PT94450A - Processo para a deslignificacao enzimatica de material lignocelulosico - Google Patents

Description

INTERNATIONAL PAPER COMPANY "PROCESSO PARA A DE5LIGNIFICAÇÃ0 ENZIMATICA DE MATERIAL LIGNOCE-LULOSICO"

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO o diz respeito, numa sua primeira ocesso de um único andar ou de vji ficação enzimática de materiais ligninollticas. Numa segunda forma nvenção refere-se a um processo de lignificação enzimática de materiais ligninollticas e com xilanases. Mais invenção refere-se a um processo ape:r ção enzimática de materiais lignoce-indústria de polpa de celulose e de A presente invençã forma de realização, a um pr rios andares para a desligni lignoceluldsicos com enzimas de realização, a presente i andares múltiplos para a des lignoceluldsicos com enzimas particularmente, a presente feiçoado para a deslignifica luldsicos para utilização na papel.

ENQUADRAMENTO GERAL DA INVENÇÃO

Os componentes principais dos materiais lignoceluldsicos (por exemplo madeira) são celulose, hemicelulose e lenhina. Estes compostos constituem respectivamente cerca de 35 - 50%, 20 - 30% e 20 - 30% do peso seco das plantas que fornecem a madei^ ra. A celulose é um sacárido polimérico constituído por unidades de D-glucose dispostas numa cadeia linear. Nas plantas que originam madeira, as moléculas lineares de celulose estão distribuídas em feixes de fibrilas densamente empacotadas. As hemiceluloses são sacá-ridos lineares e ramificados homopoliméricos e heteropoliméri-cos, compostos por diversos açucares com cinco a seis átomos de carbono. Estes açucares incluem, por exemplo, xilose, arabi-nose, manose galactose e glucose. Hemiceluloses que consistem

em um homopolímero de um destes açúcares são denominados, res-pectivamente, xilano arabinano, manano, galactano e glucano.

As hemiceluloses participam na reticulação das moléculas de celulose e dos feixes de fibrilas. 0 outro componente importari te do material lignocelulósico é a lenhina. Tal como a celul£ se e as hemiceluloses, a lenhina é um polímero natural. No entanto, a lenhina é mais complexa do que quer a celulose quer as hemiceluloses. CompÕe-se principalmente por unidade de fenil--propano metoxiladas que foram ligadas aleatoriamente por uma variedade de ligações carbono-carbono e éter, obtendo-se c£ mo resultado uma matriz tridimensional. Esta matriz encerra as fibrilas de celulose, conferindo resistência mecânica e rigidez à composição. Assim, a lenhina pode ser considerada como uma ej; pécie de "cimento" natural que mantém reunidas e rodeia as fibras de celulose. 0 papel é basicamente uma rede de malhas bidimensional de fibras celulósicas dispostas ao acaso, ligadas por ligações em ponte de hidrogénio entre as unidades de polissacáridos. Nas plantas que originam madeira, as fibras de celulose são "cimentji das" em arranjos ordenados paralelamente por acção da lenhina. Por consequência, para tornar o material lenhoso das plantas útil para a fabricação de papel, ele tem de ser separado em fibras celulósicas individuais capazes de sofrerem a ligação por ponte de hidrogénio com outras fibras celulósicas.

No processamento convencional do material de plantas lenhosas, as fibras são libertadas por moagem mecânica ou refinação, por modificação química ou por remoção da lenhina ou por combinações destes métodos. A separação das fibras tem como resultado a formação de polpa de papel - uma lama ou uma suspensão 3 de fibras de madeira. . A deposição dessas fibras de maneira a obter-se uma esteira emaranhada tem como resultado a obtenção de papel. A formação mecânica de polpa é a separação físicas das fibras de madeira., produzindo a assim chamada polpa de elevado rendimento. Obtém-se um elevado rendimento porque a lenhi-na não é eliminada durante o processo de formação da polpa e, assim, o seu peso contribui para a polpa.

No processo químico de formação de polpa o material lignoceluldsico é tratado com agentes oxidantes químicos adstrin gentes que degradam a lenhina. A formação química da polpa é mais vulgarmente realizada pelos processos Kraft (sulfato), de sulfito, de soda e de sulfito modificado. Estes tratamentos eM minam a maior parte da matriz de lenhina e libertam as fibras de celulose provocando a formação de polpa. Por exemplo, o processo Kraft de fabricação de polpa (sulfato) origina uma polpa que contém apenas 5 - 8% em peso de lenhina residual, com uma redução de aproximadamente três a cinco vezes o teor original de lenhina.

Também se utilizam processos híbridos, tais, como o processo termomecânico, químico-termomecânico e químico-mecânico para obtenção da polpa.

Cada um dos processos de fabricação de polpa acima de£ critos tem como resultado a obtenção de polpa de cor escura. A cor associada à polpa de papel é quase exclusivamente devida à lenhina residual. A intensidade de cor da polpa depende tanto da quantidade total da lenhina residual como do seu estado químico. Por exemplo, as polpas químicas, das quais a maior parte da lenhina foi removida durante a operação de formação da polpa, são

de cor especialmente escura porque a lenhina restante encontra--se extensamente oxidada e modificada. A lenhina residual que fica nas polpas químicas é particularmente difícil de remover. Esta dificuldade foi atrjl buída à ligação covalente da lenhina residual a hemiceluloses (por exemplo, xilano) e talvez a celulose. Algumas destas ligações podem estar presentes na madeira. No entanto, pensa-se que a maior parte se forma durante o processo químico de fabricação de polpa C veja-se, por exemplo, Matsumoto e col., "The Role of Sugars Remaining in Residual Lignin", Fourth International Sym-posium on Wood and Pulping Chemistry, Paris, França, Abril de 1987, Vol. 2, páginas 305 - 311; Iversen e col., "The Formation of Lignin-Carbohydrate Bonde During Kraft Pulping", Fourth International Symposium on Wood and Pulping Chemistry", Paris, França, Abril de 1987, Vol. 2, páginas 163 - 165; Iversen e Wannstrom, "Lignin-Carbohydrate Bonds in a Residual Lignin Isolated from Pine Kraft Pulp", Holzforschung, 40, páginas 19 - 22 (1986) J. Há muitos tipos de papel, que vão desde o papel branco de elevada qualidade até ao utilizado em caixas de cartão ori dulado. A fim de se produzir um produto de papel desejavelmente brilhante, a polpa tem de ser branqueada antes da sua transformação em papel. Além disso, é desejável que os papéis brancos de elevada qualidade não sejam submetidos à inversão da brancura (isto é, ao amarelecimento) em resposta à acção da luz e ao envelhecimento . A polpa pode ser branqueada com uma de duas maneiras de proceder. Em primeiro lugar, os grupos cromoféricos da lenhina podem ser destruídos sem a remoção da maior parte da lenhina. Em segundo lugar, a lenhina (incluindo os seus grupos cromofóri- -5-

Vr cos) pode ser quase totalmente eliminada da polpa. 0 primeiro método é usualmente reservado ao branquea mento de polpas mecânicas, em que a retenção da maior parte da massa de lenhina é necessária para manter elevados rendimentos. 0 segundo método é geralmente utilizado para branquear polpas químicas usadas na produção de papel branco de elevada qualidade. Adicionalmente, como a inverçio da brancura é proporcional ao teor de lenhina, só a polpa branqueada pelo segundo processo é capaz de produzir papel permanentemente branco (isto é, papel não submetido a amarelecimento). A qualidade da brancura é vulgarmente medida em termos de percentagem de G. E. - medida da reflectância. 0 teor de lenhina da polpa e dos produtos de papel é geralmente quantificado em função do número kapa. Muito embora a cor escura da polpa seja devida aos cromóforos da lenhina, a brancura (percentagem de G. E.) não é directamente proporcional ao teor de lenhina (número Kapa). Por exemplo, uma operação de branqueamento que re duza o número Kapa de uma polpa de 25 para 15, sem destruir os cromóforos da lenhina, não branqueará significativamente a polpa. 0 número kapa deve ficar compreendido entre cerca de 8 e 12 antes de se observar um aumento significativo da percentagem de G. E. como resultado da eliminação da lenhina. Assim, pode ser necessária uma extensa deslenhificação antes de se conseguir uma brancura mensurável. 0 processo de clarificação da polpa ê designado como branqueamento. 0 branqueamento da polpa é geralmente um processo de operações múltiplas. A clarificação não se observa necessária mente em todas as fases do processo de branqueamento ou mesmo depois dos primeiros andares. E a soma total dos andares de bra]i >Γ queamento que tem como resultado uma polpa branqueada brilhante. Os processos de um único andar ou vários andares que destr£ em os cromóforos da lenhina, eliminam a lenhina (deslignificam), ou realizam estas duas operações, podem ser designados por operações de branqueamento.

Os processos de branqueamento mais vulgarmente utilizados empregam cloro ou compostos que contêm cloro, tais como h_i poclorito de cálcio, hipoclorito de sddio e dióxido de cloro. Estes processos branqueiam a polpa principalmente removendo quase toda a sua lenhina, de preferência a destruírem os cromóforos da lenhina. Os primeiros andares destes processos são geralmente a cloração e a extracção alcalina da polpa. Muito embora estas operações tenham como resultado um branqueamento efectivo, apr£ sentam severos inconvenientes. Em primeiro lugar, a natureza adstringente destes tratamentos provoca a degradação significat_i va da celulose. A extensão desta degradação pode ser controlada medindo a viscosidade da polpa. Quanto maior for o comprimento da cadeia das moléculas de celulose, mais elevada será a viscosidade da polpa. Como o papel é basicamente uma esteira emaranha da de moléculas de celulose, uma deminuição do comprimento da ca deia tem como resultado um produto de papel com uma reduzida resistência mecânica e uma menor resistência ao rasgamento. Assim, seria preferível um processo de branqueamento que minimizasse a degradação das fibras de celulose.

Um inconveniente mais importante do andar de extracção por cloração reside no facto de o efluente desta operação ser muito corrosivo e conter um grande número de produtos clorados orgânicos de ruptura da lenhina. Alguns destes produtos orgânicos clorados são tóxicos e potencialmente mutagénicos e/ou

carcinogénicos. A descarga para o esgoto deste efluente apreseri ta assim um sério problema de tratamento de esgotos. Um outro inconveniente reside no facto de os derivados de cloro muito fo£ temente corrosivos presentes neste efluente atacarem o equipamento da instalação fabril e impossibilitarem assim a reciclagem do efluente para utilização em outros andares no processo de fabricação de papel. Finalmente, a natureza corrosiva do efluente torna-o perigoso para o pessoal da instalação fabril.

Por estes motivos, têm sido vigorosamente procurados pela indústria processos de branque-amento alternativos que redjj zam o cloro necessário ao branqueamento. A técnica anterior também inclui processos de branquea_ mento que utilizam peróxido de hidrogénio, oxigénio e ozono. Es_ tes processos, no entanto, também têm vários inconvenientes con sequentes. A deslignificação significativa e o branqueamento das polpas Kraft pelos processos à base de peróxido de hidrogénio são acompanhados pela degradação inaceitável das fibras de celjj lose e, além disso são operações dispendiosas. Os processos de branqueamento com oxigénio e com ozono tendem também a degradar as fibras de celulose, além de degradarem a lenhina. A degradação da celulose tem como resultado a obtenção de menores rendimentos de polpa e polpas de pequena viscosidade, que originam papel com fracas propriedades mecânicas.

Para evitar os vários inconvenientes dos processos de branqueamento anteriormente referidos, explorou-se o desenvolvi^ mento de processos de branqueamento enzimáticos não poluentes. Diversos tipos de microrganismos segregam enzimas que modificam ou degradam a lenhina sem atacar a celulose nem as hemicelulo-ses. A classe mais largamente estudada destes microrganismos

que degradam a lenhina é constituída pelos fungos da podridão branca. 0 membro melhor estudado desta classe de fungos é ο ιτΰ crorganismo Phanerochaete chrysosporium. No entanto, a utiliza^ ção directa destes fungos para branqueamento da polpa tem inconvenientes. [ Veja-se, por exemplo, Tran e Chambers, "Deligni^ fication of an Unbleached Hardwood Kraft Pulp by Phanerochaete chrysosporium11, Appl. Microbiol. Biotechnol., 25, páginas 484 -490 (1987) J. Um inconveniente importante reside no facto de a deslignificação pelos fungos ser muito lenta, necessitando de pe^ lo menos sete dias para se obter um embranquecimento apreciável. Um outro problema reside no facto de os fungos também segregarem enzimas que degradam a celulose, efeito secundário muito indesejável. Finalmente, o processo pode apenas realizar-se sob as coin dições circunscritas às quais os fungos são viáveis. Na tentativa de vencer alguns destes obstáculos à deslignificação enzimá-tica prática, explorou-se a utilização de preparações de enzimas derivadas de culturas de fungos, de preferência à utilização dos fungos propriamente ditos.

Presume-se que os fungos da podridão branca realizem a degradação completa da lenhina com obtenção de diéxido de car bono e água pela acção concertada de muitas enzimas. Os mecani^ mos que estão por detrás deste processo complexo começam agora a ser conhecidos. Pensa-se que a reacção inicial na deslignifi-cação enzimática ocorre por um mecanismo por radicais livres.

Diversas enzimas do sistema ligninolítico do fungo da podridão branca Phanerochaete chrysosporium foram isoladas e pelo menos parcialmente caracterizadas. Membros de uma família de enzimas, designadas lignina-peroxidades ("LiP enzimas") foram descritas por diversos grupos e são vulgarmente consideradas

como sendo as enzimas mais directamente responsáveis pela des-lignificação. As lignina-peroxidases necessitam de perdxido de hidrogénio para serem activas. As actividades de deslignificação destas enzimas é vulgarmente medida em termos da sua capacidade para oxidar álcool veratrílico (álcool 3,4-dimetoxi-ben-zílico) com obtenção de aldeído veratrílico (aldeído 3,4-dime-toxi-benzilico) . 0 álcool veratrílico foi assim usado na técni_ ca como composto modelo da lignina, cuja oxidação é considerada como o diagnóstico da presença de uma enzima que degrada a le-nhina (também referida como "ligninase") .

Outra enzima de Phanerochaete chrysosporium, que recein temente se sugeriu que participa no processo de deslignificação, é a peroxidase dependente de Mn(II) (também conhecida por "NADH--oxidante peroxidase"), na presente memória descritiva designada como "MnP". Tal como as enzimas LiP, a enzima MnP necessita de perdxido de hidrogénio mas, como o seu nome sugere, aparente mente também necessita de Mn(II). A MnP não oxida o composto m£ delo de lignina-álcool veratrílico. No entanto, oxida diversos corantes incluindo 2,2'-azino-bis-(3-etil-6-benzotiazolino-sul-fonato) ("ABTS") £ Glenn e Gold, "Purification and Characterizji tion of an Extracellular Mn(II)-Dependent Peroxidase from the Lignin-Degrading Basidiomycete, Phanerochaete chrysosporium", Arch. Biochem. Biophs., 242(2), páginas 329 - 341 (1985) ] e o vermelho de fenol. A oxidação do vermelho de fenol é uma maneira vulgarmente utilizada para exprimir a actividade de MnP £ Kuwahara e col., "Separation and Characterization of Two Extra cellular ^C^-Dependent Oxidases from Ligninolityc Cultures of Phanerochaete chysosporium", FEBS Lett., 169(2), páginas 247 -250 (1984) J. -11-

A "verdadeira" função de MnP no sistema ligninolltico, se ela na realidade existir, presentemente não é clara. No entanto, recentemente pôs-se a hipótese de que a MnP participa no processo ligninolltico, gerando o perdxido de hidrògénio requerido pelas enzimas LiP. Esta hipótese foi confirmada, em parte, pela recente descoberta de que se produz peróxido de hidrogénio como subproduto da oxidação de NADH por MnP [ Asada e col., "An Extracellular NADH-Oxidizing Peroxidase Produced by a Lignin--Degrading Basidiomycete Phanerochaete chr\sosporium", J. Ferment. Technol. 65(4), páginas 483 -487 (1987) J. Há uma certa confusão no estado actual da técnica relativamente ao facto de se saber se as preparações de enzimas derivadas de Phanerochaete chrysosporium são efectivas na modificação e/ou na degradação da lenhina existente na polpa de madeira.

Farrell e col., na patente de invenção norte-americana número 4 687 741, referem-se a (1) enzimas ligninolíticas purificadas, obtidas a partir da estirpe mutante SC26 do Phanerochiaete chrysosporium; (2) estirpe mutante SC26 de Phanerochaete chryso^ porium; e (3) um processo para a degradação e a modificação de lenhina em polpa de madeira usando estas enzimas purificadas. A patente de invenção norte-americana número 4 687 745, concedida a Farrell, refere-se a um processo para melhorar as propriedades de resistência mecânica e a estabilidade da brancura de polpas mecânicas usando enzimas derivadas da estirpe SC26 de Phanerochaete chrysosporium. A patente de invenção norte-americana número 4 690 895, depositada por Farrell, refere-se a um processo para o branqueamento de polpa Kraft utilizando enzimas derivadas da estirpe SC26 de Phaneroch<aetê chrysosporium. 12-

Em contraste com as patentes de Farrell, Viikari e col., "Application of Enzymes in Bleaching", Fourth International Symposium on Wood and Pulping Chemistry, Paris, França, Abril de 1987, Vol. 1, páginas 151-154 ("Viikari I"), afirma; "As ligninases de P. radiata e de P. chrysosporium não têm efeitos detectáveis sobre a polpa kraft de pinheiro quaji do comparadas com os tratamentos com o tampão de referência. Os valores dos números de kapa e os graus de brancura depois dos tratamentos com ligninase foram virtualmente os mesmos que nos tratamentos de referênoia . Estes números estão de acordo com os recentes resultados que mostraram que as reacções de ligninases extracelulares originam de preferência uma posterior polimeriza-ção do que uma degradação da lignina..."

Viikari I, página 153, coluna da esquerda, parágrafo superior (citações omitidas). A referência bibliográfica Viikari £ não oferece qualquer sugestão relativamente ao facto de o tratamento com. ligninase não ser eficaz. A presente invenção refere-se, na sua primeira forma de realização, a um novo processo para a deslignificação enzimjá tica de materiais lignocelulósicos com enzimas ligninoliticas que diferem substancialmente dos processos referidos quer nas patentes de invenção de Farrell quer por Viikari I.

Consistente com relatórios de acordo com os quais a lenhina residual da polpa Kraft está reticulada com hemicelulo-se, diversas publicações referem-se ao tratamento de polpa de madeira com hemicelulases (por exemplo, xilanase) com a finalidade de deslignif ica ção, branqueamento e/ou para a produção de polpa que permite produzir papel com propriedades mecânicas ape:r feiçoadas. Essas publicações sugerem que as hemicelulases efec- -13-

tuam a deslignificação degradando as hemiceluloses, tornando por isso extractável a hemicelulose clivada e toda a lenhina que está reticulada com ela C Vide por exemplo, Viikari I;

Paice e col., "Bleaching Hardwood Kraft Pul with Enzymes from Cloned Systems", Proceedinqs : 74th Annual Meetinq of the Cana-dian Pulp & Paper Association, Montreal, Canadá, Janeiro de 1988, páginas A133 - 136; Chauvet e col., "Assistance in the Bleaching of Never-Dried Pulps by the Use of Xylanases, Consequences on Pulp Properties", Fourth International Symposium on Wood and Pulping Chemistry, Paris, França, Abril de 1987, Vol. 2, páginas 325 - 327; Noé e col., "Action of Xylanases on Chemical Pulp Fibers", J. Wood Chem. Technol. 6, páginas 167 - 184 (1986); Viikari e col., "Bleaching with Enzymes", Proceedings: Third International Conference on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry"? Estocolmo, Suécia, Junho de 1986, páginas 67 - 69 ; patente de invenção francesa número 2 557 894; patente de invenção norte-americana número 2 280 307 J.

Como se referiu antes, Viikari I descreve o tratamento de polpa de madeira ou com hemicelulases ou com ligninases. Além disso, Viikari I refere-se à operação que consiste em submeter--se polpa Kraft não branqueada tanto de madeira dura como de ma deira macia a tratamento com hemicelulase seguida de tratamento com ligninase. Refere, no entanto, que este tratamento sequencial com hemicelulase-ligninase não resulta numa deslignificação significativamente maior do que no caso de tratamento apenas com hemicelulase. A presente invenção refere-se, na sua segunda forma de realização, a um processo para a deslignificação de material li-gnocelulósico por tratamento sequencial com ligninases e com xi-

lanases. Inesperadamente, e ao contrário das conclusões referidas por Viikari I, o processo de acordo com a presente invenção permite uma deslignificação significativa quando comparada com o tratamento ou com a ligninase ou com a xilanase sozinhas.

SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método prático para a deslignificação eficaz de material lignocelulósico com enzimas ligninollticas ou com enzimas ligninolíticas e xilanases.

Por consequência, constitui um objectivo da presente invenção proporcionar um processo que tem como resultado a obten_ ção de uma polpa lignoceluldsica deslenhifiçada, branqueada, sem a produção de correntes efluentes corrosivas e poluentes associa_ das com as operações convencionais de branqueamento com cloro.

Um outro objectivo da presente invenção é proporcionar um processo que tem como resultado a obtenção de polpa lignoceluldsica branqueada utilizada para a produção de papel que apr£ senta uma estabilidade de brancura melhorada quando comparada com a produzida depois do branqueamento da polpa convencional.

Constitui ainda um outro objectivo da presente invenção proporcionar um processo que tem como resultado a obtenção de uma polpa lignocelulósica branqueada que tem uma elevada vij3 cosidade e que pode ser empregue na produção de papel com propriedades superiores de resistência mecânica.

Um outro objectivo da presente invenção é proporcionar um processo de branqueamento enzimático em que os efluentes de cada andar de branqueamento e da operação de lavagem podem ser recliclados para utilização na lavagem de polpas de outras operações .

Um objectivo adicional da presente invenção é propor- cionar um processo de branqueamento de andares múltiplos, que inclui um ou mais andares de deslignificação ligninolítica e, numa segunda forma de realização, um ou mais andares de desli-gnificação com xilanase, assim como um ou mais andares de branqueamento convencionais.

Estes e outros objectivos adicionais e outras vantagens da presente invenção, evidentes na descrição pormenorizada e nas reivindicações que se seguem, são conseguidos na primeira forma de realização da presente invenção tratando o material lignocelulósico com uma preparação de enzimas ligninolíti-cas na presença de uma pequena concentração estacionária de pe-róxido de hidrogénio. De acordo com um processo preferido desta forma de realização, pelo menos um dos seguintes reagentes está também presente: Mn(II); um alfa-hidroxi-ácido; um detergente não iónico ou anfotérico; e/ou um álcool aromático substituído capaz de servir como substrato das enzimas ligninolíticas.

