JPH0340887A - リグノセルロース材料の酵素脱リグニン - Google Patents

リグノセルロース材料の酵素脱リグニン

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JPH0340887A
JPH0340887A JP2163021A JP16302190A JPH0340887A JP H0340887 A JPH0340887 A JP H0340887A JP 2163021 A JP2163021 A JP 2163021A JP 16302190 A JP16302190 A JP 16302190A JP H0340887 A JPH0340887 A JP H0340887A
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William L Olsen
ウィリアム　エル．オルセン
Shyam S Bhattacharjee
シャム　エス．バタチャージー
Hugh P Gallagher
ヒュー　ピー．ガラジャー
John P Slocomb
ジョン　ピー．スロコウム
A Kathleen Burris
エー．キャスリーン　バリス
Doraine M Dewitt
ドレイン　エム．デュイット
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の技術的分野］ 本発明は第一に、リグノセルロース材料のリグニンをリ
グニン分解酵素（Ｉｉｇｎｌｎｏｌｙｔｌｃ　ｅｎｚｙ
ｍｅｓ　）を用いて除去する酵素による脱リグニンの一
段法または多段法に関する。本発明はまた、リグノセル
ロース材料のリグニンをリグニン分解酵素とキシラナー
ゼ（にｙｌａｎａｓｅｓ）を用いて除去する酵素による
脱リグニンの多段法に関する。さらに詳しくは、本発明
はバルブおよび製紙産業に使用されるリグノセルロース
材料の酵素による脱リグニン法の改良法に関する。
［発明の背景］ リグノセルロース材料（例えば木材）の主成分は、セル
ロース、ヘミセルロースおよびリグニンである。これら
の化合物は乾ｊｔ基準で木質植物のそれぞれ約３５−５
０％、２０−３０％、２０−３０％を構成する。セルロ
ースは、直線状に配列したＤ−グルコーズ単位より成る
サッカローズポリマーである。木質植物では直線状のセ
ルロース分子は緊密に詰った繊維の束として配列されて
いる。ヘミセルロースは直線状および分岐状のサツカラ
イドのホモおよびヘテロポリマーで５ケおよび６ケの炭
素をもつ色々なＰｉ類より成っている。これらの糖類に
は例えば、キジローズ、アラビノーズ、マンノーズ、ガ
ラクトーズやグリコーズが含まれる。これらの糖類のひ
とつのホモポリマーより成るヘミセルロースはそれぞれ
キシラン、アラビナン、マンナン、ガラクタンやゲルタ
ンと呼ばれる。ヘミセルロースはセルロース分子と繊維
束の架橋結合に関与する。
リグノセルロース材料のこの他の主要成分はリグニンで
ある。セルロースやヘミセルロースと同様にリグニンは
天然のポリマーであるがこれらよりもっと複雑である。
リグニンは一次的にはメトオキシレートされたフェニー
ルプロパンの単位より成っておりこれは、色々な炭素−
炭素やエーテル結合によってランダムに結合しており三
次元のマトリックスを形成している。このマトリックス
はセルロースの小繊維を包み、構成物に強度と剛性を与
える。このためリグニンはセルロース繊維を取囲みこれ
を束ねる天然の“セメント“の一種であると考えられて
いる。
紙は基本的に水素によって結合しているポリサッカライ
ド単位に、セルロースが結合して無秩序に配列された二
次元的網目構造を成している。木質植物ではセルロース
繊維はリグニンによって“セメント°され、秩序的に平
行に配列される。
それ°ゆえ、木質植物を製紙用に利用しようとするなら
ば、これを個々のセルロース繊維に分離し他のセルロー
ス繊維と水素結合出来るようにせねばならない。木質植
物材料の従来の処理方法では繊維を分離するには、機械
的に粉砕したり化学処理すなわちリグニン除去によって
精製したりあるいはこの両者の組合せが使われる。−繊
維の分離によって紙パルプ、すなわち木質繊維のスラリ
ーまたは懸濁物ができる。これらの繊維を絡みマット（
ｔａｒｌｇｌｅｄ　ｍａｔ）に付着させて紙ができあが
る。
機械的なバルブ化は木質繊維の物理的分離でありいわゆ
る高収率バルブが製造される。高収率はバルブ工程でリ
グニンを除去しないことにより、このためリグニンはパ
ルプに持込まれる。
化学的なパルプ化ではリグニンを分解する強い化学的酸
化剤でリグノセルロース材料を処理する。
化学的パルプ化はもっとも普通にはクラフト法（硫酸塩
法）、亜硫酸塩法、ソーダ法および改良亜硫酸塩法を使
っておこなわれる。これらの方法でリグニンのマトリッ
クスの大半を除去し、セルロース繊維を分離しパルプを
生成する。例えば、クラフト法（硫酸塩法）によるパル
プ化では残留リグニンは重量比でわずかに５−８％に過
ぎず、ちとのリグニン含有量を約１／３−１１５に減す
る。
熱機械的方法、化学灼熱機械的方法、化学機械的方法と
いうような組合せ方法によるパルプ化も使用されている
。
上述のパルプ化方法のいづれも暗色のパルプを生じる。
紙バルブにともなう色は殆ど排他的に残留リグニンによ
るものである。パルプの色の強さは残留リグニンの量と
その化学状態の両者に依存する。例えば、大部分のリグ
ニンがパルプ化で除去された化学パルプはとくに暗色を
呈するがこれは残留リグニンが広範に酸化され変化した
からである。
化学パルプ中に残留しているリグニンはとくに除去しに
くい。これは残留リグニンかヘミセルロース（例えばキ
シラン）や多分セルロースと共有結合をしているからで
ある。
この結合はある程度木質中に存在している。しかし大部
分は化学的パルプ化の過程で生じるものと考えられる。
例えば次の文献を見よ：　Ｍａｔｓｕｍｏｔ。
ｅｔ　ａｌ、、　　−Ｔｈｅ　Ｒｏｌｅ　ｏｌ’　Ｓｕ
ｇａｒｓ　ＲｅＩｌａｌｎｌｎｇｉｎＲｅｓｉｄｕａｌ
　Ｌｉｇｎｉｎ　　　、Ｐｏｕｒｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔ）ｏｎａＩＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ｗｏｏｄ　ａ
ｎｄ　Ｐｕｌｐｌｎｇ　Ｃｈｅｎ＋１ｓｔｒｙ。
Ｐａｒｉｓ、　Ｆｒａｎｃｅ、　Ａｐｒｉｌ　１９８７
．　Ｖｏｌ、２．　ｐｐ、３０５−１１；１ｖｅｒｓｅ
ｎ　ｅｔ　ａｌ、、　　’Ｔｈｅ　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
　ｏｌ’　Ｌｉｇｎｉｎ−Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　
Ｂｏｎｄｓ　Ｄｕｒｉｎｇ　Ｋｒａｆ’ｔ　Ｐｕｌｐｉ
ｎｇＦｏｕｒｔｈ　Ｉｎ−ｔｅｒｎａｔｌｏｎａｌ　Ｓ
ｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｗｏｏｄ　ａｎｄＰｕｌｐｌ
ｎｇ　Ｃｈｅｒａｉｓｔｒｙ、　Ｐａｒｉｓ、　Ｆｒａ
ｎｃｅ、Ａｐｒｊｌ　１９８７゜Ｖｏｌ、２．　ｐｐ、
１８３−６５：　　Ｉｖｅｒｓｅｎ　ａｎｄνａｎｓｔ
ｒｏｍ。
“Ｌｉｇｉｎｉｎ−Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｂｏｎ
ｄｓ　ｉｎ　ａ　ＲｅｓｌｄｕａｌＬｉｇｎｉｎ　ｌ５
ｏｌａｔｅｄ　Ｆｒｏｍ　Ｐｉｎｅ　Ｋｒａｆｔ　Ｐｕ
ｌｐＨｏｌｚｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、４０．ｐｐ、１９−
２２　　（１９８（ｉ）。
紙には上質の白い紙から段ボール箱に使われる紙にいた
るまで多くのグレードがある。望ましい光沢をもった紙
製品を作るにはパルプは紙にされる前に光らせられねば
ならない。さらに上質の白紙は光やエージングによって
光沢が変化（すなわち黄色化）しないことが望まれる。
パルプは次の二つの方法のどちらかで光沢を与えられる
。第一の方法は、大半のリグニンが除去されないままそ
の発色団が破壊される。第二の方法は、はとんどすべて
のリグニンは（その発色団も含め）パルプから除去され
る。第一の方法は普通、大半のパルプを保持することが
高収率に必要とされる機械的パルプの光沢化に使われる
。第二の方法は普通、上質の白紙の製造に使用される化
学バルブの光沢化に用いられる。さらに光沢の変化がリ
グニンの含有量に比例することから、第二の方法によっ
て光沢化されたパルプによってのみ永久光沢紙（すなわ
ち黄色化しない紙）の製造が可能である。
光沢の質は一般にＧ、Ｅ、％、すなわち反射度のひとつ
、で測定される。パルプや紙製品のリグニン含有量は普
通、カッパー数であられされる。パルプの暗色はリグニ
ンの発色団によるが光沢度（Ｇ、Ｅ、％）はリグニンの
含有量（カッパー数）に直接的に比例しない。例えば、
漂白の工程ではリグニンの発色団を破壊しなくてもパル
プのカッパー数は２５から１５に減少するがパルプは目
立って光沢化されない。リグニンが除去されカッパー数
が約８ないし１２以下に低下すれば、Ｇ、Ｅ、１％も相
当増大する。このように測定できる程の光沢を与えるの
にはリグニンを事前に充分除去しておくことが必要なの
である。
パルプに光沢をあたえる工程は漂白とみなされる。パル
プの漂白工程は普通多段工程である。光沢化は必ずしも
漂白工程のいづれかの段階にあたるとはみられていない
し、またその最初の数工程であるともみられていない。
光沢化は漂白の全工程のトータルでありその結果として
パルプは光沢か与えられかつ漂白されるのである。リグ
ニンの発色団を破壊する工程、リグニンを除去する（脱
リグニン）工程あるいはこれらの目的を達するための工
程は単独であれ多段駆出あれ、漂白工程と定義されよう
。
最も普通に用いられる漂白工程は、塩素または次亜塩素
酸カルシウム、次亜塩素酸ナトリウム、二酸化塩素など
の塩素含有化合物を使用する。これらの工程ではパルプ
の漂白に先立ち、リグニンの発色団を破壊するというよ
りむしろ、はとんどのリグニンを除去しておく。またそ
の第一工程で普通パルプを塩素化しアルカリ抽出をおこ
なう。
この工程により漂白が効果的におこなわれるが同時にき
びしい欠点もある。その第一はこれらの処理は激しいも
のなのでセルロースは相当劣化する。
この劣化の程度はパルプの粘度を測定すればわかる。セ
ルロースの鎖の長さが大きいほどパルプの粘度は高い。
紙は基本的にセルロース分子のもつれた塊であるから鎖
の長さの減少は紙製品の強度や引裂き抵抗を弱める。こ
のように、セルロース繊維の劣化を最小限にとどめる漂
白工程が好ましいＯ 塩素化抽出工程のもう一つの重大な欠点はこの工程から
きわめて腐食性で大量の塩素化されたリグニン分解物を
含有した排水が出ることである。
これらの塩素化有機物は有毒でありかつ突然変異誘発性
および／または発癌性が高い。従ってこの排水の処置は
深刻な破棄物処理上の問題を提出している。もう一つの
欠点はこの排水中の高腐食性の塩素化物は工場機械を腐
食するのでこの排水を他の製紙工程に循環使用すること
ができない。最後にこの排水の腐食性は工場従業員にと
って危険である。これらの理由から漂白に必要な塩素を
減少する代替漂白法が産業界で熱望されている。
従来の技術では漂白工程で過酸化水素、酸素、オゾンも
使用する。しかしこれらの工程では色々な欠点をともな
う。過酸化水素による工程で相当な脱リグニンをおこな
いクラフトパルプを漂白するときセルロース繊維は許容
量以上の劣化をうける。のみならず費用がかかる。酸素
やオゾンによる漂白でもセルロース繊維の劣化を生じゃ
すくさらにリグニンが劣化される。セルロースの劣化は
パルプの収率を低下させまた、パルプの粘度を低くし機
械的に弱い性質をもった紙をつくる。
以上述べたような漂白工程の色々の欠点を克服するため
酵素による非汚染的な漂白方法の開発が探求されている
。いくつかの微生物（ａ＋ｉｃｒｏｏｒｇａｎ１ｓｍｓ
）はセルロースやヘミセルロースを破壊しないでリグニ
ンを変化させあるいは減少させる酵素を隠し持っている
。リグニンを減少させるこれらの微生物のうち最も広範
に研究されたものは白色の枯葉菌（ｗｈｉｔｅ　ｒｏｔ
　ｆ’ｕｎｇｉ）である。このうち最もよく研究されて
いるのはファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎ
ｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）で
ある。しかしこの菌をパルプの漂白に直接使用するには
欠点がある。例えば次の文献を見よ：Ｔｒａｎａｎｄ　
Ｃｈａｍｂｅｒｓ、　　”Ｄｅｌｉｇｎｉｆｌｃａｔｌ
ｏｎ　ｏｆ’　ａｎＵｎｂｌｅａｃｈｅｄ　　ｌ１ａｒ
ｄｖｏｏｄ　　Ｋｒａｆ’ｔ　　Ｐｕ１ｐ　　ｂｙＰｈ
ａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｌｕｎ
　　　、　　Ａｐｐｌ。
旧ｃｒｏｂｉｏｌ　、Ｂｌｏｔｅｃｈ−ｎｏｌ　、　、
　２５．ｐｐ、４８４−９０（１９８７）。
主な欠点は菌による脱リグニンは極めて遅く、満足すべ
き光沢を得るのに少なくとも７日を要する。
もう一つの問題は菌類はセルロースを劣化させるという
最も好ましくない副作用をもつ酵素も隠し持っているこ
とである。最後に、この方法は菌類が生存し得るという
限定された状態のもとでしかおこなわれないという点で
ある。実用的な酵素による脱リグニンに対するこれらの
障害をのりこえるために、菌そのものの利用よりもむし
ろ菌の培養による酵素の調製を利用することが探求され
た。
白色枯葉菌は多くの酵素と協同して、リグニンを完全に
劣化させ二酸化炭素と水とにすると考えられている。こ
の複雑なプロセスのメカニズムは今判ったところである
。酵素による脱リグニンの最初の反応はフリーラジカル
のメカニズムを経由して起こると考えられている。
白色枯葉菌ファネロケーテ・クリソスポリウムのもつリ
グニン分解系（１１ｇｎｌｎｏｌｙＨｃ　５ｙｓｔｃｖ
）のいくつかの酵素はｉ！ｉ離され少なくとも部分的に
識別される。リグニンパーオキシダーゼ（“ＬＩＰ酵素
”）と呼ばれる酵素の一類のメンバーはいくつかのグル
ープによって記述されており、これは普通、直接に脱リ
グニンに最も関与すると考えられている。このリグニン
パーオキシダーゼはその活性のために過酸化水素を必要
とする。これらの酵素の脱リグニンの活性度は普通ベラ
トリル（ｖｅｒａｔｒｙｌ）アルコール（３，４−ｄｉ
Ｉｌｅｔｈｏｘｙ−ｂｅｎｚｙｌａｌｃｏｈｏｌ）をベ
ラトリルアルデヒド（３，４−ｄｉＩｌｌｅｔｈ。
