの態様において、清澄化された 醗酵ブロスは少なくとも６５℃の温度及び少なくとも９のｐＨで木材パルプ培地 中において酵素活性を示す上記清澄化培養ブロスの部分的精製分画を得るため硫 酸アンモニウム沈降及び場合により液体培地中において再懸濁に付される。本発 明による方法のもう１つの態様において、清澄化された醗酵プロスは少なくとも ６５℃の温度及び少なくとも９のｐＨで木材パルプ培地中において酵素活性を示 すキシラナーゼの形で高度精製分画をを得るため陽イオン交換体を用いて精製及 び濃縮される。
本発明の更にもう１つの面は単離されたバチルス・ステアロサーモフィルス株Ｎ ＣＩＭＢ４０２２１及びＮＣＩＭＢ４０２２２並びにそれらの突然変異株及び変 異体に関するが、上記変異株及び変異体は上記株ＮＣＩＭＢ４０２２１及びＮＣ ＩＭＢ４０２２２と実質上同一の酵素活性発現製剤産生能力を有し、上記製剤は 少なくとも６５℃の温度及び少なくとも９のｐＨで木材パルプを脱リグニン化す る能力を有する。
本発明の更にもう１つの面は、木材パルプが本発明による製剤で少なくとも１ス テツプにおいて処理されることを特徴とする木材パルプの処理からなるプロセス に関する。本発明のこの面の一態様において、処理される木材パルプは硫酸塩パ ルプである。もう１つの態様において、処理される硫酸塩パルプは特に脱リグニ ン化された硫酸塩パルプである。本発明のこの面の更にもう１つの態様において 、処理される部分的脱リグニン化硫酸塩パルプは酸素脱リグニン化硫酸塩パルプ である。木材パルプの処理を含むプロセスは、適切には少なくとも９のｐＨを有 する培地において少なくとも６５℃の温度で行われる。
本発明のもう１つの面は本発明による製剤で少なくとも１ステツプにおいて処理 された木材パルプから得られる産物に関する。このため、本発明のこの面は本発 明による製剤で少なくとも１ステツプにおいて処理された木材パルプ及び毛羽パ ルプ並びに本発明による製剤で少なくとも１ステツプにおいて処理された木材パ ルプから得られるペーパー、ボード及び毛羽からなる。
本発明のもう１つの面は下記アミノ酸配列についてコードするヌクレオチド配列 を認識するＤＮＡ又はＲＮＡプローブに関するニ ーＬ７ｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−人５ｐ−３ｅｔ−Ｔ７＋−Ａｌａ−Ｌ７ｓ−Ｌ７＋ −Ｐｒｏ−１（ｉｓ−１１ｅ−３ｅ　ｔ−Ａｌ　ｚ−Ｌｅａ−Ａｓ　ｎ−Ａ　ｌ 　ａ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔ７ｒ−Ｌ７ 　＋−Ａｓｎ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈ　ｒ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｇ　ｌ　７−Ａｌ ｉ−ＡＩｉ４ｉ　１−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−７７＋−ＧＩｎ−Ｌｓｕ−Ｇｌｎ−Ａｔ ｎ−更に、本発明の一面は下記アミノ酸配列ニーＬ７　ｌ−Ａｇｎ−Ａ　ｌ　ｔ −Ａｓ　ｐ−９ｅ　ｒ−Ｔ７　ｒ−Ａ　ｌ　ｘ−Ｌ７ｓ−Ｌ７ｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｈ ｉ　ｓ−１１！−３ｅｔ−Ａｌ　ｔ−Ｌｅｕ−Ａｓ　ｎ−Ａ　Ｉ　５−Ｐｒ　ｏ −Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅａ−Ａｔｎ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｔ７　ｒ−Ｌｙ＋−＾１ｎ−Ｇ ｌ　ａ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｈｒ−［１ｅ−Ｇ　ｌ　７−Ａ　ｌ　１−Ａｌａ−Ｖｌ　 １−Ｇｌｕ−Ｐ　ｒｏ−７７＋−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−と結合する 抗体に関する。本発明のこれら最後の２つの面は少なくとも６５℃の温度及び少 なくとも９のｐＨで木材パルプを脱リグニン化する能力を有する酵素の発見に有 用である。
熱安定性酵素産生生物の単離 生物源はコースナス、ガブル、スウェーデン（Ｋｏｚｎａｓ、　Ｇ１ｙ１６．　 Ｓｗｅｄｅｎ）のパルプ及びぺ−ｔ＜−ミルにおける水処理プールから採取され た水及び泥サンプルであった。富化培地（ＸＭ）はｐＨ７，０で０．０１％酵母 エキス、０．０４％トリプトン及び０．２％キシランを含有していた。ｐＨ８， １及び９．６の同培地は更にＮ　ａ　２　Ｃ０３を含有していた。水及び泥サン プルをＸＭ培地に加え、６５℃で好気的に培養した。培養物からのサンプルを２ 〜３日毎に新鮮培地に移した。４回の移転後、培養物からのサンプルを希釈し、 ＸＭ寒天プレート（２％寒天含有ＸＭ）上に拡散した。
