JPH06501609A - トリコデルマ・リーセイによって生産される酵素によるヘミセルロースの加水分解方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トリコデルマ・リーセイによって生産される酵素によるヘミセルロースの加水分 解方法 発明の分野 本発明は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ） によって生産される１種類または２種類の特徴付けられたキシラナーゼからなる 酵素調製物を使用する木もしくはバルブ中のヘミセルロースまたはこれらから単 離されたヘミセルロースの加水分解方法に関する。

発明の背景 種によって、木は約２０％のヘミセルロースを含有しており、そのキシランは広 葉樹および針葉樹の両方において実質的な部分を形成する。広葉樹はグルクロノ キンラン１５〜３０％を含有し、針葉樹はアラビノグルクロノキシラン７〜１０ ％を含有する。バルブ形成工程の間、ヘミセルロースの一部が溶解するが、一部 は繊維内に残存する。繊維中に残存するヘミセルロースの構造は、それらの物理 的および機能的性賀に影響を及ぼす。使用されるバルブ形成方法の種類によって 、化学組成および分子量分布について異なる可溶性ヘミセルロース画分を得るこ とができる。いくつかの溶解されたヘミセルロースでさえ高分子量を有してもよ く、すなわち、これらのヘミセルロースは、高分子糖鎖（キシラン）からなって いる。ヘミセルロース画分は、この目的のために、例えば、キシロースの生産の ために、特に研究された方法を使用して木から単離することもできる。

ヘミセルロースの組成によって、加水分解のためにい（つかの酵素が必要である 。多（の用途で主に重要なものは、キシラン玉鎖を加水分解するエンド−β−キ シラナーゼ（ＥＣ３，２，１，８，）である。キシラナーゼは数種類の微生物に よって生産され得る。酵素生産方法において、これらの微生物は、通常、培養ブ ロス中に数種類のヘミセルロース分解酵素を生産する。これらは、主鎖を加水分 解する酵素および玉鎖に結合した側鎖または側基を分離することができる酵素を 含有する（エンド−キシラナーゼ、β−キシロシダーセ、アラビノシダーセ、α −ガラクトンダーゼ、グルクロニダーゼ、アセチルキンランエステラーゼなど） 。

さらに、ある種の酵素グループ内では、異なるメカニズムを使用して同一基質を 加水分解する個々の酵素を単離することができる。このような酵素の例は、例え ば、よく文献で立証されているセルラーゼ（セロビオヒドロラーゼＩおよび■、 エンドグルカナーゼＩおよび■など）である。これらの酵素はそれらの生化学的 構造およびそれらの作用モードに関してお互いに異なる。

トリコデル？−リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）は、セルラ ーゼおよびヘミセルラーゼの生産にしばしば使用される。この微生物の種々の酵 素を生産することができる能力、ならびにこれらの酵素、特にセルラーゼの分離 および精製方法は広範囲に開示された。対照的に、この微生物によって生産され る種々のキンラーゼの生化学的性質および、さらにまた、水誘導ヘミセルロース の種々の変質のためのこれらの特異的性質の利用はよく知られていない。

トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）は数種類の キシラン分解酵素を生産するが、そのうちの２つだけはキシランに対して特異的 である（ビエリイ（Ｂ　１ｅｌｙ）およびマルコヴイック（Ｍａｒｋｏｖｉｃ） 、１９８８）。他の公知のキシラナーゼもまたセルロースを分解し、これはバル ブおよび紙用途において、しばしば、有害な性質である。真菌類トリコデルマ属 の様々な種がキシラナーゼの生産に使用された。一般に、１つの主なキシラナー ゼは、８以上の等電点（ｐＩ値）を有する（例えば、ギブワン（Ｇｉｂｓｏｎ） およびマククリアリ−（ＭｃＣｌｅａｒｙ）、１９８７、デツカ−（Ｄ　ｅｋｋ ｅｒ）、１９８５、ワン（Ｗｏｎｇ）ら、１９８６）。しかしながら、唯一の研 究において、トリコデルマ・リグノラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｉｇｎｏ ｒｕｍ）の菌株から等電点５．１を有する別のキシラナーゼが精製され、特徴付 けられた（ジョーン（Ｊ　ｏｈｎ）およびスミス（Ｓ　ｗｉｔｈ）、１９８８） 。

