FI96875B - Hemiselluloosan hydrolysointimenetelmä - Google Patents

Description

96875 HEMISELLULOOSAN HYDROLYSOINTIMENETELMÄ

Keksintö koskee menetelmää hydrolysoida puussa tai kuidussa olevaa tai kuidusta irrotettua hemiselluloosaa entsyymivalmisteiden avulla, jotka muodostuvat yhdestä tai kahdesta Trichoderma Teeseillä tuotetusta, karakterisoidusta ksylanaasista.

Puussa on lajista riippuen noin 20 % hemiselluloosaa, joista ksylaani muodostaa oleellisen osan sekä lehti- että havupuissa. Lehtipuissa on noin 15-30 % glukuronoksylaania ja havupuissa 7-10 % arabinoglukuronoksylaania. Selluloosan keittoprosesseissa osa hemiselluloosasta liukenee, mutta osa jää jäljelle kuituihin. Kuiduissa olevan hemiselluloosan rakenne vaikuttaa kuidun fysikaalisiin ja funktionaalisiin ominaisuuksiin. Selluloosan keittomenetelmästä riippuen voidaan saada koostumukseltaan ja molekyylipainojakaumaltaan erilaisia liukoisia hemiselluloosajakeita. Liuenneestakin hemiselluloosasta osa on usein korkeamolekyylipainoista, ts. hemiselluloosa muodostuu sokeriketjuista (ksylaanista). Hemiselluloosajakeita voidaan myös eristää puusta erikoisesti tähän tarkoitukseen kehitetyillä menetelmillä esim. ksyloosin valmistusta varten.

Hemiselluloosan hydrolyysiin tarvitaan useita entsyymejä hemiselluloosan koostumuksesta riippuen. Keskeisen tärkeitä entsyymejä ovat endo-^S-ksylanaasit (EC 3.2.1.8.), jotka pilkkovat ksylaaniketjuja. Ksylanaaseja voidaan tuottaa useilla erilaisilla mikro-organismeilla. Entsyymien tuotantoprosesseissa nämä organismit tuottavat . yleensä useita erilaisia hemiselluloosaa hajottavia entsyymejä kasvatusliuokseen. Näitä entsyymejä ovat sekä hemiselluloosien perusrunkoa että niihin liittyneitä sivuketjuja ja -ryhmiä hajottavat aktiivisuudet (ksylanaasit, /J-ksylosidaasi, arabinosidaasi, a-galaktosidaasi, glukuronidaasi, asetyyliksylaaniesteraasi jne.). Lisäksi voidaan eri entsyymityyppiryhmistä eristää entsyymejä jotka hajottavat samaa substraattia eri mekanismeilla. Tällaisia ovat esimerkiksi erittäin hyvin kuvatut sellulaasit (sellobiohydrolaasit I ja II; endoglukanaasit I ja II jne.). Nämä entsyymit poikkeavat toisistaan sekä biokemiallisen rakenteensa että toimintatapansa suhteen.

2 96875

Trichoderma reesei on erittäin yleisesti käytetty sekä selluloosaa että hemiselluloosaa hajottavien entsyymien tuotanto-organismi. Sen kykyä tuottaa erilaisia entsyymejä on laajasti kuvattu, samoin näiden entsyymien erotus- ja puhdistusmenetelmiä. Sen sijaan suhteellisen huonosti tunnettuja ovat erilaisten ksylanaasien biokemialliset ominaisuudet sekä varsinkin näiden erityisominaisuuksien hyödyntäminen erilaisissa puuperäisen hemiselluloosan muuttamismenelmissä.

Trichoderma reesei tuottaa useita ksylaania hajottavia entsyymejä, joista kuitenkin vain kaksi hajottaa ainoastaan ksylaania (Biely ja Markovic, 1988). Muut ksylanaasit hajottavat ksylaanin lisäksi myös selluloosaa, joka näissä sovellutuksissa yleensä on haitallinen ominaisuus. Trichoderma-sienen eri lajeilla on tuotettu ksylanaaseja, joista on puhdistettu toinen pääksylanaasi, jonka isoelektrinen piste (pl-arvo) on yli 8 (esim. Gibson ja McCleary, 1987, Dekker, 1985, Tang ym. 1985, Wong ym. 1986). Vain yhdessä tutkimuksessa on puhdistettu ja karakterisoitu myös toinen ksylanaasi, jonka isoelektrinen piste on 5.1 (John ja Smith, 1988), jonka tuottoon käytettiin Trichoderma lignorum-kantaa.