３回の独立した富化操作後、３０株を単離したが、それはＸＭ寒天プレート上６ ５℃で増殖することができた。
単離物はｐＨ９，６のＸＭ培地から得られなかった。
３０単離物中１０はコロニー周囲に透明ゾーンを形成したが、これはそれらがｔ ｌＢ＃１外キシラナーゼを産生ずることを示唆している。これら１０単離物のう ち２つ（株Ｔ２及びＴ６）を寄託のために選択した。
微生物の寄託 ２つの株、即ちバチルスｓｐＴ　−２及びバチルスｓｐＴ　−６をブダペスト条 約に従い１９８９年１１月８日付でアバディーンのナショナル瞭コレクションズ ・オブ・インダストリアル−アンド嗜マリン・バクテリアＬ１ｄ（ｌｌｘｔｉｏ ｎａｌ　Ｃｏ１１ｅＮｉｏｎ＋　ｏｆ　Ｉｎｄｕ＋＋＋ｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒ ｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｌｔｄ：ｌＪｃｌＭＢ）に寄託した。付与された受 託番号は株Ｔ−２及びＴ−５に関して各々ＮＣＩＭＢ４０２２１及びＮＣＩ　Ｍ 　Ｂ　４０２２２であった。
株Ｔ２及びＴ６の識別 株Ｔ２及びＴ６は好気性、ダラム陽性、６５℃で増殖できる胞子形成桿状体であ る。これらの株は下記試験結果に基づきＮ　ＣＩ　Ｍ　Ｂによると異なるバチル ス・ステアロサーモフィルス株であると考えられる：バチルス−二次段階試験 ８℃２楕円形又は円柱形；Ｓ９球形又はほぼそれに近い：ｂｃ、中央：Ｔ、末端 又は末端近＜；ＣＴ、中央〜末端；０グルコース寒天上；　ｄペプトン・ウエー ト（Ｗλｔｅ）糖。
、　Ｒ アンドレード（Ａｎｄ＋ａｄｅ）の指示薬、　−限定的味Ｔ２及びＴ６の脂肪酸 組成 好熱キシラナーゼ陽性単離物Ｔ２及びＴ６は脂肪酸組成に関してＵＳＡ、ＤＥ、 ニューアークのマイクロビアルＩＤ社（Ｍｉｅ＋ｏｂｉａｌ　ＩＤ、ＩＮｃ）に 送られた。受は取った結果は下記のとおりであった： キシラナーゼ陽性好熱菌の脂肪酸組成（％）株Ｔ２及びＴ６の増殖特性並びに培 養株からの濃縮粗製上澄の調製 増殖培地：ｇ／リットルで無ビタミンカザミノ酸、４；酵母ｆ−キス、０．２　 ；Ｍｇ５Ｏ０，０１；　（ＮＨ４）４゜ Ｓｏ　２；Ｋ　ＨＰＯＯ，４６；ＫＨ２ＰＯ４゜２　４°　２　４′ ０．１；キシロース、５　、ＭＯＰＳ　Ｃ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスル ホン酸）、１０．４；及び微量元素を含有したＸＭＰ培地。培地のｐＨは７．０ であった。
キシラナーゼ活性： キシラナーゼ活性はキシランの新鮮溶液を細胞外上澄液と共にインキュベートし 、フェリシアニド法（Ｓｐｉ＋ｏ。
Ｒ，Ｇ、］９６６、Ｍｅｊｈｏｄ＋　ｉｎ　Ｅｎｒｙｍｏｌｏｇｙ　８ニア−９ ）で還元糖の増加に関して分析することにより調べた。アッセイ緩衝液はｐＨ７ ，０の５０１トリスＣ１及び０，５％キシラン〔オートスベルト、シグマ（Ｓｉ ｇｍａ）　］であった。キシラナーゼに関する活性単位は６５℃で１分間当たり に生成する還元糖μｍｏｌである。
培地の細胞混濁度： 培地の細胞混濁度はクレット（Ｋｌｅｔ＋）単位で示される。
ＩＫＵ＝０．００４ｇ乾燥細胞重量（ＤＣＷ）／リットル。培養物がその最大密 度に達すると、それは培養物混濁度の鋭い減少で示されるように溶解しがちであ る。
株Ｔ２及びＴ６をニュー・プランスウィック・マイクロファーム（Ｎｅｗ　Ｂ＋ ｕｎ＋ｖｉｅｋ　Ｍｉｃｔｏｆｅｒｍｌ　７．　５リツトル醗酵槽においてＸ　 Ｍ　Ｐ培地中で２４時間増殖させた。増殖は６０℃、攪拌速度６００　＋ｐｍ及 び通気速度７リツトル／分で４リツトルの作業容量で行った。発泡はケイ素消泡 剤〔５％フル力（Ｆｌｕｋａ）　）を加えることで自動的にコントロールし、作 業容量は無菌水を加えることで維持した。初期出発接種源は１０ＫＵ　（０，０ ４ｇＤｃＷ／リットル）の混濁度を示した。最初の８時間の醗酵で、細胞混濁度 は株Ｔ６及びＴ２に関して各々５４０及び７００にＵに増加した。２４時間で細 胞混濁度は下りだした。
培養液を室温まで冷却し、遠心（８０００ｇ、１０ｍ１ｎ、２０℃）して細胞を 除去した。無細胞上澄は株Ｔ２及びＴ６に関して各々ｌ　Ｏ−１，４及び２．０ −２．４単位／ｍｌのキシラナーゼと双方の株に関して約０．０２ｍｇ／ｍｌの タンパク質を含有していた。タンパク質は４℃で上澄に固体硫酸アンモニウムを ８０％飽和まで加え、４℃で１２時間後に混合液を遠心（９０００ｇ、１５ａ＋ ｉｎ）することにより濃縮した。沈降物をｐＨ７，０の１０ｍＭリン酸緩衝液全 容量１００ｍ１に溶解し、４℃で同緩衝液５リツトルに対して３回透析した。透 析された溶液（１２０ｍｌ）は約７ｍｇ／ｍｌタンパク質と株Ｔ２及びＴ６に関 して各々１５−２０及び３５−４０単位のキシラナーゼを含有していた。
株Ｔ６の増殖 株Ｔ２及びＴ６のキシラナーゼ活性は醗酵の最後に減少巳なかったことに留意す べきである。