本発明では、２種類の機能的に異なるキンラナーラゼおよびその用途を記載する 。本発明は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ ）によって生産された２種類のキンラナーラゼが異なる実用的用途において利用 され得る実質的に異なる性質を有するという予想外の観察結果に基づいている。

本発明では、それ自体公知の蛋白精製方法を使用して２種類のキシラナーゼをお 互いに分離した。蛋白の分離のために陰イオンおよび陽イオン交換樹脂を使用し た。使用した方法は、予想外に迅速かつ簡単であった。しかしながら、本発明は 、この蛋白精製方法に限定されず、別の方法によっても所望の蛋白を精製するこ とができる。これらの蛋白の一方または両方を多量に生産するために遺伝的に修 飾された、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ） 菌株を使用して、あるいは、これらのティ・リーセイ（Ｔ、　ｒｅｅｓｅｉ）酵 素の一方または両方をコードする遺伝子が形質転換される別の遺伝的に修飾され た生産微生物と一緒に所望の蛋白を生産することもできる。

本発明の実質的な観察は実用的用途工程においてこれらの２種類のキシラナーゼ 間の機能的差異を利用できる可能性である。キシラナーゼは、異なる条件下での それらの最適な活性またはそれらの異なる基質を加水分解することができる能力 によって特徴付けることができる。さらに、当該酵素は同一基質について異なる 加水分解パターンを示し得る。本発明で記載する酵素は、意外にも、それらのｐ Ｈ最適条件ならびに異なる基質に対するそれらのキシラン溶解および糖化活性の 両方についてお互いに異なる。本明細書において、当該酵素は、国際酵素命名法 にしたがって示され、これによって、酵素は等電点（ｐＩ値）の増加する順番で 番号付けされる。かくして、より低いｐＩ値（ｐＩ　５．５）を有するキシラナ ーゼ酵素をキシラナーゼエと称し、より高いｐＩ値（ｐＩ　９．０）を有するキ シラナーゼ酵素をキシラナーゼ■と称する。本発明の酵素の特徴は、１つの酵素 （キシラナーゼエ）はより酸性のｐＨ領域で最適な活性を有するが、別のもの（ キシラナーゼ■）は中性付近のｐＨ範囲にそのｐＨ最適条件を有する。キシラナ ーゼＩは、典型的には、より有効にキシランを溶解するが、キシラナーゼｎはよ り有効に還元糖単位を生産する。キシラナーゼエおよび■は、低い置換基（側基 ）を有する化学的に修飾されたキシランを分解することができるそれらの能力に ついてお互いに異なる。

キシラナーゼエはこの種の修飾された基質の加水分解において相対的により有効 である。これらの性質は様々な用途において好都合に利用され得る。すなわち、 条件（ｐＨ）および酵素で処理されるべき基質の構造特性によって最も安定な酵 素を選択することができる。当該方法で使用される方法および木の種類によって 、基質（キノラン）の化学構造は特にキシラン玉鎖上の置換基の量および種類に 関して変わる。これらの構造的差異は当技術分野の文献に広範囲に記載されてい る。

ヘミセルロースの利用に基づ（いくつかの方法が文献に開示されている。これら の方法では、目的は、ヘミセルロースをより高度にまたはより低度に加水分解す ることである。これらの方法としては、例えば、セルロースパルプからのヘミセ ルロースを部分加水分解して、漂白における塩素化学物質の消費を減少させるか またはバルブまたは流出液における塩素化残留物を減少させること（例えば、ビ イカリ（Ｖ　１ｉｋａｒｉ：）ら、１９８７、クラーク（Ｃ１ａｒｋ）ら、１９ ８９、タン（Ｔａｎ）ら、１９８７）、溶解パルプの生産のための残留ヘミセル ロースの除去（ベイス（Ｐ　ａｉｃｅ）およびンユラセク（Ｊ　ｕｒａｓｅｋ） 、１９８４、バイスら、１９８８）、ヘミセルロースの部分加水分解による繊維 特性の改質（ノエ（Ｎｏｅ）ら、１９８６、ヒュンテス（Ｆ　ｕ６ｎｔｅｓ）お よびロバート（Ｒｏｂｅｒｔ）、１９８６、モラ（Ｍｏｒａ）ら、１９８６、ポ ンメイヤ−（Ｐ　ｏｍｍｉｅｒ）ら、１９８９、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら 、１９９０）または溶解されたキノランの単量体糖への加水分解が挙げられる。