ｘｙｂｅｎｚｙｌ　ａｌｄｅｈｙｄｅ）に酸化させる能
力で測られる。
このためベラトリルアルコールはリグニンのモデル化合
物として一般技術上で使用されておりその酸化はリグニ
ンを減少させる酵素（“リグニナーゼともいわれる）の
存在の診断となる。
もう一つのファネロケーテ・クリソスポリウムの酵素で
脱リグニンの工程に関係すると最近示唆されているのは
２価のマンガンに依存したパーオキシダーゼ（これは“
ＮＡＤＨ−酸化パーオキシダーゼとしても知られている
）であり以下“ＭｎＰ　”と略す。ＬｉＰ酵素と同様に
ＭｎＰ　　は過酸化水素を必要とするがその名前から示
唆されるように、これは２価のマンガンを必要とする。
ＭｎＰはりゲニンのモデル化合物であるベラトリルアル
コールを酸化しない。しかし　２．２°−ａｚｉｎｏ−
ｂｌｓ（３−ｅｔｈｙｌ−６−ｂｅｎｚｏｔｈｌａｚｏ
ｌｉｎｅｓｕｌｒｏｎａｔｅ）　（これは（“ＡＢＴＳ
”）と記す）やフェノールレッドなどのいくつかの染料
を酸化する。“ＡＢＴＳ−については次の文献を参照：
　Ｇｌｅｎｎ　ａｎｄ　Ｇｏｌｄ。
“Ｐｕｒｌｌ’１ｃａｔｌｏｎ　Ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｏｆ’＾ｎＥｘｔｒａｃｅｌｌ
ｕｌａｒ　Ｍｎ（ＩＩ）−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｐｅｒ
ｏｘｉｄａｓｅＦｒｏｍ　Ｔｈｅ　Ｌｉｇｎｉｎ−Ｄｅ
ｇｒａｄｉｎｇ　Ｂａｓｉ−ｄｌｏｍｙｃｅｔｅ。
ＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅＬｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｒｏｌ
ｕＩｌ、　　Ａｒｃｈ。
１１１ｏｃｈｅＩ１．　Ｂｌｏｐｈｙｓ、、　２４２（
２）、ｐｐ、３２９−４１（１９８５）。
フェノールレッドの酸化はＭｎＰ　　の活性度の測定に
普通に使われている（文献：　Ｋｕｖａｈａｒａ　ｅｔ
　ａｔ、。
５ｅｐａｒａｔ１ｏｎ　Ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｔｗ。
Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｈ２Ｏ２−Ｄｅｐｅｎｄ
ｅｎｔ　０ｘｉｄａｓｅｓ　Ｐｒｏｎ＋Ｌ１ｇｎ１ｎｏ
ｔｙｉｃ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　Ｏ「Ｐｈａｎｅｒｏｃｈ
ａｅｔｅｃｈｒｏｓｏｓｐｏｒｌ■、ＰＥＢ５　Ｌｅｔ
ｔ、、１８９（２）、ｐｐ、２４７−５０（１９８４）
）。
リグニン分解系におけるＭｎＰの“本当の”機能は、あ
るとしても現在まだはっきりしていない。
しかし最近、ＭｎＰがＬＩＰ＃素が必要とする過酸化水
素をリグニン分解反応中に発生する点で関与している、
という仮説がおこなわれている。この仮設は過酸化水素
がＭｎＰによるＮＡＤＨの酸化の際の副産物として生成
するという最近の発見によって部分的に鼓舞されている
（文献：　Ａｓａｄａ　ｅｔ　ａｌ、。
“＾ｎ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｆｕｌａｒ　ＮＡＤＨ−Ｏｘ
ｉｄｉｚｉｎｇ　ＰｅｒｏｘｌｄａｓｅＰｒｏｄｕｃｅ
ｄ　Ｂｙ　Ａ　Ｌｊｇｎｌｎ−Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　Ｂ
ａ５ｉｄｌｏｔａｙｃｅｔｅ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅ
ｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒＩｕｔｘ　　、　Ｊ、　Ｆ
ｅｒｍｅｎｔ。
Ｔｅｃｈ−ｎｏｔ、、　６５（４）、９９．４８３−８
７　＜１９８７））。
ファネロケーテ・クリソスポリウムからもたらされたど
の酵素製剤が木質バルブ中のリグニンの変異および／ま
たは劣化に効果があるか、という点については技術的に
混乱がみられる。
フアーム等（Ｐａｒｒｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、）の米国特
許４．６ｇ７，７４１は　（１）ファネロケーテ・クリ
ソスポリウムの突然変異Ｍ　５ＣＲ６から純粋にとりだ
されたリグニン分解酵素、（２〉ファネロケーテ・クリ
ソスポリウムの突然変異種５Ｃ２Ｂおよび（３）これら
の純化された酵素を使って木質パルプ中のリグニンを劣
化させ変異させる方法に関する。フアーム等の米国特許
４．８８７．７４５はファネロケーテ・クリソスポリウ
ムの種であるＳＣ２［ｉから得られた酵素を使って機械
バルブの強度や光沢安定性を強化する方法に関する。フ
アームの米国特許４，６９０．Ｂ５はファネロケーテ・
クリソスポリウムの種である５Ｃ２Ｂから得られた酵素
を使ってクラフトパルプの漂白をおこなう方法に関する
。
フアームの特許とは反対にピッカリ等 （Ｖｉｉｋａｒｉ　ｅｔ　ａｌ、）は’Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎ　ｏｌ’　Ｅｎｚｙｍｅｓ）ｎ　Ｂｌｅａｃｈ
ｉｎｇ　　、　Ｆｏｕｒｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌＳｙｍｐｏｓｉｕｒＡｏｎ　Ｗｏｏｄ　ａｎｄ　Ｐ
ｕｌｐｉｎｇ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。
Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ、Ａｐｒｉｌ　　１９８７．
Ｖｏｌ、１．ｐｐ、１５１−５４（以下ピッカリ　Ｉ）
で次のように述べている：“ピー、ラヂアタ（Ｐ、ｒａ
ｄｌａｔａ）とピー、クリソスポリウムのりグニナーゼ
（ｌｌｇｎｌｎａｓｅｓ）は松のクラフトパルプについ
ては対照の緩衝処理と比較してとくに効果はなかった。
リグニナーゼ処理をした後のそのカッパー数と光沢度は
対照のものとほとんど同じであった。これらの数字は、
余分の細胞状のりグニナーゼの反応はリグニンを劣化さ
せるよりむしろさらに重合をすすめるという最近の結果
と一致している一一一一 ピッカリ　！の１５３頁の左の欄の一番上の節（引用は
略）。ピッカリ　１では何故リグニナーゼ処理が効果な
かったかについては、なんら示唆していない。
本発明は第一の態様として、ファレル特許ともピッカリ
　１　とも基本的に異なったリグニン分解酵素を用いて
酵素によるリグノセルロース材料を脱リグニンする新規
な方法を開示する。
クラフトバルブの残留リグニンがヘミセルローズと架橋
結合をしているという報告と一致しているが、いくつか
の報告では脱リグニン、光沢化および／または機械的性
質の改善された紙を製造しうるバルブを生産することを
目的として、ヘミセルロース（例えばキシラナーゼ（ｘ
ｙｌａｎａｓｅ））を用いたウッドバルブの処理に言及
している。これらの文献ではへミセルラーゼ（ｈｅｓｌ
ｃｅｌ　Ｉｕｌａｓｅｓ）　　はヘミセルロースの劣化
による脱リグニンに影響を及ぼし、このため裂解したヘ
ミセルロースとそれに架橋結合をしているリグニンを抽
出させることを示唆している。例えば次の文献を見よ：
Ｖｉｌｋａｒ　ｌ　；　Ｐａ１ｃｅ　ｅｔ　ａｔ、　　
“旧ｅａｃｈｉｎｇ　ＨａｒｄｗｏｏｄＫｒａｆｔ　　
ｐｕｌｐ　　ｗｉｔｈ　　Ｅｎｚｙｍｅｓ　　ｆｒｏｍ
　　Ｃ１ｏｎｅｄ　　５ｙｓｔｅｏ＋ｓ、Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇｓ：　７４ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎ
ｇ　ｏｒｔｈｅ　Ｃａｎａｄｉａｎ　　Ｐｕ１ｐ　＆　
Ｐａｐｅｒ　Ａｓ５ｏｃｉａｔ１ｏｎ、　Ｍｏｎｔｒａ
ｌ、　Ｃａｎａ−ｄａ、　Ｊａｎｕａｒｙ　１９８ｇ、
　ｐｐ、　Ａ１３３−３［ｉ；Ｃｈａｕｖｅｔ　ｅｔ　
ａｌ、、　　”Ａｓ５ｉｓｔａｎｃｅ　１ｎ　ｔｈｅＢ
ＩｅａｃｈｉｎｇｏｒＮｅｖｅｒ−Ｄｒｉｅｄ　Ｐｕ１
ｐｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｘｙｌａｎａｓｅ
ｓ、Ｃｏｎ５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｎ　Ｐｕ１ｐ　　Ｐ
ｒｏｐｅｒｔｌｅｓ　　、ＦｏｕｒｔｈＩｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ　　５ｙＢｏｓｉｕｉ　　ｏｎ　　Ｗｏｏ
ｄ　　ａｎｄ　　ＰｕｌｐＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　Ｐ
ａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ、　　Ａｐｒｉｌ１９ｇ？、　
　Ｖｏｌ、２゜ｐｐ、　３２５−２７； Ｎｏｅ　ｅｔ　　ａｌ、、　　’Ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ’
　Ｘｙｌａｎａｓｅｓ　ｏｎＣｌ＋ｅｉｉｃａｌ　Ｐｕ
１ｐ　Ｆｉｂ−ｅｒｓ　　、　Ｊ、　Ｗｏｏｄ、　Ｃｈ
ｅＩＩｌ。
Ｔｅｃｈｎｏｌ、、６．　ｐｐ、１［１７−８４（１９
８Ｂ）；Ｖｉｌｋａｒｌ　ｅｔａｌ、、　　”Ｂｌｅａ
ｃｈｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ＥｎｚｙｍｅｓＰｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ：　Ｔｈ１ｒｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｕ１ｐ　ａｎｄ　ＰａｐｅｒＩ
ｎｄｕｓｔｒｙ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ、
Ｊｕｎｅ　　１９８６、ｐｐ。
８７−６９；　　Ｐｒｅｎｅｈｐａｔｅｎｔ　　２．５
５７，８９４；Ｕｎｌｒｅｄ　　５ｔａｔｅｓ　　ｐａ
ｔｅｎｔ　　２，２６０，３０７゜上述のごとくピッカ
リ　１はへミセルラーゼやりグニナーゼを用いたウッド
バルブの処理について言及している。さらにピッカリ　
１は硬水と軟木の未漂白クラフトバルブの両者について
ヘミセルラーゼを用いた処理につづきリグニナーゼを用
いた処理をすることについて言及している。しかしヘミ
セルラーゼ−リグニナーゼの連続処理は、単なるヘミセ
ルラーゼ処理に比べて有意に大きな脱リグニンを生じな
いことを報告している。
本発明は第二の態様として、リグニナーゼとキシラナー
ゼを連続して用いるリグノセルローズ材料の脱リグニン
方法を開示する。思いがけないことであるがピッカリ　
ｌの教示と反対に、本発明の方性ではりグニナーゼやキ
シラーゼを単独で用いた処理に比べて有意な脱リグニン
が達成される。
［発明の要約］ この発明はリグニン分解酵素またはリグニン分解酵素と
キシラナーゼを用いてリグノセルロース材料の効率的な
脱リグニンをおこなう実用的方法に関する。
したがって、この発明のひとつの目的は、従来の塩素漂
白段階に伴われる腐食性の汚染排水を生成する事無く、
脱リグニンされ光沢のあるリグノセルロースバルブを生
成する方法を提供することである。
この発明の他のひとつの目的は、従来のバルブ漂白によ
って製造されたものに比して改善された光沢度安定性を
示す紙を製造できるような、漂白されたリグノセルロー
スパルプを生成する方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、強度の優れた紙を製造でき
るような高い粘度をもつ漂白されたリグノセルロースパ
ルプを生成する方法を提供することである。
他の一つの目的は、各工程および洗浄工程での排出演が
、他の工程でのバルブの洗浄用に循環使用できる酵素に
よる漂白方法を提供することである。
さらに本発明の目的は、一つもしくはそれ以上のリグニ
ン分解による脱リグニン工程を含み、その第二の態様と
して従来の一つもしくはそれ以上の漂白工程と同様に一
つもしくはそれ以上のキシラナーゼによる脱リグニン工
程を含む、多段工程の漂白方法を提供することである。
本発明のこれらの目的、その他の目的および利点は以下
の詳細なる説明および請求範囲で明らかであるが、本発
明の第一の態様はリグニン分解酵素製剤を用いて低濃度
の安定状態にある過酸化水素の存在のもとでリグノセル
ロース材料を処理することである。この態様の好ましき
方法のひとつは次の試薬の少なくとも一種類もまた存在
することである：　Ｍｎ（ＩＩ）；　α−ヒドロキシ酸
；非イオン洗剤または両性イオン洗剤；および／または
リグニン分解酵素の基質として用いられる置換芳香族ア
ルコール。
第二の態様において、本発明の目的と利点は分離された
培養器のなかでリグニン分解酵素製剤およびキシラーゼ
製剤を用いてリグノセルロース材料を処理することであ
る。この態様の好ましい方法のひとつはリグニン分解酵
素を使った培養を、低濃度の安定状態にある過酸化水素
の存在のもとでおこなうことである。この態様のさらに
好ましき方法はリグニン分解酵素で培養する間、次の試
薬の少なくとも一種類もまた存在することである：Ｍｎ
（ＩＩ）；α−ヒドロキシ酸；非イオン洗剤または両性
イオン洗剤；および／またはリグニン分解酵素の基質と
して用いられる置換芳香族アルコール。
本発明の好ましき態様は、リグニン分解酵素またはキシ
ラナーゼを用いた培養につづいてリグノセルロースバル
ブがアルカリ抽出されついで水で洗浄される（すなわち
各々の酵素脱リグニン工程の後で）ものであることであ
る。抽出を任意に伴う酵素脱リグニンの工程は、本発明
による酵素脱リグニン方法の一工程である。
［発明の詳細な説明］ 本発明は第一の態様として、リグニン分解酵素を用いて
リグノセルロース材料を酵素で脱リグニンする新規な一
段法または多段法に関する。第二の態様として、本発明
の方法は少なくとも一つのリグニン分解酵素処理工程と
、少なくとも一つのキシラナーゼ処理工程とより成る。
本発明の方法はまたリグノセルロース材料の光沢化をも
たらす事が出来る。
本発明の第二の態様の重要な思いがけない内容は、キシ
ラナーゼまたはりグニナーゼ単独で処理する時より大き
な脱リグニンを達成するために、キシラナーゼとリグニ
ン分解酵素を別々の培養器にいれてリグノセルロース材
料を処理せねばならない、ということである。このこと
は何度も繰返したテストの結果、リグニン分解酵素とキ
シラナーゼを同一の培養器にいれてリグノセルロース材