Tässä keksinnössä kuvataan kahta toiminnaltaan erilaista ksylanaasia sekä niiden käyttösovellutuksia. Keksintö perustuu siihen yllättävään havaintoon, että Trichoderma reeseillä tuotetut kaksi ksylanaasia poikkeavat oleellisesti toisistaan ominaisuuksiensa suhteen, joita ominaisuuksia voidaan hyödyntää eri käyttösovellutuksissa.

Tässä keksinnössä proteiinit erotettiin toisistaan sinänsä periaatteiltaan tunnetuilla proteiinien puhdistusmenetelmillä. Proteiinien erottamiseen käytettiin anionisia ja kationisia ioninvaihtimia. Yllättävää oli proteiinien erottamisen yksinkertaisuus ja nopeus käytetyillä menetelmillä. Keksinnössä ei kuitenkaan rajoituta tähän proteiinien erotusmenetelmään, vaan halutut proteiinit on mahdollista eristää myös muilla tunnetuilla menetelmillä. Haluttuja proteiineja on myös mahdollista tuottaa Trichoderma reesei-kannoilla. jotka on geneettisesti parannettu tuottamaan juuri näitä haluttuja proteiineja tai muilla geneettisesti parannetuilla tuotto-isännillä, joihin näitä entsyymejä koodaavat geenit on siirretty.

3 96875

Keksinnön oleellinen havainto on tässä hakemuksessa esitetyn kahden eri ksylanaasin toimintamekanismin eron hyväksikäyttö käytännön prosesseissa. Ksylanaaseja voidaan luonnehtia niiden optimaalisten toimintaolosuhteiden ja eri substraatteja hajottavan kyvyn perusteella. Lisäksi entsyymit voivat poiketa toisistaan samaa substraattia eri lailla hajottavan kyvyn perusteella. Keksinnössä kuvatut entsyymit poikkeavat yllätyksellisesti toisistaan sekä pH-optiminsa että erityyppisiä ksylaaneja liuottavan ja sokeroivan kykynsä suhteen. Tässä hakemuksessa käytetään entsyymien nimeämiseen kansainvälistä luokitusjärjestelmää, jonka mukaisesti entsyymit numeroidaan nousevan isoelektrisen pisteen (pl) mukaisessa järjestyksessä. Näin ollen alhaisemman isoelektrisen pisteen (pl 5.5) omaavaa entsyymiä kutsutaan ksylanaasi I:ksi ja korkeamman isoelektrisen pisteen omaavaa entsyymiä (pl 9.0) kutsutaan ksylanaasi II:ksi. Keksinnössä kuvatuille entsyymeille on tunnusomaista, että toinen entsyymi (ksylanaasi I) toimii paremmin happamammalla pH-alueella kun taas toinen (ksylanaasi Π) neutraalimmalla pH-alueella. Ksylanaasi I hajottaa ksylaania tehokkaammin liukoiseen muotoon kun taas ksylanaasi Π muodostaa tehokkaammin sokeriyksiköitä. Ksylanaasit I ja Π eroavat toisistaan myös kun verrataan niiden kykyä hajottaa kemiallisesti muuttunutta, vähemmän sivuketjuja sisältävää ksylaania. Ksylanaasi I kykenee suhteellisesti hieman paremmin hajottamaan tällaista modifioitua substraattia. Näitä ominaisuuksia voidaan edullisesti hyödyntää eri käyttösovellutuksissa; ts. valita sopivin entsyymi sekä käyttöolosuhteiden (pH) ja käsiteltävän hemiselluloosan rakenteen perusteella. Prosessista ja puulajista riippuen vaihtelee substraatin, ksylaanin kemiallinen koostumus erityisesti ksylaaniketjun sivuryhmien määrän ja laadun suhteen. Näitä kemiallisia ja rakenteellisia eroja on kuvattu laajasti alan käsikirjoissa.