Numa segunda forma de realização, os objectivos e as vantagens do processo de acordo com a presente invenção são conseguidos tratando o material lignocelulósico, em incubações separadas, com uma preparação de enzimas ligninolíticas e com uma preparação de xilanase. De acordo com um processo preferido desta forma de realização, a incubação com inzimas ligninolíticas realiza-se na presença de uma pequena concentração estacionária de peréxido de hidrogénio. De acordo com um processo mais prefjs rido desta forma de realização, pelo menos um dos seguintes re^ gentes estará também presente durante a incubação com enzimas l_i gninolíticas: Mn(II); um ácido alfa-hidréxi; um detergente não iúnico ou anfotérico; e/ou um álcool aromático substituído capaz de servir como substrato das enzimas ligninolíticas. -16-

Numa forma de realização preferida da presente inveji ção, a polpa lignocelulósica é submetida a uma operação de ex-tracção alcalina e depois é lavada com água, a seguir a cada incubação com enzimas ligninoliticas ou com xilanases (isto é, depois de cada operação de deslignificação enzimática). Uma op£ ração de deslignificação enzimática opcionalmente seguida das operações de extracção respectivas constitui um andar de um pr£ cesso de deslignificação enzimática de acordo com a presente invenção .

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se, de acordo com uma sua primeira forma de realização, a um novo processo, em um andar ou em vários andares, para a deslignificação enzimática de material lignocelulásico com enzimas ligninoliticas. De acordo com uma s£ gunda forma de realização, o processo da presente invenção compreende pelo menos um tratamento com enzimas ligninoliticas num andar e pelo menos um andar de tratamento com xilanase. Os processos de acordo com a presente invenção podem também ter como resultado o branqueamento do material lignocelulósico.

Um aspecto importante e inesperado da segunda forma de realização da presente invenção reside no facto de o material lignocelulósico ter de ser tratado com xilanases e com enzimas ligninoliticas em incubações diferentes a fim de conseguir-se uma maior deslignificação do que no caso do tratamento com xila nases ou com ligninases sozinhas. Por meio de ensaios repetidos, determinou-se que o tratamento de material lignocelulósico com enzimas ligninoliticas e xilanases na mesma incubação tem como resultado uma menor deslignificação do que a que se consegue apenas com o tratamento com enzimas ligninoliticas sozinhas. ,, -17- * .%

Tal como é utilizada na presente memória descritiva, a expressão "andar de deslignificaçio enzimática" refere-se a uma operação que compreende a fase de se incubar material lign£ celulósico com ou enzimas ligninoliticas ou com xilanases. Uma operação de deslignificação enzimática : de acordo com a presente invenção pode ainda compreender as operações de extracção e/ou de lavagem a seguir à operação de incubação com enzimas lignin£ líticas ou com xilanases. Um "andar de tratamento com enzimas ligninoliticas" é uma operação de deslignignificação enzimática que compreende a operação que consiste na incubação do material lignocelulósico com uma preparação de enzimas ligninoliticas. Um "andar de tratamento com xilanase" é uma fase de desligni^ ficação enzimática que compreende a operação de se incubar o material lignocelulósico com uma preparação de xilarase.

Materiais lignocelulósicos

Os materiais lignocelulósicos preferidos para utilizji ção no processo de acordo com a presente invenção são as polpas de madeira. A título de exemplo, estas polpas de madeira incluem as polpas preparadas pelo bem conhecido processo do sulfito, su_l fato ou Kraft, soda e sulfito modificado. 0 processo de acordo com a presente invenção origina uma deslignificação significativa das polpas tanto de madeira macia como de madeira dura. A pr£ Sente invenção é particularmente útil para o branqueamento de polpa Kraft de madeira dura, em que o número kapa da polpa não tratada é já tão baixo que a deslignificação enzimática provoca facilmente o branqueamento.

Também se observou um branqueamento significativo da polpa de madeira macia produzida por processamento Kraft extensivo (tendo um número kapa de pré-branqueamento igual a 8) após 18-

o tratamento com enzimas ligninolíticas de acordo com a primeira forma de realização da presente invenção. No entanto, as polpas de madeira macias produzidas pelos processos Kraft normais têm um teor de lignina muito elevado, com um número kapa de pré-brari queamento igual;a pelo menos 20. Como o valor do número kapa deve descer abaixo de cerca de 8 a 12 antes de se observar um aumento significativo da brancura como resultado da remoção da l£ nhina, o grau de deslignificação conseguido num processo de um ou dois andares de acordo com a primeira forma de realização da presente invenção com estas polpas com uns elevados índices de kapa não foi ainda suficiente para se obter como resultado um bra£ queamento significativo. No entanto, um processo de acordo com a primeira forma de realização da presente invenção que consiste em três ou mais andares de deslignificação enzimática conseguiu dar como resultado uma deslignificação suficiente de polpa kraft de madeira macia meridional para se obter como resultado um branquea_ mento mensurável.

Um processo de quatro andares de acordo com a segunda forma de realização da presente invenção, que compreende três ajn dares de tratamento com enzimas ligninolíticas e um andar de tratamento com xilanase, pode originar uma deslignificação suficiente de polpa de madeira macia com um número kapa elevado (isto é, um número kapa maior do que 20), de maneira a resultar em branqueamento significativo. A requerente sublinha o facto de que o material ligno-celulásico não necessita de ser completamente deslignifiçado, ou mesmo mensuravelmente embranquecido, para se obterem os benefícios da presente invenção. A deslignificação parcial do material lignocelulásico conseguida pelo processo de acordo com a prese£

% te invenção teria o efeito benéfico de reduzir a quantidade de produtos químicos de branqueamento necessários para deslignifi-car e branquear completamente a polpa. Assim, o nível de produtos orgânicos clorados presentes na corrente de esgoto efluente da instalação de branqueamento é reduzido.

Também se contempla a deslignificação enzimática de po_l pas mecânicas, polpas termomecânicas e polpas químico-termomecâ-nicas. As indicações anteriores constituem apenas uma lista pa£ ciai de materiais lignocelulósicos que podem ser utilizados com boa vantagem. Por exemplo, não se exclui a utilização de polpas produzidas por processos não conhecidos na técnica.

Além disso o processo de deslignifica ção de acordo com a presente invenção tem um efeito benéfico sobre a formação da polpa, a deslignif icação e o branqueamento de materiais lignocelu^ lósicos parcialmente transformados em polpa é igualmente previsto. Admite-se que, se um tal material lignoceluldsico parcialmente transformado em polpa for deslignifiçado de acordo com a presente invenção, se obtém concomitantemente uma polpa apropriada para utilização directa na fabricação de papel.

Os materiais lignoceluldsicos deslignificados de acordo com processos da presente invenção podem ser lavados ou tratados de qualquer outra forma antes da deslignificação enzimática quer com enzimas ligninolíticas quer com xilanases. As operações de lavagem são particularmente benéficas quando o material lignoceluldsico utilizado é uma polpa química. Na forma de realização preferida do processo de acordo com a presente invenção, as polpas químicas são extensivamente lavadas com água antes de serem submetidas ao tratamento com enzimas. As polpas químicas podem também ser lavadas com agentes quelantes diluídos, tais como ácido etilenodiamino-tetracético ("EDTA") (5 a 100 mM) ou com i·; ácido dietileno-triamino-pentacético ("DTPA") (0,01 a 100 mM). 0 material lignocelulósico é então extensivamente lavado com água antes de ser submetido à operação de deslignificação enzi-mática. Pode ser também vantajoso lavar o material lignocelulósico com ácido diluido, por exemplo com ácido acético 10 a 200 mM, antes de se proceder à deslignificação enzimática.A consistência da polpa varia normalmehte entre 0,1 e 10,0% durante estas operações de lavagem. A requerente reconhece também a possibilidade de que os andares de processamento anteriores possam envolver o aqueci_ mento do material lignocelulósico. A realização desta possibilidade pode requerer que o material lignocelulósico seja arrefecido antes da sua adição à mistura da reacção de deslignificação, de modo a evitar-se a inactivação pelo calor das enzimas ligni-nolíticas ou xilanases activas.

Preparações de enzimas ligninolíticas e preparações de xilanases

As preparações de enzimas ligninollticas derivadas de fungos da podridão branca, fungos de podridão castanha ou fungos de podridão seca são úteis para as finalidades da presente inven_ ção. São tambémúteis enzimas derivadas de estirpes mutantes desses fungos de ocorrência natural, especialmente o mutante for escolhido pela sua produção aumentada das enzimas ligninollticas pretendidas. Preferivelmente, empregam-se enzimas derivadas de um fungo da podridão branca. E particularmente preferida a utilização de enzimas derivadas de Phanerochaete chry sosporium. Mui_ to embora se possa empregar qualquer estirpe deste fungo, os exemplos de estirpes desejáveis incluem SC26 C Northern Regional Research Laboratory ("NRRL") n2 15978 J, ME-446 [ American Type Culture Collection (" A T T C " ) n2 34541 J e VKM-F-1767 (ATCC n2 24725). -21-

As preparações de xilanases derivadas quer de fungos quer de bactérias são úteis para a finalidade da presente invejn çío. Preferem-se as preparações de xilanase que compreendem uma endoxilanase.

Os microrganismos particulares utilizados como fonte de xilanase não fazem parte do âmbito da presente invenção. Pelo contrário, qualquer microrganismo que se saiba produzir xilanases e, preferivelmente, endoxilanases, é útil para a finalidade da presente invenção. Muitos destes microrganismos são conhecidos na técnica. C Veja-se, por exemplo, Bastawde, "Studies on Xylana^ se fronri Chainia sp.H, Tese de Doutoramento (em Bioquímica), Universidade de Poona, Division of Biochemical Sciences, National Chemical Laboratory, Pune - 411008, índia, páginas 9-37 (Maio de 1987) ("tese de Bastawde1·); Dekker, "Biodegradation of the Hemicelluloses", em Biosynthesis and Biodegradation of Wood Com-ponents, Academic Press, MV., páginas 505 - 533 (1985) J.

As espécies úteis de fungos incluem as compreendidas, entre outras, no grupo formado por Aspergillus, Chaetomium, Sporotrichum, Sclerotium, Schizophyllum, Trichoderma e Thermoascus. As espécies de fungos particulares que se supõe serem úteis incluem, entre outras, Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Sporotrichum dimorphosporum, Schizophyllum radiatum, Trichoderma Eeesei, Trichoderma harzianum e Thermoascus aurantia cus.

As espécies de bactérias úteis incluem as espécies do * grupo constituído por Chainia , Streptomyces, Bacillus e Clos-tridium. As espécies de bactérias particulares que se crê serem úteis incluem, entre outras, Streptomyces olivochromoqens, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Clostridium thermocellum i

··>»*» -> e Clostridium acetobutylicum.

Preferem-se as estirpes que produzem xilanases mas não celulases. São especialmente preferidas como fontes de preparações de xilanase as espécies Chainia e as espécies Steptomyces classificadas antes como pertencentes ao género Chainia. * - Foi proposto recentemente que o género Chainia s£ ja considerado como um sinónimo júnior do género Streptomyces e que as espécies que ele contém sejam redesignadas de acordo com esta proposta -C Goodfellow e col., "Transfer of Chainia Species to the Genus Streptomyces with Emended Description of Species", System. Appl. Microbiol. 8, páginas 55 - 60 (1986) J. Aprovando esta sugestão, a Cole£ ção de Cultura Típica Americana (ATCC) reclassifi-cou a maior parte das sua s estirpes de Chainia como pertencentes ao género Streptomyces♦ 0 Northern Regional Research Laboratory, aparentemente, não concorda com esta proposta; não reclassificou as suas espécies de Chainia.

Muitas estirpes dos géneros e das espécies acima indicadas estão disponíveis em colecções públicas de microrganismos.

As estirpes úteis (isto é, aquelas que produzem xilanases) podem ser identificadas pelo simples expediente de cultivar os microrganismos, isolar o sobrenadante de cultura extracelular e proceder à escolha relativamente à actividade de xilanase de acordo com maneiras de proceder conhecidas na técnica. /"Veja-se, por exemplo, Khan e col., "Assay of Xylanase and Xylosidase Activities in Bacterial and Fungai Cultures", Enzyme Microb, Technol., 8, ^23- % páginas 373 - 377 (1986) J. A requerente estudou dezasseis estirpes de Streptomyces e de Chainia obtidas a partir da American Type Culture Collection relativamente à actividade de xilanase. Verificou-se que todas elas produziam xilanases, excepto três.

Os microrganismos liofilizados obtidos a partir da ATCC foram cultivados nos meios recomendados pela ATCC (meios ATCC nS 5; designados posteriormente na presente memória descriti^ va por "meios de esporulação") (50 ml de meio de esporulação em balões de Erlenmeyer de 250 ml), a 26°C num conjunto sacudidor orbital rotativo a 150 rotações por minuto. Depois de se ter acu mulado uma ampla quantidade de biomassa aproximadamente ao fim de duas semanas), colocou-se um inóculo a 10¾ (5 ml) em 50 ml de 3 x meios de esporulação (contém todos os materiais dissolvidos dos meios de esporulação em concentração três vezes maior) em bíí Iões de Erlenmeyer de 250 ml, e incubaram-se durante sete dias a 28 - 30°C num conjunto sacudidor rotativo orbital a cento e cinquenta rotações por minuto. Após incubação durante sete dias, co locaram-se inóculos a 10¾ (5 ml) de cada cultura em meio de fermentação de xilano a 3¾ C 3¾ de xilano de madeira de larlcio (Sigma Chemical Co., n^ X3875) e 1¾ de extracto de levedura (Difco) em água da rede de distribuição J (Conjunto A) e meio de farelo de trigo a 5¾ C flocos de farelo natural a 12,5¾ (40¾ de farelo de trigo) e 1¾ de extracto de levedura (Difco) em água da rede de distribuição J (Conjunto B).

Incubaram-se as culturas em meio de fermentação a 3¾ de xilano (Conjunto A) em balões de Erlenmeyer de 250 ml, a 30°C, num conjunto agitador orbital regulado a duzentas e vinte rotações por minuto. Retiraram-se amostras de 3 ml de cada cultura do Con- junto A em cada um dos dias 3 a 8 depois da inoculação.

Incubaram-se as culturas em meio de farelo de trigo a 5% (Conjunto B) durante quatro dias em balões de Erlenmeyer de 250 ml, a 28°C, num conjunto agitador orbital de sacudimento rotativo a 150 rotações por minuto. No quarto dia da incubação, transferiu-se em condições assépticas 10?á de inéculo (5 ml) de cada cultura do Conjunto B para meio de fermentação de xilano a 3% e incubou-se em balões de Erlenmeyer de 250 ml, a 30°C, num conjunto rotativo de sacudimento'a' 220 rotações por minuto . Retiram-se amostras de cada uma das culturas do Conjunto B em cada um dos dias 3 a 8 depois da inoculação.

As amostras foram centrifugadas a 70 x g (médio) durante vinte minutos à temperatura ambiente e ensaiaram-se os sobre-nadantes relativamente à actividade de xilanase como se descreve mais abaixo. De salientar que como os picos de produção de xilanase se verificaram em diferentes dias com diferentes estirpes, é importante ensaiar relativamente à actividade em pelo menos c£ da um dos três dias até oito depois da inoculação.

Incubou-se o Conjunto B num meio contendo 5¾ de farelo de trigo porque se sabe que este meio provoca a produção de xilanase. C Veja-se Srinivasan e col., "Studies on Xylan Degrading Enzymes from Chainiaw, Biotechnol. Lett. 6, páginas 715 - 718 (1984) J. No entanto, a requerente não observou qualquer diferença significativa na actividade de xilanase entre as culturas em duplicado do Conjunto A e as do Conjunto B.

Utilizando cada um dos protocolos de ensaio para escolha acima descritos, identificaram-se dez estirpes como produtoras positivas de xilanase. Classificou-se uma estirpe como produtora positiva se em qualquer dos dias quatro a oito foi caracte;

% rizada por possuir uma actividade maior do que 2 U/ml de xilana-se. As dez produtoras positivas (e os seus números de acesso da ATCC) são as seguintes: Steptomyces sclerotialus (ATCC 15896); Streptomyces flaviscleroticus (ATCC 19347); Streptomyces fumiga-tiscleroticus (ATCC 19345); Streptomyces minutiscleroticus (ATCC 17757); Streptomyces niger (ATCC 17756); Streptomyces ochraceis-cleroticus (ATCC 15814); Streptomyces poonensis (ATCC 15723); Streptomyces roseiscleroticus (ATCC 17755); Streptomyces sp. (ATCC 27946); e Chainia hygroatrocyanea (ATCC 43962).

Além das dez estirpes produtoras positivas acima indicadas, a requerente identificou três estirpes como produtoras marginais de xilanases. Uma estirpe foi classificada como produtora marginal se, nos seus dias de produção máxima dentro.dos dias 4 a'8, ela :foi caracterizada por 1-2 U/ml de actividade de xila-nase. As três estirpes produtoras marginais (e os seus números de acesso da ATCC) são as seguintes; Streptomyces olivaceisclero-ticus (ATCC 15722 e 15897) e Streptomyces purpurogeniscleroticus (ATCC 19348). Só três das dezasseis estirpes estudadas se verificou serem produtores negativos. Uma estirpe foi classificada como pr£ dutora negativa se, no seu dia máximo de produção dentro dos dias 4 a 8, ela se caracterizou por menos do que 1 U/ml de actividade de xilanase. As estirpes produtoras negativas (e os seus números de acesso da ATCC) são os seguintes: Streptomyces ruber (ATCC 17754); Streptomyces violens (ATCC 15898); e Chainia yaxianesis (ATCC 43139). A estirpe mais preferida como fonte de endo-xilanase é Chainia sp. (NCL 82-5-1) (ATCC 53812). Prefere-se a xilanase II daquela estirpe em relação à xilanase I. As hemicelulases de / -26-

Chainia sp. (NCL 82-5-1) são estudadas na tese de Bastawde e por Srinivasan e col., em "Studies on Xylan Degrading Enzymes from Chainia" Biotechnol. Lett. 6, páginas 715 - 718 (1984). Para po£ terior caracterização daquela estirpe, veja-se Srinivasan e col., "Hig Activity Extracllular Glucose (Xylose) Isomerase from a Chainia Species", Biotechnol. Lett. 5, páginas 611 - 614 (1983); Vartak e col., "Characterization of Extracellular Substrate Specific Glui cose and Xylose Isomerases of Chainia", Biotechnol. Lett. 6, páginas 493 - 494 (1984); e pawar e col., "Purification and Characterization of Glucose (Xylose) Isomerase from Chainia sp. (NCL 82 - 5 - 1)", Biochem. Biophys. Res. Commun. 155 páginas 411 -417 (1988). Uma característica vantajosa desta estirpe de Chainia reside no facto de não produzir também celulases. Por consequência, podem usar-se meios extracelulares de cultura não fracciona-dos, ou os seus concentrados, sem se verificarem os efeitos deletérios das celulases (isto é, reduzida viscosidade da polpa e reduzido rendimento da polpa).

Geralmente, as enzimas ligninoliticas pretendidas ou as xilanases são segregadas pelo microrganismo para o meio de cultura extracelular. 0 meio de cultura extracelular é então recolhido e processado para se conseguir o grau de concentração pretendido e a purificação da enzima. As condições de cultura e o tempo de colheita influenciam a quantidade total da actividade enzimática recuperada, assim como as proporções relativas de cada uma das várias xilanases ou enzimas ligninoliticas, se se encontrarem pre^ sentes mais do que uma. Além disso, várias estirpes diferem na sua produção total de enzimas ligninoliticas ou de xilenases e nas proporções das várias enzimas produzidas. Portanto, qualquer especialista na matéria é capaz de optimizar a produção da enzima

relativamente à utilização final pretendida da preparação de enzima. Os métodos para a iniciação e o desenvolvimento das culturas de fungos ou de micróbios e para a colheita do meio de crescimento extracelular para se obter a produção óptima de enzimas ligninoliticas ou de xilanases não fazem parte da presente inveii ção e podem ser convenientemente realizadas por métodos conhecidos da técnica.

Os meios de cultura colhidos podem ser utilizados, directamente no processo de deslignificação. Preferivelmente, no entanto, o meio de cultura é concentrado para originar um concentrado de enzima ligninolitica não fraccionada ou um concentrado de xilenase não fraccionado para ser utilizado no processo de deslignificação de acordo com a presente invenção. A vantagem de utilizar meios de desenvolvimento extra-celular, ou um seu concentrado não fraccionado, diminui quando estas preparações compreendem quantidades significativas de celu-lases activas ou de proteases activas. Quantidades significativas de celulases activas provocariam, devido ao seu ataque sobre a celulose, diminuições indesejáveis de viscosidade da polpa e, se estivessem presentes em quantidade suficiente, diminuiriam de ma neira mensurável o rendimento da polpa. Quantidades significativas de proteases activas poderiam, devido ao seu ataque a outras proteínas, provocar diminuições indesejáveis de actividades das enzimas ligninoliticas ou das xilanases na mistura reaccional. Os efeitos indesejáveis de contaminação com celulases ou com proteases podem ser diminuídos ou evitados adicionando inibidores destas enzimas à preparação de enzima não fraccionada. Como variante, as preparações de enzimas podem ser fraccionadas para eliminar al_ gumas ou todas as celulases ou proteases que a contaminem.

Qualquer método de concentração que preserve a activi-dade enzimática é apropriado. Os métodos de concentração apropriji dos incluem a liofilização e a evaporação sob vazio, assim como a precipitação com elevados teores de sal, de polietileno-glicol, de acetona e de álcool. Se se utilizar qualquer destes procedimentos de concentração, as enzimas (ligninases ou xilanases) podem ser reconstituídas num. tampão apropriado (por exemplo, acetato de sédio, tartarato de sódioj dimetil-succinato de sódio ou succinato de· Sódio a pH 3 - 6) para produzir o concentrado de enzimas não fraccionado para utilização na reacção de deslignificação. Como variante, o liofilizado ou o precipitado podem ser adicionados directamente à mistura submetida à reacção de deslignificação. 0 método preferido para produzir um concentrado de enzima ligninolítica não fraccionada é por diálise sob pressão do meio de cultura extracelular. Um concentrado de enzima ligninolítica extracelular típico contém 0,5 - 20,0 U/ml de activida-de oxidante de álcool veratrilico ("VAO"). Uma unidade de activi-dade VAO é definida, para as finalidades da presente invenção, como a quantidade de enzima que é capaz de oxidar uma micromole de álcool veratrilico por minuto a 25°C, nas condições padrão de ensaio descritas abaixo. A actividade VAO é quantificada a partir da alteração de absorvância da solução de ensaio a 310 nanómetros. Nos ensaios de actividade VAO usam-se três reagentes preparados: A) tartarato de sódio 0,25 molar, ajustado a pH 3,0 com

B) C) álcool veratrilico 10,0 mM (Aldrich Chemical Co., Milwaukae, WI, n^ D13, 30U-0); e peróxido de hidrogénio 98 mM (Fischer Scientific, /-29- f

%

Fairlawn, NJ, n2 325-5) (solução fresca preparada diáriamente ) .