料を処理すると、リグニン分解酵素単独で処理した時よ
り低い脱リグニンをもたらしたことから結論された。
ここに使用される“酵素脱リグニン工程“という言葉は
、リグニン分解酵素またはキシラナーゼのどちらかをと
ともにリグノセルロースキオ料を培養する工程より成る
工程をいう。本発明による酵素脱リグニン工程は、リグ
ニン分解酵素またはキシラナーゼを用いる培養工程につ
づきさらに抽出および／または洗浄する工程より成る。
“リグニン分解酵素処理工程”とはリグノセルロース材
ｆ４をリグニン分解酵素製剤とともに培養する工程より
成る脱リグニン工程である。“キシラーゼ処理工程°と
はリグノセルロース材料をキシラナーゼ製剤とともに培
養する工程より成る酵素脱リグニン工程である。
リグノセルロース材料 本発明の方法に用いる好ましいリグノセルロース材料は
木材バルブである。例としては、周知の亜硫酸塩法、硫
酸塩もしくはクラフト法、ソーダ法および変性亜硫酸塩
法によって製造されたような木材バルブである。本発明
の方法は軟水バルブと硬水バルブの両方の有意性のある
脱リグニンをもたらす。本発明は特に、酵素脱リグニン
が上白を容易にもたらすほど未処理バルブのカッパ数（
ｋａｐｐａ　ｎｕＩＩｂｅｒ）がすでに低いような硬水
クラフトバルブの漂白に有用である。
本発明の第一の実施態様に係るリグニン分解画素を用い
た処理において広範囲なりラフト処理Ｃ１よって生ずる
軟木バルブ（漂白前カッパ数８を４する）の有意な漂白
も観察されている。しかし、標準的クラフト方法によっ
て生ずる軟水バルブ【：非常に高いリグニン含量と、少
なくとも２ｏの漂Ｃ前カッパ数とを有する。リグニンが
除去された釈果、光沢度が相当に増加する前にカッパ数
は杓ないし１２以下に低下せねばならないので、これら
の高いカッパー数のバルブを用いる本発明の第一の態様
による一段または二段工程で達成される肪リグニンの程
度は有意な光沢化をもたらすには夫分ではない。しかし
三またはそれ以上の酵素脱リグニン工程より成る第一の
態様による方法は南剖産の軟木クラフトバルブを充分に
脱リグニンしその結果、測定可能な光沢化をもたらした
。
本発明の第二の態様による方法で、三つのリグニン分解
酵素処理工程と一つのキシラナーゼ処理工程の四段工程
より成る方法では高いカッパー数（すなわち２０以上）
の軟水パルプを充分に脱リグニンしてその結果、有意な
光沢化をもたらすことが出来る。
出廟人は、本発明の実用上の利益として、リグノセルロ
ース材料は完全に脱リグニンされる必要のないこと、ま
たは測定可能な光沢化さえ必要でないことを強調する。
本発明の方法によって達成されるリグノセルロース材料
の部分的な脱リグニンは、そのバルブを完全に脱リグニ
ンしかつ漂白するに必要な漂白剤の量を減少するという
利益を有するであろう。その結果、漂白工場の排水中の
塩素化有機物レベルは減少するであろう。
機械バルブ、熱機械バルブや化学熱機械バルブの酵素脱
リグニンも考えられる。これらは、利用して良い利益の
あるリグノセルロース材料の一部をリストしたに過ぎな
い。例えば技術的に未知である・方法で製造されたバル
ブの使用も排除されない。
さらに、本発明の脱リグニン方法はバルブ形成に有益な
効果を有するので、不完全パルプ化リグノセルロース材
料の脱リグニンと増白が同様に予期される。かかる部分
的にパルプ化されたリグノセルロース材料が本発明によ
って脱リグニンされるならば、これに付随して、直接製
紙に使用するに適したバルブを減少させるであろう。
本発明の方法によって脱リグニンされたリグノセルロー
ス材料はリグニン分解酵素またはキシラナーゼを用いて
酵素脱リグニンをおこなう前に洗浄またはその他の処理
をおこなうことが出来る。
使用されるリグノセルロース材料が化学バルブであると
きは、洗浄工程はとくに有益である。本発明の好ましい
態様では、化学バルブは酵素処理に先立ち水で広範に洗
浄される。化学バルブはまた、エチレン・ヂアミン四酢
酸（“ＩＥＤＴＡ”　）（５−１００ａ＋Ｍ）またはヂ
エチレントリアミンペンタ酢酸（’ＤＴＰＡ’　）（０
，０ｌ−１００ａ＋Ｍ）のような希薄なキレートで洗浄
することも出来る。ついでリグノセルロース材料は酵素
脱リグニンに先立ち水で広範に洗浄される。酵素脱リグ
ニンに先立ちリグノセルロース材料を希薄な酸、例えば
１０〜２００ｍＭの酢酸、で洗浄することも有利である
。これらの洗浄工程出のバルブ・コンシステンシは普通
０．１−１０．０％であろう。
加工工程以前にリグノセルロース材料の加熱を含む可能
性のあることを発明者は認識している。
この可能性が実施されるときは、リグノセルローズ材料
をその脱リグニン反応に添加されるに先立ち冷却し、活
性なリグニン分解酵素またはキシラナーゼが熱によって
不活性になることを防ぐ必要がある。
リグニン分解酵素製剤およびキシラーゼ製剤０腐れ菌、
褐色腐れ菌（ｂｒｏｗｎ　ｒｏｔ　ｆ’ｕｎｇｌ）また
は乾腐病菌（ｄｒｙ　ｒｏｔ　ｆｕｎｇｉ）に由来する
リグニン分解酵素製剤が本発明のために有用であろう。
これらの天然生成菌の変異菌株に由来する酵素も、特に
変異菌株が目的のリグニン分解酵素の産出量を増加させ
るために選択された菌株である場合に、有用であろう。
白腐れ菌に由来する酵素の使用が好ましい゛。フ７ネロ
ケーテ・クリソスポリウムに由来する酵素の使用が特に
好ましい。この菌の軸向なる菌株も用いることができる
が、好ましい菌株の例には５Ｃ２６［ノザン　リージョ
ナル　リサーチ　ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒ
ｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）　　（ＮＲＲＬ）　＃　　１５９７８］　、　ＭＥ
−４４６［アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクシ
ョン　（Ａｓｅｒｌｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔ１ｏｎ）　　（Ａ　　Ｔ　　Ｔ
Ｃ）　＃　３４５４１］およびＶＫＭ−Ｆ−１７６７（
ＡＴＴｃ＞　＃　　２４７２５）がある。
菌（ｒｕｎｇｉ）またはバクテリアのいづれかから作ら
れたキシラナーゼ製剤は、この発明の目的に対して有用
である。エンドキシラナーゼ（ｅｎｄｏｘｙｌａｎａｓ
ｅ）より成るキシラナーゼ製剤が好ましい。
キシラナーゼの原種として使われる特殊な微生物は本発
明の一部を形成していない。むしろキシラナーゼを製造
するために見つけ出された微生物、好ましくはエンドキ
シラナーゼ、が本発明の目的にたいして有用であろう。
かかる微生物の多くは技術上既知である。次の文献を見
よ： Ｂａ５ｔａｖｄｅ、　　’５ｔｕｃｌｌｅｓ　ｏｎ　Ｘ
ｙｌａｎａｓｅ　ｒｒｏｔ＊　ＣｈａｌｎｉａＳｐ、　
　　、ｄｏｃｔｏｒａｌ　　ｔｈｅｓｌｓ（ｉｎ　　ｂ
ｌｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）。
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　ｏｆ　　Ｐｏｏｎａ、Ｄｌｖ
ｉｓｉｏｎ　　ｏｆＢｉｏｃｈｅＩＩｌｌｃａｌＳｃｉ
ｅｎｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｕｎｅ−４１１００８、Ｉ
ｎｄｌａ、ｐｐ、　　９−３９−３７（１９８７）（“
ｔｈｅＢａｓｔａｗｄｅ　　ｔｈｅｓｉｓ　　″　）；
Ｄｅｋｋｅｒ　、　　　“　Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉ
ｏｎ　　ｏｆ　ｔｈｅ）１ｅｍｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅｓ
　　　、ｉｎ　　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　　ａｎｄ
ＢｉＯｄｅｇｒａｄａｔｉＯｎ　ｏｌ’　Ｗｏｏｄ　Ｃ
ｏａ＋ｐｏｎｅｎｔｓ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、
ＮＹ、ｐｐ、５０５−３３（１９８５）。
菌種として中でも次のものからのが有用である：Ａｓｐ
ｅｒｇｌ　１１ＵＳ、Ｃｈａｅｔ０１１＋Ｉｕ＋Ｉ、５
ｐＯｒＯｔｒｉｅｈｕｆｌｌ。
Ｓｃｌｅｒｏｔｌｕｍ、５ｃｈｉｚｏｐｈｙｌ　Ｉｕｆ
ｆｉ、ＴｒｌｃｈｏｄｅｒｍａおよびＴｈｅｒａ＋ｏａ
ｓｃｕｓ　ｏ中でもとくに有用な菌種は次のものである
： Ａｓｐｅｒｇｌｌｌｕｓ　ｏｃｈｒａｃｅｕｓ、Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　　ａｗａＩＩＩｏｒｌ、ｓｐ
ｏｒｏｔｒ１ｃｈｕｍｄｉａ＋ｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｍ
、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ　ｒａｄｉａｔｕｉ。
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍおよびＴｈｅｒｍｏａ
ｓｃｕｓ　ａｕｒａｎｔｔａｅｕｓ　。
有用なバクテリア種には　Ｃｈａｉｎｉａ※Ｓｔ　ｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ　、　Ｂａｃｉ　Ｉ　ｌｕｓおよびＣ
ｌ０８ｔｒｉｄｉｕｆｌｌからつくられた菌が含まれる
。中でも特に次のバクテリア種は有用であると信じられ
る： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇ
ｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｕｓ、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ。
Ｃｌｏｓｔｒｌｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍお
よびＣＩｏｓｔｒｉｄｌｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｊｃ
ｉｕｍ　。
（※Ｃ１１ａｌｎｊａという属はＳｔ　ｒｅｐｔｏｉｙ
ｃｅｓという属の新しい同義語（ｊｕｎｉｏｒ　５ｙｎ
ｏｎｙｒａ）となり、それに含まれる種の名は再検討さ
れるべきだ、という意見か最近提出された。
Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｖ　ｅＬ　ａｌ、、“Ｔｒａｎｓｌ
’ｅｒ　ｏｒ’　ＣｈａｉｎｉａＳｐｅｃｉｅｓ　ｔｏ
　ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　５ｔｒｅｐｔｏＩＩｌｙｃｅｓ
　ｗｉｔｈＥｍｅｎｄｅｄ　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　
ｏｆ’　５ｐｅｃｌｅｓ　　、５ｙｓｔｅＩ１．Ａｐｐ
ｉ、旧ｃｒｏｂ１ｏ１．，８．ｐ１）、５５−６０（１
９８Ｂ）参照。
この提案を是認して、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（Ａｒａｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅＣｏｔ　ｆａｃｔｉｏｎ）はＣｈａｉｎｉａ
種の大部分をｓｔ　ｒｃｐｔｏｎ＋ｙｃｃｓ属へ再分類
した。ノーザン◆レジオナル・リサーチ・ラボラトリ（
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ＲｃｇｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）はその提案に対し明らかに不
賛成であり、Ｃｈａｉｎｉａ種を再分類していない。）
キシラナーゼを生産するが、セルラーゼ（ｅｅｌ　Ｉｕ
ｌａｓｅｓ）を生産しない種（５ｔｒａｉｎｓ）が好ま
しい。
Ｃｈａｌｎｉａ種および、さきにＣｈａｉｎｆａ属に属
すると分類されたＳｔｒ’ｅｐｔＩＩｌｙｃｅｓｉ’ｌ
はキシラナーゼ製剤の原種としてとくに好ましい。
上記された属および種からの多くの種は公的な微生物寄
託所で人手できる。有用な種（すなわちキシラナーゼを
つくるような種）は微生物を培禿し、表面に浮かぶ細胞
外培養物を集め、既知の技術手順によってキシラナーゼ
活性物（ｘｙｌａｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ）をスクリ
ーニングする、という単純な方法で同定される。次の文
献を見よ： Ｋｈａｎ　ｅｔ　　ａｔ、、　”Ａｓ５ａｙ　ｏｆＸｙ
ｌａｎａｓｅ　ａｎｄＸｙｌｏｓｌｄａｓｅ　Ａｃｔｉ
ｖｉｔｉｅｓ　ｉｎ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｎｄＰｕ
ｎｇａｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　　、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉ
ｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、、８゜１）Ｉ）、３７３−
７７（１９８Ｂ＞。
われわれはキシラナーゼ活性物としてアメリカンＯタイ
プ・カルチャー・コレクションから得られた１６種のＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＣｈａｌｎｌａの種をス
クリーニングした。略３つでキシラナーゼを製造するこ
とが見いだされた。
ＡＴＴＣから入手した凍結乾燥された微生物をＡＴＴＣ
の推奨した媒体（ＡＴＣＣＭｅｄｌａ　＄５；　これは
以下″胞子形成媒体１という）のなかで２６℃で１５０
ｒｐｍに設定した回転撹拌器上で培養した（５（１ｍｌ
の胞子形成媒体を２５０ｍ１のエルレンマイーヤーフラ
スコにいれた）。充分な生物量が培養されたのち（約二
週間）、１０％（５ｍｌ）の接種材を２５０ｍ１　　の
エルトンマイヤーフラスコ中にいれた５０ｍ１３ｘ胞胞
子形成体（媒体は３倍の高濃度の溶質を含有）中にいれ
７日間２６−３０℃で１５０ｒｐ−に設定された回転撹
拌器上で培養した。７日間の培養の後、各培養物からの
それぞれ１０％（５ｍｌ）の接種材を３％キシラン発酵
媒体（３％Ｌａｒｅｈｖｏｏｄ　Ｘｙｌａｎ；５１ｇ５
ａ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。
