PL166837B1 - Preparat dellgnifikacyjnle aktywny na osnowie enzymu i sposób wytwarzania preparatu delignifikacyjnle aktywnego m a osnowie enzymu PL PL PL PL PL - Google Patents

Preparat dellgnifikacyjnle aktywny na osnowie enzymu i sposób wytwarzania preparatu delignifikacyjnle aktywnego m a osnowie enzymu PL PL PL PL PL

Info

Publication number
PL166837B1
PL166837B1 PL90295425A PL29542590A PL166837B1 PL 166837 B1 PL166837 B1 PL 166837B1 PL 90295425 A PL90295425 A PL 90295425A PL 29542590 A PL29542590 A PL 29542590A PL 166837 B1 PL166837 B1 PL 166837B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
xylanase
enzyme
ala
lys
clarified
Prior art date
Application number
PL90295425A
Other languages
English (en)
Inventor
Eugene Rosenberg
Yuval Shoham
Original Assignee
Korsnaes Ab
Technion Res & Dev Foundation
Univ Ramot
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korsnaes Ab, Technion Res & Dev Foundation, Univ Ramot filed Critical Korsnaes Ab
Publication of PL166837B1 publication Critical patent/PL166837B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/22—Processes using, or culture media containing, cellulose or hydrolysates thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01032—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1-3-beta-xylanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01055—Alpha-N-arabinofuranosidase (3.2.1.55)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus

Abstract

1. Preparat delignifikacyjnie aktywny na osnowie enzymu zawierajacy substancje pomocnicze, znamienny tym, ze jako enzym zawiera ksylanaze wyizolowana z Bacillus stearothermophilus NCIMB 40221 lub Bacillus stearothermophilus NCIMB 40222 o dzialaniu delignifikujacym o czesciowej N-terminalnej sekwencji aminokwasów -Lys-Asn-Ala- -Asp-Ser-Tyr-Ala-Lys-Lys-Pro-His-Ile-Ser-Ala-Leu-Asn-Ala-Pro- Gln-Leu-Asn-Gln-Arg- -Tyr-Lys-Asn-Glu-Phe-Thr-Ile-Gly-Ala-Ala-Val-Glu-Pro-Tyr-Gln-Leu-Gln-Asn- i punkcie izoelektrycznym 9,0 okreslonym metoda izoelektrycznego ogniskowania oraz przyblizonej masie czasteczkowej 41000-42000 Daltonów okreslonej metodami SDS - PAGE i saczenia molekularnego oraz o przyblizonym skladzie aminokwasów wyrazonym w liczbie reszt aminokwasowych w czasteczce, okreslonym metoda analizy aminokwasów: Asx 58; Thr 12; Ser 10; Glx 44; Pro 24; Gly 20; Ala 30; Cys 1; Val 28; Met 2; Ile 25; Leu 14; Tyr 22; Phe 16; Lys 38; His 6; Arg 12, w postaci nieoczyszczonej, czesciowo oczyszczonej lub w postaci o wysokim stopniu czystosci. 5. Sposób wytwarzania preparatu delignifikacyjnie aktywnego na osnowie enzymu przez tlenowa fermentacje bakterii wytwarzajacych ksylanaze wodpowiednim podlozu zawierajacym pozywke konieczna do biosyntezy tego enzymu, znamienny tym, ze jako bakterie wytwarzajace ksylanaze stosuje sie bakterie szczepu Bacillus stearothermophilus NCIMB 40221 lub szczepu Bacillus stearothermophilus NCIMB 40222, a otrzymana w procesie fermentacji brzeczke klaruje sie i ewentualnie oczyszcza sie i zateza zawarta w niej ksylanaze. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest preparat delignifikacyjnie aktywny na osnowie enzymu, posiadający zdolność delignifikacji ścieru drzewnego w temperaturze 65°C i pH co najmniej
9. Ponadto, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wspomnianego preparatu przez fermentację tlenową bakterii wytwarzających ksylanazę.
W przemyśle celulozowo-papierniczym główne wysiłki kieruje się w celu zredukowania stosowania czynników chemicznych w procesach delignifikacji i bielenia, ponieważ
166 837 czynniki takie, a zwłaszcza organiczne związki chloru, występujące w ściekach z zakładów przemysłowych prowadzących bielenie, powodują wzrost zanieczyszczenia środowiska.
Jednym ze sposobów redukcji stosowania czynników chemicznych w procesach roztwarzania i bielenia jest zastosowanie drobnoustrojów rozkładających ligninę. Sugerowano także zastosowanie enzymów rozkładających i modyfikujących ligninę. Wyczerpujący przegląd dotyczący biodegradacji ligniny opublikowano w Critical Reviews TM in Biotechnology, tom 6, numer 1 1987, str. 1-60, red. Stewart, G.G i Russell, I., CRC Press, Inc. Boca Raton, Floryda.
Inny sposób dotyczy usuwania ligniny przez zastosowanie hemicelulaz do rozrywania wiązań hemicelulozowych. Artykuł przeglądowy Dekkera, R.F.H. i Richardsa. G.N. Hemicellulases: Their Occurence, Purification, Properties, and Mode of Action, opublikowano w Advances in Garbohydrate Chemistry and Biochemistry, tom 32,1976, str. 277-352.
Wśród hemicelulaz stosowanych w procesach biologicznego roztwarzania i bielenia, największą uwagę zwracają ksylanazy. Opis patentowy FR 2 557 894-AJ ujawnia obróbkę masy papierniczej roztworem enzymatycznym, który nie zawiera żadnych cellulaz, a zawiera ksylanazę. Obróbkę prowadzi się w temperaturze 20-60°C, zwłaszcza w temperaturze 40°C, a przykład 6 wykazuje, że pH powinno wynosić 5. Przemysł celulozowo-papierniczy powinien jednakże z powodów ekonomicznych i ze względu na dogodność, być zainteresowany w prowadzeniu obróbki ścieru drzewnego w wyższych temperaturach i przy wyższych wartościach pH, ponieważ pewne określone procesy bielenia prowadzi się w temperaturach przekraczających 65°C i przy wartości pH wyższej niż 9.
Z posiadanych informacji wynika, że dotychczas nie ujawniono obróbki ścieru drzewnego preparatem wykazującym aktywność enzymatyczną i posiadającym zdolność delignifikacji ścieru drzewnego w temperaturze wynoszącej co najmniej 65°C i przy wartości pH wynoszącej co najmniej 9.
Niniejszy wynalazek obejmuje preparat delignifikacyjnie aktywny na osnowie enzymu posiadający zdolność delignifikacji ścieru drzewnego w temperaturze co najmniej 65°C i przy pH co najmniej 9.
W niniejszym opisie określenie ścier drzewny należy interpretować szeroko, a zatem obejmuje ono wszystkie rodzaje materiałów lignocelulozowych.
Według wynalazku preparat delignifikacyjnie aktywny na osnowie enzymu jako enzym zawiera ksylanazę wyzolowaną z Bacillus stearothermophilus NCIMB 40221 lub Bacillus stearothermophilus NCIMB 40222 o działaniu delignifikującym o częściej N-terminalnej sekwencji aminokwasów -Lys-Asn-Ala-Asp-Ser-Tyr-Ala-Lys-Lys-Pro-His-Ile-Ser-AlaLeu-Asn-Ala-Pro-Gln-Leu-Asn-Gln-Arg-Tyr-Lys-Asn-Glu-Phe-Thr-Ile-Gly-Ala-Ala-Val -Glu-Pro-Tyr-Gln-Leu-Gln-Asn-, i punkcie izoelektrycznym 9,0 określonym metodą izoelektrycznego ogniskowania oraz przybliżonej masie cząsteczkowej 41000-42000 Daltonów określonej metodami SDS - PAGE i sączenia molekularnego oraz o przybliżonym składzie aminokwasów wyrażonym w liczbie reszt aminokwasowych w cząsteczce, określonym metodą analizy aminokwasów Asx 58; Thr 12; Ser 10; Glx 44; Pro 24; Gly 20; Ala 30; Cys 1; Val 28; Met 2; Ile 25; Leu 14; Tyr 22; Phe 16; Lys 38; His 6; Arg 12, w postaci nieoczyszczonej, częściowo oczyszczonej lub w postaci o wysokim stopniu czystości.