Para realizar o ensaio da actividade de VAO, realizam--se as seguintes operações: a) adicionam-se 400 microlitros de reagente A a uma tina de quartzo: b) adicionam-se 200 microlitros de reagente B; c) adicionam-se 390 microlitros de amostra de enzima/água bidestilada; d) mistura-se o conteúdo da tina usando um laço de cabo; e) adicionam-se 10 microlitros de reagente C; f) misturam-se os componentes da tina imediatamente usando um laço de cabo; e g) mede-se a absorvância a 310 nm durante trinta segundos a 25°C.

Calculam-se as unidades de actividade VAO por mililitro de uma amostra de ensaio (U/ml) da seguinte maneira, usando um va_ lor de 9300 M-'*' cm ^ como coeficiente de extinção para o álcool veratrilico; (Δ A/min.)(9300) ^(1000) ^"volume da amostra de ensaio (ml)

Para as finalidades do presente pedido de patente de invençãojuma unidade de LiP é igual a uma unidade de actividade de VAO A Δ Ajio/min. é linear em relação à concentração de LiP dentro do intervalo de 0,1 a 0,5 Δ A3io/minuto. As amostras de enzimas que originam velocidades fora deste intervalo não são utilizadas para calcular a actividade. Em vez delas, o volume da amostra de ensaio por tina é reduzido ou aumentado de modo que a velocidade medida fique dentro do intervalo linear.

Em certas circunstâncias, pode ser desejável usar sub-fracções parcialmente purificadas dos meios de cultura colhidos. Por exemplo, prefere-se a .utilização de uma subfracção que contém ligninase ou de uma subfracção que contém xilanase que não contém também quantidades significativas de celulases ou de proteases. Deve esperar-se que as preparações de xilanases não fraccionadas, de maneira particular, contenham celulases. Como variante, pode ser desejável separar as enzimas de LiP de quaisquer enzimas MnP, ou separar várias xilanases, de modo que as actividades enzimáti-cas possam ser utilizadas independentemente nos tratamentos com enzimas. Por fim, prevê-se a utilização de enzimas ligninoliticas e de xilanases que foram purificadas até aproximadamente à homogeneidade, assim como a utilização de misturas de enzimas ligni-nollticas purificadas e de misturas de xilanases purificadas.

Os métodos usados para subfraccionar os meios de cultura extracelulares e conseguir o grau pretendido de purificação da enzima não fazem parte do âmbito da presente invenção e podem realizar-se por quaisquer combinações efectivas de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, podem empregar-se operações de se_ paração por cromatografia com base nas diferenças de cargas, pi, hidrofobicidade e tamanho. São também apropriados vários métodos de precipitação selectiva, por exemplo com sulfato de amónio.

Além disso, prevê-se a utilidade da cromatografia por afinidade para purificar enzimas escolhidas. Os ligados de afinidades apropriados incluem, entre outros, lectinas, compostos de lignina e anticorpos monoclonais dirigidos para a enzima pretendida. Vide por exemplo, Tan e col., patente de invenção norte-americana nó-mero 4 725 544, que descreve um processo para a separação de xilanases das misturas que as contêm com outras hemicelulases ou -31-

celulases produzidas cultivando microrganismos hemicelulíticos.

Uma propriedade característica importante da presente invenção reside no facto de a MnP purificada do Phanerochaete chrysosporium ser eficaz na deslignificação de polpa de madeira usando o processo de acordo com a presente invenção. Com base na técnica anterior (veja-se "Enquadramento Geral da Invenção", antes referida na presente memória descritiva), foi totalmente inesperado que a MnP fosse útil na deslignificação e no branqueamento de polpa de madeira. Tal como é utilizado na presente memória de£ critiva, o termo "MnP" aplica-se a qualquer peroxidase dependente de manganês que é capaz de motificar ou de degradar a lenhina,independentemente de a enzima ser ou não ser presentemente conhecida na técnica. Tal como são utilizadas na presente memória descri_ tiva, as expressões "enzimas ligninolíticas" ou "ligninases" referem-se a enzimas LiP e/ou MnP.

As xilanases recombinantes ou sintéticas ou as enzimas ligninolíticas que têm actividade ou de LiP ou de MnP são também úteis no processo de acordo com a presente invenção. Estas ejn zimas podem ser produzidas por métodos conhecidos da técnica.

Normalmente, a preparação contendo a enzima pretendida é adicionada directamente à reacção de deslignificação. No entanto, pode ser vantajoso imobilizar as enzimas num suporte sólido e em seguida adicionar este suporte sólido derivatizado ao meio de reacção de deslignificação. A maneira de proceder utilizada para imobilizar depende do suporte utilizado e pode realizar-se por qualquer método apropriado que não destrua a actividade enzimática. Uma vantagem da utilização das enzimas ligninolíticas ou das xilanases acopladas a suportes sólidos reside no facto de as enzimas poderem ser mais 2-

convenientemente recuperadas da mistura reaccional de deslignifi cação depois de se ter atingido o grau de deslignificação desej£ do. A enzima recuperada é então adicionada ao material lignocel£ lósico para iniciar outra reacção de deslignificação.

Fase de tratamento com enzimas ligninolíticas A operação de tratamento com enzimas ligninolíticas p£ de realizar-se em qualquer recipiente de tamanho desejado, desde que se adoptem as medidas necessárias para a mistura, regulação da oxigenação e da temperatura do seu conteúdo. Além disso, devem proporcionar-se os mecanismos convenientes para a introdução dos componentes não gasosos da reacção e a eliminação dos produtos da reacção. A ordem da adição dos componentes da reacção não é crítica; no entanto, prefere-se adicionar as enzimas no fim. A mistura reaccional de base compreende o material lignocelulósico a ser deslignifiçado, uma preparação de enzimas ligninolíticas activas e peróxido de hidrogénio, preferivelmente a baixa conce£ tração invariável, tudo em solução aquosa mantida ao valor apropriado de pH. Preferivelmente, a mistura reaccional contém também um ou mais dos seguintes componentes: a) um detergente não idnico ou anfotérico: b) Mn(II)s c) um alfa-hidróxi-ácido ; e/ou d) um álcool aromático substituído, capaz de servir de substrato das enzimas ligninolíticas.

Se o material lignocelulósico a ser branqueado for po_l pa de madeira, ele deve encontrar-se presente na mistura reacci£ nal com uma consistência (grama de polpa em peso seco por grama de polpa húmida) compreendido entre 0,1 a 15¾ e preferivelmente entre 2,0 e 10¾. -33- -33-

Se se utilizar uma preparação de enzimas ligninoliti-cas que compreende pelo menos um LiP e é isenta de qualquer acti vidade de MnP, ela deve encontrar-se presente na mistura reacci£ nal numa proporção de 10 a 100 unidades de actividade de VAO por grama de polpa de peso seco, e preferivelmente 15 a 30 U/g. Se se utilizar uma preparação de enzima que compreende pelo menos uma MnP e é isenta de actividade de LiP, ela deve encontrar-se presente na mistura reaccional numa proporção de 10 a 200 unidades por grama de peso seco de polpa, e preferivelmente 35 a 100 U/g, de actividade de oxidação de vermelho de fenol ("PR0").

Uma unidade de actividade de PR0 é definida como a quajn tidade de enzima que provoca uma alteração da absorvância da solução de ensaio, a 530 nm, igual a uma unidade de absorvância por minuto, a 25°C sob as condições normais do ensaio.

Nos ensaios de actividade de PR0 usam-se três reagentes preparados. 0 reagente A consiste em 0,11 g/litro de sal de sódio de vermelho de fenol (Sigma Chemical Co., St. Louis, Estados Unidos da América M0, N2 P-5530), 1,1 g/litro de ovalbumina e 2,5 rôl/litro de ácido láctico a 85¾ em succinato de sódio 20 mM, pH 4,5. 0 reagente B é sulfato de manganês 10 mM em succ_i nato de sódio 20 mM, pH igual a 4,5. 0 reagente C é peróxido de hidrogénio 9,8 mM (Fischer Chemical Co.) (fresco, preparado diariamente ) .

Para realizar o ensaio de determinação da actividade de PR0, realizam-se as seguintes operações: a) adicionam-se 900 microlitros de reagente A a uma tina de quartzo; b) adicionam-se 100 microlitros da amostra de enzima/água bidestilada; c) adicionam-se 10 microlitros do reagente B; d) misturam-se imediatamente os conteúdos da tina usando um laço de cabo; e) determina-se o zero do espectrofotómetro a 530 nm com esta tina; f) adicionam-se 10 microlitros de reagente C; g) mistura-se o conteúdo da tina imediatamente com o laço de cabo; e

h) regista-se o valor da absorvância a 530 nm durante trir^ ta segundos a 25°C. As unidades da actividade de PRO por mililitro de amostra de ensaio (U/ml) são então calculadas usando a seguinte operação: (^A/min.) /“volume da amostra de ensaio (ml)

Para as finalidades do presente pedido de patente de invenção, uma unidade de MnP é igual a uma unidade de actividade de PRO. 0 quociente zy A^-jo/min é linear em relação à concentração de MnP dentro do intervalo de 0,05 a 0,20 Δ A^g/minuto ·

As amostras de enzima que originam velocidades fora deste intervalo não são utilizadas para calcular a actividade. Em seu lugar, reduz-se ou aumenta-se o volume de amostra ensaiada por tina de modo que a velocidade medida fique compreendida dentro do intervalo de linearidade.

Se se utilizar uma preparação de enzimas ligninollti-cas que compreende uma ou mais enzimas LiP e uma ou mais enzimas MnP, elas devem encontrar-se presentes na mistura reaccional nas concentrações acima especificadas.

Na forma de realização mais preferida da presente inveji çao, mantém-se a concentração do perdxido de hidrogénio igual a *-35- .% um valor estacionário baixo na mistura reaccional ao longo da incubação com enzimas ligninollticas. A concentração do peróxido de hidrogénio deve manter-se compreendido entre 0,001 e 0,5 mM. Preferivelmente, mantém-se a concentração do peróxido de hidrog<§ nio compreendida entre 0,005 e 0,1 mM. A concentração do peróxi-do de hidrogénio pode manter-se convenientemente ao nível desejado por formação enzimática in situ, por exemplo, por meio da ac-ção de glucose-oxidase sobre a glucose. Por consequência, é usual a adição à mistura reaccional de 0,001 a 10,0 U/ml de glucose-ox£ dase e de 0,01 a 20,0 mM de glucose. Mais tipicamente, utiliza-se 1,0 U/ml de glucose-oxidase e 0,1 a 10,0 mM de glucose. Como variante, o peróxido de hidrogénio pode ser fornecido por adição contínua medida. A adição medida pode ser o método preferido para manter a concentração de peróxido de hidrogénio nas reacções de deslignificação em grande escala. A concentração de peróxido de hidrogénio pode também ser mantida aproximadamente mediante adições periódicas. 0 pH deve manter-se compreendido entre 2 e 8 ao longo de toda a reacção de deslignif icação. Preferivelmente, o pH é maji tido dentro do intervalo de cerca de 3 a 5. 0 pH pode ser mantido por quimostatização - adição medida ou periódica das quantidades apropriadas de ácido ou de base. A quimostatização é o método pr£ ferido para manter o pH em reacções em grande escala. Como variar^ te, o pH pode ser mantido por utilização de um tampão na mistura reaccional. Pode utilizar-se qualquer tampão conveniente que seja eficaz ao valor de pH pretendido. Os exemplos de tampões apropriados ao intervalo de pH pretendido incluem tampões de acetato, succinato de dimetilo, tartarato e ácido trans-aconítico. 0 tampão é geralmente adicionado à mistura reaccional a uma concentra- -36- * / '"?*** .% ção compreendida entre cerca de 5 e 50 mM e, preferivelmente en_ tre 15 e 25 mM.

Prefere-se a adição de um detergente não idnico ou an_ fotérico à mistura reaccional ligninolítica. Mais vulgarmente, utiliza-se um detergente não iónico. Os exemplos de detergente não iónicos apropriados incluem octil-glucésido, polioxietileno--glicol e compostos das séries de detergentes Triton e Tween. Prefere-se Tween 80. 0 detergente pode ser adicionado com uma co£ centração compreendida entre 0,001 e 0,1¾ volume/volume e, preferivelmente a 0,01 até 0,05¾ volume/volume.

Se a preparação de enzimas ligninolíticas utilizada corn prender uma MnP, é necessária a presença de Mn(II) na mistura reaccional. Quando a preparação de enzima ligninolítica utilizada compreende pelo menos uma LiP e exclui qualquer MnP, a adição de Mn(II) não é essencial. 0 Mn(II) pode ser convenientemente adi_ cionado sob a forma de sal, por exemplo, sob a forma de sulfato de manganês ou de acetato de manganês. Em geral, 0 Mn(II) é adicionado sob a forma de sulfato de manganês. Quando adicionado, o Mn(II) deve encontrar-se presente na mistura reaccional em uma concentração compreendida entre 0,05.e 1,0 mM. Preferivelmente, a concentração de Mn(II) está compreendida entre 0,10 e 0,50 mM.

Quando se adiciona Mn(II) à mistura reaccional, á preferível adicionar igualmente pelo menos um alfa-hidroxi-ácido.Os alfa-hidroxi- -áçidos apropriados incluem"malatOjtartarato, citrato, lactato, fenil--lactato, glicolato, 2-hidroxi-butirato e os seus sais. Preferivelmente usa-se lactato. 0 alfa-hidroxi-ácido deve encontrar-se presente na mistura reaccional com uma concentração compreendida entre 0,5 e 20,0 mM, e preferivelmente entre 1,0 e 10,0 mM.

Se a preparação da enzima ligninolítica utilizada com- preender pelo menos uma enzima LiP e excluir qualquer enzima MnP, é preferível adicionar à mistura reaccional 0,005 a 0,60 mM de um álcool aromático substituído capaz de servir como subs_ trato para as enzimas ligninolíticas. Mais preferivelmente, adiciona-se álcool veratrílico. Se a preparação de enzima lignino-lítica utilizada compreender uma enzima LiP e uma enzima MnP, pode adicionar-se 0,005 a 0,60 mM de um álcool aromático substi_ tuído capaz de servir como substrato às enzimas ligninolíticas (por exemplo, álcool veratrílico) à mistura reaccional. Se a pr£ paração da enzima ligninolítica utilizada compreender uma enzima MnP e excluir qualquer enzima LiP; então á ' preferível não adicionar à mistura reaccional um álcool aromático substituído capaz de servir como substrato para as enzimas ligninolíticas (por exemplo, álcool veratrílico). 0 oxigénio é necessário à deslignificação enzimática pelas enzimas ligninolíticas. E preferível saturar a mistura reac cional com oxigénio antes da adição das enzimas ligninolíticas. Tipicamente, depois de todos os componentes reaccionais terem sido adicionados, o vaso reaccional é rapidamente lavado com oxig£ nio e então vedado para se criar uma atmosfera enriquecida em oxi. génio. A mistura reaccional ligninolítica deve ser incubada a 15 até 55°C durante 0,25 até dezoito horas·. Preferivelmente, a reacção de deslignificação realiza-se a 40 até 50°C durante duas a oito horas. Mais preferivelmente, a reacção de deslignificação realiza-se a 45°C. E desejável proporcionar um dispositivo para mistura dos componentes da mistura reaccional durante a reacção de deslignif icação . Pode usar-se qualquer método de mistura apropriado -38- para a escala da reacção de deslignificação. No entanto, deve evitar-se fazer uma mistura demasiadamente vigorosa que originja ria a formação de espuma e a concomitante desnaturação das enzi_ mas .

Operação de tratamento com xilanase A operação de tratamento com xilanase deve realizar-se em qualquer vaso de reacção de tamanho pretendido para o qual se tenham adaptado os dispositivos de mistura e os dispositivos de regulação de temperatura do seu conteúdo. A ordem de adição dos componentes da reacção não ê critica; no entanto, prefere-se adi^ cionar as xilanases no fim. A mistura reaccional de base compreende o material lignocelulósico a ser deslignif içado e uma prepja ração de xilanase activa numa solução aquosa mantida a um valor apropriado do pH.

Se o material lignocelulósico a ser deslignifiçado for uma polpa de madeira, ela deve encontrar-se presente na mistura reaccional com uma consistência de 0,1 a 15%, e preferivelmente de 2 a 10%. A preparação de xilanase encontra-se presente na misttJ ra reaccional de maneira a originar uma proporção de 0,1 a 200 unidades de actividade de xilanase por grama de peso seco de polpa. Preferivelmente, a preparação de xilanase encontra-se preseri te a 0,1 até 50, e mais preferivelmente 1 até 25, unidades de actividade de xilanase por grama de peso seco de polpa.

Uma unidade de actividade de xilanase é definida com a quantidade de enzima que provoca a produção de xilano igual a 1 micromole de xilose por minuto, a 25°C, sob as condições normais de realização da reacção. A clivagem do xilano pela xilanase produz agrupamentos »39- de açucares redutores que, então, reagem com ácido dinitro-sa-licllico ("DNSA") presente na solução de ensaio para originar uma alteração de cor que é controlada a 340 nm.

Construiu-se uma curva de calibração para a concentração de xilose (micromoles/mililitro) em função da absorvância a 540 nm usando diversas diluições de xilose 100 mM (Pfaltz and Bauer, Inc.) em acetato de sódio 50 mM, de pH 5,0. A partir da curva de calibração, determinou-se que 1 micromole de xilose .tem uma absorvância a 540 nm aproximadamente igual a 0,0128 sob as condições normais de realização da reacção. Utilizou-se essa cons tante para calcular a actividade de xilanase das soluções da amo£ tra (por exemplo, sobrenadantes da cultura) que foram ensaiadas. 0 ensaio era linear para as soluções de amostra com uma absorvância medida a 540 nm até aproximadamente 0,2. As soluções de amostra com absorvâncias acima daquele valor foram diluídas de modo que a sua absorvância estivesse dentro do intervalo linear.

Para cada solução de amostra (por exemplo, sobrenadantes de cultura) ensaiada, preparou-se uma "solução de referência", que continha a mesma quantidade de solução de amostra (por exemplo, sobrenadante da cultura) e suficiente acetato de sódio 50 mM de pH 5,0 para se obter um volume final de ensaio igual a 1 ml. A cada tubo com amostra adicionou-se uma solução a 1% de xilano de madeira de larício (Sigma Chemical Co., N2 X3875)em acetato de sódio 5Ú mM.de pH 5,0 (0,5 ml)· seguida adicionou-se um volume suficiente de acetato de sódio 50 mM, pH 5,0, aos tubos de amostra para se obter como resultado um volume de ensaio final igual a 1 ml depois da adição da solução da amostra (por exemplo, sobrenadante da cultura) e a solução de xilano. De maneira semelhante, adicionou-se um volume suficiente de acetato de sódio 50 mM aos tubos de referência para se obter como resultado um volume final de ensaio igual a 1 ml depois da adição da solução de amostra (por exemplo, sobrenadante da cultura). Em seguida, adicionou-se o volume préte.ndido de solução de 'amostra (volume máximo: 0,5 ml) a cada tubo de amostra e a cada tubo de referência. Misturaram-se cuidadosamente os conteúdos dos tubos e incubaram-se a 50°C durante trinta minutos. Depois de incubação, adicionou-se DNSA a 1¾ em água destilada (1 ml) a cada tubo e incubaram-se os tubos durante cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicionou-se NaOH 5 N (0,2 ml) a cada tubo ( para reforçar o desenvolvimento de cor) e incubaram-se os tubos durante trinta minutos à temperatura ambiente. Mediu-se a absor-vância de cada solução de amostra a 540 nm com o espectrofotóme-tro calibrado a zero com a solução de referência que corresponde à amostra. 0 pH deve manter-se compreendido entre 4 e 8 durante toda a incubação da xilanase com o material lignocelulósico. Preferivelmente, o pH é conservado dentro do intervalo de cerca de 5 até 7. Como se descreveu antes para o tratamento com enzimas ligninoliticas, o pH pode ser mantido por quimostatização. A qui-mostatização é o método preferido de conservação do pH em incub£ ções em larga escala. Como variante, o pH pode ser conservado por utilização de um tampão na mistura reaccional. Pode utilizar-se qualquer tampão conveniente que seja eficaz ao pH pretendido. Os exemplos de tampões apropriados para a gama preferida de pH incluem os tampões de acetato, tartarato e fosfato. 0 tampão é geralmente adicionado à mistura reaccional a uma concentração com- preendida entre 0,1 e 100 mM, e preferivelmente entre 40 e 60 mM. A mistura reaccional de xilanase deve ser incubada a 20 até 70°C e, preferivelmente, a 40 até 65°C. 0 tempo de incubei ção está compreendido entre 0,25 e dezoito horas, preferivelmente entre 0,5 e seis horas, e mais preferivelmente entre uma e quei tro horas. ✓ E desejável realizar a mistura dos componentes da reac-ção durante a incubação com a preparação de xilanase. Pode usar--se qualquer método de mistura apropriado à escala da incubação.

No entanto deve evitar-se uma operação de mistura vigorosa que originaria a formação de espuma e a concomitante desnaturação das enzimas.