Kirjallisuudessa on esitetty useita menetelmiä ja prosesseja, jotka perustuvat hemisellulaasien käyttöön. Näissä menetelmissä halutaan hajoittaa suurempi tai pienempi osa hemiselluloosasta. Tällaisia menetelmiä ovat mm. hemiselluloosan osittainen hydrolyysi sellumassoista valkaisun kloorikemikaalien kulutuksen, sellumassan tai jätevesien kloorijäännösten vähentämiseksi (esim. Viikari ym. 1987, Clark ym. 1989, Tan ym. 1987) , jäännöshemiselluloosan poisto liukosellun valmistamiseksi (Paice ja Jurasek, 1984, Paice ym. 1988), kuidun ominaisuuksien muuttaminen hemiselluloosan osittaisella hydrolysoimisella (Noe ym. 1986, Fuentes ja Robert, 1986, Mora ym. 1986, 4 96875

Pommier ym. 1989, Roberts ym. 1990) tai liuenneen ksylaanin hydrolyysi sokereiksi. Kuvatuissa menetelmissä käytetyt entsyymit ovat yleensä olleet seoksia, eikä niissä ole käytetty hyväksi puhdistettujen entsyymien tunnistettuja erityisominaisuuksia. Niitä ei myöskään ole eristetty Trichoderma reesei-kannasta. Esimerkiksi Tanin ja muiden kuvaamassa menetelmässä sellulaasivapaa ksylanaasivalmiste tehtiin Trichoderma harzianum- kannalla. Tuotettuja ksylanaaseja ei mitenkään karakterisoitu eikä erotettu toisistaan. Muissa julkaisuissa tutkitut ksylanaasit on tuotettu muilla mikro-organismeilla kuin Trichoderma reesei. Missään aiemmin julkaistussa sovellutuksessa ei ole käytetty hyväksi ksylanaasien erikoisominaisuuksia.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että tässä kuvatuista entsyymeistä voidaan käyttää vain toista tai näiden seosta. Eri entsyymien tarve riippuu oleellisesti käyttösovellutuksesta. Keksinnön mukaisessa menetelmässä on uutta se, että tässä kuvatusta kahdesta entsyymikomponentista voidaan muodostaa edullisin valmiste kuhunkin käyttösovellutukseen. Esimerkiksi haluttaessa hydrolysoida ksylaania mahdollisimman tehokkaasti on keksinnön mukaisessa menetelmässä edullista käyttää sekä liuottavaa että sokeroivaa aktiivisuutta. Haluttaessa hajottaa liukoista pienimolekyylistä ksylaania on edullista käyttää sokeroivaa ksylanaasia Π. Kun taas halutaan vain osittain liuottaa kemiallisesti modifioitunutta ksylaania kuidusta (esim. valkaisun esikäsittely) on edullisinta käyttää joko pelkästään ksylanaasia I tai sitä sisältävää valmistetta. Jos taas tavoitteena on kuituominaisuuksien parantaminen hajottamalla osa kuidun ksylaanista (esim. mekaanisen massan kuidutusenergian säästämiseksi) on edullisempaa käyttää vain joko ksylanaasia II tai sitä sisältävää valmistetta. Entsyymien valintaperusteena voidaan myös käyttää niiden erilaisia pH-optimeja, ksylanaasille I edullisimmin pH-aluetta 3-6 ja ksylanaasille Π aluetta 4-7. Kun käytetään kahdesta ksylanaasista I ja II muodostuvaa entsyymiseosta, voidaan pH säätää erittäin edullisesti arvoon 3-7.

Keksintöä ryhdytään seuraavassa lähemmin tarkastelemaan muutaman ei-rajoittavan esimerkin avulla. Esimerkeissä 1, 2 ja 3 on selostettu ksylanaasien eristämistä ja luonnehtimista ja esimerkeissä 4, 5, 6 ja 7 niiden käyttösovellutuksia.