しかしながら、開示された方法では、使用される酵素は不確定の混合物からなっ ており、個々の酵素の確認された特異的な性質は利用されなかった。いずれもト リコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）種から単離さ れた酵素ではなかった。例えば、タン（Ｔａｎ）らによって開示された方法では 、トリコデルマ・ハルツイアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕ の）の菌株からセルラーゼを含まないキシラナーゼ調製物が調製された。生産さ れたキシラナーゼをお互いに特徴付けるかまたは分離する方法は全くなかった。

個々のキシラナーゼの特異的性質は、いずれの公開された出願にも利用されてい なかった。

本発明に記載された方法について特徴的なことは、本明細書に記載された酵素の うちの１種類または２種類の混合物のいずれも使用し得ることである。酵素に必 要なことは考慮されている用途に左右される。本発明の新規な特徴は、各適用に ついて記載された２種類のキシラナーゼの最も好ましい組合せが設計され得る。

例えば、本発明の方法によると、キシランの高度の加水分解が望ましい場合、溶 解性および糖化性の両方をもつ酵素混合物を調製するのが好都合である。基質が 王に可溶性の低分子量オリゴ糖を含有する場合、主にキシラナーゼ■を使用する のが好都合である。他方、（漂白に関する前処理におけるように）化学的に変質 された繊維結合キンランの部分加水分解だけが望ましい場合、キシラナーゼエだ けまたはそれを含有する混合物を使用するのが好都合である。目的が（砕木バル ブの生産におけるエネルギー消費の減少に関するように）繊維内のキシランの部 分加水分解によって繊維特性を改良することである場合、キシラナーゼ■だけま たはそれを含有する混合物を使用することがより好都合である。最も好都合な酵 素を選択することを基礎として、それらの異なるｐＨ最適条件を利用することが できる。ｐＨ範囲３〜６においてはキシラナーゼＩおよびｐＨ範囲４〜７におい てはキシラナーゼ■。両者の混合物を使用する場合、ｐＨは最も好都合には３〜 ７とすることができる。

以下に、非限定の実施例によって本発明の詳細な説明する。酵素の単離および特 徴付けを実施例１．２および３に記載し、それらの用途を実施例４．５．６およ び７に記載する。

酵素のキシラナーゼ活性は、２つの方法・ポウタ不ン（Ｐ　ｏｕｔａｎｅｎ）お よびパルス（Ｐｕｌｓ）　（１９８８）によって記載されたキシランからの還元 糖の形成を測定するＸＹＬ−ＤＮＳ法、およびベイリー（Ｂａｉｌｅｙ）および ボウタホン（１９８９）によって記載されたキシラン溶解性を測定するＸＹＬ− ８ＱＬ法を用いて測定される。糖化性は、科学文献において、および市販のキシ ラナーゼ調製物の特徴付けの両方において、キシラナーゼを測定するために使用 される、より一般的な方法であるが、当該方法の多くの変形がある。セルラーゼ 活性はヒドロキシエチルセルロースを分解する活性として分析される（ＩＵＰＡ Ｃ１１９８７）。

異なる酵素を比較する場合、それらは、酵素蛋白または活性単位に基づいて調合 することができる。前者の方法は、機能的差異（比活性）を示し、後者は、例え ば、異なる市販の調製物を比較する場合に、より実用的である。

！奥刑 実施例１　酵素の精製 ｐＨ４で陽イオン交換樹脂（ＣＭ−セファロース）を使用し、塩化ナトリウムを 添加して０〜０１５Ｍの間の直線濃度勾配液を展開するクロマトグラフィーによ って、酵素の精製を開始した。所望の酵素をこれらの画分中に回収した。後にｐ ｌ値が５５であることを測定した第１キシラナーゼ（キシラナーゼＩ）をさらに ｐＨ７，０で陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−セファロース）上でクロマトグラフ ィーによって精製した。ｐＴ値９０の第２キシラナーセ（キシラナーゼ■）をさ らにｐＨ８，０で陽イオン交換樹脂（ＣＮ３−セファロース）上で精製した。