Fase de extracção depois da fase detratamento com enzima

Um processo de deslignificação enzimática de "um andar" de acordo com a primeira forma de realização da presente invenção pode consistir somente na operação de tratamento do material ligno celulósico com uma preparação de enzima ligninolitica, como se descreveu antes. Semelhantemen.te, um processo de dois andares de acordo com a segunda forma de realização da presente invenção p£ de consistir somente nas operações de tratamento do material ligno celulósico com uma preparação de enzima ligninolitica, isolamento do material lignocelulósico e, em seguida, tratamento com uma pr£ paração de xilanase (a ordem do tratamento com enzimas pode ser invertida). Preferivelmente, no entanto, cada andar destes proce£ sos compreende a operação ou as operações posteriores de extracção do material lignocelulósico depois de realizada cada operação de deslignificação enzimática.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, o material lignocelulósico é submetido a uma operação de extra£ ção com um meio alcalino depois de cada operação de deslignifi-cação enzimática. Esta fase de extracção alcalina compreende a adição de uma solução alcalina à mistura reaccional, seguida de incubação opcional durante até duas horas a 25° até 100°C, com uma consistência compreendida entre 0,1 a 10% do material ligno-celuldsico. Preferivelmente, realiza-se a incubação durante uma hora a 70°C, com uma consistência da polpa compreendida entre 0,3 e 1,0¾. Depois da incubação, a mistura é geralmente filtrada para separar o material lignocelulósico da solução alcalina. E apropria^ da qualquer solução alcalina, tal como uma solução que contenha hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio. A solução alcalina deve encontrar-se presente durante a operação de extracção na prci porção de 1 a 5 gramas de hidróxido alcalino por 100 gramas de peso seco de polpa. Preferivelmente,o produto alcalino encontra--se presente numa proporção de 4 gramas de produto alcalino por 100 gramas de peso seco de polpa durante a extracção alcalina de polpa de madeira macia e numa proporção de 2 gramas de substância alcalina por 100 gramas de peso seco de polpa durante a extracção alcalina de polpa de madeira dura.

Se se pretende re-utilizar as enzimas na mistura reaccional, elas devem ser separadas do material lignocelulósico antes da extracção alcalina. Os métodos apropriados para separar as enzimas do material lignocelulósico incluem a filtração sob vazio, a precipitação e a sedimentação. Vulgarmente, esta separação realiza-se por filtração. Depois de as enzimas terem sido separadas, a solução alcalina é adicionada ao material lignocelulósico e a operação de extracção alcalina realiza-se como se descreveu antes. 0 material lignocelulósico pode ser lavado com água a -43- seguir à operação de extracção alcalina. Para realizar esta fase de lavagem com água, o material lignocelulósico com uma consistência de 0,1 a 10¾ é dispersa em água e, em seguida, é separado por filtração. Preferivelmente, esta lavagem deve ser ve_ petida até três vezes. Opcionalmente, pode realizar-se uma lavagem com água imediatamente apás a operação de deslignificação enzimática, sem qualquer operação de extracção alcalina.

Se submeter o material lignocelulósico tratado com enzimas a uma operação de extracção com ácido, consegue-se uma maior deslignificação. Verificou-se que a extracção com ácido produz melhoramentos particularmente drásticos no branqueamento da polpa Kraft previamente submetida a tratamento com enzimas ligninolíticas na presença de Mn(II). No entanto, a extracção com ácido tende a não se realizar porque o beneficio que proporciona é muitas vezes contrabalançado pelos seus custos. A extracção com ácido pode realizar-se imediatamente a seguir à operação de extracção alcalina. Como variante, se o material lignocelulósico for submetido a uma operação de lavagem com água depois da operação alcalina ou em vez da operação de extracção alcalina, a operação com ácido realiza-se depois da operação de lavagem com água. Para realizar a operação de e>< tracção com ácido, separa-se o material lignocelulósico, suspen de-se em ácido diluído e incuba-se durante 0,1 a 10 minutos a 10 até 100°C. Preferivelmente, o material lignocelulósico é s£ parado por filtração, suspenso em ácido diluído e incubado durante cerca de 0,1 minuto a 25°C. A solução de ácido diluído compreende preferivelmente 0,05 a 0,50 mM de ácido. Os ácidos apropriados incluem o acetato, succinato, lactato, ácido sulfuroso e outros ácidos minerais fracos. Prefere-se o ácido acéti- / -44- .¾ co. A operação de extracção com ácido realiza-se com cerca de 0,15 a 2,5 litros de solução de ácido diluído por grama de peso seco de material lignoceluldsico.

Processos de vários andares

Num processo preferido de acordo com a presente inven ção, o material lignoceluldsico é submetido a um processo de des_ lignificação enzimática de vários andares. Na primeira forma de realização da presente invenção, cada andar do processo de andja res múltiplos compreende a operação de tratamento do material lignoceluldsico com uma preparação de enzima ligninolítica. Na segunda forma de realização da presente invenção, pelo menos um andar do processo de vários andares compreende a fase de tratamento do material lignoceluldsico com uma preparação de xilanase e pelo menos um outro andar do processo de andares múltiplos cojn preende a operação de tratamento do material lignoceluldsico com umà preparação de enzima ligninolítica.

De acordo com uma forma de realização preferida da pr£ sente invenção, cada andar de deslignificação enzimática compreende ainda uma operação de extracção alcalina, como se descreveu antes. Se se realizar uma operação de extracção alcalina, cada andar antes do andar final compreende preferivelmente ainda uma operação de lavagem com água, como se descreveu antes. 0 andar final pode compreender ainda uma operação de extracção com ácido, como se descreveu acima.

Um processo de vários andares segundo a primeira forma de realização de acordo com a presente invenção consegue realizar uma maior deslignificação do material lignoceluldsico do que um processo de um andar, dadas as mesmas unidades totais de preparação ligninolítica aplicadas à mesma quantidade de mate- -45-

rial lignocelulósico . Cada andar do processo de dois ou três andares de acordo com a primeira forma de realização necessita aparentemente de menos unidades de actividade ligninolítica do que o andar prévio para conseguir o mesmo grau de deslignifica-ção . Qualquer especialista na matéria pode proporcionar a preparação de enzima ligninolítica entre os andares de um processo de andares múltiplos de acordo com a primeira forma de realização. Estas considerações também se aplicam aos processos de acordo com a segunda forma de realização da presente invenção, que compreende mais do que um andar de tratamento com enzima liç[ ninolitica. A segunda forma de realização da presente invenção abrange processos para deslignificar material lignocelulósico que compreendem um ou mais tratamentos com xilanase ("X") e um ou mais andares de tratamentos com enzima ligninolítica ("L"), como se descreveu antes. 0 número absoluto de andares X ou L ( na medida em que haja pelo menos um de cada um deles) não é critico. Actualmente, no entanto parece que os processos que compreendem mais do que um andar X não se justificam porque os andares adicionais X não diminuem significativamente o teor de lenhina reduzida. Portanto, os processos de acordo com a segunda forma de realização da presente invenção que compreendem apenas um andar X são os preferidos.

Além disso, conquanto seja permissível qualquer ordem de sequência dos andares X e L, prefere-se realizar o andar ou os andares X precocemente na sequência do processo. Por exemplo, a sequência X/L é geralmente preferível à sequência L/X. De maneira semelhante, as sequências X/L/L e L/X/L são geralmente preferíveis às sequências L/L/X. A ordem de sequência, no entanto, -46- / tem apenas um efeito relativamente pequeno sobre o teor da le-nhina e o grau de brancura da polpa tratada. 0 número absoluto de andares L tem de longe um impacto muito maior.

Geralmente, quanto maior for o número de andares de tratamento com enzimas ligninollticas num processo de acordo com a primeira ou com a segunda forma de realização da presente invenção, maior é a proporção em que o material lignocelolósico é deslignifiçado. 0 número preferível de andares é escolhido pelos especialistas na matéria com base nas considerações de tempo, economia e compatibilidade com as instalações existentes na fábrica de branqueamento. Por exemplo um processo de deslignifica ção enzimática de um, dois ou três andares, de acordo com a pri^ meira forma de realização da presente invenção ou um processo de dois ou três andares (que compreende um andar de tratamento com xilanase), de acordo com a segunda forma de realização da presente invenção, pode ser preferível a um processo de cinco andíi res de acordo com qualquer forma de realização, se o processo de deslignificação enzimática se destina a ser combinado com andares de branqueamento convencionais para originar produtos completamente branqueados. Nesse caso, o número de andares de braji queamento enzimático seria escolhido de modo a optimizar a economia do processo de branqueamento global. A presente invenção também abrange os processos de brari queamento de andares múltiplos nos quais um ou mais andares de deslignificação enzimática se realizam de acordo com a primeira forma de realização da presente invenção, ou dois ou mais andares se realizam de acordo com a segunda forma de realização da presente invenção mas apenas se utiliza um componente.

Os andares de deslignificação enzimática podem combi- nar-se em série com um ou mais andares de branqueamento conveji cional. Num tal processo de branqueamento de andares múltiplos, qualquer andar de deslignificação enzimática que precede imediji tamente um andar de branqueamento convencional preferivelmente não compreende quaisquer operações de lavagem ou de extracção.

Os exemplos de operações de branqueamento convencionais efecti-vas suplementares são andares que utilizam diéxido de cloro, cloro, hipoclorito, oxigénio, ozono, peróxido de hidrogénio, outros oxidantes fracos e branqueamento por electro-redução. Mesmo embora se empreguem andares adicionais de branqueamento com base em cloro nesta forma de realização, a quantidade total de produtos orgânicos clorados presentes no efluente da instalação de branqueamento é significativamente menor devido à inclusão de um ou mais andares de deslignificação enzimática. A fim de que a presente invenção possa ser mais completamente compreendida, descrevem-se os seguintes exemplos de processos de acordo com a presente invenção. Estes exemplos de£ tinam-se apenas a servir como ilustração e a presente invenção não deve considerar-se como sendo limitada por qualquer descrição que neles se faça. .-48-

Exemplo 1

Preparação de concentrado de enzimas liqn.inolíticas não fraccio-nadas

Prepararam-se concentrados de enzimas ligninolíticas a partir de duas estirpes de Phanerochaete chrysosporium SC26 (NRRL 15978) e VKM-F-1767 (ATTC 24725). A cultura da estirpe VKM-F-1767 iniciou-se a partir de um inóculo de esporos preparado da seguinte forma: 1) propagação das culturas em agar, a 24°C durante catorze a vinte e oito dias, em placas que contêm meio de indução de esporos / "Meio N,r, descrito por H.J.

Vogel em "Distribution of Lysine Pathways Among Fungi: Evolutionary Implications", Ajn. Nat., XCVIII(903), páginas 435 - 46 (1964) J preparado com uma diluição de 1/500 da solução de oligoelementos, uma diluição de 1/100 da Solução de Biotina, sem clorofórmio e suplementada com 2/ó em peso/volume de extracto de malte e 3¾ em peso/volume de extracto de levedura. 2) após desenvolvimento suficiente de esporos (como é evidenciado pela aparência encrespada das placas), a lavagem da superfície de agar de cada placa com 100 x 15 mm com cerca de 3 a 10 ml de água esteriliza^ da para libertar os esporos; e 3) a passagem de água de lavagem, contendo esporos, atr£ vés de um funil esterilizado, cheio com lã de vidro esterilizada, para remover micélios de fungo contami-nantes.

Determinou-se então'a absorvância da' suspensão de esporos resultante -49- % a 650 nm,' sendo uma absorvâhcia:igual ala 650 nm aproximadamente equivalente a 5 x 10^ esporos/ml. Estas preparações de esporos foram armazenadas a 4°C até à sua utilização.

Para iniciar as culturas de VKM-F-1767, inoculou-se Meio de Crescimento A com a suspensão apropriada de esporos, até uma concentração final de pelo menos 0,5 x 10^ esporos/ml e usualmente igual a 2,5 x 105 esporos/ml. 0 Meio de Crescimento A é o meio descrito em T.K. Kirk e col., "Influence of Culture Parameters On Lignin Metabolism By Phanerochaete chrysosporium" Arch. Microbiol., 117, páginas 277 - 285 (1978), com os "Minerais" adicionados a uma concentração sete vezes maior e suplementado com os seguintes reagentes, com as concentrações indicadas: tartarato de amónio 1 mM; Tween 80 0,1¾ em volume/volume; sulfato de manganês 1,8 micromolar; acetato de sódio 20 mM, pH 4,5; álcool benzllico 6mM; glucose a 2¾ em peso/volume (para servir como fonte de carbono). A cultura da estirpe SC26 iniciou-se a partir de cu_l turas iniciais preparadas por transferência directa de micélios do fungo de placas de agar para 10 ml de Meio de Crescimento A. As culturas de iniciação foram preparadas como variante misturar^ do uma cultura de fungos existente num misturador Waring esterilizado. Estas culturas de iniciação foram incubadas a 37°C durante pelo menos três dias, antes de se utilizarem.

Para se iniciar uma cultura de SC26, inoculou-se Meio de Crescimento A com 1¾ em volume e, usualmente, com 10¾ em volume, de uma cultura de iniciação.

Todas as estirpes de fungos foram cultivadas de acordo com a maneira habitual em volumes de 0,1 a 1,0 litro, em recipientes esterilizados de 2 litros (ou balões de Erlenmeyer ou -50- balSes redondos). Depois da inoculação, as culturas foram purgadas com oxigénio e incubadas a 37°C num agitador rotativo a 50 rotações por minuto (se se utilizar um balão de Erlenmeyer) ou num incubador de balões de rolamento a quarenta rotações por minuto. A mistura começou imediatamente depois da inoculação.

Controlou-se o meio extracelular das culturas relati vament e à actividade de VAO, a começar no quarto dia apés a in£ cu lação. Quando s e tiver dete ctado pelo m enos cerca de 0, 05 U/ml de act ivi dade de VAO, o meio de cultura foi colhido e s ubsti- tu ído por Meio de Crescimento B. 0 Meio d e Crescimento B é uma ve rsão co m baixo teor de carb ono do Meio de Crescimento A , dife^ ri ndo do Meio de Crescim ento A pelo facto de conter tartarato de amd nio 3,6 mM e 0,2% em pe so/volume de glucose. Se uma cul- tu ra i ndi vidual n ão tive r ati ngido o níve 1 pretendido de activi da de e nzi mática d entro d e qui nze. dias, o meio foi substituído po r Me io de Cresc imento A, pa ra increment ar a actividade enzirruâ ti ca.

Quando o meio de cultura extracelular tiver atingido o nível pretendido de actividade de VAO, separou-se o micélio do fungo despejando a cultura através de um funil contendo lã de vidro. 0 concentrado de enzima ligninolítica foi então preparado a partir deste meio activo por diálise sob pressão, usando uma célula de ultrafiltração Amicon do Modelo 8400, adaptada com membrana de diálise PM 10. A ultrafiltração realizou-se sob 1,4 2

Kg/cm (20 psi) de azoto.

Quando o volume do meio foi reduzido para aproximada-mente 5 a 10% do seu volume original, o concentrado foi despejado. Armazenou-se o concentrado a -70°C até à sua utilização. Esta preparação concentrada de enzimas ligninoliticas continha tipicamente 0,1 a 1,0 U/ml de actividade de VAO. -51-

.%

Exemplo 2

Deslenhificagão e branqueamento de polpa Kraft de madeira dura

setentrional por meio de uma fracção de concentrado de enzima de SC26 contendo actividade de PRO mas substancialmente isenta de actividade de VAO

Fraccionou-se o concentrado de enzimas não fracciona-das da estirpe SC26 de Phanerochaete chrysosporium por cromato-grafia de permuta aniónica. As fracções foram ensaiadas relativamente à sua actividade de VAO e a sua actividade de oxidação de ABTS (ABTSO) (ABTS) é um substrato de peroxidase que é fundamentalmente resistente a enzimas LiP). Mediu-se também a abso_r vância da fracção a 280 nm e 407 nm.

Seleccionaram-se as fracções com fase na actividade ein zimática e combinaram-se para originar três tipos. As fracções combinadas para formar o tipo I continham actividade de ABTSO, mas não actividade detectável de VAO. As fracções combinadas para formar o tipo III continham actividade de VAO, mas eram substancialmente isentas de actividade de ABTSO. As fracções combinadas para formar o tipo II apresentavam ambos os tipos de act_i vidade.

Os três tipos de concentrados foram então ensaiados relativamente à sua actividade de VAO, PRO e ABTSO e relativameji te à sua absorvância a 280 nm e 407 nm. Finalmente, ensaiou-se a capacidade de estes tipos de misturas de enzimas deslenhifica rem e branquearem polpa Kraft de madeira dura. 0 resultado surpreendente foi o concentrado do tipo I, que é totalmente isento de actividade de VAO mensurável e, assim, presumivelmente, nlo contém qualquer LiP activa, foi muito eficaz no branqueamento da -52- / polpa. Todas as operações foram realizadas à temperatura ambiente, a menos que se indique de outro modo.

Fraccionamento do concentrado de enzimas SC26

Preparou-se concentrado de enzimas não fraccionado a partir da estirpe SC26 Phanerochaete chrysosporium, como se des_ creveu no Exemplo 1, mas com a diferença de se ter modificado o Meio de Crescimento B para substituir a glucose por glicerol a 0,2¾ em peso/volume. Concentrou-se um total de 1,3 litros de so brenadante de cultura (reunido de três culturas) por diálise sob pressão, como se descreveu no Exemplo 1.

Fez-se passar o concentrado de enzimas de 5C26 através de uma coluna com 1,5 x 6 centímetros, carregada com resina Am-berlite XAD-2 (Mallinckrodt, Inc., Paris, KY, Número 3409), qde tinha sido préviamente equilibrada com água bidestilada. A coliu na XAD-2 foi em seguida lavada com água bidestilada e este eluí^ do foi reunido com a corrente anteriormente reunida. 0 volume total combinado de XAD-2 tinha um volume de 65 ml. Era ainda caracterizado pelos seguintes valores: ^00= 2,5 ; ^4Q7= actividade de VAO = 0,81 U/ml; actividade de ABTSO = 9,0 U/ml.

Carregou-se todo o conjunto XAD-2 para uma coluna de 6 x 10 cm contendo DEAE-Sephacel (Pharmacia Fine Chemicals, Up-psala, Suécia), previamente equilibrada com água bidestilada. Depois de carregada, a coluna foi lavada com 100 ml de água bidestilada. A coluna foi em seguida eluída a um caudal de cerca de 100 - 200 ml/hora com um gradiente linear de 770 ml de 0,1 a 0,5 molar de cloreto de sódio em tartarado de sódio 5 milimolar pH 4,8. Separaram-se as fracçoes (300 gotas/fracção) a partir do instante em que se iniciou o gradiente.

Selecgão das fracções da coluna

Cada fracção foi ensaiada relativamente à actividade de VAO e à actividade de ABTSO, assim como relativamente S abso£ vância a 280 nm.

Definiu-se uma unidade de actividade de ABTSO como a quantidade de enzima que provocava uma alteração da absorvância da solução de ensaio, a 415 nm, de uma unidade de absorvância por minuto, a 25°C, sob as condições normais do ensaio. Empregaram-se três reagentes nos ensaios de ABTSO. 0 reagente A consistia em 0,045 gramas/litro de ABTS (Boehringer Mannheim, Alemanha Federal, número 102946), 10 ml/litro de lactato de sódio a 60%, 3,4 gramas/litro de albumina de soro bovino ou de gelati^ na, em succinato de sódio 50 mM, pH 4,5. 0 reagente B era constituído por sulfato de manganês 10 mM em succinato de sódio 50 mM, pH 4,5. 0 reagente C era peróxido de hidrogénio 0,0171% em succinato de sódio 50 mM, pH 4,5 (preparado em fresco diariamente).

Para realizar o ensaio de ABTSO, adicionaram-se 900 mi_ crolitros de reagente A a uma cuveta de quartzo; adicionaram-se 100 microlitros da amostra de ensaio; adicionaram-se 10 microli^ tros do reagente B; o conteúdo da cuveta foi misturado imediata_ mente usando um laço de cabo; o espectrofotómetro foi considera^ do igual a 0 a 415 nm com esta cuveta; adicionaram-se 10 micro-litros de reagente C; misturou-se o conteúdo da cuveta imediata mente com um laço de cabo; e registou-se a absorvância a 415 nm durante trinta segundos a 25°C. Calcularam-se então as unidades de actividade ABTSO por mililitro de amostra de ensaio (U/ml), usando a seguinte equação: ( A/minuto) C volume da amostra de ensaio utilizada (ml) J~^

Um pico complexo largo de actividade de ABTSO espalhja va-se aproximadamente pelas fracções 18 a 60. Havia três picos discretos de actividade de VAO espalhados aproximadamente pelas fracçSes 35 a 50, 70 a 80 e 80 a 92.

Escolheram-se as fracções da coluna e combinaram-se para formar três tipos de eluído, que foram armazenados a -70°C até à sua utilização. Estas fracções foram ensaiadas relativa-mente à sua actividade de VAO,ABTSO e PR0, assim como à sua ab-sorvância a 280 e 407 nm. As fracções da coluna combinadas para formar as associações assim como as caracterlsticas destas associações estão indicadas no Quadro I.

QUADRO I

Associação I II III Fracções 18-34 36-48 72-77 & 82-89 Actividade de ABTSO - (U/ral) 3,7 2,4 0,05 Actividade de PRO (U/ml) 2,9 0,2 0,03 Actividade (U/ml) de VAO* 0 o o H- O O O 0,16 ± 0,02 0,42 ± 0,10 A280 0,43 0,15 0,20 A407 0,04 0,05 0,11 0s valores para as actividades de VAO representam as médias de duas determinações independentes; indicam-se os desvios de padrão. A Amostra I não apresentou actividade de VAO em qualquer das determinações. -55-

Τ'"

Preparação da polpa

Suspenderam-se 30 gramas de peso húmido de polpa Kraft de madeira dura setentrional em 2 litros de água bidestilada e agitaram-se num misturador Waring (em altura) durante quinze se gundos. Separou-se a polpa mediante filtração sob vazio, ressus pendeu-se em 1 litro de EDTA 5 mM e recolheu-se novamente mediar^ te filtração sob vazio. Em seguida, ressuspendeu-se a polpa em 1 litro de ácido acético 0,17 normal e separou-se mediante filtração sob vazio. Por fim, ressuspendeu-se a polpa em 2 litros de água bidestilada, separou-se mediante filtração sob vazio e depois armazenou-se a 4°C até utilização. Esta "polpa lavada" húmida tinha uma consistência de 24¾ (0,24 grama de peso seco de polpa por grama de peso húmido de polpa lavada).

Reacções com enzimas; Experiência A

Preparou-se uma mistura de base contendo os seguintes componentes reaccionais: 175 ml de água bidestilada; 20 ml de acetato de súdio 0,2 molar, pH 5,0; 0,5 ml de 10¾ em volume/vo-lume de Tween 80; 1,0 ml de lactato 2,0 molar; 1,0 ml de glucose 0,3 molar; 0,2 ml de sulfato de manganês 0,1 molar ; 0,8 ml de álcool veratrllico 0,1 molar; e 0,5 ml de NADH (2 mg/ml). Fez-se borbulhar oxigénio através desta mistura de base durante três minutos. A mistura reaccional foi então distribuída unifo^ memente por dez tubos de centrifugação de polipropileno de fundo cónico, de 50 ml (cerca de 20 ml por tubo) e a cada tubo adicionou-se 0,5 grama de peso molhado de polpa lavada (0,12 grama de polpa seca). Em seguida, adicionaram-se as fracções dos concentrados de enzima, nas seguintes proporções.