＄Ｘ３８７５と１％イースト抽出物（Ｄｌｆｅｏ）を生
水中にいれたもの）（Ｓｅｔ　Ａ　）と５％Ｗｈｅａｔ
　Ｂｒａｎ　Ｍｅｄｉａ（１２，５％Ｐｏ５ｔ　Ｎａｔ
ｕｒａｌ　Ｂｒａｎ　Ｆｌａｋｅｓ　（４０％ｗｈｅａ
ｔｂｒａｎ）と　１駕のイースト抽出物（Ｄｉｒｃｏ）
を生水中にいれたもの）（ＳｅｔＢ）の中にいれた。
３％のキシラン発酵媒体（Ｓｅｔ　Ａ）中の培養物を２
５０１のエルトンマイヤーフラスコ中で３０℃で２２Ｏ
ｒｐｍｌこ設定された回転撹拌器の上で培養した。
試料の一部（アリコー）　；　ａｌｌｑｕｏｔ）（３ｍ
ｌ）を接種後３ないし８日目にそれぞれＳｅｔ　Ａ培養
物より取り出した。
５Ｘ　Ｗｈｅａｔ　Ｂｒａｎ　Ｍｅｄｉａ　（Ｓｅｔ　
Ｂ）中の前記培養物を２５０ｍ１のエルレンマイヤー・
フラスコ中で２６℃で１５０ｒ９■に設定された回転撹
拌器の上で４日培養した。培養４日目に、Ｓｅｔ　Ｂか
らのそれぞれの培養物の１０％（５ｍｌ）の接種材を３
％キシラン発酵媒体へ防腐処置をして移し、２５ｈｌの
エルレンマイヤー・フラスコ中で３０℃で２２０ｒｐ−
に設定された回転撹拌器の上で培養した。前記試料の一
部を接種後３ないし８日目にそれぞれＳａｔ　Ｂ培養物
より取り出した。
前記試料の一部を７０　ｘ　ｇａｙで２０分間室温で遠
心分離して、その上澄みを後述のようにキシラナーゼ活
性について分析した。キシラナーゼ生成は種により異な
った日にピークを示すので、活性度は接種後世なくとも
３ないし８日目に分析することが重要であることに注意
せよ。
Ｓｅｔ　Ｂはキシラナーゼ生成を誘発するといわれてい
るので５％　Ｗｈｅａｔ　Ｂｒａｎの媒体中で培養した
。
次の文献を見よ： ５ｒｌｎｌｖａｓａｎ　ｅｔ　ａｌ、　　”５ｔｕｄｌ
ｅｓ　ｏｎ　ＸｙｌａｎＤｅｇｒａｄｉｎｇ　Ｅｎｚｙ
ＩＩｅｓ　ｆｒｏｍ　ｅｈａ１ｎｉａ’　、Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ。
Ｌｅｔｔ、、６．ｐｐ、７１５−１８（１９８４）。
しかしキシラナーゼの活性度については、Ｓｅｔ＾とＳ
ｅｔ　Ｈの培養の間に有意な差は見られなかった。
上に述べたスクリーニングの記録の各々を使って、我々
はキシラナーゼを生成する可能性のある１０種の種を同
定した。種の分類は、４〜８日のいづれかの日に２０　
／　ｍｌより大きなキシラナーゼ活性度が認められたら
この種は陽性生成種であるとした。１０種の陽性生成種
（およびそのＡＴＣＣ管理記号）は次の通りである： Ｓｔｒｅｐｔｏｇ＋ｙｃｅｓ　　５ｃｌｅｒｏｔｌａｌ
ｕｓ　　（ＡＴＣＣ１５Ｂ９Ｂ）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｆｌａｖｌｓｃ！ｅｒｏｔｉｃｕｓ　（ＡＴＣ
Ｃ１９３４７）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｍｌ
ｇａｔｌｓｃｌｅｒｏｔｌｃｕｓ（ＡＴＣＣ１９３４５
）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍ１ｎｕｔｊｓｃｌｅ
ｒｏｔｌｃｕｓ（ＡＴＣＣ１７７５７）；５ｔｒｅｐｔ
ｏａ＋ｙｃｅｓ　　ｎｉｇｅｒ　　（ＡＴＣＣ１７７５
６）；５ｔｒｅｐｔｏａ＋ｙｃｅｓ　　ｏｃｈｒａｃｅ
ｉｓｃｌｅｒｏｔｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１５８１４）；Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｐｏｏｎｅｎｓｉｓ　　（
ＡＴＣＣ１５７２３）。
５ｔｒｅｐｔｏＩｌｙｃｅｓ　　ｒｏｓｅｉｓｅｌｅｒ
ｏｔｉｃｕｓ　　（ＡＴＣＣ１７７５５）；５ｔｒｅｐ
ｔｏｒａｙｃｅｓ　ｓｐ、　（ＡＴＣＣ２７９４６）；
およびＣｈａｌｎｌａ　　ｈｙｇｒｏａｔｒｏｃｙａｎ
ｅａ　　（ＡＴＣＣ４３９Ｂ２）。
上記の１０種の陽性生成種に加えて、三種の種をキシラ
ナーゼの限界生成種（ｍａｒｇｉｎａｌ　ｐｒｏｄｕｃ
ｅｒｓ）として同定した。種の分類は、４〜８日のうち
最も高くキシラナーゼを生成する日に　１〜２　Ｕ　／
　ｍｌのキシラナーゼ活性度が認められると、これを限
界生成種とした。三種の限界生成種（およびそのＡＴＣ
Ｃ管理記号）は次の通りである：５ｔｒｅｐｔｏｔｉｙ
ａｅｓ　ｏｌｉｖａｃｅｉｓｃｌｅｒｏｔｉｅｕｓ（Ａ
ＴＣＣ１５７２２および１５８９７）および ５ｔｒｅｐｔｏＩｌｙｃｃｓ　ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｉ
ｓｃｌｅｒｏｔｊｃｕｓ　（ＡＴＣＣ１９３４ｇ）。
１６種をスクリーニングしたうち非生成種（ｎｅｇａＮ
ｖｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ）はわずか３種であった０種
の分類は、４〜８日のうち最も高くキシラナーゼを生成
する日にｌ　Ｕ　／　ｍ１未満のキシラナーゼ活性度が
認められると、これを非生成種とした。非生成種（およ
びそのＡＴＣＣ管理記号）は次の通りであるＳｔｒｃｐ
ｔｏｍｙｃｃｓ　ｒｕｂｅｒ（ＡＴＣＣ１７７５４）；
Ｓｔｒｃｐｔｏｍｙｅｅｓ　ｖｉｏｌｅｎｓ（ＡＴＣＣ
１５８９ｇ）：およびＣｈａｉｎｉａ　ｙａｘｌａｎｅ
ｓｌｓ（ＡＴＣＣ４３１３９）。
キシラナーゼ包含（ｅｎｄｏ−ｘｙｌａｎａｓｅ）の原
種として最も好ましいものはＣｈａｉｎｉａ　ｓｐ、［
ＮＣＬ　８２−５−１１（ＡＴＣＣ５Ｈ１２）である。
その種のもつキシラナーゼ■はキシラナーゼＩよりも好
ましい。Ｃｈａｉｎｌａｓｐ、［ＮＣＬ　８２−５−１
］の５ミセルラーゼ（１＋ｅｉ＋１ｅｅｌ　Ｉｕｌａｓ
ｅｓ）はＢａ５ｔａｖｄｅの論文および５ｒｊｎｌｖａ
ｓａｎ等　’５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　Ｘｙｌａｎ　Ｄｅ
ｇｒａｄｉｎｇＥｎｚｙｍｅｓ　ｆ’ｒｏＩＩＣｈａｉ
ｎ１ａ　　、Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ、Ｌｅｔｔ、、［ｉ
。
ｐｐ、７１５−１８（１９ｇ４）の中で議論されている
。さらにその種の特長については次の文献を見よ：５ｒ
１ｎｉｖａｓａｎ等“ｌｌｉｇｈ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　
ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＧｌｕｃｏｓｅ（Ｘｙｌｏ
ｓｅ）Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　ｆｒｏｍ　ａ　Ｃｈｉｎｌ
ａＳｐｅｃｉｅｓ　　　、Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌ、Ｌｃ
ｔｔ、、５．ｐｐ、６１１−１４（１９８３）　。
Ｖａｒｔａｋ等″Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　
ｏｆ　ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＳｕｂｓｔｒａｔｅ
　　５ｐｅｃｉｆｉｃ　　Ｇｌｕｃｏｓｅ　　ａｎｄ　
　ＸｙｌｏｓｅＩｓｏｉｅｒａｓｅｓ　　ｏｒ　Ｃａ１
ｎｉａ　　　、Ｂｔｏｔｅｃｈｎｏ＋、ｔ、ｅｔｔ、、
ｅ。
ｐｐ、４９３−９４（１９８４）　；およびＰａｖａｒ
等”Ｐｕｒｊｒｊｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｊｓａｔｊｏｎｏｆ　Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｘｙｌｏ
ｓｅ）ＩｓｏＩＩｅｒａｓｅ　　ｆ’ｒｏｍ　　Ｃａ１
ｎｉａ　　ｓｐ。
（ＮＣＬ　　８２−５−１）’　　、ＢＩｏｃｈｅｍ、
ＢＩｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ■ｕｎ、、１５５、ｐｉ
）、４１１−１７（Ｊ９８８）。
このＣｈａｉｎｉａ　ｇの有利な点はセルラーゼも生成
しないことである。それ故、細胞外培養基を分別してい
ない媒体またはその濃縮物を使用してもセルラーゼの有
害な影響（すなわちバルブ粘度を低下させパルプの収量
を高める）を引起すことはないという点である。
通常、希望するリグニン分解酵素またはキシラナーゼは
微生物によって細胞外培養基中に分泌される。この細胞
外培養基はついで回収され、所望の濃度と酵素純度を達
成するよう加工される。培養条件と回収ｎｉ間は回収さ
れた酵素の活性度の全量に影響を及ぼす。もし色々なキ
シラナーゼあるいはリグニン分解酵素のひとつが存在す
るなら、その各々の相対比率も同様に影響をうける。さ
らに各種の種はリグニン分解酵素またはキシラナーゼの
全生成量が異なり、生成される各種の酵素の比率も異な
る。それ放出業者であれば酵素製剤の所望の最終目的に
ついて最適の酵素生成を行うであろう。菌や微生物の培
養を開始したり生育したりする方法や最適のリグニン分
解酵素あるいはキシラナーゼ生成用の細胞外生育媒体を
回収する方法は本発明の部分を構成せず公知の方法で便
宜に行うことが出来る。
回収された培養基は直接脱リグニン工程で使用されるが
、この培養基を濃縮して、本発明の脱リグニン法に使用
出来る未分別のリグニン分解酵素ｌｆＡ縮物または未分
別のキシラナーゼ濃縮物を生成させることが望ましい。
細胞外生育媒体あるいはそれらの未分別の濃縮物の使用
を希望することは、これらの製剤が活性なセルラーゼや
プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）の相当量より成る
時は、その可能性は少くなる。活性なセルラーゼが相当
量あると、これらはセルロースに作用してバルブ粘度を
低下させるので好ましくなく、もし十分に存在するなら
バルブ収率はある程度減少する。活性なプロテアーゼが
相当量あると他の蛋白に作用して反応混合物中のリグニ
ン分解酵素またはキシラナーゼの活性を減少させ好まし
くない。セルラーゼまたはプロテアーゼの汚染について
の望ましくない影響は、これらの酵素の抑制剤を未分別
酵素製剤に添加することにより減少または回避すること
が出来る。代りに、セルラーゼまたはプロテアーゼの汚
染の全部または一部をとり除くために酵素製剤を分別す
ることも出来る。
いづれの濃縮法でも酵素活性を保存するものであれば適
している。適当な濃縮法として凍結乾燥および真空蒸発
があり、高級塩、ポリエチレングリコール、アセトンお
よびアルコールで沈澱させる方法も同様である。もしこ
れらの濃縮法のいづれかを使用するなら、酵素（リグニ
ナーゼまたはキシラナーゼ）は、適当な緩衝度（例えば
、酢酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、ジメチル・コハ
ク酸ナトリウムまたはコハク酸ナトリウムでｐＨ３〜８
〉の巾で再構成され、脱リグニン反応に使用される未分
別の酵素濃縮物を生成する。かわりに、凍結乾燥や沈澱
を直接脱リグニン−反応（こ添加することも出来る。
分別されていないリグニン分解酵素の好ましい濃縮方法
は細胞外培養培地の加圧透析による方法である。典型的
な細胞外酵素濃縮液は０．５〜２０．ＯＵ／ｍｌのベラ
トリル・アルコール酸化（ＶＡＯ）活性を含む。本出願
のためＶＡＯ活性１単位は下記のような標準検定条件下
で２５℃において１分間にベラトリル・アルコール１パ 素量と定義される。
ＶＡＯ活性は３１０ｔｖにおける検定溶液の吸光度の変
化から定量される。ＶＡＯ活性検定においては、調製し
た３種類の試薬を用いた：　（Ａ）　Ｈ　２　Ｓ。
４でｐ）１３．０に調節した、０．２５　Ｍ酒石酸ナト
リウム；　（Ｂ）　ｌＯ．０１１Ｍベラトリル・アルコ
ール［アルドリッヒ　ケミカル社（Ａｌｄｒｌｃｈ　Ｃ
ｈｅｍｊｃａｌ　Ｃｏ．）ライスコンシン州　ミルウォ
ーキー　＃　Ｄ１３．３０Ｌｌ−０　］および（Ｃ）　
９８１Ｍ過酸化水素［フィシャー・サイエンティフィッ
ク（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　、　二ｘ
ーシャーシー州、フェアローン＃　８８２５−５］　　
（毎日新しく調製）。ＶＡＯ活性検定を実施するには、
（ａ）試薬Ａ４００μｇを石英キュベツトに加え；（ｂ
）試薬８　　２００μｇを加え；（Ｃ）酵素サンプル／
二度蒸留した水（二重蒸留水）３９０μρを加え；（ｄ
）キュベツトの中味を混合し；（ｅ）試薬Ｃ　　１０μ
ｐを加え；（「〉キュベツトの中味を直ちに混合し；そ
して（ｇ）３１０ｎｍにおける吸光度を２５℃において
３０秒間測定する。試験サンプル１ミリリツトルあたり
のＶＡＯ活性単位（Ｕ／ｍｌ）はベラトリル・アルコー
ルの吸光係数として９３００Ｍ　−’ａｍ−’の値を用
いて次のように算出する：　（ΔＡ／分）　　（９３０
０）　−１（　１０００）　　（試験サンプルｆｆｉ　
（ｍｌ）　）−’。本出願のために、ＬｉＰ酵素１単位
はＶＡＯ活性１単位に等しい。
ΔＡ３１０／分は０．１〜０．５ΔＡ１１ｏ／分の範囲
内で、ＬＩＰ濃度に比例して線型である。この範囲外の
割合を生ずる酵素サンプルは活性の算出に用いない。こ
の代りに、キュベツトあたりの試験サンプル量を、測定
割合が前記線型範囲に入るように減少または増加させる
。
ある状況下では、回収した培養培地の不完全精製した亜
分画（ｓｕｂｆ’ｒａｃｔｉｏｎｓ）を用いることが望
ましい。例えば、有意量のセルラーゼまたはプロテアー
ゼを含まないリグニナーゼ含有並分画またはキシラナー
ゼ含有並分画の使用が望ましい。特に、分画（分別）さ
れていないキシラナーゼ調整剤はしばしばセルラーゼを
含むことが予期されるであろう。この代りにＬｉＰ酵素
をＭｎＰ酵素から分離して、または様々なキシラナーゼ
を分離して、これらの酵素活性を酵素処理において別々
に用いることも望ましい。結局、殆んど均質になるまで
精製したリグニン分解酵素およびキシラナーゼの使用が
、精製リグニン分解酵素の混合物および精製キシラナー
ゼの混合物と同様に予期される。
回収された細胞外培養基をさらに分別 （ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅ）　シて酵素純度を所
望のものにするために使用される方法は本発明の部分を
構成せず、既知の技術を効果的に組み合せれば出来るこ
とである。例えば電荷（ｃｈａｒｇｅ）、ｐｌ、疎水性
およびサイズの差によるクロマトグラフ分離が使用出来
る。各種の選択沈澱法、例えば、硫酸アンモニウムを使
うものも適している。さらに選別された酵素を純化する
ためにアフィニティー（ａｆＮｎｌｔｙ）クロマトグラ
フが有用であると予想している。中でも典型的なリグニ