本発明による酵素活性を示す製剤 ＸＭＰ培地中における株Ｔ２及びＴ６の増殖物からの無細胞上澄は、それらがキ シラナーゼ活性を示すことがわかったため少なくとも１種のキシラナーゼを含有 している。上記上澄（粗製酵素製剤ともよばれる）及びその部分的精製分画は未 漂白及び酸素半漂白軟材硫酸塩パルプの処理に用いられた。
未漂白及び酸素半漂白パルプサンプル パルプサンプルはコースネス（Ｋａ＋５ｎｚＳ）ミルから採取された軟材硫酸塩 パルプサンプルであった。
未漂白パルプサンプルはカミル（Ｋ！ｍＢ）蒸解がまでアルカリ蒸解後に採取さ れたサンプルであり、実験室スクリーニングし、洗浄し、上記サンプルを５０℃ で一夜乾燥させた。半乾燥サンプルを実験で用い、それをに８と命名した。この 物質を１０５℃で一定重量まで乾燥させ、６．３５％の含水率を得た。
酸素半漂白パルプサンプルはコースネスファイバーライン３で処理されたサンプ ルであり、それを二次酸素処理後に採取し、実験室スクリーニングし、洗浄した 。コースネスのパルプ処理植物の一般的記載はＰｉｐｅｒ、　２６゜ＳｅｐＩｅ ｍｂｅｒ　１９１１９．ｐ、２０及びＮｏ＋ｄｉ＋ｋ　Ｃｅ１ｌｕｌｏｓｘ　１ ９８９．Ｎｏ。
６、　ｐ、　８−１１で公表された。
酸素半漂白パルプはＫｌｌと命名した。
パルプに８及び１１のリグニン含有率 パルプに８及び１１のリグニン含有率は’Ｔｈｅ　ＳｗｅｄｉｓｈＡｓｓｏｃｉ ａｔｉｏｎ　Ｏ［Ｐｕ１ｐ　ｉｎｄ　Ｐａｐｅ＋　Ｅｎｇｉｎｅｅｚ’、５ｅｒ ｉｅ＋ＣＣＡ３の操作で調べた。Ｋ８（未漂白）のリグニン含有率は２．８％、 Ｋ１１（酸素半漂白）のリグニン含有率は２．０％であった。このため酸素半漂 白サンプルに１１はに８と比較してリグニン含有率に関し約２５％低い値を有し ていた。
パルプに８及び１１の脱リグニン化に関してバチルス・ステアロサーモフィルス 株Ｔ２及びＴ６からの粗製酵素製剤で行われた実験 リグニンが本発明の酵素製剤により抽出される量の評価に関して鋭敏なスペクト ル測定アッセイを用いた。
３５０ｎａ＋（Ａ　）における吸光度値をサンプルの上澄液で測定し、測定され た値を放出されたリグニン％として表示する。
実験及び結果は表１−５で要約されている。
表１−５で示されたデータから、バチルス・ステアロサーモフィルス株Ｔ２及び Ｔ６からの粗製酵素製剤は少なくとも９のｐＨ値及び少なくとも６５℃の温度で 未漂白及び半漂白パルプサンプルの双方を脱リグニン化しつると結論付けること ができる。更に、放出されたリグニン％は時間及び濃度双方に依存性であると結 論付けることもできる。
表１ Ｂ、ステアロサーモフィルス株Ｔ２及びＴ６からの粗製酵素製剤の関数としてパ ルプＫｌｌからのリグニンの放出１ １酵素製剤は示されたようなタンパク質の最終濃度までｐＨ９，０の１０ｍＭリ ン酸緩衝液に溶解された硫酸アンモニウム沈降物であった。コントロールはｐＥ （９，０の１０ｍＭリン酸緩衝液であった。パルプＫｌｌは３１中１５０ｍｇで あった。
５インキユベートは６５℃及びｐＨ９，０で１８時間であった。放出されたリグ ニン％はＡ　に基づいており、適切な濃度で粗製酵素製剤の吸光度に関して補正 される。
表２ Ｂ、ステアロサーモフィルス株Ｔ２及びＴ６からの粗製酵素製剤によるバルブＫ ｌｌからのリグニン放出の動態１実験は６５℃及びｐＨ９，０で表１で記載され たように行った。
ｂ粗製酵素Ｔ２及びＴ６の濃度は各々２．８及び１．５ｍｇタンパク質／ｍｌで あった。
表３ Ｂ、ステアロサーモフィルス株Ｔ２及びＴ６からの粗製酵素製剤による温度の関 数としてリグニンの放出１１実験は６５℃及びｐＨ９，０で表１で記載されたよ うに行った。
５粗製酵素Ｔ２及びＴ６の濃度は各々１．７及び０．７ｍｇタンパク質／ｍｌで あった。
表１ ｐＨの関数としてＫｌｌからのリグニンの放出３２実験は６５℃で１８時間にわ たり表１で記載されたように行った。
５粗製酵素製剤Ｔ２及びＴ６の濃度は各々１．７及び１．５Ｂタンパク質／ｍｌ であった。
表５ バルブに８からのリグニンの放出３ １実験はＫｌｌの代わりにバルブに８を用いて６５℃及びｐＨ９，０で１８時間 にわたり表１で記載されたよう株Ｔ６の増殖物から清澄化された培養ブロスの高 度精製分画（キシラナーゼの形）は単−濃度及び精製ステップで陽イオン交換体 の使用により得ることができる。このため、キシラナーゼＴ６は陽イオン交換体 ＣＭ−５２〔ワットマン（Ｗｂ！＋ｍｇｎ）　）への吸着により無細胞上澄から 直接精製及び濃縮した。しかしながら、ＸＭＰ培地の場合、回収率はおそらく培 地の高イオン強度のためにわずか２１％であった。培地が低イオン強度緩衝液に 対して透析された場合又はＭＯＰＳが培地から省略された場合には、回収率は約 ５０％であった。清澄化された培地からの効果的な吸着のために要求されるＣＭ −５２の最少量を調べるため、異なる量のＣＭ−５２をキシラナーゼＴ−６を精 製する上で試験した。結果は表６で示されている。