W jednej postaci wynalazku preparat stanowi sklarowana brzeczka hodowlana. W kolejnym rozwiązaniu tej postaci wynalazku, preparat jest częściowo oczyszczoną frakcją brzeczki hodowlanej, wykazującą aktywność enzymatyczną w podłożu ścieru drzewnego. Częściowo oczyszczoną frakcję można otrzymać przez wytrącanie siarczanem amonu. W dalszym rozwiązaniu tej postaci wynalazku, preparat jest frakcją sklarowanej brzeczki hodowlanej oczyszczoną w wysokim stopniu, którą można otrzymać przez zastosowanie wymieniacza kationowego.
Sposób wytwarzania preparatu delignifikacyjnie aktywnego na osnowie enzymu przez tlenową fermentację bakterii wytwarzających ksylanazę w odpowiednim podłożu zawierającym pożywkę konieczną do biosyntezy tego enzymu, według wynalazku polega na tym, że jako bakterie wytwarzające ksylanazę stosuje się bakterie szczepu Bacillus stearothermophilus NCIMB 40221, lub szczepu Bacillus stearothermophilus NCIMB 40222, a otrzy4
166 837 maną w procesie fermentacji brzeczkę klaruje się i ewentualnie oczyszcza się zawartą w niej ksylanazę.
W jednym rozwiązaniu tej postaci wynalazku, brzeczkę fermentacyjną klaruje się, korzystnie przez wirowanie. W innym rozwiązaniu sklarowaną brzeczkę fermentacyjną poddaje się wytrąceniu siarczanem amonu i ewentualnie ponownie zawiesza się w podłożu płynnym, otrzymując częściowo oczyszczoną frakcję sklarowanej brzeczki hodowlanej wykazującą aktywność enzymatyczną w podłożu ścieru drzewnego w temperaturze co najmniej 65°C i przy pH co najmniej 9. W dalszym rozwiązaniu sposobu według wynalazku sklarowaną brzeczkę fermentacyjną oczyszcza się i zatęża przy użyciu wymieniacza kationowego, otrzymując oczyszczoną w wysokim stopniu frakcję w postaci ksylanazy wykazującej aktywność enzymatyczną w podłożu ścieru drzewnego w temperaturze co najmniej 65°C i przy pH co najmniej 9.
Obróbkę ścieru drzewnego preparatem według wynalazku prowadzi się co najmniej w jednym etapie. W jednym z rozwiązań poddawany obróbce ścier drzewny stanowi, masę celulozową siarczanową. W innym rozwiązaniu poddawana obróbce masa celulozowa siarczanowa jest częściowo zdelignifikowaną masą celulozową siarczanową. W jeszcze innym rozwiązaniu poddawana obróbce zdelignifikowana masa celulozowa siarczanowa stanowi zdelignifikowaną pod wpływem tlenku masę celulozową siarczanową. Proces obejmujący obróbkę ścieru drzewnego prowadzi się w temperaturze co najmniej 65°C w podłożu o pH co najmniej 9.
Izolowanie organizmów wytwarzających termostabilny enzym
Źródłem organizmów były próbki wody i mułu pobrane ze zbiorników wody przy młynie celulozowo-papierniczym, Korsnas, Gavie, Szwecja. Wzbogacone podłoże (XM) zawierało 0,01% ekstrakt drożdżowy, 0,04% trypton 10,2% ksylan, pH 7,0. Takie podłoże o pH 8,1 i 9,6 zawierało ponadto Na2CO3. Próbki wody i mułu dodano do podłóż XM i hodowano w warunkach tlenowych w temperaturze 65°C. Próbki hodowli przenoszono do świeżych podłóż co 2-3 dni. Po 4 przeniesieniach próbki hodowli rozcieńczono i rozprowadzono na płytki z podłożem agarowym XM (XM zawierające 2% agar).
Po trzech niezależnych procedurach wzbogacania, wyizolowano 30 szczepów zdolnych do wzrostu na płytkach z podłożem agarowym XM w temperaturze 65°C. Z podłoża XM o pH 9,6 nie otrzymano żadnych izolatów. Spośród 30 izolatów, 10 wytwarzało jasne strefy wokół kolonii, co sugeruje, że wytwarzały one zewnątrzkomórkową ksynalazę. Dwa z tych dziesięciu izolatów (szczepy T2 i T6) wybrano do zdeponowania.
Depozyt drobnoustrojów.
Dwa szczepy, mianowicie Bacillus sp T-2 i Bacillus sp T-6 zdeponowano na warunkach Porozumienia Budapeszteńskiego w National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd (NCIMB), Aberden w dniu 8 listopada 1989. Szczepy T-2 i T-6 otrzymywały następujące numery akcesy'ne odpowiednio NCIMB 40221 i NCIMb 40222.
Identyfikacja szczepów T2 i T6
Szczepy T2 i T6 są szczepami tlenowymi, Gram-dodatnimi, tworzącymi przetrwalniki zdolne do wzrostu w temperaturze 65°C. Według NCIMB, w oparciu o następujące wyniki testów, uważa się, że szczepy te są różnymi szczepami Bacillus stearothermophilus.
Bacillus - testy drugiego etapu
Izolat nr T2 (NCIMB 40221) T6 (NCIMB 40222)
1 2 3
Testy w temperaturze 60°C 60°C
Kształt przetrwalników3 E E
Sporangium wyraźnie rozszerzone - -
Przeważająca pozycja spory*5 T T
166 837
1 2 3
Wzrost w warunkach beztlenowychc
Wzrost w 5% NaCl - -
Wzrost w 5% NaCl - -
Wzrost w 10% NaCl - -
Wzrost w bulionie o pH 5,7 - -
Tworzenie kwasu z glukozy d + -
Tworzenie gazu z glukozy® - -
VP (acetoina) -
Mętność agaru z żółtkiem jaja brak wzrostu brak wzrostu
Rozkład kazeiny + +
Rozkład żelatyny + (+)
Eskulina +
Hydroliza skrobi +R +R
N03 - do NO2 - -
Pozostały N - -
Cytrynian. Kosera -
Azydek dekstrozy - -
pH w bulionie VP 5,5 6,3
Koagulacja mleczka lakmusowego - -
Zakwaszenie mleczka lakmusowego - -
Katalaza + +
Oksydaza + +
Temperatury wzrostu °C
25°C - -
37°C - -
65°C + +
70°C - -
aE, eliptyczny lub cylindryczny; S, sferyczny lub zbliżony; hC, centralne; T, terminalne lub subterminalne; CT, centralno-terminalne:c na podłożu agarowym z glukozą; “peptone wate sugar, wskaźnik Andrade’a
R - ograniczona.
Zawartość kwasów tłuszczowych szczepów T2 i T6
Ciepłolubne, dodatnie pod względem aktywności ksylanazy izolaty T2 i T6 wysłano do Microbial ID, Newark, DE Stany Zjednoczone Ameryki w celu oznaczenia składu kwasów tłuszczowych. Otrzymano następujące wyniki:
Skład kwasów tłuszczowych (%) ciepłolubnych izolatów dodatnich pod względem aktywności ksylanazy
Izolat T2 T6
1 2 3
Kwas tłuszczowy
9:0 0,73 0,64
12:0 0,46
14:0 izo
14:0 0,85 1,92
15:0 izo 44,41 46,2
166 837 ciąg dalszy tabeli
1 2 3
15: anteizo 2,59 2,35
15:0 0,53
16: izo 6,25 4,15
16:1 4,24 5,53
16:0 5,29 6,14
17:1 izo H 2,41 2,6
17:0 izo 26,07 22,58
17:0 auteizo 7,15 5,82
18:0 1,09
Charakteiystyka wzrostu szczepów T2 i T6 i wytworzenie zatężonych nieoczyszczonych supematantów z hodowli tych szczepów.