5 96875

Entsyymien ksylanaasiaktiivisuus on määritetty käyttäen kahta menetelmää: ksylaanista sokereiden muodostusta mittaavaa XY^öNS-menetelmää, jonka Poutanen ja Puis (1988) ovat kuvanneet sekä ksylaania liuottavaa aktiivisuutta mittaavaa XYL/SOL-menetelmää, jonka ovat kuvanneet Bailey ja Poutanen (1989). Sokeroiva aktiivisuus on yleisimmin sekä tieteellisissä julkaisuissa että kaupallisissa valmisteissa käytetty entsyymipreparaatin aktiivisuutta kuvaava suure, joskin menetelmästä on useita muunnelmia. Selluloosaa hajottavaa aktiivisuutta on kuvattu hydroksietyyliselluloosaa hajottavana aktiivisuutena (IUPAC, 1987).

Entsyymejä verrattaessa voidaan vertailuperusteena käyttää joko entsyymiproteiinin määrää, jolloin saadaan kuva eri proteiinien toimintaeroista, tai preparaatin sisältämiä, tietyllä menetelmällä mitattavia aktiivisuusyksiköitä. Jälkimmäisessä tapauksessa ollaan lähempänä kaupallisia hinnoitteluperusteita.

Esimerkit

Esim. 1. Entsyymien puhdistus

Entsyymien puhdistus aloitettiin kationit vaihtavalla kromatografiapylväällä (CM-Sepharose) pH arvossa 4, johon tavoitellut ksylanaasit tarttuivat. Pylvääseen tarttuneet •' proteiinit eluoitiin puskurilla pH 4, johon lisättiin natriumkloridia siten, että muodostui lineaarinen konsentraatiogradientti pitoisuusvälille 0-0.15 M. Tavoitellut entsyymit saatiin näihin jakeisiin. Toinen ksylanaasi (ksylanaasi I), jonka pl arvoksi saatiin myöhemmin 5.5, puhdistettiin edelleen anionit vaihtavalla kromatografiapylväällä (DEAE-Sepharose) pH arvosssa 7.0. Toinen ksylanaasi (ksylanaasi Π), pl arvo 9.0, puhdistettiin edelleen kationinvaihtajalla (CM-Sepharose) pH arvossa 8.0.

6 96875

Esim. 2. Entsyymien karakterisointi

Esimerkin 1 mukaisesti puhdistettujen entsyymien proteiiniominaisuudet määritettiin tavanomaisilla proteiinikemian menetelmillä. Näitä ominaisuuksia on kuvattu taulukossa 1.

Taulukko 1. Trichoderma reesein ksylanaasien ominaisuudet

Entsyymi Isoelektrmen Molekyyli- pH-optimi

piste pl paino kD

Ksylanaasi I 5,5 19 4,0-4,5 (Xyl I)

Ksylanaasi Π 9,0 20 5,0-5,5 (Xyl Π)

Esim. 3. Entsyymien substraattispesifisyydet

Esimerkkien 1 ja 2 mukaisesti puhdistettujen ja karakterisoitujen entsyymien ominaisuuksia selvitettiin edelleen määrittämällä niiden kyky hajottaa erilaisia substraatteja. Tulokset on kuvattu taulukossa 2.

7 96875

Taulukko 2. Ksylanaasien spesifiset aktiivisuudet

Entsyymi Spesifinen aktiivisuus

Sellulaasi Ksylanaasi Ksylanaasi

HEC XYL/SOL XYL/DNS

nkat/mg U/mg nkat/mg

Ksylanaasi I 0 630 1700

Ksylanaasi Π 0 430 7000

Esim. 4. Hemiselluloosan hydrolyysikoe Jäteliemestä eristettyä ksylaania hydrolysoitiin esimerkin 1 mukaisilla ksylanaasivalmisteilla XYL I ja XYL Π. Käytetty entsyymimäärä oli 150 /tg/g substraatin kuiva-ainetta käytettäessä vain yhtä ksylanaasia ja käytettäessä kahta ksylanaasia annosteltiin kumpaakin entsyymiä puolet tästä määrästä. Hydrolyysit tehtiin 45 °C.ssa, pH-arvossa 5 ja hydrolyysiaika oli 24 tuntia. Hydrolyysituloksia, jotka kuvaavat entsyymien ominaisuuksia on esitetty taulukossa 3. Tulosten mukaan on selvää, että pyrittäessä mahdollisimman korkeaan hydrolyysiasteeseen on edullisinta käyttää kummankin ksylanaasin seosta. Mahdollisimman korkea hydrolyysiaste edellyttää sekä hyvää liuottavaa että sokeroivaa aktiivisuutta entsyymipreparaatissa.