表６．異なる量のＣＭ−５２によるキシラナーゼＴ−６のバッチ吸着 ＣＭ−５２／ブロス　分画　容量　キシラナ　全単位　収率（ｇ／ｇ）　（ｍｌ ）　−ゼ（Ｕ／ｍｌ）　（％）上澄　１００　０．７８　７８．０　１［ＩＱ、 ００．１　抽出物　４０　１．０４　４１．６　５３．３非吸着　ＩＯ［Ｉ　Ｏ ，０５５５，５７，００，０５抽出物　３０　１．３　３９，９　５０．０非吸 着　１００　０．０７７　７．７　９．８０．０２　抽出物　１５　１．９４　 ２９．１　３７．３非吸着　１００　０．１６　１６．０　２０．５０．０１　 抽出物　１４　２．０５　２８．７　３６．８非吸着　ＩＮ　［１，２４２４， Ｑ　３Ｑ、ｌ１表６で示されたように、５％吸着剤で収率は５０％である。もう １つの市販陽イオン交換体は５Ｅ−５２（ワットマン）である（負の基はセルロ ースに結合されたスルホキシエチルである）。５Ｅ−５２はＣＭ−５２よりも大 きな吸着能力を有することが知られている。精製ステップも濃縮ステップである ため、できるだけ少量の吸着剤を用いることが有利である。したがって、我々は キシラナーゼ吸着のためにＳＥ〜５２を試みた。結果は表７で示されている。
表７．異なる量の５Ｅ−５２によるキシラナーゼＴ−６のバッチ吸着 ５Ｅ−５２／ブロス　分画　容量　キシラナ　全単位　収率（ｇ／ｇ）　（ｍｌ ）　−ゼ（σ／１）（％）上澄　１００　１．４１　１４１．０　１００．００ ．０５　抽出物　３０　２．４　７２．０　５１．１０．０２　抽出物　２１　 ３．２　６７．８　４８．００．０１　抽出物２０　２，９　５８．０　４１． １表７で示されたように、わずか２％の５Ｅ−５２がキシラナーゼＴ６の４８％ 回収率を得るために要求されたキシラナーゼＴ−６の分子量はＳＤＳ　ＰＡＧＥ 及びゲル濾過により決定され、４１，０００〜４２，０００ドルトンの値を示す 。双方の方法が同様のＭＷを示すという事実は、その酵素が単一のポリペプチド 鎖から構成されることを示す（ＳＤＳ　ＰＡＧＥはタンパク質サブユニットを分 離する）。その酵素のｐＩ（タンパク質の全電荷がゼロであるｐＨ）は高電圧等 電点電気泳動により決定したところ９．０であった。酵素の比較的高いｐＩは中 性ｐＨにおける酵素の正電荷を説明している。酵素の至適ｐＨは７．０付近であ った；ｐＨ９，０において酵素はそのｐＨ７，０活性の約５０％を有していた。
キシラナーゼＴ−６活性の温度特性は表８で示されている。
表８．異なる温度におけるキシラナーゼＴ６の活性１温度℃　比活性％ ０反応時間＝５分間 温度６５℃及びｐＨ９におけるキシラナーゼＴ６の熱安定性は表９で示されてい る。
表９．６５℃及びｐＨ９におけるキシラナーゼＴ６の熱安定性 時間ｈ　比活性％ 更に、６５℃及びｐＨ７において活性の喪失は１０時間にわたり検出されなかっ たことが記述できる。
株Ｔ６からキシラナーゼ構成変異株の獲得変異株を得るため、我々は多くのケー スにお諭でキシラナーゼ及びキシロシダーゼが同じｌ１ＩＢコントロール（同じ レプレッサー）下にあるという事実を用いた。キシロシダーゼを産生じた株は発 色原基質ｐ−ニトロフェニル　β−Ｄ−キシロピラノシド（ＯＮ　Ｐ　Ｘ）含有 の寒天プレートで容易に検出できる。キシロシダーゼに関する唯一の構成変異株 はキシロースの不存在下寒天プレート上で黄色を呈する。キシロシダーゼ構成変 異株を得るため、細胞をＭＮＮＧ　（１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグ アニジン）で変異誘発させ、しかる後無キシロースの０ＮＰＸ含有寒天プレート 上で培養した。
５００細胞のうち約１つが寒天プレート上で黄色を呈するコロニーを産生じた。
３０のキシロシダーゼ構成変異株をこうして単離したが、それらはすべてキシラ ナーゼ構成でもあった。キシロース又はゲルコールの存在下で増殖させた場合に おけるこれら変異株のうち２つ（Ｍ−７及びＭ−２８）の増殖及びキシラナーゼ 産生が表１０及び１１で示されている。双方の培地（ＸＭＰ及びＧＭＰ）におい て変異株及びＴ−６は同様の増殖率を示した。
しかしながら、変異株はＴ−６と比較してＸＭＰ培地上で著しく高いレベルのキ シラナーゼを産生じた。ＧＭＰ培地（グルコースが炭素源である）において株Ｔ −６は検出しつるレベルのキシラナーゼを産生じなかったが、一方変異株は高レ ベルのキシラナーゼ活性を生じた。株Ｍ−７からのキシラナーゼは精製したとこ ろ、Ｔ−６キシラナーゼと同一の性質を示した。