Podłoże do wzrostu: podłoże XMP zawierające w g/litr: wolny od witamin hydrolizat kazeiny, 4; ekstrakt drożdżowy, 0,2; MgSOą, 0,01; (NH^SO-t, 2; K2HPO4: 0,46; KH2PO4, 0,1: ksyloza, 5; MOPS (kwas 3-[N-morfolino]propanosulfonowy), 10,4 i pierwiastki śladowe, pH podłoża wynosiło 7,0. Aktywność ksylanazy:
Aktywność ksylanazy oznaczono przez inkubację świeżego roztworu ksylanu z zewnątrzkomórkowego supernatantu i oznaczano pod kątem wzrostu ilości cukrów redukujących metodą z zastosowaniem żelazicyjanku (Spiro, R.G., 1966, Methods in Enzymology 8; 7-9). Skład buforu do oznaczeń był następujący: 50 mM Tris.Cl, pH 7,0 i 0,5% ksylen (oat spelts, Sigma). Jednostką aktywności ksylanazy jest liczba μ moli cukrów redukujących utworzonych w ciągu 1 minuty w temperaturze 65°C. Zmętnienie podłoża spowodowane obecnością komórek.
Zmętnienie podłoża spowodowane obecnością komórek określono w jednostkach Kletta (KU), 1 KU = 0,004g suchej masy komórek (DCW)/litr. Po osiągnięciu maksymalnej gęstość hodowli, występuje skłonność do lizy, na co wskazuje gwałtowny spadek zmętnienia hodowli.
Szczepy T2 i T6 hodowano w podłożu XMP w ciągu 24 godzin w fermentorze New Brunswick Microferm o pojemności 7,5 litrów. Wzrost prowadzono w objętości roboczej 4 litrów w temperaturze 60°C, przy szybkości mieszania 600 obrotów/minutę i szybkości napowietrzania 7 litrów na minutę. Spieniania usuwano automatycznie przez dodawanie silikonowego środka przeciwpieniącego (5%, Fluka), a objętość roboczą utrzymywano dodając jałowej wody. Początkowe inokula wyjściowe powodowały zmętnienie 10 KU (0,04 g DCW/litr). W ciągu pierwszych 8 godzin fermentacji zmętnienie wywołane obecnością komórek wzrosło odpowiednio dla szczepów T6 i t2 do 540 i 700 KU. W 24 godzinie zmętnienie spadło.
Płyn hodowlany schłodzono do temperatury pokojowej i odwirowano (8000 g, 10 minut, temperatura 20°C) w celu usunięcia komórek. Wolny od komórek supernatant zawierał 1,0-1,4 i 2,0-2,4 jednostek ksylanazy na ml odpowiednio dla szczepów T2 i T6 i dla obu szczepów około 0,02 mg białka na ml. Białko zatężono przez dodanie do supernatantu stałego siarczanu amonu do 80% wysycenia w temperaturze 4°C i po 12 godzinach w temperaturze 4°C mieszaninę odwirowano (9000 g, 15 minut). Osad rozpuszczono w objętości całkowitej 100 ml 10 mM buforu fosforanowego o pH 7,0 i trzykrotnie dializowano wobec 5 litrów tego samego buforu w temperaturze 4°C. Po dializie, roztwór (około 120 ml) zawierał około 7 mg/ml białka i odpowiednio dla szczepów T2 i T6 15-20 i 35-40 jednostek aktywności ksylanazy.
166 837
Wzrost szczepu T6
Czas (h) KU Ksylanaza /U/ml/
0 10 nd
2 25 nd
4 140 nd
6 400 1.48
8 540 1.88
11 540 1.78
14 528 2.26
24.5 280 2.42
Wzrost szczepu T-2
Czas (h) KU Ksylanaza /U/ml/
0 10 nd
2 30 nd
4 160 0,75
6 430 0,58
8 700 0,98
11 600 1,05
24 250 1,28
Należy zauważyć, że aktywność ksylanazy szczepów T2 i T6 nie obniżała się pod koniec fermentacji.
Preparat wykazujący aktywność enzymatyczną
Pozbawione komórek supernatanty otrzymane z podłóż po wzroście szczepów T2 i T6 w podłożu XMP zawierają przynajmniej jedną ksylanazę, ponieważ, jak wykazano, przejawiają aktywność ksylanazy. Te supernatanty (nazywane także nieoczyszczonymi preparatami enzymatycznymi) i ich częściowo oczyszczone frakcje zastosowano do obróbki niebielonej i półbielonej tlenem masy celulozowej siarczanowej z drewna miękkiego.
Niebielone i półbielone tlenem próbki masy celulozowej.
Próbki masy celulozowej były próbkami masy celulozowej siarczanowej z drewna miękkiego, pobranymi z młynu Korsnas.
Próbki niebielonej masy celulozowej były próbkami pobranymi po alkalicznym trawieniu w warniku Kamyr, laboratoryjnie przesianymi i przemytymi, po czym próbki te suszono w ciągu nocy w temperaturze 50°C. Pół suchą próbkę stosowano w doświadczeniach, a oznaczono ją K8. Materiał ten wysuszono w temperaturze 105°C do stałej wagi, otrzymując zawartość wody 6,35%.
Próbka półbielonej tlenem masy celulozowej była próbką poddaną obróbce na linii 3 w młynie w Korsnas, a pobrano ją po drugiej obróbce tlenem, przesiano laboratoryjnie i przemyto. Ogólny opis obróbki masy celulozowej w młynie Korsnas opublikowano w Paper 26, wrzesień 1989, str. 20 i Nordisk Cellulosa 1989, nr 6, str. 8-11.
Próbkę półbielonej tlenem masy celulozowej oznaczono K11.
Zawartość ligniny w próbkach K8 i K11.
Zawartość ligniny w próbkach masy celulozowej K8 i K11 oznaczono według procedury The Swedish Association of Pulp and paper Engineers, Seria CCA5. Zawartość ligniny w K8 (próbka niebielonej masy celulozowej) wynosiła 2,8%, a zawartość ligniny w K11 (próbka półbielonej tlenem masy celulozowej) wynosiła 2,0%. A zatem, półbielona tlenem próbka K11 wykazywała zawartość ligniny obniżoną o około 25% w porównaniu z K8.
166 837
Doświadczenia przeprowadzone z nieoczyszczonymi preparatami enzymatycznymi ze szczepów T2 i T6 Bacillus stearothermophilus odnośnie delignifikacji mas celulozowych K8 i K11.
W celu oszacowania, ile ligniny można wyekstrahować po obróbce preparatami enzymatycznymi według wynalazku, zastosowano czułe oznaczenia spektrofotometiyczne. Mierzono wartości absorbancji próbek supernatantów przy długości fali 350 nm (A350) i mierzone wartości wyrażono jako % uwolnionej ligniny.
Doświadczenia i wyniki podsumowano w tabelach 1-5.
Z danych podanych w tabelach 1-5 można wywnioskować, że nieoczyszczone preparaty enzymatyczne ze szczepów T2 i T6 Bacillus stearothermophilus są zdolne do delignifikacji próbek masy celulozowej zarówno niebielonej, jak i półbielonej w pH przynajmniej 9 i temperaturach wynoszących przynajmniej 65°C. Co więcej, można wyciągnąć wniosek, że % uwolnionej ligniny zależy zarówno od czasu, jak i od stężenia.