ン化合物であるレクチン（＋ｅｃｔｉｎｓ）や所望の酵
素をもたらすモノクロナール抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）などの親和性配位子（ａｆ
ｆｉｎｉｔｙ　ｌｉｇａｎｄｓ）が適している。例えば
タン等（Ｔａｎ　ｅｔ　ａｌ、）の米国特許４，７２５
．５４４を見よ。
この特許はキシラナーゼをその混合物から分離する方法
としてヘミセルロース分解 （ｈｃｏ＋１ｃｃｌ　１ｕｌｙｔｉｃ）微生物を培養し
て作った他のへミセルラーゼやセルラーゼを使うことを
述べている。
本発明の重要な特長はファネロケーテ・クリソスポリウ
ムの純化されたＭｎＰが本発明の方法を使ったウッドバ
ルブの脱リグニンにおいて効果的であることである。従
前の技術（発明の背景、上述を見よ）ではＭｎＰがウッ
ドバルブの脱リグニンおよび漂白に有用であることは全
く予期されなかった。この出願で使用しているように”
ＭｎＰ”という言葉は、その酵素が現在技術上公知であ
るか否かに拘らず、リグニンを改質または分解し得るマ
ンガン依存性パーオキシダーゼに適用される。ここで使
用されているように“リグニン分解酵素”または“リグ
ニナーゼという言葉はＬＩＰおよび／またはＭｎＰ＃素
をいう。
ＬＩＰまたはＭｎＰ活性をもつ組換または合成キシラナ
ーゼまたはリグニン分解酵素も本発明の方法に有用であ
る。かかる酵素は既知の技術で製造し得る。
標準的には所望の酵素製剤は直接脱リグニン反応に添加
される。しかしこの酵素を固体支持物の上に固定し、つ
いでこうして出来た固体支持物を脱リグニン反応に添加
すると有利である。固定する方法は使用される支持物に
よるが、酵素の活性を破壊しなければいかなる方法でも
適している。
固体支持物にリグニン分解酵素またはキシラナーゼを一
緒に使うことは、脱リグニンが所望の程度に達したのち
脱リグニン反応混合物からこれらの酵素を回収すると、
いっそう便利であるという利点がある。回収された酵素
はついでリグノセルロース材料に添加し他の脱リグニン
反応を開始させる。
リグニン分解酵素処理工程 リグニン分解酵素処理の工程は所望のサイズをもち、内
容物を混合、酵素処理および温度制御する設備のつけら
れた容器の中で行われる。さらに非ガス性の反応成分を
導入し反応生成物を除去するための便利な機械を設置せ
ねばならない。反応成分の添加順序は厳密でなくてよい
が酵素を最後に添加することが望ましい。反応混合物は
基本的に、脱リグニンされるべきリグノセルロース材料
、活性なリグニン分解酵素製剤および過酸化水素より成
り、好ましくは低安定状態濃度で水溶液中のすべてのも
のが適切なｐＨに保持されたものであることが望ましい
。反応混合物は次の成分を含有することもまた好ましい
：（ａ）非イオンまたは両性イオン洗剤、　（ｂ）Ｍｎ
　（Ｕ　）　、（ｃ）アルファーハイドロキシアシドお
よび／または（ｄ）リグニン分解酵素の基体として役立
つような置換芳香族アルコール。
被漂白リグノセルロース材料がウッドバルブの場合はそ
れは反応混合物中に０．１ないし１５％、好ましくは２
．０ないし１０％のコンシスチンシー（パルプ乾ｆｆ１
ｇ／パルプ湿ｉｎ　ｔｒ　）で存在すべきである。
少くとも１種のＬＩＰを含み、ＭｎＰ活性を全く有しな
いリグニン分解酵素製剤が使われる場合は、それは反応
混合物中にＶＡＯ活性がバルブ乾ｆｆ１１ｇ当りＩＯな
いし　１００単位、好ましくは１５ないし３０Ｕ／ｇの
比で存在すべきである。もし少くとも一種のＭｎＰを含
みＬＩＰ活性を全く有しない酵素製剤が使用されるとき
は、バルブ乾Ｊｉ１ｇ当りＩＯないし２００１１１位で
存在すべきであり、フェノールレッド酸化（”ＰＲＯ”
）活性度として３５ないし　ｌ０ＱＩＪ／ｇが好ましい
。
ＰＲＯ活性１単位は、標準検定条件下、２５℃において
１吸光度単位／分の検定溶液の吸光度（５３０Ｉにおけ
る）を変化させるような酵素量として定義される。ＰＲ
Ｏ活性検定には３ｉ１ｉ類の試薬を用いる。試薬Ａはフ
ェノール・レッドのナトリウム塩［シグマ　ケミカル社
（Ｓｉｇｓａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）ミズーリ州
、セントルイス、＃Ｐ−５５８０Ｅ　　Ｏ，１１ｆ／１
、オボアルブミン１．１ｓｒ　／１および８５％乳酸２
．５ｍｌ／１を２０ｍ１４コハク酸ナトリウム（ｐＨ４
，５＞中に含む。試薬Ｂは２０ｍＭコハク酸ナトリウム
（ｐＨ４，５）中の１ｈＭ硫酸マンガンである。試薬Ｃ
は９．１＋＊Ｍ過酸化水素（フィッシャー・ケミカル社
）（毎日新たに調ｆ！Ａ）である。ＰＲＯ活性検定を実
施するために、以下のステップが実施される。：（ａ）
試薬Ａ　９００μｇを石英キュベツトに加え；（ｂ）酵
素サンプル／二重蒸留水１００μｇを加え；（Ｃ）試薬
Ｂｌ（ｌμｇを加え；（ｄ）キュベツトの中味を直ちに
混合する；（ｅ）このキュベツトにおいて分光測光計は
５３（ｌｎｍでブランクである；（ｆ）次に試薬ＣＩＯ
μｇを加え：（ｇ）キュベツトの内容物を直ちにケーブ
ル・タイを用いて混合し；（ｈ〉そして５３０ｎｍの吸
光度を２５℃において３０秒間記録する。試験サンプル
１ミリリツトルあたりのＰＲＯ活性単位（ＩＩ／ｍｌ）
は次式を用いて算出する：　（△Ａ／分）（検定に用い
た試験サンプル量（ｍｌ））−’。本出願のために、Ｍ
　ｎ　Ｐ　１単位はＰＲＯ活性の１単位に等しい。
△Ａ３３０／分は０．０５〜０．２０△Ａ３３０／分の
範囲内でＭ　ｎ　Ｐ　９度に比例して線型である。この
範囲外の割合を生ずる酵素サンプルは活性の算出に用い
ない。この代りに、測定割合が前記線型範囲内に入るよ
うに、キュベツトあたりの試験サンプル量を減少または
増加させる。
１種類以上のＬｉＰ酵素と１種類以上のＭｎＰ酵素を含
む酵素製剤を用いる場合には、酵素製剤は反応混合物中
に上記濃度で存在すべきである。
本発明の最も好ましき態様においては過酸化水素の濃度
はリグニン分解酵素を用いた培養の間を通じて反応混合
物中に低安定状態の濃度で保持される。この過酸化水素
の濃度は０．００１ないし０．５１１ｍＭに保持される
べきである。好ましくは、過酸化水素濃度は０．００５
ないし０．ｌａ＋Ｍで保持される。過酸化水素濃度は例
えばグルコースに対するグルコース・オキシダーゼの作
用によるその場での酵素発生によって、好ましいレベル
に便利に維持することができる。従って、反応混合物へ
のグルコース・オキシダーゼ０．００１＝　１０．ＯＵ
／ｍｌとグルコース０、Ｏ１〜２０．０ｍＭとの添加、
典型的にはグルコース・オキシダーゼ１．ＯＵ／ｍｌと
０．１〜ｌＯ，Ｏｄグルコースの添加を利用することが
できる。または、連続計量添加によって過酸化水素を供
給することができる。計量添加は、大規模な脱リグニン
反応において過酸化水素濃度を維持する好ましい方法で
ある。
過酸化水素濃度は定期的・な添加によっても大体維持す
ることができる。
ｐＨ値は脱リグニン反応を通して２〜８に、好ましくは
約３〜５の範囲内に維持するべきである。
ｐＨは、ケモスタツティング（ｃｈｃｍｏｓｔａｔ　１
ｎｇ）によって・・・・・・適当量の酸または塩基の計
量添加または定期的添加によって維持することができる
。ケモスタッティングは大規模反応におけるｐＨ維持の
好ましい方法である。または、反応混合物に緩衝波を用
いることによってｐＨを維持することができる。
好ましいｐ＋＋で有効である好都合な緩衝液を用いるこ
とができる。好ましいｐ）Ｉ範囲における適当な緩衝液
の例は、酢酸塩、ジメチル・コハク酸塩、酒石酸塩およ
びトランス−アコニット酸である。緩衝液は通常、反応
混合物に約５〜５０＋＋＋Ｈの濃度で、好ましくは１５
〜２５ｎ＋Ｈの濃度において加えられる。
リグニン分解反応混合物への非イオン洗剤または両性イ
オン洗剤の添加が好ましい。最も一般的には、非イオン
洗剤が用いられる。適当な非イオン洗剤の例には、オク
チル・グルコシド、ポリオキシエチレン・グリコールお
よびトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）系列とトウィーン（Ｔ
ｖｅｅｎ）系列の洗剤からの化合物がある。トウピーン
８０が特に好ましい。洗剤は０．００１−０．１ＸＶ／
Ｖ、好ましくは０．０１〜０．０５％Ｖ／Ｖの濃度で加
えられる。
用いられるリグニン分解酵素製剤がＭ　ｎ　Ｐを含んで
いる場合には、反応混合物中にＭｎ（ＩＩ）が必要であ
る。用いられるリグニン分解酵素製剤が少なくとも１種
類のＬｉＰを含み、Ｍ　ｎ　Ｐを含まない場合には、Ｍ
ｎ（ＩＩ）の添加は必須ではない。
Ｍｎ　（ＩＩ）は例えば硫酸マンガンまたは酢酸マンガ
ンのような塩として便利に添加される。通常は硫酸マン
ガンとして添加される。添加される場合、Ｍｎ　（ＩＩ
）は０．０５〜１．ｏｍＭ、好ましくは０．１０〜０．
５０ｍＭの濃度で反応混合°物中に存在しなければなら
ない。標準的にはＭｎ　（ＩＩ　）は硫酸マンガンとし
て添加される。添加されるとき、Ｍｎ　（ｎ　）は０．
０５ないし１．ＯｍＭの濃度で反応混合物中に存在すべ
きである。好ましくはＭｎ（ｎ）の濃度は０６１０ない
しく１．５０１１Ｍである。
Ｍｎ（■）を反応混合物に加える場合には、少なくとも
１種類のα−ヒドロキシ酸を同様に加えることが好まし
い。適当なα−ヒドロキシ酸にはリンゴ酸塩、酒石酸塩
、クエン酸塩、乳酸塩、フェニル−乳酸塩、グリコール
酸塩、２−ヒドロキシブチレートおよびそれらの塩があ
る。乳酸塩の使用が好ましい。α−ヒドロキシ酸は反応
混合物中に０．５〜２０．ｈＭ、好ましくは１．０〜Ｉ
Ｏ，ＯＩｍＭの濃度で存在しなければならない。
用いられるリグニン分解酵素製剤が少なくとも１種類の
ＬｉＰ酵素を含み、ＭｎＰ酵素を含まない場合には、リ
グニン分解酵素の基質として用いられうる置換芳香族ア
ルコール０．００５〜０．８０ＩＩＩＮを反応混合物に
加えることが好ましい。ベラトリル・アルコールを加え
ることが最も好ましい。使用されるリグニン分解酵素製
剤がＬｉＰ酵素とＭｎＰ酵索より成るときは、反応混合
物にリグニン分解酵素（例えばベラトリルアルコール）
の基体となり得る置換芳香族アルコールの０．００５な
いし０．６０ｍＭを添加することが出来る。もし使用さ
れるリグニン分解酵素製剤がＭｎＰ酵素より成りいかな
るＬｉＰ酵素も含有しないならば、リグニン分解酵素（
例えばベラトリル・アルコール）の基体となり得る置換
芳香族アルコールを反応混合物に添加しないことが好ま
しい。
リグニン分解酵素を用いた酵素脱リグニンには酸素が必
要である。リグニン分解酵素を加える前に、反応混合物
を酸素で飽和することが好ましい。
典型的には、全ての反応成分を加えた後に、反応容器を
短時間酸素でフラッシュし、次に密封して酸素を多く含
む雰囲気を形成する。
リグニン分解反応混合物を１５〜５５℃において０．２
５　〜１８時間インキュベートし、好ましくは４０〜５
０℃において２〜８時間脱リグニン反応すべきである。
最も好ましくは脱リグニン反応を４５℃において実施す
る。
脱リグニン反応中に反応混合物成分の混合を行うことが
好ましい。脱リグニン反応の規模に適した混合方法を使
用することが出来る。しかし酵素を泡立てかつ不自然に
するような激しい混合は避けるべきである。
キシラナーゼ処理工程 キシラナーゼ処理工程は、内容物を混合し、温度制御す
るための設備をとりつけた所望の大きさの容器中で行わ
れる。反応成分の添加順序は厳密ではないが、キシラナ
ーゼを最後に添加することが好ましい。基本的な反応混
合物は、脱リグニンされるリグノセルロース材料と活性
なキシラナーゼ製剤より成り、これらは適当、なｐＨで
保持された水溶液中にある。
脱リグニンされるリグノセルロース材料がウッドバルブ
であるときは、それは反応混合物中に０．１ないし１５
％、好ましくは２ないし　１０％のコンシスチンシーで
存在すべきである。
前記キシラナーゼ製剤は反応混合物中にバルブの乾Ｅｇ
あたり　０，１ないし　２００単位のキシラナーゼ活性
度の比で存在する。好ましくはキシラナーゼ製剤はバル
ブの乾ｍｇあたり　０．１ないし５０．最も好ましくは
１ないし２５、単位のキシラナーゼ活性度をもって存在
する。
キシラナーゼ活性度の１単位とは、標準反応状態の下で
２５℃において１分あたり　１マイクロモルのキジロー
ズ（ｘｙｌｏｓｅ）をキシラン（ｘｙｌａｎ）より製造
する酵素の量をいう。キシラナーゼによってキシランが
裂開すると糖の部分が減少する。ついでこれをジニトロ
サルチル酸（ｄｌｎＨｒｏｓａｌｉｃｙ口ｅ　Ｈｅ１ｄ
）　（”ＤＮＳＡ”）と試験溶液中で反応させると色調
が変化しこれは５４０ｎＭで測定される。
５４０ｎＨの吸光度対キジローズ濃度（μモル／ｍｌ）
の標準曲線は、ｐＨ５、０の５０ｍＭ酢酸ナトリウム液
中の　１０ｈＭキジローズ（Ｍａｌｚ　ａｎｄ　Ｂａｕ
ｅｒ、　Ｉｎｃ、）の数ケの希釈液を使って作成した。
この標準曲線によれば１マイクロモルのキジローズの５
４０ｎＨの吸光度は標準反応条件下で約０．０１２６で
あった。この定数は分析に供した試料溶液（例えば培養
の上澄液）のキシラナーゼ活性度の計算に使用された。
試料溶液の分析結果は５４０ｎＨの吸光度で約０．２ま
で直線的であった。それ以上の吸光度をもつ試料溶液は
その吸光度がこの直線範囲内に入るように希釈された。
分析された各試料溶液（例えば培養上澄液）に対し、同
量の試料溶液（例えば培養上澄液）にｐＨ５，０の５０
５Ｍ酢酸ナトリウムを加え全量を１ｍｌとした“対照溶
液を調製した。
各試験管にｐＨ５，０の５［１ｍＭ酢酸ナトリウム中で
１％のカラマツ（ｌａｒｃｈ）材のキシラン（ＳｉｇＩ
ｌａ　Ｃｈｅｓ＋１−ｃａｌ　Ｃｏ、　＄Ｘ３８７５）
　　溶液（０，５ｍ１）を添加した。ついでｐＨ５，０
の５０ｍＭ酢酸ナトリウムの十分な量を試験管に加え、
試料溶液（例えば培養上澄液）とキシラン溶成を加えた
のち、１ｍｌの最終的分析量とした。同様に５０ｍｆの
酢酸ナトリウムの十分な量を対照溶液に加え、試料溶液
（例えば培養上澄液）を添加したのち、１ｍｌの最終的
分析量とした。ついで試料溶液の所望量（最大０．５ｍ
１）を各試験管と対照溶液の管に加えた。これらの内容
物をゆるやかに混合し５０℃で３０分間培養した。培養
後蒸溜水中の１％ＤＮＳ＾（１ｍｌ）を容管に添加しこ
の管を室温で５分間培養した。ついで容管に５Ｎ　Ｎａ
０Ｈ（０，２ｍｌ　）を（色調を高めるために）添加し
、容管を室温で３０分培養した。各試料溶液の５４０ｎ
ｍ吸光度は、対照溶液に対応する試料をブランクとして
０とした分光光度計を用いて測定した。
リグノセルロース材料をキシラナーゼで培養するあいだ
そのｐＨはずっと　４ないし８に保たれねばならない。
約５ないし　７のｐＨが好ましい。リグニン分解酵素を
用いる処理について上に述べたようにそのｐＨはＣｈｅ