表１０．ＸＭＰ上におけるＴ−６キシラナ一ゼ構成変異株の増殖及びキシラナー ゼ産生株　時間　混濁度　キシラナーゼ （ｈ）　（ＫＵ）　（Ｕ／ｍ　１） ７６　４　１５０　０．５ Ｔ６　６　２００　０．１１ Ｔ６　１２　３１０　２．Ｉ Ｔ６　２４　２Ｎ　２．３ Ｍ７　０　１０ Ｍ７　２　３０ Ｍ７　４　１９０　０．９ Ｍ７　６　２７０　１．６ Ｍ７　１２　３５０　２．１ Ｍｌ　２４　３１０　２．３ Ｍ７　３０　３１０ Ｍ２８　０　２０ Ｍ２Ｒ１２Ｇ Ｍ２Ｒ４４０［１，６ Ｍ２８　６　１２０　２．０ Ｍ２８　１０　３７０　５．５ Ｍ２８　２４　３２０　７．２ 表１１．ＧＭＰ上におけるＴ−６キシラナ一ゼ構成変異株の増殖及びキシラナー ゼ産生Ｔ６　４　１１０　０．　Ｉ Ｔ６　６　２３０　０．　Ｉ Ｔ６　８　３４０　０．　Ｉ Ｔ６　２３　３９０　０．Ｉ Ｔ６　３２　３７゜ Ｍ７　２　７０　［１，３ Ｍ７　４　１００　０．６ Ｍ７　６　３１０　１．１ Ｍ７　８　３４０　１．４ Ｍ７　２３　’３３０　２．２ Ｍ７　３２　３００ Ｍ２８　０　２０ Ｍ２Ｒ１２０ Ｍ２８　４　３０　０．１ １２８　６　１００　Ｇ、９ Ｍ２８　８　＋９０　１．７ １１２ｇ　１０　３２０　３．１ キシラナーゼＴ−６の断片配列及びアミノ酸組成タンパク質のＮ末端アミノ酸配 列の十分に長いストレッチから該タンパク質を完全に確認することができる。
キシラナーゼＴ−６の１断片の配列をイスラエルのワイツマン・インスティチュ ート（Ｗｅｉｒｍｘｎ　ＩｎｕＮｕｔｅ）においてアプライド・バイオシステム ズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ＋７ｓｔｅｍＳ）ガス相マイクロシーケンサ−ＡＢ Ｉ　４７５Ａで２回調べた。第一のタンパク質サンプルは最初にＰＶＤＦ膜〔ミ リポア（Ｍｉｌｌｉｐｏ＋ｅ）　］上にエレクトロプロットしたところ、２０の アミノ酸だけを与えた。箪二のタンパク質サンプルは最初にスーパーロース（Ｓ ｕｐｅｒｏｓｃ）　１２　Ｆ　ＰＬＣカラム〔ファルマシア（Ｐｈｘｔｍｘｃ目 ）〕で精製したところ、４１アミノ酸の配列を得る上で十分であった。得られた 配列は下記のとおりであるニ ーＬ７ｓ−Ａｓｎ−＾１ｘ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔ７＋−Ａｌｓ−Ｌ７＋−Ｌ７ｓ −Ｐ＋ｏ−［ｆｉｓ−１１ｅ−３ｅ　ｔ−Ａ　ｌ　ｚ−Ｌｅｕ−Ａｓ　ｎ−Ａ　 ｌ　ｌ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌｅ　ｕ−Ａｓ＋＋−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　ｒｇ−Ｔ ７　「−Ｌ７■ −Ａｓｎ−Ｇ　ｌ　ａ−Ｐｈｅ−Ｔｈ　ｒ−１ｌ　ｅ−Ｇ　ｌ　７−Ａ　Ｉ！− Ａ　１１４！１−Ｇｌａ−Ｐ　ｒｏ−Ｔｙ　「−Ｇｌｎ−Ｌｅａ−Ｇｌｎ−Ａｓ ｎ− その酵素を更に特徴付けるため、アミノ酸分析を精製されたキシラナーゼＴ−６ で行った。この分析からの結果は表１２で示されている。
表１２．キシラナーゼＴ−６のアミノ酸組成Ｐｋ　Ｒｅｔ　成分　濃度　残基／ ２　９．７６　トレオニン　０．８５１　１２３　１０．４５　−ｔｒｌＪ：ｚ 　０．６７２　ｔ。
４　１４．０５　グルタミン酸　３．６３９　４４Ｃ５１５，５２プロリン１． ９５０　２４６　１１８０　グＵシン１．６４０　２ｆ１７　１９．８４　アラ ニン　２．４３９　３Ｇ８　２０．８０　シスチ：／　０．０６１　１９　２１ ．８１　バリン　２．２５０　２８ＩＱ　２３．６０メチオニ＞　Ｏ，１５Ｑ　 ２ＩＩ　２４．６４　イ”）ｏイレン２．０６４　２６１２　２５．３９　ロイ シン　１．０２７　１４１３　２８．７５　チロシン　１．６１３　２２１４　 ２９．８７　フェニルアラニン　１．２６９　１６１５３ｇ、３７　リジン　３ ．１２４　３８１６　３９．９５　アンモニア　３．６９１１７　４２．６５　 ヒスチジン　０．５６０　６’４２，０００ドルトンの分子量に基づく：補正は 不安定アミノ酸に関して行った。
ｂアスパラギン酸はアスパラギン酸及びアスパラギン（Ａｓｘ）の合計である。
０グルタミン酸はグルタミン酸及びグルタミン（Ｇｌｘ）の合計である。
パルプに１４に関して酵素で行われた実験パルプサンプルに１４はコースネスミ ルからの酸素半漂白軟材パルプであった。酵素は精製された好熱性キシラナーゼ Ｔ６であった。
パルプに１４の脱リグニン化の程度に影響を与える様々なパラメーターを研究し た。繊維濃度の効果は表１３で要約されている。
表１３．キシラナーゼ処理に関する繊維濃度の効果ゝキシラナーゼ　繊維　放出 された ４０、８　２．５　１３．９ １条件：ｐＨ９，０，６５℃、２ｈ、に１４パルプ。
酵素コントロールは各ケースで差し引かれなかった。
表１３でみられるように、繊維濃度を４．７から２゜５及び１．０％乾燦重量繊 維まで減少させるとそのプロセスを高めた。酵素処理はミキシングせずに行った ため、酵素と不溶性基質との接触は乏しかったようである。実際的理由から、我 々は２．５％繊維で作業することを選表１４．キシラナーゼ処理に関するｐＨの 効果９８．５　０．ＯＩＭ　リン酸　８．３ ８．５　０．０１Ｍ　Ｎａ２５ｏ４１α、９零条件：２．５％に１４パルプ、１ ５Ｕ／ｍｌキシラナーゼ。