Tabela 1
Uwalnianie ligniny z masy K11 jako funkcja nieoczyszczonych preparatów enzymatycznych ze szczepów T2 i T6
B. stearothermophilus3)
Enzym (mg/ml) % uwolnionej ligniny b)
całkowity netto
0 8
T2 (0,6) 14 6
T2 (0,8) 17 9
T2 (1,2) 20 12
T2 (1,9) 22 14
T6 (0,25) 16 8
T6 (0,5) 18 10
T6 (1,1) 19 11
a) Preparaty enzymatyczne były osadami po funkcjonowaniu siarczanem amonu, które rozpuszczono w 10 mM buforze fosforanowym o pH 9,0 do końcowego stężenia białka jak wskazano. Kontrolę stanowił 10 mM bufor fosforanowy o pH 9,0 W 3 ml znajdowało się 150 masy K11.
o5 Inkubację prowadzono w ciągu 18 godzin w temperaturze 65oC i przy pH 9,0. % uwalnianej ligniny oparto na A350 i uwzględniono poprawki na absorbancję nieoczyszczonego preparatu enzymatycznego w odpowiednim stężeniu.
Tabela 2
Kinetyka uwalniania ligniny z masy K11 przez nieoczyszczony preparat enzymatyczny ze szczepów T2 i T6.
B.stearothermophilus31
Czas (h) Enzym15) % uwolnionej ligniny
całkowity netto
1 2 3 4
2 T2 17 12
4 T2 23 18
18 T2 29 21
166 837
1 2 3 4
2 4 6 18 T6 T6 T6 T6 12 15 17 18 5 8 9 10
a) Doświadczenie przeprowadzono jak opisano przy tabeli 1 w temperaturze 65°C i pH 9,0. bb Stężenia nieoczyszczonych enzymów T2 i T6 wynosiły odpowiednio 2,8 i 1,5 mg białka/ml. Tabela3 Uwalnianie ligniny przez nieoczyszczony preparat enzymatyczny ze szczepów T2 i T6 B. stearothermophilus w zależności od temperatury3)
Temperatura °C Enzymb) % uwolnionej ligniny
całkowity netto
53 65 75 53 65 75 T2 T2 T2 T6 T6 T6 16 19 20 15 18 20 6 9 5 5 8 5
a; Doświadczenie przeprowadzono jak opisano przy tabeli 1 w temperaturze 65°C i pH 9,0. bb Stężenia nieoczyszczonych enzymów T2 i T6 wynosiły odpowiednio 1,7 i 0,7 mg białka/ml. Tabela 4 Uwalnianie ligniny z K11 w zależności od pHa)
pH Enzymb) % uwolnionej ligniny
całkowity netto
7 8 9 10 7 8 9 10 10.5 T2 T2 T2 T2 T6 T6 T6 T6 T6 14 14 17 18 13 15 19 18 18 6.4 6.1 7.7 8.3 4 6 9 7 6
a) Doświadczenie przeprowadzono jak opisano przy tabeli 1 w temperaturze 65°C w ciągu 18 godzin. b Stężenia nieoczyszczonych preparatów enzymatycznych T2 i T6 wynosiły odpowiednio 1,7 i 1,5 białka/ml.
Tabela 5
Uwalnianie ligniny z próbki K8a)
Preparat enzymatyczny Stężenie (mg/ml) % uwolnionej ligniny
całkowity netto
1 2 3 4
T2 0,8 16 5
T2 1,2 17 6
T2 1,6 20 9
166 837 ciąg dalszy tabeli 5
1 2 3 4
T6 0,3 14 3
T6 0,6 15 4
T6 1,1 17 6
Doświadczenie przeprowadzono jak opisano przy tabeli 1 w temperaturze 65°C i pH 9,0 w ciągu 18 godziny stosując zamiast próbki K11 próbkę K8.
Wytworzenie frakcji o wysokim stopniu oczyszczenia z hodowli szczepu T6. Oczyszczoną w wysokim stopniu frakcję (w postaci ksylanazy) sklarowanej brzeczki hodowlanej z hodowli szczepu T6 można otrzymać przez zastosowanie wymieniacza kationowego w pojedynczym etapie zatężania i oczyszczania. A zatem, ksylanazę T6 oczyszczono i zatężono bezpośrednio z wolnego od komórek supernatantu przez adsorpcję z wymieniaczem kationowym CM-52 (Whatman). Z podłożem XMP wydajność odzysku wyniosła jednakże tylko 21%, przypuszczalnie z powodu wysokiej siły jonowej podłoża. Gdy podłoże oddializowano wobec buforu o niskiej sile jonowej, lub gdy podłoże nie zawierało MOPS, wydajność odzysku wynosiła około 50%. W celu określenia minimalnej ilości CM-52 potrzebnej do wydajnej adsorpcji ze sklarowanego podłoża hodowlanego, testowano oczyszczenie ksylanazy T-6 przez różne ilości CM-52. Wyniki przedstawiono w tabeli.
Tabela 6.
Pozakolumnowa adsorpcja ksylanazy T-6 na różnych ilościach CM-52
CM-52/brzeczka (g/g) Frakcja Objętość (ml) Ksylanaza (U/ml) Całkowita liczba jednostek Wydajność (%)
Supernatant 100 0,78 78,0 100,0
0,1 Ekstrakt 40 1,04 41,6 53,3
Nezaadsorbowana 100 0,055 5,5 7,0
0,05 Ekstrakt 30 1,3 39,9 50,0
Niezaadsorbowana 100 0,077 7,7 9,8
0,02 Ekstrakt 15 1,94 29,1 37,3
Niezaadsorbowana 100 0,16 16,0 20,3
0,01 Ekstrakt 14 2,05 28,7 36,8
Niezaadsorbowana 100 0,24 24,0 30,8
Jak przedstawiono w tabeli 6, przy 5% adsorbenta wydajność wynosi 50%.
Innym dostępnym w handlu wymieniaczem kationowym jest SE-52. (Whatman) (gupami naładowanymi ujemnie są grupy sulfoksyetylowe związane z celulozą). Wiadomo, że SE-52 posiada większą zdolność wiązania niż CM-52. Ponieważ etap oczyszczania jest także etapem zatężania, korzystne jest zastosowanie tak małej ilości adsorbenta, jak tylko jest to możliwe. Dlatego też wypróbowano SE-52 do adsorbcji ksylanazy.
Wyniki podano w tabeli 7.
Tabela 7
Pozakolumnowa adsorpcja ksylanazy T-6 na różnych ilościach SE-52
SE-52/brzeczka (g/g) Frakcja Objętość (ml) Ksylanaza Całkowita liczba jednostek Wydajność
Supernatant 100 1,41 141,0 100,0
0,05 Ekstrakt 30 2,4 72,0 51,1
0,02 Ekstrakt 21 3,2 67,8 48,0
0,01 Ekstrakt 20 2,9 58,0 41,1
166 837
Jak przedstawiono w tabeli 7, do uzyskania 48% odzysku ksylanazy T-6 potrzeba tylko 2% SE-52.
Charakterystyka ksylanazy T6
Masę cząsteczkową ksylanazy T-6 określono przy użyciu SDS-PAGE i sączenia molekularnego, otrzymując wartość pomiędzy 41 000 i 42 000 Daltonów. Fakt, że obie metody dały podobne wartości masy cząsteczkowej wskazuje, że enzym składa się z pojedynczego łańcucha polipeptydowego (SDS-PAGE rozdziela podjednostki białka), pI (pH w którym całkowity ładunek białka równyjest zero) enzymu wynosi 9,0jak określono przez wysokonapięciowe ogniskowanie izoelektryczne. Stosunkowo wysokie pI enzymu wyjaśnia jego dodatni ładunek w pH obojętnym. Optimum pH enzymu wynosi około 7,0; w pH 9,0 enzym posiada około 50% swojej aktywności w pH 7,0. Profil temperaturowy aktywności ksylanazy T-6 podano w tabeli 8.
Tabela 8
Aktywność ksylanazy T6 w różnych temperaturach*
Temperatura °C Względna aktywność %
45 28
55 51
60 70
65 81
70 92
75 100
80 73
85 40
*Czas reakcjj: 5 minut
Termostabilność ksylanazy T6 w temperaturze 65°C i pH 9 przedstawiono w tabeli 9..