8 96875

Taulukko 3. Jäteliemen ksylaanin hydrolyysikoe.

Entsyymi Hydrolyysitulos * % alkuperäisestä substraatista XYL I 26 XYL Π 33 XYL I + XYL Π 40 * Sokereihin on laskettu pienimolekyyliset hydrolyysituotteet ksyloosi, ksylobioosi, ksylotrioosi ja ksylotetraoosi.

Esim. 5. Sellumassan valkaisukoe

Valkaisematonta mäntysulfaattiselluloosamassaa (kappaluku 34,1) käsiteltiin 5 % sakeudessa T. reesein ksylanaaseilla XYL I ja XYL Π 45 °C lämpötilassa 4 h. Käsittelyn lähtö-pH säädettiin rikkihapolla kunkin entsyymin aktiivisuusoptimiin. Entsyymiä annosteltiin 2 tai 10 proteiinia/g kuivaa massaa. Entsyymikäsittelyissä .. vapaumneet pelkistävät sokerit on esitetty taulukossa 4. Tässä ksylaanin epätäydellisessä, vain osittaisessa hydrolyysissä ksylanaasi Π vapautti hiukan enemmän pelkistäviä sokereita kuin ksylanaasi I neljän tunnin käsittelyssä, mikä onkin odotettu tulos, kun huomioidaan ksylanaasi Π-entsyymin parempi kyky muodostaa sokereita. Oligomeerejä muodostui hiukan enemmän ksylanaasi 1:11a käsitellystä massasta liuenneeseen jakeeseen.

Taulukossa 4 on myös esitetty annosteltua entsyymiproteiinia vastaavat aktiivisuusyksikkömäärät sekä liuottavana että sokeroivana aktiivisuutena. Koska sokeroiva aktiivisuus on yleisimmin käytetty entsyymipreparaatin aktiivisuutta kuvaava 9 96875 suure, on luontevaa käyttää myös sitä perusteena verrattaessa eri entsyymien tehokkuutta.

Taulukko 4: Puhtailla ksylanaaseilla XYL I ja XYL Π käsitellyistä mäntysulfaattimassoista vapautuneet sokerit (4 tunnin käsittely, entsyymiaimos 2 //g/g ja 10 /zg/g massaa).

Entsyymi PROT. XYL/SOL XYL/DNS Pelk.sok.

μg/g U/g nkat/g g/g massa XYL I 2 1.2 3.4 0.20 XYL I 10 6.3 17 0.40 XYL Π 2 0.9 14 0.24 XYL Π 10 4.3 70 0.54

Entsyymikäsittelyn jälkeen massat valkaistiin kemiallisesti kloorivalkaisulla, jossa ; alkuvalkaisussa käytettiin kloorikaasua ja klooridioksidia saman verran aktiiviklooriksi lasketttuna. Koko valkaisusekvenssi oli seuraava: (D50/C50)EDED. Vertailukäsittelyssä kloorauskerroin oli 0,18. Entsyymikäsitellyn massan valkaisussa klooriannosta pudotettiin noin 20 %, jolloin kloorauskerroin oli 0,15. Valkaisun jälkeen massoista määritettiin vaaleus, viskositeetti ja massan ligniinipitoisuutta alenemista kuvaava välikappaluku. Valkaisutulokset on esitetty taulukossa 5.

10 96875

Taulukko 5: Puhtailla ksylanaaseilla XYL I ja XYL Π käsiteltyjen mäntysulfaattimassojen valkaisu (D50/C50)EDED sekvenssillä. Alkuperäinen kappaluku 34,1.