２ｈ、６５℃ 表１４でみられるように、酵素はリン酸カリウム及び硫酸ナトリウムの双方にお いてｐＨ８，５〜９．０で最も効果的である。初期実験ではｐＨ８，０以下及び ｐＨ９，５以上でそれより低い活性を示した。
孝条件＝２．５％に１４パルプ、ＩＯＵ／ｍｌキシラナーゼ。
ｐＨ９，ｏ、６５℃、２ｈ 表１６．キシラナーゼ濃度の関数としてリグニンの放出９ ＊条件：２．５％乾燥繊維に−１４，２ｈ、ｐＨ９゜６５℃ 表１６でみられるように、０．ＩＭ　Ｎａ２ｓｏ４及びリン酸カリウム緩衝液の 双方において約１５　Ｕ／ｍ１以内でリグニンの濃度依存的放出があった。酵素 のより高い濃度及びインキュベートのより長い期間（４ｈ）は放出される正味リ グニンをほんのわずかに増加させた。
次の試験のため処理されたに１４の１０ｇ及び５０ｇサンプルの調製 に１４パルプの１０ｇサンプルを適切なコントロールと一緒に１５　Ｕ／ｍｌ及 び４５　Ｕ／ｍｌキシラナーゼで２時間及び４時間処理した。すべてのサンプル は二重に調製した。
すべてのインキュベートはｐＨ９，０及び６５℃で行った。リグニン放出のスペ クトル測定分析は表１７（リン酸緩衝液）及び１８　（０，ＬＭ　Ｎａ２５ｏ４ ）ｔ’示されている。リグニンの正味放出は１０．３〜１４．９％の範囲であり 、４５Ｌｔ／ｍｌ酵素及び４時間のインキュベート期間では１５　Ｕ／ｍｌ及び ２時間よりもやや高い値を示した。
次いで、パルプの５０ｇサンプルを追加分析のため二重に処理した。リグニンの 正味放出は２時間にゎたり１５Ｕ／口１で１０．８％及び４時間にゎたり１５Ｕ ／ｍｌで１２゜６％であった。
表１７．リン酸緩衝液中に１４パルプ１０ｇのキシラナーゼ処理６ キシラナーゼ　時間　放出されたリグニン（％）（Ｕ／ｍｌ）　（ｈ）　全体　 正味 零条件＝２．５％に一１４パルプ、ｐＨ９，５，６５℃；２実験の平均 キシラナーゼ　時間　放出されたリグニン（９６）（Ｕ／ｍｌＪ　（ｈｌ　全体 　正味 本条件二表１７のとおり キシラナーゼ処理１０ｇサンプルの分析分析の結果は表１９−２３で要約されて いる。その表で示されたパラメーターは５ＣＡＮ試験シリーズに従ったが、但し 製造業者〔プルマック・インストルメンツ社（Ｐｕｌｍａｃ　ｌｎ＋！ｒｕｍｅ ｎＮ　Ｌｔｄ）、　カナダ〕の指示に従い測定されたゼロ−スパン値を除く。表 １９は酵素なしくコントロール）及び１５　Ｕ／ｍｌ酵素含有のＯ，ＬＭ　Ｎａ 　２　ＳＯ４中６５℃、ｐＨ９，０で２時間処理されたパルプを用いて得られた データについて表す。示されたように、２週間間隔で得られた二重サンプルで優 れた再現性があった。最大効果はベントサン含有率に関してであり、１７．４％ 減少させた。カッパナンバー及び引張りインデックスに関して小さいが但し有意 の減少があり、明度、粘度及びゼロ−スパン値に関して増加があった。
パルプ又はパルプから得られたハンドシートに関する上記性質の値は１５　Ｕ／ ｍｌ及び４５　Ｕ／ｍｌ酵素、２時間及び４時間処理並びに０．０１Ｍリン酸カ リウム及び０．ＩＭ　Ｎａ２ＳＯ４の使用でさほど異ならなかった（表２０及び ２１）。
これらのデータの有意性を分析するため、パルプ及びペーパー性質の値が適切な コントロールと比較された変化率として表２２及び２３で表されている。結論は 下記のとおりである： １、ベントサンは部分的に除去される（１０．４−２２．２％）；酵素レベルが 高いほど多くのベントサンを除去する。
２、粘度に関して小さいが但し有意の増加があり、これはベントサンの除去（Ｋ １４の乾燥重量約１％）で説明できる。６５℃、ｐＨ９で４時間のとき最大濃度 の酵素であってもセルロース分解に関する証拠はない。
３、カッパナンバーは試験された全部で８つの条件下で減少した（範囲：５．５ −９．１％）。値はより高い酵素濃度でも更に減少しなかった（一方ベントサン は減少した）が、高レベルの酵素はどリグニンに結合しないベントサンを除去し たようであった。
４、試験された全部で８つの条件下において、ハンドシートは明度及びゼロ−ス パン値に関して小さな増加と引張りインデックスに関して減少を示した。
表１９．に１４パルプのキシラナーゼ処理９パラメーター　コントロール　処理 酵素　平均変化（３）カッパＮｏ、３７．３　１６．８　１６．０　１５．５　 −７．６（±ｏ、１）粘１ｔ（ｄｍ”／Ｋｇ）　１０６６　１０４５　１０７２ 　１０５９　＋０．８（ｉｏ、１）ベントサン国　９．１　９４　７．７　７． ５　−１７．４（±１．８）明度（％ｌ５Ｏ）　３２．５　３２．８　３３．４ 　３３．８　＋２．９（±０．１）］リ　Ｉｎｄｅｘ　（Ｎｍ／ｇ）　２０．９ 　２Ｇ、　４　１９．０　１９．３　づ、２（±１．８）ゼａ・Ｘｒ＜ン（′ｗ ｅｔ）　９５．２　９７．８　１０１．５１０４．３　＋６．３（±０．３）（ Ｎ＋ａ／ｇ） ’条件：　１５Ｕ／ａｌｌ素、ｐＨ９，ｏ、２　ｈ。