実施例２　酵素の特徴付は 実施例１で精製した酵素の蛋白特性を、蛋白化学で使用する標準的な方法によっ て特徴付けた。これらの特性を第１表に示す。

第１表　トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）キ シラナーゼの性質実施例３．　酵素の基質特異性 実施例１および２に従って精製および特徴付けした酵素の性質を、異なる基質を 加水分解することができるそれらの能力によってさらに示した。結果を第２表に 示す。

第２表　酵素の比活性 実施例４．　単離されたヘミセルロースの加水分解実施例１に従って圭離したキ シラナーゼＩおよび■を使用して、広葉樹に源を発する廃液から単離したキンラ ンを加水分解した。酵素の使用量は１種類のキシラナーゼを使用する場合、基質 の乾燥重量１ｇ当たり１５０μ９てあった。２種類のキシラナーゼを使用する場 合、各々の酵素は二の量の半分て調合した。加水分解実験は４５℃で、ｐＨ５で 行い、加水分解時間は２４時間であった。酵素の性質による加水分解の結果を第 ３表に示す。当該結果によって、高度の加水分解が必要である場合、両方の酵素 の混合物を使用するのが最も好都合であることが明らかである。高度の加水分解 について、酵素調製物において高い溶解性および糖化性の両方が必要である。

第３表・廃液キシランの加水分解 ’　ＸＹＬ　Ｉ　＋ＸＹＬ］Ｉ　４０　’Ｘ加水分解結果には、低分子量加水分 解産物・キノロース、キンロビオースおよびキンロチトラオースの合計量が含ま れた。

実施例５．　クラフトバルブの漂白 ４５℃で４時間、ティ・リーセイ（Ｔ、　ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＸＹＬ　 ＩおよびＸＹＬｎで、５％のコンシスチンシーで、未漂白マツ硫酸塩バルブ（カ ッパ価３４゜１）を処理した。最初のｐＨ値を各酵素の最適条件に調節した。酵 素を乾燥パルプ１ｇ当たり蛋白２または】０μ９に調合した。酵素的処理で放出 された還元糖を第４表に示す。このキシランの部分的な不完全な加水分解におい て、キシラナーゼ■の、還元糖を遊離することができるより良好な能力を考慮す る場合に予想されるとおり、４時間の加水分解試験の間、キシラナーゼ■はキシ ラナーゼＩよりも若干多い還元糖を遊離することができた。キシラナーゼエによ る処理後、バルブから溶解された画分中で検出されるオリゴマー化合物が僅かに 多く得られた。

第４表では、酵素蛋白の使用量によって、溶解性および糖化性単位として表され る活性単位が存在する。糖化性が酵素調製物の活性を記載するために最も一般的 に使用される単位であるので、個々の酵素の比較に基づく場合に使用するのが最 も好都合である。

酵素処理の後、該バルブを塩素漂白／−ケンスを使用して化学的に漂白した。

この前漂白段階では、塩素ガスおよび二酸化塩素の使用量は同一であった（活性 塩素として計真した）。全体の漂白シーケンスは（Ｄ５０／Ｃ３０）ＥＤＥＤで あった。参照漂白では、塩素化因子は０．１８であった。酵素的に処理されたバ ルブでは、活性塩素の使用量を約２０％だけ減少し、その結果、塩素化因子はＯ １５であった。漂白後、明度値、粘性および中間カッパ価（前漂白段階後のバル ブのリグニン含量を示す）を測定した。漂白結果を第５表に示す。

結果から、蛋白として調合される場合に両キシラナーゼが等しく有効にクラフト バルブの漂白能を増大させることができることが明らかである。しかしながら、 キシラナーゼをＸＹＬ／ＤＮＳ活性（第２表を参照）に基づいて調合した場合、 キシラナーゼＩが漂白においてより有効に作用すると考えることができる。同一 調合量の、糖化ＸＹＬ／ＤＮＳ活性、１４〜１７　ｎｋａｔ／　９の基質（キシ ラナーゼエ１０μ９およびキシラナーゼ■　２μ９と等価）を使用すると、キシ ラナーゼエによって、より良好な漂白結果を得ることができる。

実施例６・　クラフトバルブの漂白 未漂白クラフトバルブを、４５℃で２時間、３〜７のｐＨ値で、実施例５に従っ て、キシラナーゼエおよび■で２．５％のコンシスチンシーで酵素的に処理した 。