Beacgão Conjunto de Enzimas - Volume (ml) 1 - 0 2 I 1 3 I 2 4 » I 4 5 I 10 6 I 20 7 II 2 8 II 5 9 III 2 10 III 5

Finalmente, adicionaram-se a cada tubo 20 microlitros de glucose-oxidase (Sigma Chemical, Co., número 6500, 1,0 U/mi-crolitro). Cada tubo foi em seguida lavado durante um curto intervalo de tempo com oxigénio, tapado e incubado a 37°C durante dezoito horas, horizontalmente, num sacudidor rotativo a sesseri ta rotações por minuto.

Depois da incubação, adicionou-se hidróxido de sódio 0,5 N a cada tubo até se obter um volume final de aproximadameji te 50 ml. Adicionou-se o conteúdo de cada tubo a funis de filtro de vidro sinterizado individuais, equipados com filtros Whatman 3M. Os tubos de ensaio vazio foram então lavados, cada um deles, com aproximadamente 30 ml de hidróxido de sódio 0,5 N e estas lja vagens foram adicionadas ao funil de filtração apropriado.. A polpa de cada funil de filtração foi separada mediante filtração sob vazio. A cada funil de filtração, adicionaram-se cerca de 250 ml de água bidestilada, com agitação, e separou-se a polpa.

Em seguida, a cada funil de filtração adicionaram-se cerca de -57- 250 ml de ácido acético 0,17 N, com agitação, e separou-se de novo a polpa. Deixou-se que esta secasse ao ar durante três horas e determinou-se o grau de branqueamento (% G.E.), usando um Technidyne Corporation Model 54 Brightimeter.

No Quadro II, apresenta-se o resumo dos resultados destes ensaios:

QUADRO II

Reacção Actividade de VAO Actividade de PRO Brancura (U/ml) CU/s? polpa)·* (U/ml) CU/g polpa)'* (% G.E.) 1 0,0 0,0 0,0 0,0 39,2 2 0,0 0,0 0,14 24,2 44,0 3 0,0 0,0 0,26 48,3 47,8 4 0,0 0,0 0,48 96,6 50,5 5 0,0 o,o 0,97 241,7 53,2 6 0,0 0,0 1,45 483,3 53,4 7 0,015 2,7 0,02 3,3 46,0 8 0,032 6,7 0,04 8,3 46.3 9 0,038 7,0 0,003 0,5 52,2 10 0,084 17,5 0,006 1,3 52,7 Unidades por grama de peso seco de polpa na mistura cional -5JB-η '•V.

Reacgões cotn enzimas: Experiência B

Adicionaram-se os seguintes reagentes a cada um de três balões de Erlenmeyer de policarbonato de 250 ml, equipados com tampas roscadas: 125 ml de água bidestilada; 20 ml de aceta to de sódio 0,2 molar, pH 5,0; 0,5 ml de Tween 80 a 10¾ em volume/volu me; 1,0 ml de lactato 2,0 molar; 1,0 ml de glucose 0,3 molar; 0,2 ml de sulfato de manganês 0,1 molar; 0,8 ml de álcool vera-trilico 0,1 molar; e 0,5 ml de NADH (2 mg/ml).

Através da mistura reaccional, fez-se borbulhar oxigé nio em cada balão durante três minutos. Em seguida, adicionaranrç -se 5 gramas de polpa lavada de peso húmido (1,2 gramas de peso seco) a cada balão. Adicionaram-se 50 ml de água bidestilada à reacção A; adicionaram-se 50 ml da mistura I ao balão de reacção B; adicionaram-se 50 ml da mistura III ao balão de reacção C. Finalmente, adicionou-se 0,2 ml de glucose-oxidase (1,0 U/micr£ litro) a cada balão.

Lavou-se cada balão com oxigénio, tapou-se e incubou--se a 37°C durante dezóito horas num sacudidor rotativo a 60 rotações por minuto.

Depois da incubação, a polpa de cada balão de reacção foi separada mediante filtração sob vazio em funis de filtro de vidro sinterizado, equipados com filtro de papel Whatman 3M. Res-suspendeu-se cada almofada de polpa, com agitação, em aproximada^ mente 200 ml de solução de hidróxido de sódio 0,5 normal e depois separou-se mediante filtração. Repetiu-se esta lavagem com hidró_ xido de sódio. Finalmente, as polpas foram ressuspensas, com agi_ tação, em cerca de 250 ml de ácido acético 0,17 N e separadas mediante filtração. As almofadas de polpa foram secas ao ar durante pelo menos quatro horas antes de se medir o teor de lenhina (número kapa) e o índice de brancura (% de G.E.). 0 número de microkapa foi determinado essencialmente como descrito em V. Berzins. "A Rapid Procedure For The Determination Of Kappa Num-ber", Tappi, 48(1), páginas 15 - 18 (1965). Os resultados destas análises estão reunidos no Quadro III.

QUADRO III

Reacção A B Ç Actividade de VAO (U/ml) * (U/g de polpa) 0,0 0,0 0.,0 0,0 0,11 17,5 Actividade de PRO (U/ml) „ (U/g de polpa) o o o o 0,73 120,8 0,01 1,3 Brancura (% G. E.) 41,1 54,5 51,0 Teor de Lenhina JLJL (Valor de ^tikappa) 7,9 ± 0,5 6,2 ± 1,2 O H- o

Unidades por grama de peso seco de polpa em cada balão de reacção

Os valores para o número de microkapa representam as médias de duas determinações independentes; indicam-:se os desvios padrão.

Exemplo 3

Deslenhificagão e branqueamento de polpa Kraft de madeira dura setentrional por um tratamento em vários andares com concentrado de enzimas não fraccionadas VKM-F-1767

Submeteu-se polpa de Kraft de madeira dura setentrional a um tratamento em um, dois ou três andares, com concentrado de enzimas não fraccionadas VKM-F-1767 de Phanerochaete chrysosporium. Cada andar, antes do andar final do tratamento em dois ou três andares, consistiu em três operações sequenciais; 1) incubação da polpa com o concentrado de enzimas; 2) extracção da polpa com substâncias alcalinas; e 3) lavagem da polpa com água. 0 tratamento do andar final do processo em vários andares ou o único andar do tratamento em um único andar compreeri dia a quarta fase adicional de extracção da polpa com ácido diluído.

Em cada andar, ensaiaram-se três concentrações difereri tes do concentrado de enzimas. Todas as condições de reacção ex-cepto uma foram experimentadas em duplicado. Realizaram-se reac-ções de controlo na ausência de concentrado de enzimas em triplicado relativamente à análise em cada andar.

Preparação da polpa

Preparou-se polpa Kraft de madeira dura setentrional para o tratamento com enzimas "lavando" com água destilada Polpa (100 - 200 gramas de peso húmido) foi dispersa em aproximadamen-te 1 litro de água destilada, usando um British Sheet Disintegr£ tor, durante quatro a cinco minutos. Recolheu-se a polpa media£ te filtração sob vazio num funil de Buchner sobre papel de filtro -61-

Whatman 3Μ; lavou-se com aproximadamente 30 litros de água dest_i lada por 100 gramas de polpa, peso húmido, em aliquotas e elimjL nou-se a água mediante filtração sob vazio e adicionou-se outra alíquota de água. Repetiu-se este processo até a polpa ter sido lavada com o volume pretendido de água. A polpa "lavada" húmida tinha uma consistência de 23,4% (0,234 grama de peso seco de polpa por grama de peso húmido de polpa), uma brancura de 38% G.E., um número de microkappa igual a 13,3 e uma viscosidade de 28,0 cp.

Preparação do concentrado de enzimas

Os concentrados de enzimas não fraccionados de VKM-F--1767 foram preparados como se descreveu no Exemplo 1, usando ba_ Iões de rotação e Meio de Crescimento A e armazenados a -70°Ca-té serem utilizados. Usou-se a mesma preparação de concentrado para todas as reacções do andar 1. Utilizou-se uma segunda preparação de concentrado nas reacções do andar 2 e do andar 3. E£ te concentrado foi guardado a 4°C entre estes andares. As acti-vidades de VA0 e de PR0 dos concentrados de enzimas foram medidas imediatamente antes de cada andar de acordo com o protocolo descrito antes. Essas actividades foram as indicadas em seguida.

Actividaâe de VAO Actividade de (U/ml) (U/ml) 8,7 13,4 3,0 12,1 1,9 12,0

Andar 1 2 3 -62-

Andar 1

Preparou-se uma mistura reaccional contendo todos os componentes reaccionais excepto polpa, concentrado de enzima e glucose-oxidase. Utilizou-se uma solução de acetato de sódio, pH 4,5 de base e ajustou-se a mistura reaccional, depois da pr£ paração, a pH 4,5 com hidróxido de sódio 1,0 N.

Adicionou-se a mistura reaccional a cada um de dezassete tubos de reacção (tubos de centífruga de fundo cónico de 50 ml, de polipropileno), e nove tubos de reacção de controlo, para se obterem as condições reaccionais finais (excluindo quai£ quer componentes da reacção que possam contribuir para o concen trado de enzimas) de: acetato de sódio 20 mM, pH 4,5; Tween 80 0,025%; glucose 10 mM; álcool veratrilico 0,45 mM; ácido láctico 10 mM; sulfato de manganês 0,1 mM.

Fez-se borbulhar oxigénio através da mistura reaccional dentro de cada tubo, durante três minutos. Em seguida, adici£ nou-se a cada tubo 1,7 grama de polpa lavada (0,4 gramas de polpa seca) a cada tubo e os tubos foram ligeiramente rolados para dispersar a polpa. A cada tubo, adicionaram-se 20 microlitros de glucose-oxidase, (1,0 U/microlitro, Sigma Chemical Ca., número G 6500). Adicionou-se concentrado de enzimas e/ou água bidesti-lada, para se obter o volume reaccional final de 20,0 ml em cada tubo: cinco tubos receberam 5,0 unidades de LiP e 7,7 unidades de MnP (amostras 4-5, 13 e 21-22); seis tubos receberam 10 unidades de LiP e 15,4 unidades de MnP (amostras 6-7, 14-15 e 23--24); seis tubos receberam 20 unidades de LiP e 30,8 unidades de MnP (amostras 8-9, 16-17 e 25-26); e nove tubos serviram como controlos (amostras 1-3, 10-12 e 18-20), recebendo apenas água bidestilada sem concentrado de enzimas. (Ver Quadro IV).

Finalmente, os tubos reaccionais foram purgados com oxigénio durante um curto intervalo de tempo, tapados e invertidos cuidadosamente várias vezes para promover a mistura.

Os tubos de reacção foram incubados durante a noite a 37°C num G24 Environmental Incubator Shaker (New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ), numa posição horizontal durante a incubação, a aproximadamente 125 rotações por minuto.

Em seguida as polpas de cada vaso de reacção foram ad_i cionadas a funis de vidro sinteizado separados, equipados com filtros de papel Whatman 3M. Em seguida, adicionaram-se 80 ml de hidróxido de sódio 0,5 N a cada funil de filtração, agitaram-se os conteúdos do filtro e recolheram-se as polpas mediante filtrji ção sob vazio. Ressuspendeu-se a polpa existente em cada funil de filtração em aproximadamente 250 ml de água destilada e reco lheu-se novamente mediante filtração sob vazio. Repetiu-se esta lavagem duas vezes com água.

Depois da última lavagem com água, as polpas das amos tras 1 a 9 foram cada uma delas novamente ressuspensas em aproximadamente 250 ml de ácido acético 0,17 N e em seguida separadas por filtração. Estas almofadas de polpa foram secas ao ar durante pelo menos doze horas antes de se medir a brancura (% de G.E.), o teor de lenhina (número de microkappa) e a viscosidade (cp) das polpas. 0 G.E. percentual e o número de microkappa foram determinados como se descreveu no Exemplo 2. A viscosidade foi determinada essencialmente como se descreveu em "Viscosity of Pulp; Capillary Viscometer Method", TAPPI, Test Method N® T230-os-76, Atlanta, GA (1976). 0 Quadro V reúne os resultados de£ tas análises. \ aí·¢-

Andar 2

As polpas das amostras 10 a 26 foram novamente colocadas em tubos de reacçao separados contendo mistura reaccional oxigenada, com pH ajustado, como se descreveu antes. Os tubos foram rodados cuidadosamente para dispersar as polpas e, a cada tubo de reaccção adicionaram-se 20 microlitros de glucose-oxidji se. Adicionou-se concentrado de enzima e/ou água bidestilada da seguinte maneira, de modo a obter-se um volume reaccional final de 20,0 ml em cada tubo; três tubos receberam 2,0 unidades de LiP e 8,1 unidades de MnP (amostras 13 e 21-22); quatro tubos r« ceberam 4,0 unidades de LiP e 16,1 unidades de MnP (amostras 14-13 e 23-24); quatro tubos receberam 8,0 unidades de LiP e 32,3 unidades de MnP (amostras 16-17 e 25-26); e seis tubos que serviram como controlos (amostras 10-12 e 18-20) não receberam concentrado de enzimas (ver Quadro IV). Finalmente, os tubos de reac ção foram purgados com oxigénio durante um curto intervalo de tempo, tapados e invertidos cuidadosamente para misturar.

Os tubos foram depois incubados como se descreveu antes, para o Andar 1. As polpas foram então retiradas dos tubos 3 lavadas separadamente uma vez com hidróxido de sódio e três ve zes com água, como se descreveu antes. Depois da última lavagem com água, as polpas das amostras 10 a 17 foram lavadas com ácido acético 0,17 normal, como se descreveu acima. As almofadas de polpa resultantes foram secas ao ar pelo menos durante doze horas antes de se medir a brancura (percentagem de G.E.), teor de lenhina (ndmero de microkappa) e viscosidade (cp) das polpas, C£ mo se descreveu antes.

Andar 3

As polpas das amostras 18 a 26 foram de novo colocadas -65- 5.

em tubos de reacção separados contendo uma mistura reaccional oxigenada com pH ajustado, como se descreveu acima. Os tubos foram rodados cuidadosamente para dispersar as polpas e, a c£ da tubo de reacção, adicionaram-se 20 microlitros de glucose--oxidase. Adicionou-se concentrado de enzimas e/ou água bides-tilada. como segue, originando um volume reaccional final de 20.0 ml em cada tubo; dois tubos receberam 1,0 unidade de LiP e 6,3 unidades de MnP (amostras 21-22); dois tubos receberam 2.0 unidades de LiP e 12,6 unidades de MnP (amostras 23-24); dois tubos receberam 4,0 unidades de LiP e 25,3 unidades de MnP (amostras 25-26); e três tubos serviram como controlos (amostras 18-20), não recebendo concentrado de enzimas (ver Quadro IV). Finalmente, os tubos reaccionais foram purgados com oxigénio d£ rante um curto intervalo de tempo, tapados e invertidos cuidad£ samente várias vezes para misturar.

Os tubos foram incubados como se descreveu acima, no Andar 1. As polpas foram então lavadas separadamente uma vez com hidróxido de sódio e três vezes com água, como se descreveu antes. Depois da óltima lavagem com água, as polpas das amostras 18 a 26 foram lavadas com ácido acético 0,17 normal. Estas almofadas de polpa foram secas ao ar pelo menos doze horas antes de se medir a brancura (percentagem de G.E.), o teor de lenhina (número dé microkappa) e a viscosidade (cp) das polpas, como se descreveu antes.

Resultados 0 Quadro IV mostra as unidades de LiP e de MnP adicionadas por amostra de polpa em cada andar. As unidades de LiP r£ presentam unidades de actividade de VA0. As unidades de MnP representam unidades de actividade de PR0.

As unidades por grama de peso seco de polpa e as un_i dades por volume reaccional podem ser calculadas a partir dos valores indicados no Quadro IV porque cada tubo de reacção coji tinha 0,4 grama de peso seco de polpa num volume de 20 ml. 0 Quadro V reune os resultados desta experiência - braji cura, teor de lenhina e viscosidade das polpas tratadas. Os duplicados estão agrupados conjuntamente. As amostras 1 a 9 foram ensaiadas depois de um andar. As amostras 10 a 17 foram ensaiadas depois de dois andares. As amostras 18 a 26 foram ensaiadas depois de três andares. 0 Quadro V também contém as unidades cumulativas de LiP e de MnP aplicadas a cada amostra de polpa. Por exemplo, o valor indicado como unidades cumulativas de LiP para a amostra 26 (32,0) representa a soma de unidades de LiP aplicadas nos andares 1, 2 e 3. (20,0 + 8,0 + 4,0). 0 tratamento de um andar de polpa Kraft de madeira d£ ra com concentrado de enzimas VKM-F-1767 teve como resultado uma deslenhificação significativa e um branqueamento significativo da polpa em comparação com as polpas das amostras de controlo que não receberam enzima.

Qs tratamentos em dois andares originaram polpa com menor teor de lenhina e maior brancura do que os tratamentos num único andar.

Os tratamentos em três andares funcionaram ainda melhor do que os tratamentos em dois andares. Obtiveram-se teores de lenhina reduzidos a brancuras aumentadas com diminuiçSes acei táveis de viscosidade. \ ->6 7

QUADRO IV

Unidades de LiP e de MnP Adicionadas por Reacgão ANDAR UM Amostra LiP MnP 1 0,0 0,0 2 0,0 0,0 3 0,0 0,0 4 5,0 7,7 5 5,0 7,7 6 10,0 15,4 7 10,0 15,4 8 20,0 30,8 9 20,0 30,8 10 o o 0,0 11 0,0 0,0 12 0,0 0,0 13 5,0 7,7 14 ,ιο,ο 15,4 15 10,0 15,4 16 20,0 30,8 17 20,0 30,8 18 0,0 0,0 19 0,0 0,0 20 0,0 0,0 21 5,0 7,7 22 5,0 7,7 23 10,0 15,4 24 10,0 15,4 25 20,0 30,8 26 20,0 30,8 ANDAR DOIS LiP MnP 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,0 8,1 4.0 16,1 4,0 16,1 8,0 32,3 8,0 32,3 ANDAR TRÊS LiP MnP 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,0 8,1 1,0 6,3 2,0 8,1 1,0 6,3 4,0 16,1 2,0 12,6 4,0 16,1 2,0 12,6 8,0 32,3 4,0 25,3 8,0 32,3 4,0 25,3

QUADRO V

Teor de

Amostra Andar Unidades de Acumuladas LiP Enzimas adicionadas MnP Brancura (% G.E.) Lenhina (júlkappa NS) Viscosidade (cp) 1 1 0,0 0,0 46 12,2 27,3 2 1 0,0 0,0 48 10,6 28,2 3 1 0,0 0,0 48 11,1 27,6 4 1 5,0 7,7 46 11,2 26,7 5 1 5,0 7,7 52 8,9 24,9 6 1 10,0 15,4 53 7,9 24,9 7 1 10, 0 15,4 53 8,5 24,7 8 1 20,0 30,8 54 8,0 24,5 9 1 20,0 30,8 55 5,2 24,6 10 2 0,0 0,0 49 10,7 26,4 11 2 0,0 0,0 49 11,7 26,9 12 2 0,0 0,0 49 11,2 25,2 13 2 7,0 15,8 68 8,8 20,4 14 2 14,0 31,5 67 6,1 20,4 15 2 14,0 31,5 66 6,1 20,2 16 2 28,0 63,1 66 4,5 19,8 17 2 28,0 63,1 67 5,2 20,3 18 3 0,0 0,0 51 10,4 27,4 19 3 0,0 0,0 50 25,5 20 3 0,0 0,0 51 10,0 25,5 21 3 8,0 22,1 75 4,3 20,1 22 3 8,0 22,1 76 4,3 20,0 23 3 16,0 44,1 76 4,3 18,7 24 3 16,0 44,1 76 4,3 18,8 25 3 32,0 88,4 76 4,7 23,3 26 3 32,0 88,4 76 4,0 18,3 13,3 28,0

Polpa lavada não tratada 38 -69-

Exemplo 4

Deslenhificação de polpa Kraft de madeira macia meridional por um tratamento de um, dois ou três andares com concentrado de enzimas não fraccionadas de VKM-F-1767

Submeteu-se polpa Kraft de madeira macia meridional a um tratamento em um andar, dois andares ou três andares com concen trado de enzimas não fraccionado VKM-1767 de Phanerochaete chrysos-porium ♦ A experiência realizou-se como se descreveu no Exemplo 3, com as modificações indicadas abaixo.

Preparação da polpa A polpa Kraft de madeira macia meridional húmida "lavada" tinha uma consistência de 25,4%, uma brancura de 25% G.E. e um número microkappa igual a 25,0.

Preparação do concentrado de enzimas 0 concentrado de enzimas não fraccionadas de VKM-F-1776 foi preparado como se descreveu no Exemplo 1, usando balões de Rolja mento e Meio de Crescimento A e foi armazenado a -70° até à ut_i lização. Utilizou-se a mesma preparação de concentrado em todas as reacções. 0 concentrado de enzimas foi descongelado e a sua acti-vidade de VAO medida imediatamente antes da sua adição nas reacções do andar 1; estes valores estão indicados no quadro mais adiante. 0 valor indicado para a actividade de PRO do concentrado de enzima usado nas reacções do andar 1 representa a média da actividade PRO de concentrado antes de ser congelado e a acfeivi-dade de PRO do concentrado medida imediatamente antes do andar 2.

Antes de retirar as amostras para utilização no andar 1, armazenou-se o concentrado de enzimas durante a noite a 4°C. -70- / ** 1 0 concentrado de enzimas foi ensaiado novamente no dia seguinte para a determinação tanto das actividades de VAO como das actividades de PRO, antes da sua adição ãs reacções do andar 2. 0 concentrado de enzimas foi novamente guardado a 4°C até ao andar 3.