＋ｇｏｓｔａｔｉｎｇ　（生化学的恒常）によって保持
することが出来る。この方法は大規模な培養中にｐＨを
保持するのに好ましい方法である。代りにｐＨは反応混
合物中に緩衝液を使うことによっても維持できる。所望
のｐＨに有効な緩衝液ならいづれのものでも利用できる
。好ましいｐＨ範囲に適した緩衝液として酢酸、酒石酸
、リン酸などがある。緩衝液は普通、０．ｌないし１０
０５Ｍ　、好ましくは４０ないし６０ｍＭ、の濃度で反
応混合物に添加される。
キシラナーゼ反応混合物は２０ないし７０℃、好ましく
は４０ないし６５℃、で培養されるべきである。
１１時間は０．２５ないし１８時間、好ましくは０，５
ないし６時間で最も好ましいのは１ないし４時間である
。
培養液中に反応生成物を混合するためにキシラナーゼ製
剤を与えることは望ましいことである。
培養の規模に適した混合法であればいづれでも使用出来
る。しかし酵素を泡立たさせたり不自然にするような激
しい混合法は避けねばならない。
酵素処理工程後の抽出工程 本発明の第一の態様による　一段″酵素脱リグニン法は
リグノセルロース材料を上に述べたリグニン分解酵素製
剤で処理する単一の工程のみで成立−っている。同様に
本発明の第二の態様による二段法はリグノセルロース材
料をリグニン分解酵素製剤で処理してリグノセルロース
材料を遊離させ、ついでキシラナーゼ製剤を用いてそれ
を処理する工程（酵素処理工程の順序は保留する）のみ
で成り立つ。しかしこれらの方法の各工程は酵素脱リグ
ニン工程のあとに、リグノセルロース材料を抽出する工
程をさらに構成することが好ましい。
本発明の好ましい態様では、リグノセルロース材料に対
して各々の酵素脱リグニン工程後にアルカリ抽出工程を
実施する。このアルカリ土類金属は反応混合物へのアル
カリ性溶液の添加、次のリグノセルロース材料の０．１
−１０％粘稠度における２５〜ｌＯＯ℃での２時間まで
の任意のインキュベーションをも含む。インキュベート
は０．３〜１．０％のパルプ粘稠度において７０℃で約
１時間実施することが好ましい。インキュベーション後
に、通常、混合物を濾過してアルカリ性溶液からリグノ
セルロース材料を分離する。水酸化ナトリウムまたは水
酸化カリウムを含んでいるようなアルカリ性溶液は適当
である。このアルカリは抽出工程の間、パルプの乾ｆｆ
１１００ｇあたり　ｌないし５ｇのアルカリの比で存在
すべきである。軟水パルプのアルカリ抽出時にはアルカ
リはパルプ乾量１００　ｇあたり４ｇアルカリの比で存
在し、硬水パルプのアルカリ抽出時にはパルプの乾量１
００　ｇあたり　２ｇアルカリの比で存在することが好
ましい。
反応混合物中の酵素の再使用が望まれるときはアルカリ
抽出の前に酵素を分離せねばならない。
リグノセルロース材料から酵素を分離する適当な方法は
真空濾過、沈澱および沈降である。通常この分離は濾過
を伴う。酵素が濾過された後リグノセルロース材料にア
ルカリ溶液が添加されて、アルカリ抽出工程は上述の如
く行なわれる。
リグノセルロース材料はアルカリ抽出工程のあと水で洗
浄される。この水洗工程では、リグノセルロース材料を
水中に０、ｌないし１０％のコンシスチンシーで分散し
ついで濾過する。好ましくはこの水洗を１ないし３回く
りかえすべきである。ときにはアルカリ抽出工程なしで
酵素脱リグニン工程のあとすぐに水洗がおこなわれる。
酵素処理されたリグノセルロース材料を酸性抽出工程に
導くとより大きな脱リグニン化が得られる。酸性抽出は
、特にＭｎ（ＩＩ）の存在の下でリグニン分解酵素処理
をされたクラフトパルプの光沢化を劇的に向上させるこ
とが知られている。しかし、酸性抽出は、そのもたらす
利益がしばしばその経費をこえるために行われない傾向
にある。
酸性抽出はアルカリ抽出工程のあと直ちに行なうことが
出来る。代りに、もしリグノセルロース材料がアルカリ
抽出工程の後水洗されるかまたはアルカリ抽出工程の代
りに水洗されるときは、酸性抽出工程はその水洗工程の
あとで行われる。酸性抽出を行なうにはリグノセルロー
ス材料を回収し希酸中で懸濁させ、１０〜１００℃にお
いて０．１ないし１０分間培養する。好ましくはリグノ
セルロース材料は濾過によって回収し希酸中で懸濁させ
、２５℃で約０．１分培養する。希酸溶液は０．０５な
いし０．５ｈＭの酸より成ることが好ましい。適当な酸
には酢酸、コハク酸、乳酸、亜流酸および他の弱鉱酸が
ある。酢酸が好ましい。酸性抽出工程は、リグノセルロ
ース材料の乾ｆｆｉ　Ｉｇあたり約０．１５ないし　２
．５Ｄの希酸を使って行われる。
多段法 本発明の好ましき態様のひとつでは、リグノセルロース
材料は多段工程の酵素脱リグニン法で処理される。本発
明の第一の態様では、多段工程の各工程はリグノセルロ
ース材料をリグニン分解酵素製剤を使って処理すること
より成る。本発明の第二の態様では、多段工程のすくな
くとも一工程はリグノセルロース材料をキシラナーゼ製
剤を使っで処理することより成りまた多段工程のすくな
くとも、もう−工程はリグノセルロース材料をリグニン
分解酵素製剤で処理することより成る。
本発明の好ましき態様として、酵素脱リグニンの各工程
はさらに上述せるアルカリ抽出工程を含む。アルカリ抽
出工程が組込まれているならば、最終工程より前にさら
に上述せる水洗工程が含まれる。
最終工程はさらに上述せる酸抽出工程を含む。
本発明の第一の態様による多段工程法は一段工程法に比
べて同量のリグノセルロース材料に対して同じ総単位の
リグニン分解製剤を加えた場合に、リグノセルロース材
料をより大規模に脱リグニンする。この第一の態様によ
る二段工程法または三段工程法の各工程は、同じ脱リグ
ニン度を達成するために先行工程より少ない単位のリグ
ニン分解活性度を要することは明らかである。従って、
当業者は第一の態様による多段工程法の工程間に、リグ
ニン分解酵素製剤を分配するであろう。これらの考え方
はリグニン分解酵素処理工程をひとつ以上もつ本発明の
第二の態様による方法にも適用される。
本発明の第二の態様は上述せる如き一段または多段のキ
シラナーゼ処理（”Ｘ”）工程と一段または多段のリグ
ニン分解酵素処理（“Ｌ”）工程より成るリグノセルロ
ース材料の脱リグニン法を包含する。
ＬまたはＸ工程の絶対的な段数は（少なくとも各々一段
さえあれば）厳密ではない。しかし現在ではＸ工程の一
段以上より成る方法は、付加されているＸ工程でリグニ
ン含有量が有意な程威少しないことから、正当な方法と
はみられていない。それ数本発明の第二の態様による方
法ではＸ工程法は一段であることが好ましい。さらにＸ
工程と１４工程の順序はどんな順でもよいが、工程の初
段階に一段またはそれ以上の（ｓｔａｇｅ（ｓ））　Ｘ
工程を配置することが好ましい。例えばＬ／Ｘの配列よ
りＸ／Ｌの配列の方が一般に好ましい。同様にＸ／Ｌ／
ＬとＬ／Ｘ／Ｌの配列は一般にＬ／Ｌ／Ｘの配列より好
まれる。
しかし配列の順序は処理されるパルプのリグニン含有量
や光沢に及ぼす影響は比較的小さい。Ｌ工程の絶対的な
段数の方がはるかに大きな影響をもっている。
一般に、本発明の第一または第２の態様による方法にお
いて、リグニン分解酵素処理段階の数が多い程リグノセ
ルロース材料が脱リグニンされる程度は大きい。好まし
き段数は当業者によって、峙間、経費および現行の漂白
工場設備の適合度を考慮して選ばれよう。例えば本発明
の第一の態様による一段、二段又は三段工程の酵素脱リ
グニン法あるいは本発明の第二の態様による二段または
三段工程の方法（一段キシラナーゼ処理工程より成る）
は、もし酵素脱リグニン法が現行の漂白工程と結合され
て完全な漂白物が作られるならば、いづれかの態様であ
れ五段法が好ましい。このような場合には酵素による漂
白工程の段数は全漂白工程の経済を最適にするものが選
ばれよう。
本発明は、本発明の第一の実施態様に係る１つ以上の酵
素脱リグニン段階または第二の実施態様に係る２以上の
段階が１つの要素にすぎないような多段階漂白方法をも
意図する。１つ以上の従来の漂白段階に酵素脱リグニン
段階を連続的に組合せることが考えられる。そのような
多段階漂白プロセスにおいては、従来の漂白段階の直前
の酵素脱リグニン段階は洗浄または抽出ステップを好適
に含まないであろう。効果的かつ補助的な従来の漂白工
程の例は二酸化塩素、塩素、次亜塩素酸塩、酸素、オゾ
ン、過酸化水素、他の弱酸化剤および電気還元仕漂白を
用いた段階である。この態様では付加的な塩素に基づく
漂白段階を用いるとしても、漂白プラント流出液中の塩
素化有機物の総量は１つ以上の酵素脱リグニン段階を含
めることによって有意に減少する。
本発明がさらに完全に理解されるために、本発明の方法
の次の例を以下に述べる。これらの例は説明のためのみ
であり、本発明がここでの詳述によって限定されるとは
みなすべきではない。
実施例１ 非分画（ｕｎｆ　ｒａｃｔ　１ｏｎａｔｅｄ）リグニン
分解酵素濃縮物の調製 リグニン分解酵素濃縮物を２種類の菌株、ファネロケー
テ・クリソスポリウムＶ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７６７（
ＡＴＴＣ２４７２５）と５Ｃ２Ｂ　（Ｎ　ＲＲＬ　　１
５９７８）から調製した。
培養菌株ＶＫＭ−Ｆ−１７６７は胞子接種物から発生し
た。接種に適する胞子は次のように調製した：（１）微
量元素（Ｔｒａｃｅ　Ｅｌｅｍｅｎｔ）溶液の１１５０
０希釈液、バイオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）溶酸のｌ／１０
０希釈液を用い、クロロホルムを用いず、さらに２％ｗ
ｌｖモルトエキスおよび３Ｘ　Ｗ／Ｖ酵母エキスを補充
して調製した胞子誘導培地［ボーゲル（Ｖｏｇｅｌ）、
「菌類へのりシン経路の分布二進化との関係（Ｄｉｓｔ
ｒｉｂｕｔｌｏｎｏｒＬｙｓｌｎｅ　Ｐａｔｈｗａｙｓ
　Ａｍｏｎｇ　Ｆｕｎｇｉ　　：　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ
ａｒｙ　ｌｌ１ｐｌｉｃａｔ１ｏｎｓ−）Ｊアム、ナト
（Ａａ＋、Ｎａｔ、）　ＸＣＶ　ｍ（９０３）、　　４
５３〜４６頁（１９１ｉ４）に述べられている「培地Ｎ
Ｊ］を含むプレートの寒天上に２４℃において１４〜２
６日間、培養物を増殖させる；（２）（プレートの大き
く膨らんだ外観から明らかであるように胞子が充分に発
達した後に、各１１００Ｘ１５＋＊プレートの寒天表面
を無菌水約３〜ＬＯｍｌで洗浄して、胞子を遊離させる
；および（３）胞子を含む洗浄水を無菌グラスウール充
填無菌ロートに通して、汚染菌糸を除去する。次に、生
成した胞子懸濁液の６５０ｒｖにおける吸光度を測定し
た、６５０ｎＩＩにおける吸光度１は５　Ｘ　１０６胞
子／　ｍｌに大体等しい。これらの胞子製剤は使用する
まで４℃において貯蔵した。
Ｖ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７８７培養物を発生させるため
に、増殖培地Ａに胞子懸濁液を少なくとも０．５Ｘ　１
０’胞子／　ｍｌ　、通常は２．５Ｘ　１０’胞子／　
ｍｌ、の最終濃度に達するまで接種した。増殖培地Ａは
キーク（Ｋｉｒｋ）等の「ファネロケーテ・クリソスポ
リウムによるリグニン代謝に対する培養パラメーターの
影響（Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ’　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　
Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　Ｏｎ　Ｌｉｇｎｉｎ　Ｍｅｔａ
ｂｏｌｉｓｍ　Ｂｙ　Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃ
ｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｓ）Ｊアーク、ミクロパイオル
、　（Ａｒｃｈ、旧ｃｒｏｂ１ｏ１　。
）１１７巻、２７７〜８５頁（１９７８）に述べられて
いる培地に、７倍の高濃度の「無機物」を加え、下記の
試薬を指示した濃度で補充したものである：１ｍＭ酒石
酸アンモニウム；０．１％■ｌｖトウイーン８０；１．
８μＭ硫酸マンガン；　２ｈＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４
，５）　　；６ｉＭベンジル・アルコール；および２％
Ｖ／Ｖグルコース（炭素源として）。
菌株５Ｃ２Ｂは、増殖培地Ａｌ０ｍ１への寒天プレート
からの菌糸の直接転移によって調製した出発培養物から
発生した。この代りに、無菌のワーリング・ブレンダー
（Ｗａｒｉｎｇ　ｂｌｅｎｄｅｒ）内で既存の菌培養物
を混和することによっても出発培養物を調製した。これ
らの出発培養物を使用前に少なくとも３日間、３７℃１
こおいてインキュベートした。
５Ｃ２Ｂ培養物を発生させるために、増殖培地Ａに出発
培養物１容ｆｆｉ％、通常はｌＯ容量％を接種した。
両菌株は２ｇ無菌容器（エルレンマイヤー・フラスコま
たはローラー・ボトルのいずれか）内において０．１〜
ｔ、ｏｐ量で決まりきった方法で培養した。接種後に、
培養物を酸素でパージし、５０ｒｐｏ＋の回転振とう器
（エルレンマイヤー・フラスコの場合）または４０ｒｐ
ｍのローラーボトル・インキュベーターにおいて、３７
℃でインキュベートした。接種直後に混合を開始した。
接種後４日月から、培養物の細胞外培地をＶ、ＡＯ活性
に関して監視した（上述の、発明の詳細な説明参照）。
少なくとも約０　、０５　Ｕ　／　ｍｌのＶＡＯＡ性が
検出された時に、培養培地を回収し、増殖培地Ｂに取り
替えた。増殖培地・Ｂは増殖培地Ａの低炭素変形であり
、３．６１１■Ｍ酒石酸アンモニウムと０、ＢＷ／Ｖグ
ルコースとを含む点で、増殖培地Ａとは異なる。個々の
培養物が１５日間以内に好ましいレベルの酵素活性に達
しなかった場合には、酵素活性を高めるための試みにお
いて前記培地を増殖培地Ｂに替えた。
細胞外培養培地が望ましいレベルのＶＡＯＡ性に達した
場合には、培養物をグラス・ウール含有ロートに注入す
ることによって、それを採取した（このようにして菌類
菌糸体を除去す・る）。次にこの活性培地から、Ｐ旧０
透析膜を備えたアミコン・モデル（Ａｍｉｃｏｎ　Ｍｏ
ｄｅｌ）　　８４００限外濾過セルを用いる加圧透析に
よって、リグニン分解酵素濃縮物を調製した。限外濾過
は窒素２０ｐｓｉ下で、活性培地を攪拌しながら実施し
た。培地量がその最初の量の約５〜１０％に減少した時
に、濃縮物を取出した。この濃縮物は使用するまで一７
０℃に貯蔵した。
この濃縮リグニン分解酵素製剤は典型的に０．１〜１、
ＯＵ／ｍｌのＶＡＯ活性゛を有した。
実施例２ ＰＲＯ活性を有するがＶＡＯＡ性は実質的に有さない５