Entsyymi/annos Klooraus- Välikappa Vaaleus Viskosit kerroin % dm3/kg XYL I 2 μζ/g 0,15 5,3 90,4 1080 10 " 0,15 5,1 90,8 1070 XYL Π 2 /zg/g 0,15 5,3 90,4 1080 10 " 0,15 5,0 90,8 1070

Vertailu 0,18 4,7 90,0 1050

Vertailu 0,15 6,6 89,0 1070

Tuloksista voidaan nähdä, että kumpikin ksylanaasientsyymi pystyy proteiinina annosteltaessa helpottamaan massan valkaistavuutta yhtä tehokkaasti. Kun tuloksia tarkasteltaessa huomioidaan taulukon 2 mukaan lasketut aktiivisuusmäärät, voidaan päätellä että ksylanaasi I toimii jonkin verran tehokkaammin massan valkaisussa ;* käytettäessä vertailuperusteena sokeroivaa XYL/DNS aktiivisuutta. Samalla sokeroivan ksylanaasin annostustasolla, 14-17 nkat/ g substraattia (joka vastaa 10 μ% ksylanaasi I ja 2 /tg ksylanaasi Π), saavutetaan parempi valkaisutulos, kun käytetään ksylanaasia I.

96875 π

Esim. 6. Sellumassan valkaisukoe

Valkaisematonta mäntysulfaattimassaa käsiteltiin 2^ % sakeudessa esimerkin 5 mukaisesti ksylanaaseilla I ja Π pH-arvoissa 3-7, lämpötilassa 45 °C kahden tunnin ajan. Entsyymiä annosteltiin 100 nkat/g (XYL/DNS). Entsyymikäsittelyn jälkeen massat valkaistiin esimerkin 5 mukaisesti ja mitattiin loppuvaaleudet Tulokset on esitetty kuvassa 1. Kuvasta voidaan havaita, että ksylanaasi I toimii paremmin happamalla pH-alueella, kun taas ksylanaasi Π toimii paremmin neutraalilla alueella.

92 j-- co 91 - Z3 Φ «0 r.

> 90- ---- 3 89- . op__l--—!-L---1- 8 3 4 5 , 6 7 8

pH

XYL I (pl 5,5) c-- XYL »Cp! 9)o-o

Kuva 1. Valkaisu ksylanaaseilla I ja Π eri pH-arvoissa.

12 96875

Esimerkki 7. Mekaanisen massan kuituominaisuuksien muuttaminen.

Karkeaksi jauhettua kuusimassaa (TMP, freeness 450) käsiteltiin puhtailla ksylanaaseilla I ja Π niiden pH-optimeissa 45eC:ssa kahden tunnin ajan. Entsyymien annostus oli 500 nkat/kg massaa (XYL/DNS). Entsyymikäsittelyn jälkeen massoja jauhettiin PFI-jauhimella freeness arvoon noin 100. Näytteistä määritettiin kuitujen ominaisuuksia kuvaavat parametrit Tulokset on esitetty taulukossa 6. Prosenttiluvut mittausarvojen jälkeen kuvaavat positiivisen (> 100%) tai negatiivisen (< 100%) efektin suuruutta.

Taulukko 6. Ksylanaaseilla käsiteltyjen mekaanisten massojen paperitekniset ominaisuudet Käsittely Vetoindeksi Repäisyindeksi Zero-span vetoindeksi

Nm/g mNm2/g Nm/g

Vertailu 25.6 5.04 81.3 XYL I 23.0 (90%) 4.27 (85%) 78.6 (97%) XYL Π 26.5 (104%) 5.24 (104%) 85.5 (105%)

Kuten tuloksista voidaan nähdä, on ksylanaasilla II selvä positiivinen vaikutus massan paperiteknisiin ominaisuuksiin. Mekaanisen massan ksylaani muistuttaa natiivia ksylaania, eli siinä ei ole juuri tapahtunut sivuryhmien irtoamista.

13 96875

Viitteet:

Bailey, MJ. & Poutanen, K., Appi. Microbiol. Biotechnol. 1989, 30: 5-10.

Biely, P. & Markovic, O., Biotechnol. Appi. Biochem. 1988, 10: 99-106.

Clark, T.A., McDonald, A.G., Senior, DJ., Mayers, P.R., Abstr. Fourth Int. Conference on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry, Raleigh, 1989, pp. 39-40.

Dekker, R.F.H. 1985 Biodegradation of the hemicelluloses. In: Biosynthesis and biodegradation of Wood components. T. Higuchi (ed.), Academic Press, Inc. Orlando, pp. 505-533

Fuentes, J-L. & Robert, M. French Patent 8613208, 1986.