該酵素を１００ｎｋａｔ／ｇ（ＸＹＬ／ＤＮＳ）で調合した。酵素的処理の後、 実施例５に従ってバルブを漂白し、最終明度の値を測定した。結果を第１図に示 す。キシラナーゼエは酸性ｐＨ領域でより有効であり、キシラナーゼ■は中性ｐ Ｈ領域でより良好に作用する。

実施例７　砕木パルプの繊維特性の改良４５℃で２時間、精製したキシラナーゼ Ｉおよび■によってそれらのｐＨ最適条件で、粗く精選したスプルース（ｓｐｒ ｕｃｅ）砕木パルプ（Ｔ　Ｍ　Ｐ　、ろ水産４５０）を処理した。酵素調合量は パルプ１ｇ当たり５　Ｑ　Ｑｎｋａｔであった（ＸＹＬ／ＤＮＳ）。

酵素的処理後、バルブをＰＦＩリファイナーでろ水産値約１００に精製した。シ ート特性を示すパラメーターを測定した。結果を第６表に示す。かっこ内のパー センテージ値は、正の効果（＞１００％）または負の効果（＜１００％）の程度 を示す。

第６表　キシラナーゼで処理した砕木パルプの性質結果から明らかなとおり、キ シラナーゼ■はＴＭＰ−バルブの紙技術的特性への正の効果を有した。砕木バル ブ中のキンランは、側鎖の損失を伴わずに、天然キシランに類似する。

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フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、　Ａ Ｔ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、 　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、Ｎ ｏ、　ＰＬ、　ＳＥ、ＳＵ。

（７２）発明者　ペレ、ヤーツコ フィンランド、ニス・エフ−０１６２０、ヴアンター、ラーヤニーチュンティエ ８デージ番 （７２）発明者　ボウタネン、カイサ フィンランド、ニス・エフ−００２００、ヘルシンキ、リエラハデンティエ７ア ー・べ一１９番 （７２）発明者　テンカホン、マイヤ フィンランド、ニス・エフ−０２３６０、ニスポー、カスキラークソンティエ３ セー６９番（７２）発明者　ヴイーカリ、リーサ フィンランド、ニス・エフ−００２００、ヘルシンキ、ローツキクヤ５エフ番

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．等電点５．５および分子量１９ｋＤａのエンドーβ−キシラナーゼおよび／ または等電点９．０および分子量２０ｋＤａのエンドーβ−キシラナーゼＩＩを 含有するトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）か ら単離した酸素調製物を使用することを特徴とする、木または繊維中の、または これらから単離されたへミセルロース、特にキシランの加水分解方法。
2. ２．真菌類トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ） によって、それから誘導された菌株によって、またはティ・リーセイ（Ｔ．ｒｅ ｅｓｅｉ）キシラナーゼＩおよび／またはＩＩをコードする遺伝子が形質転換さ れるいずれかの他の宿主菌株によって生産される酵素調製物を使用する請求項１ 記載の方法。
3. ３．ｐＨ最適条件および適用物の性質にしたがって選択された酵素または酵素の 混合物を使用する請求項１または２記載の方法。
4. ４．ｐＨが約３〜８、好ましくは４〜７である場合、ｐＨ範囲３〜６、好ましく は４〜５においてキシラナーゼＩおよびｐＨ範囲４〜８、好ましくは５〜７にお いてキシラナーゼＩＩ、またはこれらの混合物を使用する請求項１、２または３ 記載の方法。
5. ５．パルプのシート特性を改良するためにキシラナーゼＩまたはキシラナーゼＩ Ｉまたはそれらの混合物、好ましくは、キシラナーゼＩＩを使用する請求項１、 ２、３または４記載の方法。
6. ６．セルロースパルプの漂白能を改良するための前処理において、キシラナーゼ ＩまたはキシラナーゼＩＩまたはそれらの混合物、好ましくはキシラナーゼＩを 使用する請求項１、２、３または４記載の方法。
7. ７．ヘミセルロース基質からの糖の生産のためにキシラナーゼＩまたはキシラナ ーゼＩＩ、好ましくはこれらの混合物を使用する請求項１、２、３または４記載 の方法。