Ｃ２６酵素濃縮物分画による北洋産（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
）硬水クラフト・パルプの脱リグニンと増白この実験に
おいては、ファネロケーテ・クリソスポリウム菌株５Ｃ
ＺＢの非分画酵素濃縮物を、陰イオン交換クロマトグラ
フィーによって分画化した。
コノ分画をＶＡＯＡ性とＡＢＴＳＢ化（ＡＢＴＳＯ）活
性（ＡＢＴＳはＬｉＰ酵素に対して非常に耐性であるペ
ルオキシダーゼ基質である）に関して検定した。分画の
２６０ｎｍと４０７■における吸光度も測定した。酵素
活性に基づいて分画を選択し、３種類のプールを形成す
るように組合せた。ブールＩを形成するように組合せた
分画はＡＢＴＳＯＢ性によって特性づけられるが、検出
可能なＶＡＯＡ性は示さなかった。プール■を形成する
ように組合せた分画はＶＡＯＡ性によって特性づけられ
るが、ＡＢＴＳＯＢ性は実質的に含まなかった。
プール■を形成するように組合せた分画は両タイプの活
性を示した。次に３種類のプールをそれらのＶＡＯ，Ｐ
ＲＯおよびＡＢＴＳＯＢ性に関して、および２６０ｎｍ
と　４０７■における吸光度に関して検定した。最後に
、これらのプールの硬水クラフトパルプを脱リグニンし
、増白する能力を検定した。
７１１１＋定可能なＶＡＯＡ性を全く含まず、従って活
性なＬｉＰ酵素を含まないと考えられるブールＩがバル
ブ増白に関して非常に効果であるという意外な結果が得
られた。全ての工程は他に指示しないかぎり、室温にお
いて実施した。
５Ｃ２６酵素濃縮物の分画化 非分画酵素濃縮物をファネロケーテ・クリソスポリウム
菌株５Ｃ２Ｂから、実施例１で述べたように調製した、
但しこの場合にはグルコースの代りに０．２％Ｗ／Ｖグ
リセロールを用いるように増殖培地Ｂを変更した。全体
で１．３１の培養物上清（３培養物からプールしたもの
）を実施例１に述べたような加圧透析によって濃縮した
。
二重蒸留水で予め平衡させた、アンバーライト（Ａｍｂ
ｅｒｌｉｔｃ）　ＸＡＤ−２樹脂［マリンクロッツ社（
Ｍａｌｌｌｎｃｋｒｏｄｔ　Ｉｎｃ、）ケンタラキー州
パリス、＃　３４０９コ充填１．５Ｘ６ｃｍカラムに通
して、５Ｃ２Ｂ酵素濃縮物を処理した。次に、このＸＡ
Ｄ−２カラムを二重蒸留水で洗浄し、この溶出液を流過
液（ｒＩｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）と共にプールした。組合
せたＸＡＤ−２プールは６５　ｍｌ量を有した。これを
さらに次のように特性化した：Ａ２．０−２．５；　Ａ
４０７−０．５；　ＶＡ　Ｏ活性−０，８１Ｕ／　ｍｌ
　；およびＡＢＴＳＯＢ性−９，ＯＵ／ｍｌ。
全ＸＡＤ−２プールを二重蒸留水で予め平衡させた６Ｘ
ｌＯｃｍＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）　
［ファーマシア　ファイン　ケミカルス（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ　Ｐｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、スウェーデ
ン、アブセラ］カラムに装入した。装入した後に、カラ
ムを二重蒸留水ｌ　ＯＯｍｌで洗浄した。次にカラムを
約１００〜２００　ｍｌ／時の流量において５ｒａＭ酒
石酸ナトリウム中０．１〜０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐ
Ｈ４，８）直線勾配７７０　ｍｌで溶出した。分画く３
００滴／分画）を勾配の開始時から回収した。
カラム分画の選択 他の全ての分画をＶＡＯとＡＢＴＳＯＢ性、ならびに２
６０ｎｍ・における吸光度に関して検査した。
上記発明の詳細な説明に述べられているようにＶＡＯＡ
定は実施され、ＡＢＴＳＯＢ定は以下の記述のようにし
て実施される。
ＡＢＴＳＯ活性１単位は、標準検定条件下２５℃におい
て、４１５■での検定溶酸の吸光度（１吸光度単位／分
）を変化させるような酵素量として定義した。ＡＢＴＳ
ＯＢ定には３種類の試薬を用いた。試薬ＡはＡＢＴＳ　
（ベーリンゲル　マンハイム、西ドイツ、＃１０２９４
６）　　０．０４５に／Ｎ　、　８０％乳酸ナトリウム
！Ｏｍｌ／ｆｆ、ウシ血清アルブミンまたはゼラチン３
．４ｇ／ＩＩを５ｈＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ４，５
）力、１ら戊る。試薬Ｂは５０ａＭコハク酸ナトリウ　
　ム　　（９１１４、５＞　　　　中　　の　　ｌ０ｍ
Ｍ　　硫酸マグネシウムであった。試薬Ｃは５０ｍＭコ
ハク酸ナトリウム（ｐＨ４，５）中に０．０１７１％過
酸化水素を含んだ（毎日新たに調製）。ＡＢＴＳＯＢ定
を実施するために、以下のステップが実施される。（ａ
）試薬Ａ９００μｇを石英キュベツトに加え；（ｂ）試
験サンプル１００μＤを加え；（Ｃ）試薬ＢＩＯμｇを
加え；（ｄ）キュベツトの中味をケーブル・タイを用い
て直ちに混合した；（ｅ〉分光測定計はこのキュベツト
では４１５ｒ＋ｎ＋にお、いてブランクであった；（ｒ
）試薬ＣＩＯμＤを加えた；（ｇ）キュベツトの中味を
ケーブル・タイによって直ちに混合し；（ｇ）４１５ｎ
ａ＋における吸光度を２５℃において３０秒間測定した
。試験サンプル１ミリリツトルあたりのＡＢＴＳＯＢ性
単位（ＩＪ／ｍｌ）を次式を用いて算出した：（ΔＡ／
分）（検定した試験サンプル量（ｍり）−’ ＡＢＴＳＯＢ性の広巾の複合ピークは大体分画１８〜６
０に及ぶものであった。大体分画３５〜５０．７０〜８
０および８０〜９２に及ぶ、３つの分離したＶＡＯＡ性
ピークが存在した。カラム分画を選択し、組合せて３種
類の溶出液プールを形成し、使用するまで一７０℃にお
いて保存した。これらのプールをＶＡＯＳＡＢＴＳＯお
よびＰＲＯ活性に関してならびに２６０ｒｖと４０７ｎ
ｍにおける吸光度に関して検定した。プールを形成する
ように組合せたカラム分画ならびにこれらのプールの特
性を第１表に記載する。
第 表 プール　　　Ｉ　　　　　ｎ　　　　　ＩＩ分　　画　
　　　　１８−３４　　　　３６−４８　　７２−７７
＆８２−８９ＡＢＴＳＯ活性　３．７　　　２．４　　
　０．０５（Ｕ／ｍ１） ＰＲＯ活性　　２．９　　　０．２　　　０．０３（Ｕ
／ｍ１） ＶＡＯＡ性”　０．００＋０．０００．ＩＩ３　＋０．
０２０．４２　＋Ｏ，ｌ０（Ｕ／ｍ１） Ａ２ｓｏ　　　、　　　　０．４３　　　　　０．１５
　　　　　０．２０Ａ　４０７．　　　　　　０．０４
　　　　　０．０５　　　　　０．１１”　ＶＡＯＡ性
値は独立した２回の測定の平均値である；標準偏差を示
す。プール１はいずれの；３ＰＪ定においてもＶＡＯＡ
性を示さなかった。
パルプの調製 北洋産硬水クラフト・パルプｍ　ｆｆｉ　３０　ｇを二
重蒸留水２ｐ中に懸濁させ、ワーリング・ブレンダー（
高速）で１５秒間旋回した。パルプを真空濾過によって
回収し、５ａ＋ＭＥＤＴＡ１ρ中に再懸濁させ、再び真
空濾過によって回収した。次に、パルプを０．１７Ｎ酢
酸ＩＮ中に再懸濁させ、真空濾過によって回収した。最
後に、パルプを二重蒸留水２Ｄ中に再懸濁させ、真空濾
過によって回収し、使用するまで４℃に保存した。この
湿った「洗浄パルプ」は２４１％の粘稠度（バルブ乾ｆ
ｊｈ　Ｏ，２４ｇ　／洗浄バルブ湿量ｇ）を有した。
酵素反応：実験Ａ 次の反応成分を含むマスター・ミックスを調製した二二
重蒸留水１７５ｍ１　；　　０．２Ｍ酢酸ナトリウム（
＋）Ｈ５，０）　２０ｍ１　；　１０％Ｖ／Ｖ）ウィー
ン８００．５ｍｌ　　；２．０Ｍ乳酸塩１．０ｍｌ　；
　　０．３Ｍグルコース１．０ｍｌ；０．１Ｍ硫酸マン
ガン０．２ｍｌ　；　　Ｏ，１Ｍベラトリル・アルコー
ル０．８ｍｌおよびＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ（２ｍｇ　／　ｍｌ
　）　　０．５ｍ１０酸素をこのマスター・ミックスに
通して３分間バブルさせた。次に反応ミックスを１０個
の５０ｍ１−コニカル・ボトム・ポリプロピレン遠心管
に一様に分配しく管あたり〜２０ｍ１）、洗浄パルプ湿
量０．５ｇ　（乾ｆｆ１０，１２ｇ）を容管に加えた。
次に酵素濃縮物分画を次のように加えた： 反応　　酵素プール　　量（ｍｌ　） ０ ２　　　　　１　　　　　　１ ３　　　　１　　　　　２ ４　　　　　１　　　　　　４ ５　　　　　　Ｉ　　　　　　１０ Ｉ２０ ７　　　　　　ｎ　　　　　　　２ ８　　　　　　ＩＩ　　　　　　　５ ９　　　　　　ｍ　　　　　　２ １０■５ 最後に、グルコース・オキシダーゼ［シグマ・ケミカル
社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｆｆｉｉｃａｌ　Ｃｏ、）、＃
Ｇ　６５００１．ＯＵ／μＤ］２０μｇを容管に加えた
。グルコース・オキシダーゼを加えた後、容管を短時間
、酸素でフラッシュし、栓をして、６０ｒｐｍにセット
された回転シェーカーに水平に付けて、３７℃において
１８時間インキュベートした。
インキュベートした後に、０．５Ｎ水酸化ナトリウムを
容管に、約５０ｍ１の最終量に達するように加えた。容
管の中味をホワットマン（Ｗｈａｔｉａｎ）　３　Ｍフ
ィルター付きの各焼結ガラス・フィルター・ロートに加
えた。次に空になった反応管をそれぞれ０．５Ｎ水酸化
ナトリウム約３０ｍ１で洗浄し、これらの洗液を適当な
フィルター・ロートに加えた。各フィルター・ロート内
のパルプを真空濾過によって回収した。二重蒸留水約２
５０　ｍｌを各フィルター・ロートに攪拌しながら加え
、バルブを回収した。
次に０．１７Ｎ酢酸約２５０ｍ１を各フィルター・ロー
トに攪拌しながら加え、パルプを再び回収した。白色度
（ｂｒｌｇｈｔｎｅｓｓ）をｍｌ定する前にバルブを３
時間風乾させ、テクニダイン・コーポレーション　モデ
ルＳ４ブライテイメーター（Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ　Ｃ
ｏｒｐｏｒａｌｉｏｎ　Ｍｏｄｅｌ　Ｓ４　Ｂｒｉｇｈ
ｔｌＩＩｌｅｔｅｒ）を用いて白色度（Ｇ、Ｅ、％）を
測定した。これらの反応の結果は第２表に要約する。
第２表 反応 ＶＡＯＡ性度　　ＰＲＯ活性度 （Ｕ／ｉｔ）　　（Ｕ／ｇ　　”　　（υ／ｍｌン　Ｃ
Ｕ／ｇ　　”紐υ）　　　　　　把υ） 白色度 （Ｘ　Ｇ、Ｅ、） ０．０ ０．０ ０．０ ０、Ｏ Ｏ，０ ０，０ ０，０１５ ０，０３２ ０，０３８ ０，０８４ ０，０ ０，０ ０，０ ０，０ ０，０ ０，０ ２，７ ６、７ ７、Ｏ １７，５ ０，０ Ｏ１１４ ０，２６ ０，４Ｂ ０．９７ １．４５ ０．０２ ０．０４ ０．００３ ｏ、ｏｏｅ ０．０ ２４．２ ４８．３ ９６．６ ２［Ｌ７ ４ｇ３．３ ３．３ ８．３ ０．５ １．３ ３９．２ ４４．０ ４７．８ ５０．５ ５３．２ ５３．４ ４６．０ ４６．３ ５２．２ ５２．７ ＊反応混合物中の乾量パルプ１ｇの単位酔素反応：実験
Ｂ ネジ込みキヤツジを備えた２５０ｍ１−ポリカーボネー
ト◆エルレンマイヤー・フラスコ３個の各に次の試薬を
加えた二二重蒸留水１２５ｍ１　；　　０．２Ｍ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ５，０）　２０ｍ１　；　１０％■／■
トウイーン８００．５ｍｌ　：　　２．０Ｍ乳酸塩１．
０ｍｌ　；　　０．３Ｍグルコース１．０ｍｌ　；　　
０．１Ｍ硫酸マンガン０．２ｍｌ　；　　０．１Ｍベラ
トリル・アルコール０．８ｍｌ；およびＮＡＤｆ（（２
■／ｍｌ）　　０．５ｍｌ。各フラスコの反応４合物を
通して酸素を３分間バブルさせた。次に、洗浄パルプ混
ｆｆｉ５ｇ（乾ｆｆ１１．２ｇ）を各フラスコに加えた
。
二重蒸留水５０ｍ１を反応Ａに加えた。プール１　５０
ｍ１を反応Ｂに加えた。プールｍ　　５０ｍ１を反応Ｃ
に加えた。最後にグルコース・オキシダーゼ（１，ＯＵ
／μｊ７）０．２ｍｌを各フラスコに加えた。
グルコース・オキシダーゼを加えた後、各フラスコを酸
素でフラッシュし、栓をし、６０ｒｐＩｌにセットされ
た回転振とう器上で３７℃において１８時間インキュベ
ートした。
インキュベーション後に、各反応からのパルプをホワッ
トマン３Ｍフィルター付きの焼結ガラス・フィルター・
ロートでの真空濾過によって回収した。各バルブ・パッ
ドを０．５Ｎ水酸化ナトリウム約２００　ｍｌ中に攪拌
しながら再懸濁させ、次に濾過によって回収した。この
水酸化ナトリウム洗浄をくり返した。最後にパルプを０
．１７Ｎ酢酸約２５０ｍ１中に攪拌しながら再懸濁させ
、濾過によって回収した。バルブ・パッドをリグニン含
量（カッパ数）と白色度（％Ｇ、Ｅ、）を測定する少な
くとも４時間前に風乾させた。本質的にヴイ、バージン
ス（Ｖ、Ｂｅｒｚｉｎｓ）、「カッパ数の迅速測定方法
（Ａ　Ｉ？ａｐｉｄＰｒｏｃｅｄｕｒｅ　Ｆｏｒ　Ｔｈ
ｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏ［’　Ｋａｐｐａ
　Ｎｕｒａｂｅｒ）」、タッピ（Ｔａｐｐｉ）　４８（
１）　、１５〜１ｇ頁（１９６５）に述べられている通
りにマイクロカッパ数を測定した。これらの分析結果を
第３表に示す。
第３表 反応　　　　　　Ａ　　　　　Ｂ　　　　　ＣＶＡＯ活
性 （Ｕ／ｍｌ　）　　　　　　０，０　　　０．０　　　
０．１１（Ｕ／ｇ　バルブ）”　　　　　　　０．０　
　　　　　　０．０　　　　　１７．５ＰＲＯ活性 （Ｕ／ｍｌ　）　　　　　　０．０　　　０．７３　　
０．０１ＣＩＪ／ｇ　バルブ）’　　　　　　　０．０
　　　　　１２０．８　　　　　　１．３白色度（ｉ％
Ｇ、Ｅ、）　　４１．１　　　５４．５　　５１．０リ
グニン含量　　７，９±０．５　６．２±１．２　７．
０±０．５（μカッパ数）ｎ ８各反応におけるパルプ乾量１ｇあたりの単位０μカツ
パ数の値は２回の独立した測定の平均値を表す；標準偏
差を示す。
実施例３ Ｖ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７８７非分画酵素濃縮物での多
段階処理による北洋産硬水クラフト・バルブの脱リグニ
ンと増白 この実験においては、北洋産硬水クラフト・バルブに対
してファネロケーテ・クリソスポリウムＶＫＭ−Ｆ−１
７６７非分画酵素濃縮物による１段階、２段階または３
段階処理を実施した。２段階または３段階処理の最終段
階の前の各段階は次の３連続工程から構成される：（１
）バルブを酵素濃縮物と共にインキュベートする；〈２
）バルブをアルカリで抽出する；および〈３）バルブを
水で洗浄する。
多段階処理の最終段階または１段階処理の単一段階はさ
らに、希酸によるバルブの抽出という付加的な第４段階
を含んだ。３種類の濃度の酵素濃縮物を各段階でテスト