Tabela 9
Termostabilność ksylanazy T6 w temperaturze 65°C i pH 9
Czas Aktywność względna
h %
0 100
0,25 82
0,5 78
1 75
2 72
4 63
Należy ponadto wspomnieć, że w temperaturze 65°C i pH 7 nie wykryto żadnej utraty aktywności przez ponad 10h.
Wytworzenie konstytutywnych mutantów wytwarzających ksylanazę T6.
Do otrzymania mutantów wykorzystano fakt, że w wielu przypadkach ksylanaza i ksylozydaza pozostają pod wspólną kontrolą regulacyjną (ten sam represor). Szczepy wytwarzające ksylozydazę można łatwo wykrywać na płytkach agarowych zawierających chromogenny substrat p-nitrofenylo-B-D-ksylopiranozyd (ONPX). W nieobecności ksylozy, tylko konstytutywne mutanty pod względem ksylozydazy powodują żółte zabarwienie płytek agarowych.
166 837
W celu otrzymania konstytutywnych mutantów ksylozydazy, komórki mutagenizowano za pomocą MNNG (1-metylo-3-nitro-1-nitrozoguanidyna), a następnie wysiewano na płytki agarowe zawierające ONPX bez ksylozy. Około jedna na pięćset komórek tworzyła kolonię, która powodowała powstanie żółtego zabarwienia na płytkach agarowych. W ten sposób wyizolowano trzydzieści konstytutywnych mutantów ksylozydazy, i wszystkie z nich były także konstytutywne odnośnie ksylanazy.
Wzrost i wytwarzanie ksylanazy przez dwa z nich (M-7 i M-28) podczas wzrostu w obecności ksylozy i glukozy przedstawiono w tabelach 10 i 11.
Na obu podłożach (XMP i GMP) mutanty i T6 wykazywały podobne szybkości wzrostu. Mutanty jednakże wytwarzały znacznie wyższe poziomy ksylanazy na podłożu XMP w porównaniu ze szczepem T-6. Na podłożu GMP (źródłem węgla jest glukoza) szczep T-6 nie wytwarzał wykrywalnych poziomów ksylanazy, podczas gdy mutanty wytwarzały wysoki poziom aktywności ksylanazy. Ksylanazę ze szczepu M-7 oczyszczono i wykazano, że posiada identyczne właściwości jak ksylanaza T-6.
Tabela 10
Wzrost i wytwarzanie ksylanazy przez konstytutywne mutanty wytwarzające ksylanazę T-6 na XMP
Szczep Czas 00 Zmętnienie (KU) Ksyl^anaza (U/ml)
T6 0 10
T6 2 40 -
T6 4 150 0,5
T6 6 200 0,8
T6 12 310 2,1
T6 24 290 2,3
T6 30 270 -
M7 0 10 -
M7 2 30 -
M7 4 190 0,9
M7 6 270 1,6
M7 12 350 2,1
M7 24 310 23
M7 30 310 -
M28 0 20 -
M28 1 20 -
M28 4 40 0,6
M28 6 120 2,0
M28 10 370 5,5
M28 24 320 7,2
Tabela 11
Wzrost i wytwarzanie ksylanazy przez konstytutywne mutanty wytwarzające ksylanazę T-6 na GMP
Szczep Czas (h) Zmętnienie (KU) Ksylanaza (U/ml)
T6 0 20
T6 2 30 0
T6 4 80 0,1
166 837
1 2 3 4
T6 6 230 0,1
T6 8 340 0,1
T6 23 390 0,1
T6 32 370 -
M7 0 20 -
M7 2 70 0,3
M7 4 100 0,6
M7 6 310 1,1
M7 8 340 1,4
M7 23 330 2,2
M7 32 300 -
M28 0 20 -
M28 1 20 -
M28 4 30 0,1
M28 6 100 0,9
M28 8 190 1,7
M28 10 320 3,1
M28 23 330 4,8
Sekwencja fragmentu i skład aminokwasowy ksylanazy T6
Na podstawie dostatecznie długiego odcinka N-końcowej sekwencji aminokwasowej białka można jednoznacznie je zidentyfikować. Sekwencję jednego fragmentu ksylanazy T-6 dwukrotnie określono w Weizman Institute, Izrael stosując mikrosekwentator ABI 475A firmy Applied Biosystems działający w fazie gazowej. Pierwszą próbkę białka poddano elektroblottingowi na membranę PVDF (Millipore) i otrzymano tylko 20 aminokwasów. Drugą próbkę białka oczyszczono najpierw na kolumnie HPLC. Superose 12 (Pharmacia) i była ona odpowiednia do otrzymania sekwencji 41 aminokwasów. Otrzymano następującą sekwencję:-Lys-Asn-Ala-Asp-Ser-Tyr-Ala-Lys-Lys-Pro-His-IIe-Ser-A]a-Leu-Asn-Ala-Pr o-Gln-Leu-Asn-Gln-Arg-Tyr-Lys-Asn-Glu-Phe-Thr-Ile-Gly-Ala-Ala-Val-Glu-Pro-Tyr-G ln-Leu-Gln-AsnW celu dalszej charakterystyki enzymu przeprowadzono analizę składu aminokwasowego oczyszczonej ksylanazy T-6. Wyniki tej analizy przedstawiono w tabeli 12
Tabela 12
Skład aminokwasowy ksylanazy T-6
Numer Czas Nazwa Stężenie Reszty na
piku retencji składnika (nmole) cząsteczkę8)
1 2 3 4 5
1 8,08 Kwas asparaginowy 4.705 58b)
2 9,76 Treonina 0.851 12
3 10,45 Seryna 0.672 10
4 14,05 Kwas glutaminowy 3.639 44c
5 15,52 Prolina 1.950 24
6 18,80 Glicyna 1.640 20
7 19,84 Alanina 2.439 30
8 20,80 Cystyna 0.061 1
9 21,81 Walina 2.250 28
10 23,60 Metionina 0.150 2
11 24,64 Izoleucyna 2.064 26
12 25,39 Leucyna 1.027 14
166 837
1 2 3 4 5
413 28,75 Tyrozyna 1.613 22
14 29,87 Fenyloalanina 1.269 16
15 38,37 Lizyna 3.124 38
16 39,95 Amoniak 3.691
17 42,65 Histydyna 0.560 6
18 48,05 Arginina 0.904 12
a) w oparciu o masę cząsteczkową 42 000 Daltonów; przyjęto poprawki dla aminokwasów nietrwałych. b Ilość kwasu asparaginowego stanowi sumę ilości kwasu asparaginowego i asparaginy (ASX). c) Ilość kwasu glutaminowego stanowi sumę ilości kwasu glutaminowego i glutaminy (Glx).
Doświadczenia na masie K14 prowadzone z udziałem enzymu.
Próbka masy celulozowej K14 była półbieloną tlenem masą celulozową z drewna miękkiego z młyna Korsnas. Enzym stanowiła oczyszczona ksylanaza z ciepłolubnego szczepu T6.
Badano różne parametry wpływające na stopień delignifikacji próbki K14.
Wpływ stężenia włókien podsumowano w tabeli 13
Tabela 13
Wpływ stężenia na obróbkę ksylanazą*
Ksylanaza (U/ml) Włókno % Uwolniona lignina netto %
5.1 4.7 4.9
5.1 2.5 6.6
20.4 4.7 9.3
20.4 2.5 11.8
15.0 1.0 15.0
40.8 2.5 13.9
45.0 1.0 16.7
* Warunki: pH 9,0 temperatura 65°C, 2 godziny, próbka K14.
W żadnym przypadku nie odejmowano kontroli enzymatycznej.