Gibson, T.S. & Me Cleary, B.V., Carbohydr. Polymer. 1987, 7: 225-240.

IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry). Pure Appi. Chem. 1987, 59: 257-268.

John, M. & Schmidt, J. (1988) Methods Enzymol. 160A: 662-671.

Mora, F., Comtat, J., Bamoud, F., Pia, F. Sc Noe, P. J. Wood Sci. Technol. 1986, 6, 147-165.

Noe, P., Chevalier, J., Mora, F. & Comtat, J. J. Wood Sci. Technol. 1986, 6: 167-184.

Paice, M.G., Bernier, R. & Jurasek, L. Biotechnol. Bioeng. 1988, 32: 235-239.

Paice, M.G. & Jurasek, L. J. Wood Sci. Technol. 1984, 4, 187-198.

14 96875

Pommier, J.-C, Fuentes, J.-L. & Goma, G. Tappi J. 1989, June: 187-191.

Poutanen, K. & Puls, J., Appi. Microbiol. Biotechnol. 1988, 28: 425-432.

Roberts, J.C., McCarthy, A.J., Flynn, N.J. & Broda, P., Enz. Microb. Technol. 1990, 12: 210-213.

Tan, LU.L, Wong, KJC.Y, Yu, E.K.C. & Saddler, J.N., Enzyme Microb. Technol. 1985, 7: 425-430.

Tan, L.U.L., Yu, E.K.C., Louis-Seize, G.W. & Saddler, J.N., Biotechnol. Bioeng. 1987, 30: 96-100.

Viikari, L, Ranua, M., Kantelinen, A., Linko, M. & Sundquist, J. Proc. 4th Int. Congr. on Wood and Pulping Chemistry, Paris, 1987. Voi. I, pp. 151-154.

Wong, K.K.Y., Tan, L.U.L. & Saddler, J.N., Can. J. Microbiol. 1986, 32: 570-576.

il

Claims (9)

96875

1. Menetelmä puussa tai kuidussa olevan tai kuidusta irrotetun hemiselluloosan, erityisesti ksylaanin, hydrolysoimiseksi, tunnettu siitä, että hydrolyyseissä käytetään Trichoderma reeseistä eristettyä entsyymivalmistetta, joka sisältää endo-jö-ksylanaasia I, jonka pl-arvo on 5,5 ja molekyylipaino 19 kD, ja/tai endo-/3-ksylanaasia II, jonka pl-arvo on 9,0 ja molekyylipaino 20 kD.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymival-misteet on tuotettu Trichoderma reesei -homeella, siitä jalostetulla kannalla tai muulla tuottoisännällä, johon ksylanaaseja I ja/tai II koodaavat geenit on siirretty.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että edullisin entsyymi tai entsyymiseos valitaan käyttö-pH:n ja käyttösovelluksen perusteella.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valitaan ksylanaasi I, kun käyttö-pH on alueella 3-6, edullisimmin 4-5, ksylanaasi II, kun käyttö-pH on alueella 4-8, edullisimmin 5-7, ja näiden seos, kun pH on alueella 3-8, edullisimmin alueella 4-7.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että " ksylanaasia I tai ksylanaasia II tai niiden seosta, edullisimmin ksylanaasia II, käytetään kuidun paperiteknisten ominaisuuksien parantamiseen.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ksylanaasia I tai ksylanaasia II tai niiden seosta, edullisimmin ksylanaasia I, käytetään | sellumassan valkaisun esikäsittelyyn.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ksylanaasia I tai ksylanaasia II, edullisimmin niiden seosta, käytetään sokereiden tuottamiseen. 96875

8. Sellaisen entsyymivalmisteen käyttö mekaanisen massan paperiteknisten ominaisuuksien parantamiseksi, joka on eristetty Trichoderma reeseistä ja joka sisältää endo-/3-ksylanaasia II, jonka pl-arvo on 9,0 ja molekyylipaino 20 kD.

9. Sellaisen entsyymivalmisteen käyttö sellumassan valkaisun esikäsittelyyn, joka on eristetty Trichoderma reeseistä ja joka sisältää endo-/3-ksylanaasia I, jonka pl-arvo on 5,5 ja molekyylipaino 19 kD. I! 96875