Nesta experiência, o andar três iniciou-se no mesmo dia que o andar 2. Com o intervalo de tempo entre o segundo e o terceiro andares foi relativamente curto, o concentrado não foi ensaiado uma terceira vez imediatamente antes do terceiro andar. Portanto, as unidades de LiP e de MnP indicadas no Quadro VII p£ ra as reacções em três andares foram calculadas usando valores das actividades de VAO e de PRO de ensaios realizados imediatamente antes do andar 2. Os valores das actividades de VAO e de PRO do concentrado de enzimas, utilizados para os cálculos das unidades de enzimas aplicadas em cada andar foram:

Actividade de PRO (U/ml)

Actividade de VAO Andar _ (U/ml) 12,0 11,2 11,2 1 2 3 23,8 22.5 22.5

Andar 1

Preparou-se uma mistura reaccional 10 x com a seguinte composição: acetato de sédio 200 mM, pH 4,5; Tween 80 0,5%; álcool veratrílico 4,0 mM; lactato 100 mM; sulfato de manganês 1,0 mM; ajustou-se esta mistura reaccional a pH 4,5 com hidréxido de sédio.

Adicionou-se a mistura reaccional (2,0 ml por tubo) a cada um dos onze tubos de reacção e seis tubos de reacção de controlo. Em seguida, adicionaram-se a cada tubo 1,6 gramas de polpa lavada (0,4 gr;ama de polpa seca). A cada tubo adicionou--se então água bidestilada com um volume necessário para se obter um volume reaccional final igual a 20 ml por tubo quando todos os componentes da reacção tivessem sido adicionados. Adicionou--se glucose a cada tubo para se obter uma concentração reaccional final de 10,0 mM, excluindo qualquer glucose que tivesse sido provocada pelo concentrado de enzimas. Os tubos foram então feitos rodar cuidadosamente para misturar. Fez-se borbulhar ox£ génio através do conteúdo dos tubos durante três minutos. Adicionou-se então o concentrado de enzimas; o Quadro IV mostra as unidades de LiP e de MnP adicionadas a ca da tubo de reacção. Finalmente, a cada tubo, adicionaram-se 20 microlitros de glucose--oxidase (1,0 U/microlitro). 0 volume reaccional final em cada tu[ bo foi de 20 ml. Depois da adição de glucose-oxidase, os tubos foram tapados e rodados cuidadosamente para misturar o conteúdo e dispersar a polpa .

As amostras foram incubadas durante a noite. Depois da incubação, as polpas de cada vaso de reacção foram lavadas com hidróxido de sódio e depois lavadas por duas vezes com água. Em seguida, as polpas das amostras 1 a 6 foram lava das com ácido acético, deixadas secar ao ar durante a noite e ensaiadas relati^ vamente à brancura, teor de lenhina e viscosidade. 0 Quadro VII mostra os resultados destas análises.

Andar 2

As polpas das amostras 7 a 17 foram submetidas a outra lavagem com água com aproximadamente 250 ml de água destilada. Depois desta última lavagem, as polpas destas amostras foram t -72s novamente colocadas nos tubos de reacção e submetidas' a outra incuba ção com o concentrado de enzimas, de maneira idêntica à que se descreveu antes para o Andar 1. 0 Quadro VI indica as unidades de LiP e de MnP adicionadas no caso das reacções do andar 2.

As misturas reaccionais do andar 2 foram incubadas du_ rante cinco horas, como se descreveu no Exemplo 3. As polpas de cada vaso de reacção foram então lavadas uma vez com hidróxido de sódio e duas vezes com água, como se descreveu para o andar 1. Então, as polpas das amostras 7 a 11 foram lavadas com ácido acético, deixadas secar ao ar durante a noite e ensaiadas relativamente à brancura, teor de lenhina e viscosidade. 0 Quadro VII indica o resultado destas análises.

Andar 3

As polpas das amostras 12 a 17 foram submetidas a outra lavagem com água com aproximadamente 230 ml de água destila_ da então, as polpas das amostras 12 a 17 foram novamente colocja das em tubos de reacção e submetidas a outra incubação com concentrado de enzimas, como se descreveu antes para o andar 1. 0 Quadro VI indica as unidades de LiP e de MnP adicionadas a estas misturas reaccionais do andar 3.

As misturas reaccionais do andar 3 foram incubadas dij rante a noite. As polpas de cada reacção foram então lavadas com hidróxido de sódio e água, como se descreveu para o andar 1. Em seguida, as polpas das amostras 12 a 17 foram lavadas com ácido acético, deixadas secar ao ar durante a noite e ensaiadas relativamente à brancura, teor de lenhina e viscosidade. 0 Quadro VII reune os resultados dessas análises Resultados de LiP e de MnP adicio 0 Quadro VI indica as unidades

nadas por amostra de polpa em cada andar. Como no Exemplo 3, as unidades de LiP ou de MnP por grama de peso seco de polpa e as unidades por volume de mistura reaccional podem ser calculadas a partir dos valores indicados no Quadro VI, visto que cada tubo de reacção continha 0,4 grama de peso seco de polpa num volume de 20 ml. 0 Quadro VII indica os resultados desta experiência-- brancura, teor de lenhina e viscosidade das polpas tratadas.

Os duplicados estão agrupados em conjunto. As amostras 1 a 6 foram ensaiadas depois de um andar. As amostcas 7 a 11 foram eri saiadas depois de dois andares. As amostras 12 a 17 foram ensaia das depois de três andares. 0 Quadro VI também indica as unidades acumuladas de LiP e de MnP aplicadas a cada amostra de polpa. 0 tratamento de um andar de polpa Kraft de madeira macia meridional com concentrado de enzimas VKM-F-1767 teve como resultado uma deslenhif icáção..significativa da polpa. Os tratamentos de dois andares produziram polpas com menores teores de lenhina. Os tratamentos de três andares conseguiram obter melh£ res resultados do que os tratamentos em dois andares.

Muito embora se tenha conseguido uma deslenhificação significativa com os tratamentos de um andar e de dois andares, as polpas não estavam branqueadas, provavelmente por causa de o teor de lenhina não ter sido diminuído suficientemente para pro_ vocar o branqueamento. No entanto, depois do tratamento em três andares, o teor de lenhina tinha diminuído suficientemente e observou-se a brancura. A viscosidade da polpa não foi diminuída pelos tratamentos enzimáticos,

r

QUADRO VI

Unidades de Lip e de MnP adicionadas por Reacgão • 11 19,2 38,1 9,6 19,3 [ANDAR LiP TRÊS MrLP 12 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 13 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 14 9,6 19,0 4,8 3 *}6 0,6 1,2 15 9,6 19,0 4,8 9,6 0,6 1,2 16 19,2 38,1 9,6 19,3 1,3 2,5 17 19,2 38,1 9,6 19,3 1,3 2,6 ANDAR UM Amostra LiP tfaP 1 0,0 0,0 2 0,0 0,0 3 9,6 19,0 4 9,6 19,0 5 19,2 38,1 6 19,2 38,1 ANDAR DOIS LiP MnP 7 0,0 0,0 0,0 0,0 8 0,0 0,0 0,0 0,0 9 9,6 19.0 19.0 4,8 9,6 10 3,6 4,8 9,6

1

Unidades de Enzimas Teor de lenhina acumuladas Brancura (^ukappa) Viscosidade Amostra Andar LÍP MnP (% G.E.) N2 (cp) 1 1 0,0 0,0 36 23,5 2 1 0,0 0,0 36 22,4 14,3 3 1 9,6 19,0 28 19,9 21,4 4 1 9,6 19,0 27 20,1 19,4 5 1 19,2 38,1 28 17,9 18,3 6 1 19,2 38,1 28 19 j4· 19 ,5 7 1. O r O O o 35 23,0 7,7 8 1 0,0 0,0 34 22,3 12,8 9 1 14,4 28,6 31 16,0 14,3 10 2 14,4 28,6 30 15,0 11 2 28,8 57,4 30 16,4 15,9 12 2 0,0 0,0 í ' 33 20,1 13 2 0,0 0,0 35 20,4 11,9 14 2 15,0 29,8 35 12,4 15 2 15,0 29,8 40 10,2 14,2 16 2 30,1 60 $0 40 10,1 13,9 17 2 30,1 60,0 43 8,7 14,3 Polpa lavada não tratada 25 25,0 -76-

.¾

Exemplo 5

Preparação de xilanase a partir de Chainia sp. (NCL B2-5-1)

Manteve-se Chainia sp. (NCL 82-5-l)(ATCC 53812) em tu_ bos de ensaio inclinados contendo ágar e dextrose de batata, a 4°C.Ds mi crorganismos foram transferidos para um meio de cultura esteri-zado contenda uma fonte de xilano (por exemplo, 5% de farelo de trigo ou 1% de xilano) e os nutrientes convencionais (por exemplo, 1¾ de extracto de levedura. Incubaram-se as culturas a 30°C em frascos sacudidos com agitação vigorosa até aparecer o pico da actividade de xilanase (medida pelo ensaio descrito antes) (geralmente três a cinco dias). Depois de se ter atingido a acti vidade do pico, separaram-se as células do micróbio e os outros sólidos por meios convencionais (por exemplo, filtração ou centrifugação) a fim de se obter um filtrado límpido ou um sobrena-dante límpido. Concentrou-se tipicamente o filtrado ou o sobrena-dante antes de se utilizar, por ultrafiltração ou por evaporação sob vazio. 0 rendimento da xilanase obtida a partir das culturas foi aproximacb mente igual a 10 U/ml quando se usou como meio farelo de trigo a 5%, e aproximadamente 25 U/ml quando se utilizou um meio com 1% de xilano.

Exemplo 6

Tratamento de polpa Kraft de madeira dura com xilanase de Chainia Sp. (NCL 82-5-1) em combinação com um concentrado de enzimas não fraccionado VKM-F-1767: Tratamento simultâneo em comparação com o tratamento sequencial

Nesta experiência, tratou-se polpa Kraft de madeira dura setentrional com concentrações variadas de uma preparação de xilanase não fraccionada derivada de Chainia sp. (NCL 82-5-1) -77- η (ATCC 53812) quer sozinha ou em combinação com um concentrado de enzimas .não fraccionadas derivadas da estirpe VKM-F-1776 (ATCC 24725) de Phanerochaate chrysosporium. Aplicou-se o concentrado de enzimas ligninollticas quer simultaneamente com o tratamento com xilanase quer subsequentemente ao tratamento com xila nase.

Preparação da polpa

Preparou-se polpa Kraft de madeira dura setentrional para o tratamento com enzimas essencialmente como se descreveu no Exemplo 3. A "polpa lavada" húmida foi armazenada a 4°C até ser utilizada. Tinha uma consistência igual a 28% (0,28 grama de peso seco de polpa por grama de peso húmido de polpa). Preparações de Enzimas A preparação das enzimas ligninollticas utilizada nes^ te Exemplo foi constituída por concentrados de enzimas lignino-líticas não fraccionadas de Phanerochaete chrysosporium, VKM-F--1767. Preparou-se como se descreveu no Exemplo 1, usando balões submetidos a rolamento e meio de crescimento A e armazenaram-se a -70°C até à utilização. Mediram-se as actividades de VAO e de PRO deste concentrado depois de descongelar, como se descreveu antes. Essas actividades foram de 17,5 U/ml de actividade de VAO (isto é, LiP) e de 20,7 U/ml de actividade de PRO (isto é, U/ml de MnP). A preparação de xilanase não fraccionada utilizada nes te Exemplo foi derivada do sobrenadante de cultura de Chainia sp. (NCL 82-5-1), por evaporação sob vazio como se descreveu no Exem pio 5. 0 pé tinha uma actividade de xilanase igual a 2.500 U/g e foi armazenado a 20°C até à utilização, precisamente antes de se iniciar esta experiência, preparou-se uma "solução de xilana- /78- /

se" contendo 10 mg de pd de enzima por ml de acetato de sódio 50 mM, pH 5,0 (isto é, 25 U/ml de xilanase).

Andares de tratamento com enzima A amostra 1 era o controlo de enzima mínima para as amo£ tras 2 - 4. As amostras 2-4 foram tratadas com solução de apenas xilanase com concentrações variadas. A amostra 5 era a amostra de controlo com enzima menos para as amostras 6-11. A amos tra 6 foi tratada apenas com concentrado de enzima ligninolítica. As amostras 7-10 foram tratadas numa incubação com ambas as s£ luções de xilanase e concentrado de enzima ligninolítica. A amo£ tra 11 era o controlo de enzima menos para as amostras 12 - 14.

As amostras 12 - 14 fora tratadas, num primeiro andar, com concentrações variadas de solução de xilanase e, num segundo andar, com uma única concentração de concentrado de enzima ligninolítica. Cada tratamento enzimático realizou-se sobre 0,3 grama de peso seco de polpa num volume de aproximadamente 20 ml. Todas as incubações com enzima foram realizadas em tubos de polipropileno de. centrífugas de 50 ml com fundo cónico. A. Amostras 1-4

Adicionaram-se aos tubos de amostras 1-4 vinte ml de solução 50 mM de acetato de sódio, pH 5,0 e 1,07 gramas de polpa lavada (0,3 grama de peso seco de polpa). Em seguida, adicionou-se solução de xilanase (25 U/ml) a tubos com as amostras 2-4, para se atingir a proporção de unidades de xilanase por grama de peso seco de polpa indicada o Quadro VIII. Os tubos foram então tapados, rodados ligeiramente para misturar o conteúdo e incubados a 50°C durante seis horas, fixados horizontalmente num conjunto de sacudimento orbital rotativo a sessenta rotações por mi-

% nuto .

Depois da incubação, adicionou-se uma solução 0,5 N de hidróxido de sódio e cada tubo, até se obter o volume final de aproximada mente 50 ml. Adicionou-se o conteúdo de cada tubo a funis de vidro sinterizado individuais, equipados com filtros Whatman 3M. Os tubos de reacção vazios foram então lavados com aproximadamente 30 ml de solução 0,5 N de hidróxido de sódio e estas lavagens foram adicionadas aos funis de filtração apropriei dos. A polpa em cada funil filtrante foi separada mediante filtração sob vazio. Em seguida, adicionaram-se cerca de 250 ml de água destilada a cada funil filtrante, com agitação e separou-se novamente a polpa. Por fim, adicionaram-se cerca de 250 ml de ácido acético 0,17 N a cada funil filtrante, com agitação, e se-parou-se de novo a polpa.

Deixaram-se secar ao ar almofadas de polpa pelo menos durante três horas antes de se medir a brancura e o teor de le-nhina como se descreveu no Exemplo 3. B. Amostras 5-9

Preparou-se uma mistura reaccional de ligninase com a seguinte composição: solução 20 mM de acetato de sódio de pH 4,3; solução a 0,025¾ de Tween 80; solução 0,4 mM de álcool veratríli^ co; solução 0,2 mM de sulfato de manganês; solução 10 mM de lactato; solução 3 mM de glucose. Ajustou-se esta mistura reaccional a pH 4,3 e borbulhou-se oxigénio através da solução durante três minutos.

Aos tubos das amostras 5-9, adicionaram-se 20 ml de mistura de reacção de ligninase e 1,07 gramas de polpa lavada (0,3 grama de peso seco). Em seguida, adicionou-se solução de xilanase (25 U/ml) e/ou concentrado de enzima ligninolítica não fraccionada (17,5 U/ml de LiP; 20,7 U/ml de MnP) aos tubos das amostras 6--9 para se conseguir a proporção de unidades de enzima por grama de peso seco de polpa indicada no Quadro VIII. Finalmente, adicionaram-se 20 microlitros de glucose-oxidase (Sigma Chemical Co., n9 G-6500, 1,0 U/microlitro) aos tubos das amostras 6-9. Cada tubo foi então lavado rapidamente com oxigénio, rolhado e rodado suavemente para misturar o conteúdo. Ιβ cubaram-se os tubos a 37°C durante dezoito horas, fixados horizontalmente num conjunto sacudidor rotativo orbital a sessenta rotações por minuto. . ;

Depois da incubação, as amostras de polpa foram processadas e analisadas relativamente à brancura e ao teor de le-nhina, como se descreveu acima para as amostras de polpa 1-4. C. Amostras 10 - 14

Andar 1

Adicionaram-se 20 ml de solução 50 mM de acetato de s^5 dio de pH 5,0 e 1,07 gramas de polpa lavada (0,3 grama de peso seco de polpa) aos tubos das amostras 10 - 14. Em seguida, adi-cionou-se solução de xilanase (25 U/ml) aos tubos das amostras 11 - 14, para se conseguir a proporção de unidades de enzima por grama de peso seco de polpa indicada no Quadro VIII. Os tubos foram então tapados, rodados ligeiramente para misturar o conteúdo e incubados a 50°C durante seis horas, fixados horizontalmente num conjunto sacudidor rotativo orbital a 60 rotações por minuto .

Depois da incubação com solução de xilanase, adicionou^ -se o conteúdo de cada tubo da amostra a um funil de vidro sin-terizado separado, equipado com filtro Whatman 3M e separou-se a polpa por filtraçao sob vazio. Ressuspendeu-se então a polpa em cada funil com agitação em aproximadamente 250 ml de água destilada e separou-se de novo mediante filtração sob vazio. Repetiu-se duas vezes esta lavagem com água.

Andar 2

Colocaram-se novamente as polpas dos tubos com as amostras 10 - 14 em tubos separados. Em seguida, adicionaram-se a cada tubo 20 ml de mistura reaccional de ligninase (descrita antes para as amostras 5-9). Em seguida, adicionou-se concentrado de enzimas ligninoliticas não fraccionadas (17,5 U/ml de LiP; 20,7 U/ml de MnP) aos tubos das amostras 11 - 14, como se indica no Quadro VIII. Finalmente, adicionaram-se 20 microlitros de glucose-oxidase (Sigma Chemical Co, G-6500; 1,0 U/microlitro) aos tubos com as amostras 11 -14. Então, cada tubo foi rapidamente lavado com oxigénio, tapado e rodado suavemente para misturar o conteúdo. Incubaram-se os tubos a 37°C durante dezoito horas, fixados horizontalmente num conjunto de sacudimento rotativo a 60 rotações por minuto.

Depois da incubação com concentrado de enzimas ligninoliticas, as amostras de polpa foram processadas e analisadas relativamente à brancura e ao teor de lenhina como se descreveu antes para as amostras de polpa 1-4.

Resultados 0 Quadro VIII mostra as unidades de enzima ,por grama de peso seco de polpa presente em cada operação de tratamento com enzimas. As unidades de LiP representam unidades de activi-dade de VA0, definidas como se descreveu no parágrafo com o titulo Descrição Pormenorizada da Invenção, mencionado antes na presente memória descritiva. As unidades de MnP representam un_i dades de actividade de PR0, definidas e medidas como se descreve -82-

na "Descrição Pormenorizada da Invenção" mencionada antes. As unidades de xilanase definem-se e medem-se como se descreveu no parágrafo com o título "Descrição Pormenorizada da Invenção", referido antes na presente memória descritiva. As entradas na coluna com o título "Adição de Enzima" simbolizam o tratamento com enzima de cada amostra de polpa. Por exemplo, "X" refere-se a um tratamento com solução de xilanase e "10X" refere-se a um tratamento com 10 vezes aquela quantidade de solução de xilanase; "X+L" refere-se ao tratamento numa única incubação com a s£ lução de xilanase e simultaneamente com o concentrado de enzima ligninolítica ; e "X/L" refere-se ao tratamento com solução de xilanase no andar 1 e com concentrado de enzima ligninolítico no andar 2. 0 Quadro IX reune os resultados destas experiências - brancura e teor de lenhina das amostras de polpa depois de tratadas. 0 Quadro X mostra o branqueamento percentual e a des-lignificação percentual das amostras de polpa tratadas com enzimas em comparação com os controlos de enzima menores apropri£ dos (por exemplo, percentagem de branqueamento das amostras 6 - - 10 em relação à amostra de polpa 5).

QUADRO VIII

Unidades de Enzima Adicionadas por Grama de Peso Seco de Polpa em cada Andar Adição de ANDAR UM

Amostra enzima LiP MnP Xilanase 1 0,0 0, 0 0,0 2 X 0,0 0,0 16,7 3 2X 0,0 0,0 33,3 4 10X 0, 0 0,0 166,7 5 - 0,0 0,0 0,0 6 L 48,3 57,3 0,0 6 X+L 48,3 57,3 16,7 7 2X + L 48,3 57,3 33,3 8 10X + L 00 57,3 166,7 9 10X+2L 96,7 114,7 166,7 ANDAR DOIS LiP MnP Xilanase 11 -/- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 12 X/L 0,0 0,0 16,7 48,3 57,3 0,0 13 2X/L 0,0 0,0 33,3 48,3 57,3 0,0 14 10X/L 0,0 0,0 166,7 48,3 57,3 0,0 -84- / QUADRO IX Adição de Brancura Teor de lenhina Amostra enzimas (¾ de G.E.) (jmkappa) 1 - 41,9 12,0 . 2 X 44,0 10,2 3 2X 46,2 10,0 4 10X 47,2 9,4 C J - 41,9 11,6 6 L 52,5 8,4 7 X + L 47,3 9,6 8 2X+L 45,2 9,6 9 1OX + L 44,9 10,6 10 10X+2L 43,2 10,7 11 -/- 43,1 11,6 12 X/L 56,3 6,9 13 2X/L 55,1 7,2 14 10X/L 55,1 6,5 i -85- / r *

QUADRO X

Adição de Percentagem de Percentagem de Amostra Enzimas branqueamento desliqnificação 2 X 5 15 3 2X 10 17 4 10X 13 22 6 L 25 28 7 X+L 13 17 8 2X + L 8 17 9 10X + L 7 9 10 10X+2L 3 8 12 X/L 31 41 13 2X/L 28 38 14 10X/L 28 44

Os valores reunidos nos Quadros IX e X demonstram que um tratamento sequencial de polpa Kraft de madeira dura com xi-lanase e em seguida com ligninases tem como resultado uma maior percentagem de branqueamento e uma deslignificação percentual mais elevada do que o tratamento só com xilanase ou com ligninji ses sozinhas.

Inesperadamente, o tratamento da polpa com xilanase e enzimas ligninoliticas na mesma incubação teve como resultado menor branqueamento e deslignificação do que o tratamento só com enzimas ligninoliticas.

·»

Exemplo 7

Tratamento sequencial de polpa Kraft de madeira dura com xilana-se de Chainia sp. (NCL 82-5-1) e concentrado de enzima não frac-cionada de VKM-F-1767: Efeito do número de andares e ordem da sequência I

Esta experiência foi concebida para determinar o efeito do número de andares sobre o tratamento de um único andar e de vários andares de polpa Kraft de madeira dura com xilanase sozinha e, sequencialmente, com xilanases e ligninases. Também se estudou o efeito de várias ordens do tratamento sequencial com estas preparações enzimáticas.