０　、　１　Ｍ　Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４０／ｍｌ　１５０／ｍｌ　４５Ｕ／ｍｌ 　Ｏ／ｍｌ　１５Ｕ／ｍｌ　４５Ｕ／ｍｌパラメーター　２ｈ　２ｈ　２ｈ　４ ｈ　４ｈ　４ｈカツパ　１７，１　１５．８　１５．Ｑ　１７．９　１５．４　 １５．８粘度　１０５５　１０６６　１０７２　１０６１　１０７５　１０７５ ベントサン　９．２　７．６　７．３　９．０　７．５　７．０明度　３２．６ 　３３．６　３４．１　３２．６　３４．１　３４．４引張り　２０．７　１９ ．２　２０．７　２１．２　１９．６　１９．８ゼロ−スパン　９７　１０３　 ＋０４　１００　１０４　１０３表２１．０．０１Ｍリン酸緩衝液中におけるに １４パルプのキシラナーゼ処理１ Ｇ／ｍｌ　１５０／ｍｌ　４５［１／ｍｌ　Ｏ／ｍｌ　１５［１／ｍｌ　４５［ １／ｍｌパラメーター　２ｈ　２ｈ　２ｈ　４ｂ　４ｈ　４ｂカツパ　１７．０ 　１５．９　＋６．０　１７．２　１６．８　１６．２粘度　１０６５　１０７ ３　１０７６　１０６０　１０７［１１０７３ベントサン　９．１　８．２　７ ．４　９．０　７．９　７．４明度　３１．８　３３，２　３３．６　３２．６ 　３３．２　３３．７引張り　２１．０　１９．２　２０．４　２１１．９　１ ９．４　２０．３ゼロースパ：／１０１　１０＋　１０７　９９　１０２　ｌＮ ５２実験の平均 表２２．に１４パルプのキシラナーゼ処理１パラメーター　１５Ｕ／ｍｌ　１５ Ｕ／ｍｌ　４５１１／ｍｌ　４５Ｕ／ｍｌ粘度　＋０．８　＋１．４　＋１．５ 　＋１．４ベントサン　−１７，４−１６，５−２１６−２２，２明度　＋２． ９　＋４．４　＋４．７　＋５．３引張り　−７，２−７，５−６，８−６，４ ”０．ＩＭ　Ｎａ　Ｓｏ　７表２０からのデータ表２３．に１４パルプのキシラ ナーゼ処理８粘度　＋０．８　＋０．９　＋１．０　＋１．２ベントサン　−１ ０，４−１２，７−２０，７−１８，４明度　＋４．３　÷２．８　＋５．３　 ＋３．２引張り　−８，８−７，４−３，３−２，９’０．０１Ｍリン酸；表２ １からのデータ漂白能の試験 カッパナンバー１８．５のパルプに１４を用いて、漂白能に関する酵素処理の効 果を試験した。パルプに１４を株Ｔ６から産生されたキシラナーゼ１５単位／ｍ ｌの濃度で酵素処理に付した。酵素処理後、パルプをコースネルミルで用いられ た漂白順序で漂白した：二酸化塩素（ＤΦ）−酸素で増強されたアルカリ抽出（ Ｅ　Ｏ）　−二酸化塩素（Ｄｌ）−二酸化塩素（Ｄ２）。
酵素処理はパルプのリグニン含宵率を１５．９のカッパナンバーまで減少させた 。酵素処理パルプと同様に、即ち１００　ｍＭＮ　ａ　Ｓ　Ｏ−緩衝液中６５℃ 及びｐＨ９で但し酵素添加せずに処理されたパルプは１７．２のカッパナンバー まで脱リグニン化された。酵素処理の正味効果はカッパナンバー１７．２から１ ５．９への脱リグニン化、即ち８％の脱リグニン化であった。
硫酸緩衝液系中酵素で処理されたパルプは漂白順序ＤΦ（ＥＯ）０１Ｄ２で８３ ％のｌ５Ｏ−明度まで漂白する場合にパルプ１トン当たり二酸化塩素（活性塩素 ）４７ｋｇを消費した。単に緩衝液で処理されたパルテに関する対応消費量はパ ルプ１トン当たり二酸化塩素（Ｃ１）５９ｋｇであり、即ち酵素処理パルプは２ ０％少ない二酸化塩素を消費した。
要　約　書 酵素活性を示しかつ少なくとも６５℃の温度及び少な（とも９のｐＨで木材パル プを脱リグニン化する能力を有する製剤が記載されている。その製剤は寄託味Ｎ ＣＩＭＢ４０２２１及びＮＣＩＭＢ４０２２２とそれらの突然変異株及び変異体 から選択されるバチルス・ステアロサーモフィルス株の好気性醗酵により得られ る。しかも、寄託味ＮＣＩＭＢ４０２２１及びＮＣＩＭＢ４０２２２とそれらの 突然変異株及び変異体は本発明に包含される。
更に、上記製剤の産生方法及び上記製剤による木材バブルの処理からなるプロセ スが開示されている。更に、本発明は上記製剤で処理された木材バブル及び毛羽 パルプと上記製剤で処理された木材パルプから得られるペーパかも、特定アミノ 酸配列についてコードするヌクレオチド配列を認識するＤＮＡ及びＲＮＡプロー ブとそのアミノ酸配列と結合する抗体も含まれる。
国際調査報告 国際調査報告

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. １．酵素活性を示す製剤であって、株ＮＣＩＭＢ４０２２１及びＮＣＩＭＢ４０ ２２２並びに上記株ＮＣＩＭＢ４０２２１及びＮＣＩＭＢ４０２２２と実質上同 一の上記製剤産生能力を有するそれらの突然変異株及び変異体から選択されるバ チルス・ステアロサーモフィルス株の適切な培地における好気性醗酵により得ら れ、少なくとも６５℃の温度及び少なくとも９のｐＨで木材パルプを脱リグニン 化する能力を有することを特徴とする製剤。
  2. ２．製剤が、バチルス・ステアロサーモフィルス株ＮＣＩＭＢ４０２２２の変異 株の炭素源としてグルコースを含む適切な培地における好気性醗酵により得られ る、請求項１に記載の製剤。