Jak jest to widoczne w tabeli 13, obniżenie ciśnienia włókien z 4,7 do 2,5 i do 1,0% suchej masy włókien wzmacniało proces. Ponieważ obróbkę enzymatyczną przeprowadza się bez mieszania jest prawdopodobne, że pomiędzy enzymem i nierozpuszczalnym substratem występował słaby kontakt. Z przyczyn praktycznych zdecydowano się na pracę z próbką zawierającą 2,5% włókien.
Wpływ pH przedstawiono w tabeli 14.
Tabela 14
Wpływ pH na obróbkę ksylanazą*
pH Bufor Uwolniona lignina netto (%)
8,5 0,01 M fosforan 8,3
9,0 8,4
9,5 6,3
8,5 0,1 M Na2SO4 10,9
9,0 10,2
9,5 8,2
Warunki: próbka K14 2,5%, 15 U/ml ksylanazy, 2 godziny, temperatura 65°C.
166 837
Jak jest to widoczne w tabeli 14, enzym jest najbardziej skuteczny przy pH 8,5-9,0 zarówno w fosforanie potasowym, jak i siarczanie sodowym. Wcześniejsze doświadczenia wykazywały na niższe aktywności poniżej pH 8,0 i powyżej pH 9,5.
Wpływ stężenia Na2SO4 przedstawiono w tabeli 15.
Tabela 15
Wpływ stężenia Na2SO4*
Na2SO4 (M) Uwolniona lignina netto (%)
0 7.2
0.01 8.6
0.05 9.9
0.10 10.8
0.15 11.5
0.20 10.7
Warunki: próbka K14 2,5%, 10 U/ml ksylanazy, pH 9,0. Temperatura 65°C, 2 godziny.
Obróbka była skuteczna przy stężeniach Na2SO4 od 0 do 0,2 M, z optimum aktywności przy 0,15 M Na2SO4.
Wpływ stężenia ksylanazy podsumowano w tabeli 16.
Tabela 16
Uwalnianie ligniny w zależności od stężenia ksylanazy*
Ksylanaza (U/ml) Bufor Uwalnianie ligniny (% Klason)
0 0.01 M fosforan potasowy 0
5 8
10 10
15 12
45 14
0 0.1MNa2SO4 0
5 12
10 13
15 14
45 16
Warunki: K-14 o zawartości suchego włókna 2,5% 2 godziny pH 9, temperatura 65°C.
Jak jest to widoczne w tabeli 16, występowało zależne od stężenia uwalnianie ligniny do około 15 U/ml, zarówno w 0,1 M Na?SO4, jak i w buforze fosforanowym. Wyższe stężenia enzymu lub dłuższy okres inkubacji (4 godziny) zwiększyły uwalnianie ligniny netto jedynie nieznacznie.
Przygotowanie próbek obrabianej masy K14 ważących 10g i 50g do dalszych testów.
gramowe próbki K14 poddawano obróbce 15 U/ml i 45 U/ml ksynaiizy w ciągu 2 i 4 godzin, stosując odpowiednie kontrole. Wszystkie próbki przygotowano w dwóch powtórzeniach. Wszystkie inkubacje prowadzono przy pH 9,0 i w temperaturze 65°C. Spektrofotometryczną analizę uwalniania ligniny przedstawiono w tabeli 17 (bufor fosforanowy) i 18 (0,1 M Na2SO4). Uwalnianie ligniny netto pozostawało w zakresie od 10,3 do 14,9% w obecności 45 U/ml enzymu i przy 4 godzinnych okresach inkubacji dawało nieznacznie wyższe wartości niż w obecności 15 U/ml i przy 2 godzinach.
166 837
W końcu, w celu dodatkowej analizy poddawano obróbce w dwóch powtórzeniach próbki o masie 50g. Uwalnianie ligniny netto wynosiło 10,8% dla 15 U/ml enzymu w ciągu 2 godzin i 12,6% dla 15 U/Ml w ciągu 4 godzin.
Tabela 17
Obróbka ksylanazą 10 gramowych próbek K14 w buforze fosforanowym *
Ksylanaza (U/ml) Czas (h) Uwolniona lignina (%)
całkowita netto
0 2 5.3 0
15 2 15.6 10.3
45 2 17.9 12.6
0 4 6.3 0
15 4 17.4 11.1
45 4 20.1 13.8
Warunki: próbka K14 2,5%, pH 9,5 temperatura 65°C; z dwóch
Tabela 18
Obróbka ksylanazą 10 gramowych próbek K14 o 0,1 M Na2SO4
Ksylanaza (U/ml) Czas (h) Uwolniona lignina (%)
całkowita netto
0 2 5.9 0
15 2 17.6 11.7
45 2 19.8 13.9
0 4 7.0 0
15 4 19.4 12.4
45 4 21.9 14.9
Warunki; jak przy tabeli 17.
Analiza 10 gramowych próbek traktowanych ksylanazą:
Wyniki analiz podsumowano w tabelach 19-23.
Parametry podane w tabelach określono seriami testów SCAN, z wyjątkiem wartości zerowej odległości wpięcia, które mierzono według instrukcji producentów (Pulmac Instruments Ltd. Kanada). Tabela 19 przedstawia dane otrzymane przy użyciu próbek masy, które poddawano obróbce w ciągu 2 godzin w temperaturze 65°C, pH 9,0, w 0,1 M Na2SO4, bez enzymu (kontrola) i z 15 U/ml enzymu. Jak widać, występowała doskonała powtarzalność pomiędzy, przygotowywanymi w dwutygodniowych odstępach, powtórzeniami próbek. Największy wpływ był wywierany na zawartość pentosanu, która obniżała się o 17,4%. Występowały małe, ale istotne, obniżenia liczby kappa i wskaźników rozciągliwości oraz wzrost białości, lepkości i wartości zerowej odległości wpięcia.
Parametry powyższych właściwości masy celulozowej lub arkusików laboratoiyjnych wykonanych z masy celulozowej nie różniły się bardzo przy poddawaniu obróbce 15 U/ml i 45 U/ml enzymu, w ciągu 2 i 4 godzin oraz zastosowaniu 0,01 M fosforanu potasowego i 0,1 M Na2SO4 (tabele 20 i 21).
W celu analizy ważności tych danych, parametry masy celulozowej i papieru przedstawiono w tabelach 22 i 23 jako procentowe zmiany w porównaniu z odpowiednimi próbkami kontrolnymi.
166 837
Wnioski są następujące:
1. Pentosany są częściowo usuwane (10,4-22,2%); wyższe poziomy enzymu usuwają więcej pentosanów.
2. Występuje mały, ale znaczący, wzrost lepkości; można to wyjaśnić przez usuwanie pentosanów (około 1% suchej masy K14). Brak dowodów na degradację celulozy, nawet przy najwyższych stężeniach enzymu przy 4 godzinach w temperaturze 65°C w pH 9.
3. Liczba kappa obniża się we wszystkich testowanych ośmiu warunkach (zakres 5,5-9,1%). Ponieważ nie obniżają się dalej przy wyższych stężeniach enzymu (podczas gdy w przypadku pentosanów tak), wydaje się, że wyższe poziomy enzymu usuwają pentosany, które nie były związane z ligniną.
4. Dla wszystkich ośmiu testowanych warunków, arkusiki laboratoryjne wykazywały małe wzrosty białości i wartości zerowej odległości wpięcia oraz obniżenie wskaźników rozciągliwości.