Preparação da polpa

Preparou-se polpa Kraft de madeira dura setentrional para tratamento enzimático, procedendo como se descreveu no Exem pio 3. A polpa "lavada” húmida tinha uma consistência de 26,3¾ (0,263 grama de peso seco de polpa por grama de peso húmido de polpa).

Preparações enzimáticas 0 concentrado de enzimas ligninoliticas não fracciona-das utilizado nesta experiência derivou de Phanerochaete chrysos-porium VKM-F-1767, como se descreve no Exemplo 6. Esta preparação caracteriza-se por possuir 12,4 U/ml de actividade de VAO (LiP) e 31,5 U/ml de actividade de PRO (MnE). A preparação de xilanase não fraccionada utilizada nes ta experiência (25 U/ml de xilanase em solução 50 mM de acetato de sédio, pH 5,0) derivou de sobrenadante de cultura de Chainia sp. (NCL 82-5-1) (ATCC 53812), como se descreveu no Exe mplo 6. Andares de tratamento enzimâticos A sequência dos andares de tratamento com enzimas a que

% cada amostra de polpa foi submetida está indicada no Quadro XI na coluna com o título "Sequência de Tratamento". Um andar de tratamento que compreende a operação de incubação da polpa com solução de xilanase não fraccionada é indicado por um "X". Um andar de tratamento que compreende a operação de tratar a polpa com o concentrado de enzima ligninolítica não fraccionada (que compreende tanto LiP como MnP) está indicado por um "L". Um andar de tratamento em que não estão presentes nem.enzimas ligni-nolíticas nem xilanase (isto é, controlo com enzima negativa) é indicado por um "0". Os andares de tratamento sucessivos são se parados pelo símbolo

Todas as incubações com as enzimas realizaram-se em tu_ bos de centrifugação de propileno de fundo cónico com 50 ml de capacidade, num volume de aproximadamente 20 ml. Cada um dos ti[ bos para amostra recebeu 1,9 gramas de peso de polpa lavada húmida (0,5 grama de peso seco). As unidades cumulativas de enzima por grama de peso seco de polpa com que cada amostra de polpa foi tratada estão indicadas no Quadro XI.

Andares de tratamento com xilanase

Os andares de tratamento com xilanase realizaram-se como se refere seguidamente. Adicionaram-se 20 ml de solução 50 mM de acetato de sódio de pH 5,0 a cada amostra de polpa a ser tratada. Em seguida, adicionou-se 0,5 de solução de xilanase (25 U/ml) para atingir a proporção de 25,0 unidades de xilanase por grama de peso seco de polpa empregada na incubação. Os tubos foram então tapados, rodados cuidadosamente para misturar o conteúdo e incubados a 50°C, fixados horizontalmente a um conjunto de sacudimento rotativo orbital a sessenta rotações por minuto.

As incubações com xilanase realizadas no andar um ou no andar

/ *--- * três demoraram dezasseis horas. As incubaçSes com xilanase realizadas no andar dois ou quatro demoraram seis horas.

Depois de cada incubação com xilanase que se destinava a ser seguida por outro andar de tratamento com enzima, a polpa foi lavada com água destilada. Para a lavagem adicionou-se o conteúdo de cada tubo a funis de vidro sinterizado individuais equipados com filtros Whatman 3M. Os tubos de reacção vazios foram então lavados com aproximadamente 20 - 30 ml de água destilada e estas lavagens foram adicionadas aos funis de filtração apropriados. A polpa em cada funil filtrante foi então separada mediante filtração sob vazio. Em seguida, adicionaram-se cerca de 250 ml de água destilada a cada funil de filtração com agitação, e sepafou-se de novo a polpa. Repetiu-se a lavagem com água duas vezes. Finalmente, as polpas foram devolvidas aos tubos de reacção para o tratamento subsequente com enzimas.

Andares de tratamento com enzima liqninolitica

Os andares de tratamento com enzima ligninolítica foram realizados como se descreve seguidamente. Preparou-se uma mistura reaccional de ligninase 10 x com a seguinte composição e ajustou-se a pH 4,5: acetato de sódio 200 mM, pH 4,5: 0,25% de Tween 80; 1,0 mH de sulfato de manganês; 100 mM de lactato; 100 mM de glucose.

Adicionaram-se 2 ml de mistura reaccional 10 x de ligni^ nase e 18 ml de água destilada a cada amostra de polpa a ser tr£ tada. Em seguida, fez-se borbulhar oxigénio através da mistura durante três minutos. Seguidamente, adicionou-se 0,5 ml de concentrado de enzima ligninolítica (12,4 U/ml de LiP; 31,5 U/ml de MnP) para se atingir a proporção de 6,2 unidades de LiP por grama de peso seco de polpa e 15,8 unidade de MnP por grama de peso seco de polpa durante a incubação. Por fim, adicionaram-se 20 microlitros de glucose-oxidase (Sigma Chemical Co. na G-6500; 1,0 U/microlitro).

Em seguida, lavaram-se rapidamente os tubos com oxig£ nio, taparam-se, agitaram-se suavemente para misturar o conteúdo e incubaram-se a 37°C, fixados horizontalmente num conjunto orbital rotativo de agitação a 60 rotações por minuto. As inctJ bações realizadas na fase um ou na fase três duraram dezasseis horas. As incubações realizadas na fase dois ou quatro duraram seis horas.

Depois de cada incubação com concentrado de enzima ligninolítica não fraccionada, que foi seguida de outra fase de tratamento com enzima, extraíu-se a polpa com uma solução de substância alcalina. Adicionou-se hidróxido de sddio (0,5 normal) a cada tubo até se atingir o volume final de aproximadameji te 50 ml. Adicionou-se o conteúdo de cada tubo a funis de vidro sinterizado individuais, equipados com papéis de filtro Whatman 3M. Os tubos de ensaio vazios foram em seguida lavados com apro-ximadamente 30 ml de hidróxido de sódio 0,5 normal e estas lavagens foram adicionadas aos funis com o filtro apropriado. Separou-se a polpa em cada filtro colocado no funil mediante filtração sob vazio. As polpas foram introduzidas novamente nos tubos de reacção para tratamento subsequente com enzimas.

Controlos de enzimas menos

As amostras de polpa 18 e 19 foram os controlos de "enzima menos". Incubou-se a amostra de polpa 18 com tampão e em seguida lavou-se com água, como se descreveu antes para os andares de tratamento com xilanase. Repetiu-se esta fase três vezes e, em seguida, extraiu-se a polpa como se descreve mais adiante. / -90 - • 'β·*

Incubou-se a amostra de polpa 19 com tampão e em seguida extraíiu -se como se descreveu antes, no caso das fases de tratamento com enzima ligninolitica. Repetiu-se esta fase três vezes como se descreveu antes e extraiu-se a polpa como se descreve mais adiante.

Extracgão da polpa após tratamento com enzima na fase final de cada sequência de tratamentos

Na fase final de tratamento com enzima de cada sequêji cia de tratamentos, depois da operação de incubação com enzima ligninolitica ou com xilanase, extraiu-se a amostra de polpa com substância alcalina, lavou-se com água destilada e, em seguida, extraiu-se com ácido diluído. Estas extracçSes e lavagens real_i zaram-se essencialmente como se descreveu no Exemplo 6. Deixaram-se secar ao ar as almofadas de polpa resultantes durante pelo menos três horas depois do que se mediu a brancura e o teor de lignina, como se descreveu no Exemplo 3. Os resultados destas análises encontram-se reunidos no Quadro XI: -91 -91

QUADRO XI

Unidades cumulativas de enzima por grama de peso seco de Teor de

Amostra Sequência dos tratamentos polpa LiP MnP Xilanase Brancura {% de G.E.) lenhina (Hkapaè 1 X 0,0 0,0 25,0 47 / 9,6 2 X 0,0 0,0 25,0 46 10,0 3 X/X 0, 0 0,0 50,0 44 9,2 4 X/X 0,0 0,0 50,0 47 8,7 5 X/L 6,2 15,8 25,0 53 7,1 6 X/L 6,2 15,8 25,0 50 7,1 7 L/X 6,2 15,8 25,0 52 6,9 8 L/X 6,2 15,8 25,0 51 7,3 9 X/X/X 0,0 0, 0 75,0 46 8,8 10 X/X/X 0,0 0,0 75,0 47 8,7 11 X/X/L 6,2 15,8 50, 0 53 6,1 12 X/X/L 6,2 15,8 50,0 54 5,9 13 L/L/X 12,4 31,6 25,0 59 5,2 14 X/X/X/L 6,2 15,8 75,0 51 6,6 15 X/X/X/L 6,2 15,8 75,0 51 6,5 16 L/L/L/X 18,6 47,4 25,0 67 4,5 17 L/L/L/X 18,6 47,4 25,0 67 4,5 18 o/o/o/o 0,0 0, 0 0,0 41 12,0 19 o/o/o/o 0,0 0, 0 0,0 44 12,6 -92-

Exemplo 8

Tratamento sequencial de polpa Kraft de madeira dura com xilana-se de Chainia sp. (NCL 82-5-1) e com concentrado de enzima não fraccionada VKH-F-1767; Efeito do número de fases de ordem de sequência II

Neste Exemplo, submeteu-se polpa Kraft de madeira dura a (a) uma e duas fases de tratamento com uma preparação de xilanase não fraccionada derivada de Chainia sp. (NCL 82-5-1); (b) uma, duas e três fases de tratamento com concentrado de enzima não fraccionada derivada da estirpe VKM-1767 de Phanerochaete chrysosporium; e (c) vários tratamentos sequenciais de duas, três e quatro fases com ambas estas preparações de enzima. Preparação da polpa

Preparou-se a polpa Kraft (cerca de 23¾ de madeira mja cia e cerca de 77¾ de madeira dura) para tratamento com enzimas lavando extensivamente com água. Dispersou-se a polpa (cerca de 100 gramas de peso húmido) em aproximadamente 2 litros de água destilada, usando um desintegrador de chapa britânico durante quatro a cinco minutos. Em seguida, lavou-se a polpa com 15 litros de água destilada, como se descreveu no Exemplo 3 e armaze nou-se num saco plástico vedado a 4°C até ser utilizada. A "polpa lavada" húmida tinha· uma consistência de 27,2¾ (0,272 gramas de peso seco de polpa por grama de peso húmido de polpa). Esta polpa lavada tinha uma brancura de 35¾ G.E. e um número microka-pa igual a 16,2.

Preparação de enzimas

Neste Exemplo, utilizaram-se dois concentrados diferentes de enzima ligninolítica não fraccionada. Prepararam-se arn bos os concentrados a partir da estirpe VKM-F-1767 de Phanerochaete 0 concentrado A de VAO (LiP) e nsaiado imediata^ ão reunidos no 1,15 U/ml de LiP e antes da expe-Quadro XIII. 0 actividade VAO ada utilizada nes em solução 50 mM r do sobrenadan-edendo como se chrysosporium, como se descreveu no Exemplo 6. caracterizou-se por uma actividade de 1,17 U/ml uma actividade de 14 U/ml de PRO (MnP) quando e mente antes da experiência cujos resultados est Quadro XII. 0 concentrado A caraterizou-se por e 16,4 U/ml de MnP quando ensaiado imediatament riência cujos resultados estão apresentados no concentrado B caracterizou-se por 45,8 U/ml de (LiP) e 521,3 U/ml de actividade PRO (MnP). A preparação de xilanase não fraccion te Exemplo era uma solução de xilanase (25 U/ml de acetato de sódio, pH 5,0), preparada a parti te de cultura de Chainia sp. (NCL 82-5-1), proc descreveu no Exemplo 6.

Tratamento com enzimas A sequência das fases de tratamento com enzimas à qual se submeteu cada amostra de polpa está indicada nos Quadros XII e XIII, na coluna "Sequência de Tratamentos". A significação dos símbolos utilizados para designar a sequência dos andares de tra^ tamento é a indicada no Exemplo 7.

Para determinar a reprodutibilidade, realizou-se substar^ cialmente a mesma experiência de maneira substancialmente igual em dias diferentes. Além disso, em ambas estas experiências, cada sequência de tratamento foi avaliada em amostras de polpa em duplicado. Os resultados destas duas experiências independentes estão indicados nos Quadros XII a XIII, respectivamente.

Todas as incubaçães com enzima se realizaram em tubos de centrífuga de polipropileno de fundo cénico com 50 ml, num volume de 20 ml. Cada tubo de amostra recebeu 1,47 gramas de peso -94- -94-

húmido de polpa lavada (0,4 grama de peso seco). As unidades cumulativas de enzima por grama de peso seco de polpa com que cada amostra de polpa foi tratada encontram-se indicadas nos Quadro XII e XIII.

Andares de tratamento com xilanase

Os andares de tratamento com xilanase foram realizados procedendo como se descreve seguidamente. Adicionou-se soli[ ção 50 mM de acetato de sódio, pH 5,0 (2,0 ml) e água destilada (16,4 ml) a cada amostra de polpa a tratar. Os tubos focam agitados rapidamente para dispersar a polpa no tampão. Adicionou-se solução de xilanase (l;6ml) de maneira a obter-se uma proporção de 100 unidades de xilanase por grama de peso seco de polpa num volume de 20 ml. Em seguida, rolharam-se os tubos e incubaram--se a 50°C durante duas horas, fixados horizontalmente num conjunto orbital de agitação a cento e cinquenta rotações por minuto.

Depois de cada incubação com xilanase, que foi seguida por outra fase de tratamento com enzima, extraíu-se a polpa com aproximadamente 20 ml de solução 0,5 normal de hidróxido de sódio e, em seguida, lavou-se com três alíquotas de água destilada (cerca de 250 ml cada uma), essencialmente como se descreveu no Exemplo 6. Depois da extracção e da lavagem com água, transferiu-se a almofada de polpa para o tubo apropriado contendo a mistura reaccional para a fase subsequente.

Andar de tratamento com enzima liqninolítica

Os andares de tratamento com enzima ligninolítica realizaram-se procedendo como se descreve seguidamente. Preparou-se Uma mistura reaccional de 10 x de ligninase com a seguinte composição: 200 mM de acetato de sódio de pH 4,0; 0,1 M de glucose; 0,1 M de lactato; 1 mM de sulfato de manganês; 1¾ de Tween 80. -95-

Em seguida, ajustou-se esta mistura reaccional a pH 4,0. A cada amostra de polpa a ser tratada, adicionou-se a mistura reac cional (2 ml) e o volume de água bidestilada necessário para se obter um volume reaccional final igual a 20 ml. Os tubos foram agitados rapidamente para dispersar a polpa.

Em seguida, adicionou-se concentrado ligninolltico não fraccionado de VKM-F-1767 (A ou B) de maneira a conseguir-se a proporção de cerca de 25 unidades de actividade de PRO (MnP) por grama de peso de polpa na incubação. Na experiência, cujos resultados estão reunidos no Quadro XII, utilizou-se o concentrado A (1,17 U/ml de LiP;14 U/ml de MnP) em todas as fases de trja tamento com enzima ligninolítica, obtendo-se como resultado uma proporção de 2,1 unidades de LiP por grama de peso de polpa ne^ tas fases. Na experiência descrita no Quadro XIII, utilizou-se o concentrado A (1,15 U/ml de LiP; 16,4 U/ml de MnP) em todas as fases um dos andares de tratamento com enzima ligninolítica e na fase dois dos andares de tratamento com enzima ligninolítica das amostras de polpa 1 a 20, obtendo-se como resultado uma proporção de 1,8 unidades de LiP por grama de peso seco de polpa nestes andares.

Os andares de tratamento com enzima ligninolítica restantes utilizaram o concentrado B (45,8 U/ml de LiP; 521,3 U/ml de MnP), obtendo-se como resultado uma proporção de 2,2 unidades de LiP por grama de peso seco de polpa nestes andares. No entanto, as incubações do andar dois das amostras 21 e 22 com ejn zimas ligninollticas receberam ligeiramente mais concentrado B, obtendo-se como resultado neste andar proporções iguais a 2,47 unidades de LiP e 28,7 unidades de MnP por grama de peso seco de polpa. Por fim, adicionaram-se 20 microlitros de glucose-oxi_ -96-

dase (Sig ma Ch emical Co., n2 G-6500; 1,0 U/microlitro ). Tapa- ram- se os tubo s, ag itaram -se suavemente para misturar 0 conteú- do e incubaram -se a 50°C dur ante duas horas, fixados ho rizontal_ ment e num agit ador orbital r egulado a 150 rotações po r minuto. Depo is de cada incubação com concentrado li gn inoliti- co q ue fo i seg uida de out ro andar de tratamento com e nz ima, a P°lp a foi extr aída com hi dró xido de sódio e seguidame nt e lavada com água desti lada, como se descreveu antes para os a nd ares de trat ament o com xilanase. Apó s extracção e lavagem, tr an sferiu- se a almo fada de po Ipa para o tubo apropriado contendo a mistura reac ciona 1 par a se realiz ar a operação subsquente. Controlo de en zima menos As a mostr as de polpa 23 e 24 foram os "contro los de enzima menos" para ambas as experiências apresentadas n este exem plo. Elas foram submetidas a um tratamento simulado de quatro aji dares (enzima menos), como se descreveu antes para os andares de tratamento com enzima ligninolltica. Após incubação com enzima simulada no último andar, extrairam-se as polpas como se descr£ ve seguidamente.

Extracgão da polpa após tratamento com enzimas no andar final de cada sequência de tratamentos

No andar final de tratamento com enzimas de cada sequência de tratamentos, depois da operação de incubação com enzima ligninolltica ou com xilanase, extraíu-se a amostra de polpa com aproximadamente 20 ml de solução de hidróxido de sódio, lavou-se com uma allquota de água destilada (cerca de 250 ml) e extraiu-se com uma parte alíquota de ácido acético 0,17 N, procedendo essencialmente como se descreveu no Exemplo 3. /31-

Deixaram-se secar ao ar durante pelo menos três horas as almofadas de polpa resultantes antes de se medir a brancura, teor de lignina e a viscosidade como se descreveu no Exemplo 3. Os resultados destas análises estão reunidas nos Quadros XII e XIII.

QUADRO XII

Unidades cumulativas de enzima por grama de peso seco Sequência dos polpa tratamentos LiP MnP de Xilanase Brancura (¾ de G.E.) Teor de lenhina (Ukapa) L 2,1 25,0 0,0 41 - 11,4 L 2,1 25,0 0, 0 44 11,7 X 0,0 0, 0 100,0 44 13,2 X 0,0 0, 0 100, 0 45 13,9 X/L 2,1 25,0 100, 0 47 10,2 X/L 2,1 25,0 100, 0 48 9,3 L/X 2,1 25,0 100, 0 45 10,6 L/X 2,1 25,0 100, 0 44 10,5 L/L 4,2 50, 0 0,0 52 9,5 L/L 4,2 50,0 0, 0 53 8,7 X/X 0,0 0,0 200,0 45 12,2 X/X 0, 0 0,0 200,0 46 11,8 L/L/X 4,2 50, 0 100,0 54 7,9 L/L/X 4,2 50,0 100,0 53 7,8 L/X/L 4,2 50,0 100, 0 53 8,1 L/X/L 4,2 50,0 100, 0 52 6,3 X/L/L 4,2 50,0 100, 0 59 5,9 X/L/L 4,2 50,0 100,0 57 6,0 L/L/L 6,3 75,0 0,0 61 7,0 L/L/L 6,3 75,0 0, 0 63 6,0 L/L/L/X 6,3 75,0 100,0 64 7,6 L/L/L/X 6,3 75,0 100, 0 65 4,3 O/O/O/O 0,0 0,0 0,0 46 13,4 0/0/0/0 0, 0 0,0 0,0 47 13,5 não tratada lavada 35 16,2 9- r

QUADRO XIII

Unidades cumulativas de enzima por grama

Teor de Visco-Brancura lenhina sidade de peso seco de Sequência de polpa

Amostra tratamentos líip MnP Xilanase (% de G.E.) (Vlkapa) (cp) 1 L 1,8 25,0 0,0 40 .....r — 13,6 23,6 2 L 1,8 25,0 0,0 39 14,6 22,3 3 X 0,0 0,0 100,0 44 13,8 32,7 4 X 0, 0 0, 0 100,0 45 14,4 33,5 5 X/L 1,8 25,0 100,0 46 10,9 24,6 6 X/L 1,8 25,0 100,0 48 11,9 25,0 7 L/X 1,8 25,0 100, 0 43 12,3 26,9 8 L/X 1,8 25,0 100, 0 43 12,8 27,0 9 L/L 3,5 50,0 0, 0 50 9,8 22,2 10 L/L 3,5 50,0 0,0 50 9,5 23,2 11 X/X 0, 0 0,0 200, 0 46 13,1 32,6 12 X/X 0, 0 0,0 200,0 45 11,8 27,5 13 L/L/X 3,5 50,0 100,0 53 6,7 20,5 14 L/L/X 3,5 50,0 100,0 55 6,5 21,3 15 L/X/L 4,0 50,0 100,0 57 7,2 21,0 16 L/X/L 4,0 50,0 100, 0 54 7,3 22,9 17 X/L/L 4, 0 50,0 100, 0 59 6,9 23,0 18 X/L/L 4,0 50,0 100, 0 61 6,4 22,0 19 L/L/L 5,8 75,0 0, 0 62 7,5 23,0 20 L/L/L 5,8 75,0 0,0 63 6,4 22,0 21 L/L/L/X 6,5 78,2 100,0 64 4,7 21,3 22 L/L/L/X 6,5 78,2 100,0 65 4,3 23 o/o/o/o 0,0 0,0 0, 0 46 13,6 29,0 24 o/o/o/o 0,0 0,0 0,0 45 12,6 27,2 Polpa não tratada lavada 35 16,2 100-

Exemplo 9

Tratamento sequencial de polpa Kraft de madeira macia com xila-nase de Chainia sp. (NCL 82-5-1) e concentrado de enzima não fraccionado de VKIi-F-1767 ; Efeito do número de fases e da ordem de sequência I

Neste exemplo, submeteu-se polpa Kraft de madeira mãcia a (a) tratamento de três e quatro andares com uma preparação de xilanase não fraccionada derivada de Chainia sp. (NCL 82-5-1) (ATCC 53812); (b) tratamentos de três e quatro fases com um cori centrado de enzimas não fraccionado derivado da estirpe VKM-F-1767 de Phanerochaete chrysosporium; e (c) vários tratamentos sequenciais de três e quatro fases com ambas estas preparações de enzima.