  3. ３．製剤が下記アミノ酸配列： 【配列があります】又はそのホモログを含有する酵素を含み、酵素全体が木材パ ルプ培地で酵素活性を示す、請求項１に記載の製剤。
  4. ４．製剤が清澄化された培養ブロスである、請求項１に記載の製剤。
  5. ５．製剤が木材パルプ培地において酵素活性を示す培養ブロスの部分的精製分画 である、請求項４に記載の製剤。
  6. ６．部分的精製分画が硫酸アンモニウム沈降で得られる、請求項５に記載の製剤 。
  7. ７．製剤が陽イオン交換体の使用で得られる高度精製分画であり、その分画が木 材パルプ培地において酵素活性を示すキシラナーゼの形である、請求項４に記載 の製剤。
  8. ８．キシラナーゼがＳＤＳ　ＰＡＧＥ及びゲル濾過で決定された大体の分子量４ １０００〜４２０００ドルトンを有し、下記の大体のアミノ酸組成：Ａｓｘ　５ ８；Ｔｈｒ１２；Ｓｅｒ　１０；Ｇｌｘ　４４；Ｐｒｏ　２４；Ｇｌｙ　２０； Ａｌａ　３０；Ｃｙｓ　１；Ｖａｌ２８；Ｍｅｔ　２；Ｉｌｅ　２６；Ｌｅｕ　 １４；Ｔｙｒ　２２；Ｐｈｅ　１６；Ｌｙｓ　３８；Ｈｉｓ　６；Ａｒｇ　１２ がアミノ酸分析により分子当たりのアミノ酸残基として決定された、請求項７に 記載の製剤。
  9. ９．酵素活性を示す製剤の産生方法であって、株ＮＣＩＭＢ４０２２１及びＮＣ ＩＭＢ４０２２２並びに上記株ＮＣＩＭＢ４０２２１及びＮＣＩＭＢ４０２２２ と実質上同一の上記製剤産生能力を有するそれらの突然変異株及び変異体から選 択されるバチルス・ステアロサーモフィルス株が適切な培地において好気性醗酵 に付され、上記製剤が少なくとも６５℃の温度及び少なくとも９のｐＨで木材パ ルプを脱リグニン化する能力を有することを特徴とする方法。
  10. １０．バチルス・ステアロサーモフィルス株ＮＣＩＭＢ４０２２２の変異株が炭 素源としてグルコースを含む適切な培地において好気性醗酵に付される、請求項 ９に記載の方法。
  11. １１．醗酵ブロスが場合により遠心で清澄化される、請求項９に記載の方法。
  12. １２．清澄化された醗酵ブロスが、少なくとも６５℃の温度及び少なくとも９の ｐＨで木材パルプ培地中において酵素活性を示す清澄化培養ブロスの部分的精製 分画を得るため硫酸アンモニウム沈降及び場合により液体培地中で再懸濁に付さ れる、請求項１１に記載の方法。
  13. １３．清澄化された醗酵ブロスが、少なくとも６５℃の温度及び少なくとも９の ｐＨで木材パルプ培地中において酵素活性を示すキシラナーゼの形態の高度精製 分画を得るため陽イオン交換体を用いて精製及び濃縮される、請求項１１に記載 の方法。
  14. １４．単離されたバチルス・ステアロサーモフィルス株ＮＣＩＭＢ４０２２１及 びＮＣＩＭＢ４０２２２並びにそれらの突然変異株及び変異体であって、ここに おいて該突然変異株及び変異体は株ＮＣＩＭＢ４０２２１及びＮＣＩＭＢ４０２ ２２と実質上同一の酵素活性発現製剤産生能力を有し、その製剤が少なくとも６ ５℃の温度及び少なくとも９のｐＨで木材パルプを脱リグニン化する能力を有す る。
  15. １５．木材パルプが請求項１〜８のいずれか一項による製剤で少なくとも１ステ ップにおいて処理されることを特徴とする、木材パルプの処理方法。
  16. １６．木材パルプが硫酸塩パルプである、請求項１５に記載の方法。
  17. １７．硫酸塩パルプが部分的に脱リグニン化された硫酸塩パルプである、請求項 １５に記載の方法。
  18. １８．部分的脱リグニン化硫酸塩パルプが酸素脱リグニン化硫酸塩パルプである 、請求項１７に記載の方法。
  19. １９．処理が少なくとも９のｐＨを有する培地において少なくとも６５℃の温度 で行われる、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. ２０．請求項１〜８のいずれか一項による製剤で少なくとも１ステップにおいて 処理されたことを特徴とする木材パルプ。
  21. ２１．請求項１〜８のいずれか一項による製剤で少なくとも１ステップにおいて 処理されたことを特徴とする毛羽パルプ。
  22. ２２．請求項１〜８のいずれか一項による製剤で少なくとも１ステップにおいて 処理された木材パルプから得られることを特徴とするペーパー。
  23. ２３．請求項１〜８のいずれか一項による製剤で少なくとも１ステップにおいて 処理された木材パルプから得られることを特徴とするボード。
  24. ２４．請求項１〜８のいずれか一項による製剤で少なくとも１ステップにおいて 処理された木材パルプから得られることを特徴とする毛羽。
  25. ２５．下記アミノ酸配列： 【配列があります】についてコードするヌクレオチド配列を認識するＤＮＡ又は ＲＮＡプローブ。
  26. ２６．下記アミノ酸配列： 【配列があります】と結合する抗体。
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