Tabela 19
Obróbka ksylanazą próbki K14*
Parametr Kontrola Poddane obróbce enzymatycznej Średnia zmiana %
Liczba kappa Lepkość (dm3/kg) Pentosan (%) 17,3 1066 9,1 16,8 1045 9,3 16,0 1072 7,7 15.5 1059 7.5 -7,6 -0,8 -17,4 (±01) (±01) + (± 1,8)
2 Arkusiki laboratoryjne (75 g/m )
Białość (% ISO) Wskaźnik rozciągliwości (Nm/g) Zerowa odległość wpięcia /Wet/, (Nm/g) 32,5 20,9 95,2 32.8 20,4 97.8 33,4 19,0 101,5 33,8 19.3 104.3 +2,9 -7,2 +6,3 (±0,1) (± 1,8) (±0,3)
Warunki: 15 U/ml enzymu, pH 9,0 2 godziny 0,1 M Na2SO4
Tabela 20
Obróbka ksylanazą próbki K14 w 0,1 M Na2SO4‘X
Parametr 0/ml 2h 15 U/ml 2h 45U/ml 2h 0/ml 4h 15U/ml 4h 45U/ml 4h
Kappa 17,1 15,8 16,0 17,0 15,4 15,8
Lepkość 1055 1066 1072 1061 1075 1075
Pentosan 9,2 7,6 7,3 9,0 7,5 7,0
Białość 32,6 33,6 34,1 32,6 34,1 34,4
Rozciągliwość 20,7 19,2 20,7 21,2 19,6 19,8
Zerowa odległość wpięcia 97 103 104 100 104 103
x) Średnia z dwóch doświadczeń: warunki jak przy tabeli 19.
166 837
Tabela 21
X i
Obróbka ksylanazą próbki K14 w 0,01 M buforze fosforanowym '
Parametr 0/ml 2h 15 U/ml 2h 45 U/ml 2h 0/ml 4h 15 U/ml 4h 45 U/ml 4h
Kappa 17,0 15,9 16,0 17,2 16,0 16,2
Lepkość 1065 1073 1076 1060 1070 1073
Pentosan 9,1 8,2 7,4 9,0 7,9 7,4
Białość 31,8 33,2 33,6 32,6 33,2 33,7
Rozciągliwość 21,0 19,2 20,4 20,9 19,4 203
Zerowa odległość wpięcia 101 101 107 99 102 104
x ^Średnia z dwóch doświadczeń.
Tabela 22
Obróbka ksylanazą próbki K14x^
Parametr Zmiana /%/
15 U/ml 2h 15 U/ml 4h 45 U/ml 2h 45 U/ml 4h
Kappa -7,6 -9,1 -5,9 -7,1
Lepkość +0,8 + 1,4 + 1,5 + 1,4
Pentosan -17,4 -16,5 -20,6 -22,2
Białość +2,9 +4,4 +4,7 +5,3
Rozciągliwość -7,2 -7,5 -6,8 -6,4
Zerowa odległość wpięcia +6,3 +3,7 +7,1 3,0
x) 0,1 M Na2SO4: dane z tabeli 20
Tabela 23
Obróbka ksylanazą próbki K14x)
Parametr Zmiana /%/
15 U/ml 2h 15 U/ml 4h 45 U/ml 2h 45 U/ml 4h
Kappa -7,3 -7,0 -6,7 -5,5
Lepkość +0,8 +0,9 +1,0 +1,2
Pentosan -10,4 -12,7 -20,7 -18,4
Białość +4,3 +2,8 +5,3 +3,2
Rozciągliwość -8,8 -7,4 -3,3 -2,9
Zerowa odległość wpięcia -0,7 +8,3 +5,8 +5,2
x) 0,01 M fosforan: dane z tabeli 21.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 1,00 zł.

Claims (8)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Preparat delignifikacyjnie aktywny na osnowie enzymu zawierający substancje pomocnicze, znamienny tym, że jako enzym zawiera ksylanazę wyizolowaną z Bacillus stearothermophilus NCIMB 40221 lub Bacillus stearothermophilus NCIMB 40222 o działaniu delignifikującym o częściowej N-terminalnej sekwencji aminokwasów -Lys-Asn-Ala-Asp-Ser-Tyr-Ala-Lys-Lys-Pro-His-Ile-Ser-Ala-Leu-Asn-Ala-Pro-Gln-Leu-Asn-Gln-Arg-Tyr-Lys-Asn-Glu-Phe-Thr-Ile-Gly-Ala-Ala-Val-Glu-Pro-Tyr-Gln-Leu-Gln-Asn- i punkcie izoelektrycznym 9,0 określonym metodą izoelektrycznego ogniskowania oraz przybliżonej masie cząsteczkowej 41000-42000 Daltonów określonej metodami SDS - PAGE i sączenia molekularnego oraz o przybliżonym składzie aminokwasów wyrażonym w liczbie reszt aminokwasowych w cząsteczce, określonym metodą analizy aminokwasów: Asx 58;Thr 12; Ser 10; Glx 44; Pro 24; Gly 20; Ala 30; Cys 1; Val 28; Met 2; Ile 25; Leu 14; Tyr 22; Phe 16; Lys 38; His 6; Arg 12, w postaci nieoczyszczonej, częściowo oczyszczonej lub w postaci o wysokim stopniu czystości.
  2. 2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako nieoczyszczoną postać ksylanazy zawiera sklarowaną brzeczkę hodowlaną
  3. 3. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako częściowo oczyszczoną postać ksylanazy zawiera częściowo oczyszczoną frakcję otrzymaną przez wytrącenie siarczanem amonu.
  4. 4. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako postać ksylanazy o wysokim stopniu czystości zawiera frakcję oczyszczoną w wymieniaczu kationowym.
  5. 5. Sposób wywarzania preparatu delignifikacyjnie aktywnego na osnowie enzymu przez tlenową fermentację bakterii wytwarzających ksylanazę w odpowiednim podłożu zawierającym pożywkę konieczną do biosyntezy tego enzymu, znamienny tym, że jako bakterie wytwarzające ksylanazę stosuje się bakterie szczepu Bacillus stearothermophilus NCIMB 40221 lub szczepu Bacillus stearothermophilus NCIMB 40222, a otrzymaną w procesie fermentacji brzeczkę klaruje się i ewentualnie oczyszcza się i zatęża zawartą w niej ksylanazę.
  6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że brzeczkę fermentacyjną klaruje się przez wirowanie.
  7. 7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że ze sklarowanej brzeczki fermentacyjnej wytrąca się ksylanazę za pomocą siarczanu amonu i ewentualnie ponownie zawiesza się ją w podłożu płynnym.
  8. 8. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że sklarowaną brzeczkę fermentacyjną oczyszcza się i zatęża w wymieniaczu kationowym.