Preparação da polpa

Preparou-se polpa Kraft de madeira macia para o tratamento com enzima lavando extensamente em água. Dispersou-se a polpa (cerca de 100 gramas de peso húmido) em aproximadamente 2 litros de água destilada, usando um desintegrador de lâminas bri^ tânico, durante quatro a cinco minutos. Lavou-se a polpa com 15 litros de água destilada, como se descreveu no Exemplo 3, e ar-mazenou-se num saco de plástico vedado, a 4°C, até à sua utilização. A "polpa lavada" húmida tinha uma consistência de 18,57¾ (0,186 grama de peso seco de polpa por grama de peso húmido de polpa). Esta polpa lavada tinha um índice de microkapa igual a 27,4.

Preparação de enzima 0 concentrado da enzima ligninolítica não fraccionada utilizado neste exemplo foi preparado a partir da estirpe VKM--F-1767 de Phanerochaete chrysosporium, procedendo como se descre veu no Exemplo 6. Este concentrado caracterizou-se por 1,84 U/ml de actividade VAO (LiP) e 39,5 U/ml de actividade de PRQ (MnP). A preparação de xilanase não fraccionada utilizada neste exemplo era uma solução de xilanase (25 U/ml em tampão de ace tato de sddio 50 mM, pH 5,0), preparada a partir de sobrenadante de cultura de Chainia sp. (NCL 82-5-1), procedendo como se de£ creveu no Exemplo 6.

Tratamento com enzima . A sequência de andares de tratamento com enzima a que cada amostra de polpa foi submetida ê referida no Quadro XIV, sob a designação de "Sequência de Tratamento". A significação dos símbolos utilizados para designar a sequência de andares de tratamento é a indicada no Exemplo 7. Para verificar a reprodutibili-dade, avaliou-se cada sequência de tratamento em amostras de po_l pa em duplicado. Os resultados obtidos estão reunidos no Quadro XIV.

Realizaram-se todas as incubações com enzimas em tubos de centrífuga de polipropileno de fundo cónico de 50 ml num volume de 20 ml. Cada tubo recebeu uma amostra de 2,15 gramas de polpa lavada de peso húmido (0,4 grama de peso seco). As unidades cumulativas de enzima por grama de peso seco de polpa com que cada amostra de polpa foi tratada estão indicadas no Quadro XIV. Andares de tratamento com xilanase

Os andares de tratamento com xilanase realizaram-se pr£ cedendo da seguinte forma. A cada amostra de polpa a ser tratada, adicionou-se um tampão de acetato de sddio 500 mM de pH 5,0 (2 ml) e água (15,44 ml). 0s tubos foram agitados rapidamente para dispersar a polpa. Adicionou-se solução de xilanase (2,56 ml) para se conseguir uma proporção de 160 unidades de xilanase por grama de peso seco de polpa num volume de 20 ml. Os tubos foram então fechados e incubados a 50¾ durante duas horas, fixados horizontalmente a um agitador orbital regulado a 150 rotações por minuto.

Depois da incubação com xilanase, que teve de ser seguida de outra fase de tratamento com enzima, extraiu-se a polpa com aproximadamente 20 ml de hidróxido de sódio 0,5 normal e em seguida lavou-se com três alíquotas de água destilada (cerca de 250 ml cada uma), essencialmente como se descreveu no Exemplo 6. Após extracção e lavagem com água, transferiu-se a almofada de polpa para o tubo apropriado que contém a mistura reac-cional, para a operação seguinte.

Operação de tratamento com enzima ligninolitica

As operações de tratamento com enzima ligninolitica rea lizaram-se de acordo com a seguinte maneira de proceder. Preparou-se uma mistura reaccional 10 x ligninase com a seguinte com posição: acetato de sódio 200 mM de pH 4,0; 0,1 M de glucose; 0,1 M de lactato; 1 mM de sulfato de manganês; 1% de Tween 80. A cada amostra de polpa a ser tratada, adicionou-se mistura reac cional (2 ml) e adicionou-se o volume de água bidestilada necessário para originar um volume reaccional final de 20 ml. Os tubos foram agitados durante um curto intervalo de tempo para di£ persar a polpa.

Em seguida adicionou-se concentrado ligninolítico não fraccionado de VKM-F-1767 para se conseguir a proporção de 50 uni^ dades de actividade de PR0 (MnP) e 2,3 unidades de actividade de VA0 (LiP) por grama de peso seco de polpa usada na incubação. Finalmente, adicionaram-se 20 microlitros de glucose-oxidase -103-

τ»

Sigma Chemical Co., nQ G-6500; 1,0 U/microlitro). Em seguida, rolharam-se os tubos, agitaram-se suavemente para misturar o conteúdo e incubaram-se a 50°C durante duas horas, fixados horizontalmente num agitador orbital regulado a cento e cinquenta rotaçSes por minuto.

Depois da incubação com concentrado ligninolítico, que devia ser seguida por outra fase de tratamento com enzimas, ex-traíu-se a polpa com hidróxido de sódio e, em seguida, lavou-se com água destilada como se descreveu antes para as operações de tratamento com xilanase. Após extracçao e 1avagem,-transferiu^se a almofada de polpa para o tubo apropriado contendo a mistura reaccional para a operação subsequente.

Controlos de enzima menos

Neste exemplo, as amostras de polpa 21 e 22 foram os "controlos de enzima menos" para a experiência. Elas foram tratadas como controlos de ligninase. Foram submetidas a tratamento simulado de quatro andares (enzima menos) como se descreveu antes para os andares de tratamento com enzima ligninolltica. Depois da incubação com a enzima dissimulada no último andar, as polpas foram extraídas como se descreve em seguida.

Extracçao da polpa depois do tratamento com enzima na fase final de cada sequência de tratamentos

Na fase de tratamento final com enzima de cada sequência de tratamentos, depois da operação de incubação com enzima ligninolítica ou com xilanase, extraíu-se a amostra de polpa com aproximadamente 20 ml de hidróxido de sódio, lavou-se com um volume de água destilada (cerca de 250 ml) e extraíu-se com um volume de ácido acético 0,17 normal, essencialmente como se descreveu no Exemplo 3. Deixaram-se secar ao ar as almofadas de pol /- 104- pa resultantes durante pelo menos três horas antes de se medir a brancura, o teor de lignina e a viscosidade, como se descreveu no Exemplo 3. Os resultados destas análises encontram-se reu nidos no Quadro XIV. /-105-

QUADRO XIV

Unidades cumulativas de enzima por grama

Amostra de peso seco de Sequência dos polpa tratamentos j_ip MnP Xilanase Teor de Brancura lenhina (% de G.E.) ()Jkapa) Visco sidade (cp) 1 X/X/X 0,0 0,0 480,0 35 18,9 26,3 2 X/X/X 0,0 0,0 480,0 33 18,7 23,8 3 X/L/X 2,3 49,4 320,0 35 17,5 24,9 4 X/L/X 2,3 49,4 320,0 31 17,3 24,4 5 X/L/L 4,6 98,8 160,0 30 13,6 23,0 6 X/L/L 4,6 98,8 160,0 34 13,4 19,9 7 L/X/L 4,6 98,8 160,0 41 9,7 19,6 8 L/X/L 4,6 98,8 160,0 41 10,0 19,5 9 L/L/X 4,6 98,8 160,0 32 15,8 19,9 10 L/L/X 4,6 98,8 160,0 30 15,1 17,6 11 L/L/L 6,9 148,2 :.-.0,0 42 9,6 19,7 12 L/L/L 6,9 148,2 0,0 39 10,9 17,6 13 X/L/X/L 4,6 98,8 320,0 35 12,8 17,7 14 X/L/X/L 4,6 98,8 : 320,0 36 12,9 19,4 15 L/X/L/X 4,6 98,8 320,0 40 9,9 17,8 16 L/X/L/X 4,6 98,8 320,0 38 9,1 19,5 17 L/L/L/L 9,2 197,6 0,0 52 7,0 16,2 18 l/l/l/l 9,2 197,6 0,0 53 8,1 17,6 19 X/X/X/X 0,0 0,0 540,0 32 18,6 24,8 20 X/X/X/X 0,0 0,0 540,0 37 19,0 21 O/O/O/O 0,0 0,0 0,0 35 17,7 22,6 22 o/o/o/o 0,0 0,0 0,0 39 17,9 22,5

Exemplo 10

Tratamento sequencial de polpa Kraft de madeira macia com xila-nase de Chainia sp. (NCL 82-5-1) e com concentrado de enzima não fraccionada VKM-F-1767: Efeito do número de andares e ordem de sequência II

Neste Exemplo, polpa Kraft de madeira macia foi submeti^ da a (a) tratamento de dois andares com uma preparação de xila-nase não fraccionada derivada de Chainia sp. (NCL 82-5-1); (b) tratamentos de dois e três andares com um concentrado de enzima não fraccionada derivado da estirpe VKM-F-1767 de Phanerochaete chrysosporium; e (c) vários tratamentos sequenciais de dois e três andares com ambas estas preparações de enzimas.

Preparação de polpa

Preparou-se polpa Kraft de madeira macia para tratamento com enzimas lavando extensivamente em água procedendo como se descreve no Exemplo 9. A "polpa lavada" húmida tinha uma consistência igual a 28,6% (0,286 grama de peso seco de polpa por grama de peso húmido de polpa). Esta polpa lavada tinha um valor de kapa igual a 29,6.

Preparação de enzima

Neste exemplo, preparou-se um concentrado de enzimas ligninoliticas não fraccionadas a partir de Phanerochaete chrysosporium VKM-F-1767, procedendo como se descreveu no Exemplo 6. 0 concentrado era caracterizado por 1,92 U/ml de activi-dade de VAO (LiP) e 15,5 U/ml de actividade de PRO (MnP). A preparação de xilanase utilizada neste exemplo era uma solução de xilanase (25 U/ml em tampão de acetato de súdio 50 mM, pH 5,0) preparada a partir de sobrenadante da cultura de Chai-nj-a SP· (NCL 82-5-1) procedendo como se descreveu no Exemplo 6. -107-

Tratamento com enzimas A sequência dos andares de tratamento com enzimas a que cada amostra de polpa foi submetida é indicada no Quadro XV na coluna com o titulo "Sequência de Tratamentos". A significação dos símbolos utilizados para designar sequência das fases de tratamento é a que se indica no Exemplo 7. Para avaliar a re-produtibilidade, cada sequência de tratamento foi avaliada em amostras de polpa em duplicado. Os resultados estão indicados no Quadro XV.

Todas as incubações com enzimas se realizaram em tubos de centrífuga de polipropileno com o fundo cónico de 50 ml, num volume de 20 ml. Cada tubo de amostra recebeu 1,49 gramas de pie so húmido de polpa lavada (0,426 grama de peso seco). As unidades cumulativas de enzima por grama de polpa de peso seco com que se trata cada amostra de polpa estão indicadas no Quadro XV. Andares de tratamento com xilanase

Os andares de tratamento com xilanase efectuaram-se procedendo de acordo com a seguinte forma. A cada amostra de polpa a ser tratada, adicionou-se tampão de acetato de sódio 500 mM, pH 5,0 (2 ml) e água (16,61 ml). Os tubos foram agitados durante um curto intervalo de tempo para dispersar a polpa. Adicionou--se solução de xilanase (1,6 ml) para se conseguir uma proporção de 160 unidades de xilanase por grama de peso seco de polpa num volume de 20 ml. Os tubos foram então vedados e incubados a 50°C durante duas horas fixados horizontalmente a um aparelho agitador orbital a 150 rotações por minuto.

Depois de cada incubação com xilanase, que se destinava a ser seguida de outra fase de tratamento com enzima, extraíu-se a polpa com aproximadamente 20 ml de hidróxido de sódio 0,5 N e, 108-

em seguida lavou-se com três volumes de água destilada (cerca de 250 ml cada um), essencialmente como se descreveu no Exemplo 6. Depois da extracção e da lavagem com água, transferiu-se a almofada de polpa para o tubo apropriado que contém a mistura reaccional para a operação do processo subsequente.

Fase de tratamento com enzimas ligninolíticas

Os andares de tratamento com enzima ligninolítica efec-tuaram-se de acordo com a seguinte maneira de proceder. Preparou-se uma mistura reaccional de ligninase 10 x com a seguinte corn posição: 200 mM de acetato de sddio, pH 4,0: 0,1 M de glucose; 0,1 M de glucose; 0,1 M de lactato; 1 mM de sulfato de manganês; 1% de Tween 80. A cada amostra de polpa a ser tratada, adicionou-se mistura reaccional (2 ml) e o volume de água bidestilada necessário para originar um volume reaccional final igual a 20 ml. 0s tubos foram então agitados durante um curto intervalo de tempo para dispersar a polpa.

Em seguida, adicionou-se concentrado ligninolltico não fraccionado VKM-F-1767 para se conseguir a proporção de 50 unidades de actividade de PR0 (MnP) e 6,16 unidades de actividade de VA0 (LiP) por grama de peso seco de polpa da incubação. Finalmente, adicionaram-se 20 microlitros de glucose-oxidase (Sigma Chemical Co., n^ G-6500; 1,0 U/microlitro). Os tubos foram então tapados, agitados suavemente para misturar o conteúdo e incubados a 50°C durante duas horas, fixados horizontalmente num agitador orbital regulado a 150 rotações por minuto.

Depois de cada incubação com concentrado ligninolltico, que tinha de ser seguida de outro andar de tratamento com enzimas, extraíu-se a polpa com hidróxido de sódio e em seguida lavou-se com água destilada, como se descreveu acima para os anda- -109- / res de tratamento com xilanase. Depois da extracção e da lavagem, transferiu-se a almofada de polpa para o tubo apropriado contendo a mistura reaccional para a fase seguinte.

Controlos de enzima menos

As amostras de polpa 9 - 10 e 11 - 12 foram os "controlos de enzima menos" para a experiência descrita neste exemplo. Elas foram tratadas como controlos de ligninase. As amostras 9 - 10 e 10 - 11 foram submetidas respectivamente a tratamento em dois andares e a um tratamento simulado de três andares (enzima menos), como se descreveu acima para os andares de tratamento com enzimas ligninollticas. Depois da incubação com a enzima simulada no último andar, as polpas foram extraídas, como se descreve em seguida.

Extracgão da polpa após tratamento com enzima na operação final de cada sequência de tratamento

No andar de tratamento com enzimas final de cada sequência de tratamentos, depois da operação de incubação com zima ligninolítica ou com xilanase, extraiu-se a amostra de pol_ pa com aproximadamente 20 ml de hidrdxido de sódio, lavou-se com um volume de água destilada (cerca de 250 ml) e extraiu-se com uma alíquota de 0,17 N de ácido-acético essencialmente como se descreveu no Exemplo 3. As almofadas de polpa resultantes foram deixadas secar ao ar durante pelo menos três horas antes de se medir a brancura, o teor de lenhina e a viscosidade como se descreve no Exemplo 3. Os resultados destas análises encontram-se reúnidos no Quadro XV. -110-

QUADRO XV

Unidades cumulativas de enzima por grama de peso seco de Teor de Visco-

Amostra Sequência de tratamentos polp LiP a MnP Xilanase Brancura (% de G.E.) lenhina (Hkapa) sidade (cp) 1 X/X 0,0 0,0 320,0 29 / 20,9 32,5 2 X/X 0,0 0,0 320,0 29 19,9 31,2 3 L/L 12,3 99,7 0,0 28 13,7 17,5 4 L/L 12,3 99,7 0,0 29 15,9 21,0 5 X/L 6,2 49,8 160,0 27 17,2 26,2 6 X/L 6,2 49,8 160,0 26 16,5 23,6 7 L/X 6,2 49,8 160,0 25 20,8 22,8 8 L/X 6,2 49,8 160,0 23 19,6 22,8 9 0/0 0,0 0,0 0,0 30 23,8 30,4 10 0/0 0,0 0,0 0,0 30 22,2 25,4 11 0/0/0 0,0 0,0 0,0 30 24,5 27,9 12 0/0/0 0,0 0,0 0,0 32 22,8 27,7 13 X/L/L 12,3 99,7 160,0 30 13,5 19,8 14 X/L/L 12,3 99,7 160,0 33 11,4 21,2 15 L/X/L 12,3 99,7 160,0 32 12,5 18,9 16 L/X/L 12,3 99,7 160,0 30 23,0 17 L/L/X 12,3 99,7 160,0 27 14,1 21,8 18 L/L/X 12,3 99,7 160,0 28 13,0 22,4 19 L/L/L 18,5 149,4 0,0 31 13,5 17,5 20 L/L/L 18,5 149,4 0,0 37 11,1 18,7

Claims (27)

1. REI VINDICAgÕES 1.- Processo para a deslignificaçio de material lignoceluló-sico, caracterizado pelo facto de compreender duas ou mais operações de deslignificaçio enzimática em que as operaçoes de desligni-ficação enzimática compreendem: a) uma ou mais operaçoes de tratamento com enzimas ligninolí-ticas em que cada operação de tratamento com enzimas ligninolíticas compreende uma operaçao de incubaçao do material lignoceculõsico numa mistura reaccional ligninolítica que compreende uma quantidade eficaz de uma preparaçao de enzima ligninolítica; e b) uma ou mais operaçoes de tratamento com xilanase, em que cada operaçao de tratamento com xilanase compreende a operação de se incubar o material lignocelulósico numa mistura reaccional /-112- de xilanase que compreende uma quantidade eficaz de preparação de xilanase.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o material lignocelulósico ser polpa de madeira.
3. 3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a preparaçao de enzima ligninolítica derivar de um fungo de podridão branca.
4. 4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o fungo de podridão branca ser uma estirpe de Phanerochaete chrysosporium.
5. 5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de a estirpe de Phanerochaete chrysosporium ser uma estirpe escolhida do grupo que consiste em SC26, que tem as caracte-rísticas de identificação de NKRL 15978; VKM-F-1767, que tem as caracterlsticas de identificação de ATTC 24725; e ME-446* que tem as caracterlsticas de identificação de ATCC 34541.
6. 6.- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a preparação de enzima ligninolítica ser um concentrado enzímático não fraccionado que consiste em meios de cultura extracelulares concentrados do fungo da podridão branca. ../113- ί *s**m^*f!Xé3β»
7. 7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza-do pelo facto de a preparação de enzima ligninolítica compreender pelo menos uma lenhina peroxídase.
8. 8. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a preparaçao de enzima ligninolítica compreender pelo menos uma peroxidase dependente de Μη(II).
9. 9. - Processo de acordo com a_reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a preparaçao de enzima ligninolítica compreender pelo menos uma lenhina peroxidase e pelo menos uma peroxidade dependente de Mn(II).
10. 10. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a preparação de xilanase derivar de um microrganismo escolhido do grupo que consiste em estirpes de Aspergillus, Sporotrichum, Sclerotium,Chaetomium, Schizophyllum, Chainia, Clostridium, Streptomyces, Bacillus e Trichoderma ou derivar de uma estirpe de Chainia ou de Streptomyces.
11. 11. - Processo de acordo, com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de a estirpe ser escolhida do grupo que consiste em Streptomyces sclerotialus, que tem as características de identificação de ATCC 15896; Streptomyces flaviscleroticus, que tem as características de identificação de ATCC 19347; Streptomyces /ll4-

    fumigatiscleroticus, que teta as características de identificação de ATCC 19345; Streptotayces minutiscleroticus, que tem as características de identificação de ATCC 17757; Streptomyces niger, que tem as características de identificação de ATCC 17756; Streptomyces ochraceiscleroticus, que t.em as características de identificação de ATCC 15814; Streptomyces poonensis,que tem as características de identificação de ATCC 15723; Streptomyces roseiscleroticus, que tem as características de identificação de ATCC 17755; Strepto myces sp., que tem as características de identificação de ATCC 27946; e Chainia hygroátrocyanea, que tem as características de identificação de ATCC 43962.
12. 12. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a mistura reaccional ligninolítica compreender ainda perõxido de hidrogénio e de se manter a concentração estacionária de perõxido de hidrogénio entre cerca de 0,001 e 0,5 mM.
13. 13. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de a mistura reaccional ligninolítica compreender ainda §,5 á 1,0»rimM-.d&. Hn(II) .
14. 14. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de a mistura reaccional ligninolítica compreender ainda 0,5 a 20 mM de um l*L-hidroxiãcido.

    vr
15. 15.- Processo de acordo com a reivindicação 14, caracteriza-do pelo facto de a mistura reaccional ligninolítica compreender ainda 0,001 a 0,1 1 de um detergente escolhido do grupo que consis. te em detergentes nao iónicos e anfotéricos.
16. 16. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracteriza-do pelo facto de a mistura reaccional ligninolítica compreender ainda 0,001 a 0,1 1 de um detergente escolhido do grupo que consiste em detergentes não iónicos e anfotéricos.
17. 17. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo facto de se manter a concentração de peróxido de hidrogénio a um nível estacionário pela formação enzimãtica in situ de peróxido de hidrogénio.
18. 18.- Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de o peróxido de hidrogénio ser formado in situ pela acção de 0,001 a 10 U/ml de glucose oxidase em 0,01 a 20 mM de glucose.
19. 19.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo facto de se manter a concentração de peróxido de hidrogénio a um nível estacionário por adiçao controlada contínua ou periódica de peróxido de hidrogénio. -116-
20. 20. -. Processo de acordo com as reivindicações 13, 14 ou 15, caracterizado pelo facto de o Mn(II) ser fornecido sob a forma de sulfato de manganês.
21. 21. - Processo de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo facto de o C^-hidroxiãcido ser ácido láctico.
22. 22. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de cada uma das operações de deslignificação enzimãtica compreender ainda uma fase subsequente de extracção -do material lignocelulósico com um reagente alcalino.
23. 23. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de uma ou mais operações de deslignificação enzimãtica compreender ainda uma fase subsequente de lavagem abundante do material lignocelulósico com água.
24. 24. - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de cada uma das operações de deslignificação enzimãtica compreender a operação subsequente de lavagem abundante de material lignocelulósico com agua.
25. 25. - Processo de acordo com as reivindicações 22, 23 ou 24, caracterizado pelo facto de a operação de tratamento final com enzima compreender ainda a fase subsequente de extracção do mate- £-117- rial lignocelulósico com uma solução acida diluída.
26. 26. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza-do pelo facto de: a) a incubaçao com a preparação de enzima ligninolítica se realizar a 15 a 55°C durante 0,25 a 18 horas e b) a incubação com a preparação de xilanase se realizar a 20 a 70°C durante 0,25 a 18 horas.
27. 27. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza-do pelo facto.de compreender pelo menos um branqueamento convencional e pelo menos duas operaçoes de deslignificaçao enzimãtica, Lisboa, 20 de Junho de 1990 O Aderne Uíiuai aa Propriedade Industriai