PL90295425A 1990-01-10 1990-12-28 Preparat dellgnifikacyjnle aktywny na osnowie enzymu i sposób wytwarzania preparatu delignifikacyjnle aktywnego m a osnowie enzymu PL PL PL PL PL PL166837B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9000070A SE465320B (sv) 1990-01-10 1990-01-10 Preparat som uppvisar enzymatisk delignifieringsaktivitet, saett att framstaella detsamma och tillaempningar daerav
PCT/SE1990/000885 WO1991010724A1 (en) 1990-01-10 1990-12-28 Preparation exhibiting enzymatic delignification activity, a method of producing the same, and applications thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL166837B1 true PL166837B1 (pl) 1995-06-30

Family

ID=20378196

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL90295425A PL166837B1 (pl) 1990-01-10 1990-12-28 Preparat dellgnifikacyjnle aktywny na osnowie enzymu i sposób wytwarzania preparatu delignifikacyjnle aktywnego m a osnowie enzymu PL PL PL PL PL

Country Status (22)

Country Link
US (1) US5434071A (pl)
EP (1) EP0585217B1 (pl)
JP (1) JPH05505722A (pl)
KR (1) KR920703793A (pl)
AT (1) ATE150787T1 (pl)
AU (1) AU631485B2 (pl)
BR (1) BR9007975A (pl)
CA (1) CA2073436A1 (pl)
DE (1) DE69030326D1 (pl)
FI (1) FI923016A0 (pl)
IE (1) IE62344B1 (pl)
IL (1) IL96922A0 (pl)
LT (1) LT3970B (pl)
LV (1) LV10489B (pl)
NO (1) NO922727L (pl)
NZ (1) NZ236708A (pl)
PL (1) PL166837B1 (pl)
PT (1) PT96461B (pl)
RU (1) RU2054480C1 (pl)
SE (1) SE465320B (pl)
WO (1) WO1991010724A1 (pl)
ZA (1) ZA91179B (pl)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677161A (en) * 1990-01-10 1997-10-14 Korsnas Aktiebolag Preparation exhibiting enzymatic activity, a method of producing the same, and applications thereof
WO1991018976A1 (en) * 1990-06-08 1991-12-12 Novo Nordisk A/S HEMICELLULASES PRODUCED BY $i(BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS)
GB9018426D0 (en) * 1990-08-22 1990-10-03 Sandoz Ltd Improvements in or relating to novel compounds
WO1993020192A1 (en) * 1992-03-31 1993-10-14 Korsnäs Aktiebolag DELIGNIFYING PREPARATION EXHIBITING α-L-ARABINOFURANOSIDASE ACTIVITY, PRODUCTION AND APPLICATION THEREOF
DK105592D0 (da) * 1992-08-26 1992-08-26 Novo Nordisk As Nyt enzym
JP2807612B2 (ja) * 1993-03-12 1998-10-08 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 新規キシラナーゼ、その製造法、該キシラナーゼによるパルプ処理方法及びキシロオリゴ糖の製造法
JPH0787957A (ja) * 1993-07-28 1995-04-04 Nippon Paper Ind Co Ltd 微生物ｓｋｂ−１１５２株及びそれを利用したパルプの漂白方法
CA2156048C (en) * 1993-12-24 2010-11-16 Pieter Van Solingen Alkali-tolerant xylanases
US6506592B1 (en) * 1998-08-18 2003-01-14 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Hyperthermophilic alpha-glucosidase gene and its use
KR20040033143A (ko) * 2002-10-11 2004-04-21 한남수 써모토가 마리티마의 아라비노푸라노시데이즈, 및 이를이용한 아라비노스 생산방법
US7960148B2 (en) 2003-07-02 2011-06-14 Verenium Corporation Glucanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CA2891101A1 (en) 2003-08-11 2005-03-10 Basf Enzymes Llc Laccases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
WO2006031554A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Novozymes North America, Inc. Methods for preventing, removing, reducing, or disrupting biofilm
USRE45660E1 (en) 2006-02-14 2015-09-01 Bp Corporation North America Inc. Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
DK2069389T3 (en) 2006-08-04 2015-01-12 Bp Corp North America Inc Glucanases, nucleic acids encoding them, and processes for their preparation and use
BRPI0817811A2 (pt) 2007-10-03 2014-10-14 Verenium Corp Xilanases, ácidos nucleicos que codificam as mesmas e métodos para fabricação e uso das mesmas.
JP6384720B2 (ja) 2014-07-30 2018-09-05 株式会社デンソー 回転角度検出装置

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2557894B1 (fr) * 1984-01-10 1986-12-12 Centre Tech Ind Papier Procede de traitement de pates papetieres par une solution enzymatique favorisant la fibrillation et pates ainsi traitees.
US4692413A (en) * 1985-07-15 1987-09-08 Repligen Corporation Use of rLDM™ 1-6 and other ligninolytic enzymes for the decolorization of E1 effluent
FR2604198B1 (fr) * 1986-09-22 1989-07-07 Du Pin Cellulose Procede de traitement d'une pate papetiere par une solution enzymatique.
FI81395B (fi) * 1988-03-14 1990-06-29 Cultor Oy Foerfarande foer blekning av cellulosamassa.
US5179021A (en) * 1989-02-10 1993-01-12 Gil Inc. (Now Ici Canada Inc.) Pulp bleaching process comprising oxygen delignification and xylanase enzyme treatment
FI90888B (fi) * 1989-02-14 1993-12-31 Enso Gutzeit Oy Menetelmä selluloosamassan valkaisemiseksi
FI86896B (fi) * 1989-05-04 1992-07-15 Enso Gutzeit Oy Foerfarande foer blekning av cellulosamassa.
ZA904441B (en) * 1989-06-22 1991-03-27 Int Paper Co Enzymatic delignification of lignocellulosic material
ATE134231T1 (de) * 1989-08-14 1996-02-15 Genencor Int Europ Verbesserung beim bleichen von pulpe
WO1991002791A1 (en) * 1989-08-14 1991-03-07 Cultor Oy Enzymatic bleaching of pulp
DK420289D0 (da) * 1989-08-25 1989-08-25 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til behandling af lignocellulosepulp
NZ235679A (en) * 1989-10-18 1993-01-27 Int Paper Co Bleaching lignocellulosic pulp using (a) treatment with xylanase and (b) one or more chemical bleaching stages
WO1991018976A1 (en) * 1990-06-08 1991-12-12 Novo Nordisk A/S HEMICELLULASES PRODUCED BY $i(BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS)

Also Published As

Publication number Publication date
LV10489B (en) 1996-04-20
IE62344B1 (en) 1995-01-25
IL96922A0 (en) 1992-03-29
KR920703793A (ko) 1992-12-18
SE9000070L (sv) 1991-07-11
FI923016A (fi) 1992-06-29
SE465320B (sv) 1991-08-26
PT96461B (pt) 1998-06-30
RU2054480C1 (ru) 1996-02-20
AU7166391A (en) 1991-08-05
NZ236708A (en) 1992-10-28
DE69030326D1 (de) 1997-04-30
ZA91179B (en) 1991-10-30
NO922727D0 (no) 1992-07-10
NO922727L (no) 1992-07-10
LT3970B (en) 1996-05-27
EP0585217A1 (en) 1994-03-09
CA2073436A1 (en) 1991-07-11
BR9007975A (pt) 1992-11-10
ATE150787T1 (de) 1997-04-15
JPH05505722A (ja) 1993-08-26
AU631485B2 (en) 1992-11-26
LTIP1245A (en) 1995-04-25
LV10489A (lv) 1995-02-20
WO1991010724A1 (en) 1991-07-25
SE9000070D0 (sv) 1990-01-10
IE910066A1 (en) 1991-07-17
FI923016A0 (fi) 1992-06-29
EP0585217B1 (en) 1997-03-26
US5434071A (en) 1995-07-18
PT96461A (pt) 1991-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL166837B1 (pl) Preparat dellgnifikacyjnle aktywny na osnowie enzymu i sposób wytwarzania preparatu delignifikacyjnle aktywnego m a osnowie enzymu PL PL PL PL PL
EP0825254B1 (en) Alkalophilic Bacillus sp. AC13 and xylanase obtainable therefrom
AU649703B2 (en) A method for enzymatically treating pulp with an enzyme system from thermomonospora fusca
JP4285767B2 (ja) 熱安定性キシラナーゼ
FI121469B (fi) Mikrotetraspora-lajista eristettyjä lämpöstabiileja ksylanaaseja ja menetelmä niiden käyttämiseksi
JPH08224081A (ja) 耐熱性キシラナーゼ
JPH06501609A (ja) トリコデルマ・リーセイによって生産される酵素によるヘミセルロースの加水分解方法
US5369024A (en) Xylanase from streptomyces roseiscleroticus NRRL-11019 for removing color from kraft wood pulps
US6548283B1 (en) Bacterial protein with xylanase activity
JP3353893B2 (ja) 好アルカリ性バチルス属ｓｐ．ＡＣ１３株及びそれより獲得できるプロテアーゼ，キシラナーゼ，セルラーゼ
US5677161A (en) Preparation exhibiting enzymatic activity, a method of producing the same, and applications thereof
US5183753A (en) Preparation of xylanase by cultivating thermomyces lanuginosus dsm 5826 in a medium containing corn cobs
JP2002345472A (ja) 新規ヘキセンウロニダーゼ、それをコードする遺伝子、およびそれらの使用
JP3475930B2 (ja) 耐熱性キシラナーゼを有効成分として含む漂白剤
WOOD Jeffries et al.[45] Date of Patent: Nov. 10, 1998
JP2001245665A (ja) アルカリ性キシラナーゼ及びその製造方法