した。１反応条件以外の全ての反応条件を二重にランし
た。酵素濃縮物を含まない対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）反応
は各段階の分析に対して三重にランした。
バルブの調製 北洋産硬水クラフト・バルブを蒸留水による「洗浄」に
よって、酵素処理用に調製した。バルブ（湿ｍ１ｏＯ〜
２００ｇ）をプリティシュ・シート・ディスインチグレ
ーター（ＢｒＬ口ｓｈ　５ｈｅｅｔ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇ
ｒａｔｏｒ）によって蒸留水約１１１中に４〜５分間分
散させた。バルブを小ワツトマン３Ｍ濾紙を備えたブフ
ナーーｏ−ト（Ｂｕｃｈｎｅｒ　ｆｕｎｎｅｌ）内で真
空濾過によって回収した。それから該バルブをアリコー
トバルブ湿＝１００ｇにつき蒸留水約３０ｇで洗浄した
。洗浄のために、フィルター・ロートへのアリコート（
ａｌｉｑｕｏｔ）内に前記水を加え、攪拌し、バルブを
散らした。各々の添加後、水を真空濾過によって排除し
、他のアリコートの水を加えた。
このプロセスをくり返して、バルブを望ましい量の水で
洗浄した。
湿った「洗浄」バルブは２３，４％（バルブ乾量０．２
３４ｇ／パルプ湿量ｇ）の粘稠度を有した。この洗浄バ
ルブは３８％Ｇ、Ｅ、の白色度、１３Ｊのμカッパ数お
よび２６．０ＣＰの粘度を有した。
酵素濃縮物の調製 Ｖ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７８７非分画酵素濃縮物をロー
ラーボトルと増殖培地Ａとを用いて、実施例１に述べた
ように調製し、使用するまで一７０℃に貯蔵した。
同じ濃縮物製剤を全ての第１段階反応に用いた。
第２段階と第３段階反応に第２濃縮物製剤を用い、これ
らの段階の間この濃縮物を４℃に貯蔵した。
酵素濃縮物のＶＡＯＡ性とＰＲＯ活性を各段階の直前に
、上記発明の詳細な説明にて記述したプロトコールに従
って測定した。これらの活性は次の通りであった： 段　階　　ＶＡＯＡ性　　ＰＲＯ活性 （Ｌｌ／ｍｌ　）　　　　　（Ｕ／ｍｌ　）１　　　　
　　ｇ、７　　　　　　１３．４２　　　　　３．０　
　　　　　１２．１３　　　　　１．９　　　　　　１
２．０第１段階 バルブ、酵素濃縮物及びグルコース・オキシダーゼを除
いた全ての反応成分を含む反応ミックスを調製した。反
応ミックスの調製において酢酸ナトリウムｐＨ４，５ス
トツク溶液を用いた。反応ミックスを調製後に１．ＯＮ
水酸化ナトリウムによってｐＨ４，５に調節した。反応
ミックスを１７個の反応管（５０ｍｌコニカル・ボトム
・ポリプロピレン遠心管）と９個の対照反応管の各々に
加えて、次の成分から成る最終反応条件（酵素濃縮物に
よって与えられる反応成分を除く）を得る　：　２０＋
ｎＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）　　；　０．０２５
％トゥイーン８０　；　１０ｍＭグルコ−ス；　　０．
４５＋ｎＭベラトリル・アルコール；１ｏｍＭ乳酸；　
　０．ｌｆｆ１Ｍ硫酸マンガン。酸素を６管の反応ミッ
クスに通して３分間バブルさせた。次に、洗浄パルプ１
．７ｇ　（パルプ乾ｆｍＯ，４ｇ）を６管に加え、パル
プを分散させるために管をおだやかに旋回させた。グル
コース・オキシダーゼ（１，ＯＬｌ／μｇ。
シグマ・ケミカル社（Ｓｌｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｃｏ、）＃　Ｇ　６５００］を６管に加えた。酵素濃縮
物および／または二重蒸留水を６管に最終反応ｆｆ１２
０．０ｍｌに達するように加えた：５管はＬｉＰ５．０
単位とＭｎＦ２．７単位を受容しくサンプル４〜５．１
３および２Ｉ〜２２）、６管はＬｔＰ　１０単位とＭｎ
Ｆ１５．４単位を受容しくサンプル６〜７．１４〜１５
および２３〜２４）；６管はＬｉＰ　２０単位とＭｎＦ
３０．８単位を受容しくサンプル８〜９．１６〜１７お
よび２５〜２Ｂ）；９管は対照として用いられ（サンプ
ル１〜３、ｌＯ〜１２および１８〜２０）、二重蒸留水
のみを含み、酵素濃縮物を含まなかった（第４表参照）
。最後に、反応管を短時間、酸素でパージし、栓をし、
おだやかに数回逆さにして混合した。
反応管を約１２５ｒｐｍのＧ２４エンヴイロメンタル・
インキュベーター・シェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎａ＋ｅ
ｎｔａｌ　１ｎｃｕｂａｔｏｒ　５ｈａｋｅｒ）　［ニ
ュー・プルンスウィック・サイエンティフィック社（Ｎ
ｅｗ　Ｂｒｕｎｓｖｉｃｋ　５ｃｆｃｎｔｆｆｌｃ　Ｃ
Ｏ，Ｉｎｃ、）　ニューシャーシー州、エジソン］内で
３７℃において１晩インキユベートした。前記反応管は
インキュベーション中水平状態で前記シェーカー・プラ
ットフォームに付された。
インキュベーション後、各反応からのパルプをホワット
マン３Ｍフィルターを含む別々の焼結ガラス・ロートに
加えた。次に　０．５Ｎ水酸化ナトリウム８０ｍ１を各
フィルター・ロートに加え、ロート中味を攪拌し、パル
プを真空濾過によって回収した。各フィルター・ロート
内にパルプを約２５０　ｍｌの蒸留水中に攪拌しながら
再懸濁させ、真空濾過によって再び回収した。この水洗
を２回くり返した。
最後の水洗後に、サンプル１〜９からのパルプを０．１
７Ｎ酢酸約２５０　ｍｌ中にそれぞれ攪拌しながら再懸
濁させ、次に濾過によって回収した。これらのパルプ・
パッドをパルプの白色度（％Ｇ、Ｅ、）、リグニン含量
（μカッパ数）、および粘度（ｃｐ）を測定する少なく
とも１２時間前に風乾させた。Ｘ　Ｇ、Ｅ。
およびμカッパ数を実施例２に述べたように測定した。
本質的に「パルプの粘度二毛管粘度測定法（Ｖｉｓｃｏ
ｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｐｕ１ｐ：　ＣａｐＨ１ａｒｌｙ　Ｖ
Ｉｓｃｏｏ＋ｅｔｅｒ　Ｍｅｔｈｏｄ）　Ｊ　、タツピ
（ＴＡＰＰ　Ｉ）　、試験方法Ｎｏ、Ｔ２３０−Ｏ８−
７８ジョーシア州アトランタ（１９７Ｂ）に述べられて
いるように、粘度を測定した。第５表にはこれらの分析
結果を示す。
第２段階 ｐｉｔ−ｅ、調節し、酸素化した、上述のような反応混
合物を含む、別々の反応管にサンプル１０〜２６からの
パルプを再び装入した。管をおだやかに旋回して、パル
プを分散させ、グルコース・オキシダーゼ２０μｇを各
反応管に加えた。酵素濃縮物及び／または二重蒸留水を
次のように加えて、各管内の最終反応ｆｆ１２０．０ｍ
ｌを得た：３管はＬｉＰ２．０単位とＭｎＦ２．１単位
を受容しくサンプル１３及び２１〜２２）＝４管はＬｉ
Ｐ４．０単位とＭｎＦ１６．１単位を受容しくサンプル
１４〜１５及び２３〜２４）；４管はＬｉＰ８．０単位
とＭｎＦ３２．３単位を受容しくサンプル１〜１フ及び
２５〜２６）；及び６管は対ｊｌ（（とじて用いられ（
サンプル１〜１２及び１８〜２０）、酵素濃縮物を受容
しなかった（第４表参照）。最後に、反応管を短時間、
酸素でパージし、栓をし、おだやかに数回逆さにして混
合した。
管を第１段階に対して上述したようにインキュベートし
た。次に、パルプを管から取り出し、別々に水酸化ナト
リウムで１回、水で３回、上述のように洗浄した。最後
の水洗後に、サンプル１〜１フからのパルプをＯ，１７
Ｎ酢酸で上述のように洗浄した。生成したパルプ・パッ
ドをパルプの白色度（％Ｇ、Ｅ、）　、リグニン含量（
μカッパ数）、及び粘度（ｃｐ）をＡＰＩ定する少なく
とも１２時間前に、上述のように風乾させた。
第３段階 サンプル１８〜２Ｇからのパルプを再び、上述したまう
なｐＨ調節し、酸素化した反応混合物を含む、別々の反
応管に装入した。管をおだやかに旋回してパルプを分散
させ、グルコース・オキシダーゼ２０μｇを各反応管・
に加えた。酵素濃縮物及び／または二重蒸留水を次のよ
うに加えて、冬着の最終反応量２０　、０　ｍｌを得た
＝２管はＬｉＰｌ、０単位とＭｎ　Ｐ　　６．３ｆｌｉ
位を受容しくサンプル２１〜２２）；２管はＬｉＰ２．
０単位とＭｎＰ１２．８単位を受容しくサンプル２３〜
２４）；２管はＬｉＰ４．０単位とＭｎＰ２５．３単位
を受容しくサンプル２５〜２Ｂ）３管は対照として用い
られ（サンプル１８〜２０）、酵素濃縮物を受容しなか
った（第４表参照）。最後に、反応管を酸素で短時間パ
ージし、栓をし、おだやかに数回逆さにして混合した。
管を第１段階に対して上述したようにインキュベートし
た。次にバルブを前記管から除去し、水酸化ナトリウム
で１回、水で３回、上述したように別々に洗浄した。最
後の水洗後に、上述のようにサンプル１８〜２Ｂからの
バルブを０．１７Ｎ酢酸で洗浄した。これらのバルブ・
パッドをバルブの白色度（％Ｇ、Ｅ、）リグニン含量（
μカッパ数）及び粘度（ｃｐ）を測定する少なくとも１
２時肖前に、上述のように風乾させた。
結　　果 第４表は、各段階のバルブ・サンプルに加えたＬｉＰと
ＭｎＰの単位を示す。ＬｉＰ単位は上記発明の詳細な説
明に記述されたように定義されかつ測定されたＶＡＯ活
性の単位を表す。ＭｎＰ単位は上記発明の詳細な説明に
記述されたように定義されかつ４ｐ１定されたＰＲＯ活
性の単位を表す。
各反応は２０ｍ１ｆｆｉ中にパルプ乾ｆｆ１０．４ｇを
含むので、バルブ乾ｆｆｉ　１　ｇあたりの単位および
反応容量あたりの単位は第４表の数値から算出すること
ができる。
第５表はこの実験の結果−一処理パルブの白色度、リグ
ニン含量及び粘度を示す。反復実験も含める。サンプル
１〜９は第１段階後に検定した。
サンプル同〜Ｉ７は第２段階後に検定した。サンプル１
８〜２６は第３段階後に検定した。第５表は各バルブ・
サンプルに加えたＬｉＰとＭｎＰの累積１１１位値をも
示す。例えば、サンプル２６のＬｉＰの累積＋１ｉ位値
として示した値（３２，０）は第１段階、第２段階及び
第３段階で供給したＬｉＰ単位の合計（２０，０＋８．
０＋４．０）を表す。
Ｖ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７６７酵素濃縮物による硬水ク
ラフト・バルブの１段階処理は、酵素を加えなかった対
照サンプルからのバルブに比べて、バルブの有意な脱リ
グニンと増白を示した。２段階処理は１段階処理に比べ
て低いリグニン含量と大きい白色度とを有するバルブを
製造した。３段階処理は２段階処理よりもさらに良好に
作用した。リグニン含量の低下と白色度の増大が粘度の
許容できる減少を伴って得られた。
第４表 Ｓ杉 段 階 １、ｉＰ ＭｎＰ ０．０ ０．０ ０ ０．０ ０ ５．０ １０８０ １０，０ ００ ２０，０ ０，０ ０，０ ７，７ ７，７ １５，４ １５，４ ３０，８ ３０，８ 第 段 階 ｊＰ ＭｎＰ ０．０ ０．０ ０ ５．０ １０．０ ０．０ ０．０ ０．０ ７．７ １５．４ ０．０ ０．０ ０．０ ２．０ ４．０ ０．０ ０．０ ０．０ ８．１ １６．１ １５ １０１０ １５，４ ４，０ １６，１ ６ ２０，０ ３０，８ ８，０ ３２，３ ７ ２０，０ ３０，８ ８，０ ３２，３ ０，０ ０，０ ０，０ ５，０ ５，０ １０，０ １０００ ２０，０ ２０，０ ０，０ ０，０ ０，０ ７，７ ７，７ １５，４ １５，４ ３０，８ ３０，８ ０，０ ０，０ ０，０ ２，０ ２，０ ４，０ ４，０ ８，０ ８，０ ０，０ ０，０ ０，０ ８，１ ８，１ １６，１ ｔｅ、ｔ ３２．３ ３２．３ 第３ ＬＩＰ ０１ｏ ０．０ ０．０ １．０ １．０ ２．０ ２．０ ４．０ ４．０ 段階 ＭｎＰ ０１ｏ ０．０ ０．０ ６．３ ６、３ １２．６ １２．６ ２５．３ ２５．３ 第 ５表 加えた酵素 の累積単位 ＬＩＰ　　ＭｎＰ ｏ、ｏ　　ｏ、。
ｏ、ｏ　　ｏ、。
ｏ、ｏ　　ｏ、。
白色度 リグニン含量 （ｊ力１パＮｏ、） １２．２ ｔｏ、ｅ １１．１ 粘度 （ｃｐ） ２７．３ ２６．２ ２７．６ ５．０　　　７．７　　　　４８ ５．０　　　７．７　　　　５２ １１．２　　　　２６．７ ８．９　　　　２４．９ １０．０　　１５．４　　　　５３ １０．０　　１５．４　　　　５３ ７．９　　　　２４．９ ８．５　　　　２４．７ ２０．０ ２０．０ ３０．８　　　　５４ ３０．８　　　　５５ ８．０　　　　２４．５ ５．２　　　　２４．６ ０．０　　　０．０　　　　４９ ０．０　　　０．０　　　　４９ １（１，７２６，４ １１，７２６，９ ２ ０，０ ０，０ ９ １１，２ ２５，２ ３ ７，０ １５，８ ８ ８，８ ２０，４ ４ ５ ２１４，０３＋、５　　　　６７ ２　　　＋４．０　　３１．５　　　　　Ｂ［ｉ６．１
　　　　２０．４ ６．１　　　　２０．２ Ｇ ７ ２　　２ｇ、０　　６３．１　　　　６Ｂ２　　　ｚｇ
、ｏ　　　Ｇ３．Ｉ　　　　　Ｃ７４，５１９，８ ５，２２０，３ ８ ９ ０ ３０，００，０５１ ３（１，（１０，Ｑ　　　　　５０ ３　　　０．０　　　０．０　　　　５１１０１４ ２５，５ １０００ ２７，４ ２５，５ １ ２ ８，０２２，１７５ ８，０２２，１７６ ４，３２０，１ ４，３２０，０ ３ ４ ５ １６、０　　４４．１　　　　７８ １Ｇ、０　　４４．１　　　　７Ｂ ３２．０　　　ｇ８．４　　　　７６ ４．３　　　　１８．７ ４．３　　　　１８．８ ４．７　　　　２３．３ ２６　　　　３　　３２．０　　８８．４　　　　７６
　　　　　　４．７　　　　１８．３非処理洗浄バルブ
　　　　３８　　　１３．３　　２６．０実施例４ ｖ　Ｋ　Ｍ　−Ｆ　−１７６７非分画酵素濃縮物による
１段階、２段階または３段階処理による南洋産軟木クラ
フトパルプの脱リグニン この実験においては、南洋性軟水クラフト・パルプに対
して］７ネロケーテ・クリソスポリウム−Ｖ　Ｋ　Ｍ　
−Ｆ　−１７８７非分画酵素濃縮物による１段階、２段
階または３段階処理を実施した。実験は、以下に述べる
ように変更した、実施例３の方法に従って実施した。
パルプの調製 実施例３に記述されたように南洋産軟木クラフト・パル
プが酵素処理用に必須的に調製された。
湿った「洗浄」南洋産軟木クラフト・パルプは２５．４
％の粘稠度、２５％Ｇ、Ｅ、の白色度及び２５，０のμ
カッパ数を有した。
酵素濃縮物の調製 ＶＫＭ−Ｆ−１７６７非分画酵素濃縮物を実施例１に述
べたように、ローラー・ボトルと増殖培地Ａとを用いて
調製し、使用するまで一７０℃に保存した。全ての反応
に対して同じ濃縮物製剤を用いた。
酵素濃縮物を解凍し、第１段階反応に加える直前にその
ＶＡＯＡ性を測定した；この値は下記にリストする。第
１段階反応に用いた酵素濃縮物のＰＲＯ活性のリストし
た値は、凍結前の濃縮物のＰＲＯ活性と第２段階の前に
測定した濃縮物のＰＲＯ活性との平均値を表す。第１段
階反応に用いるためのアリコートを取り出した後、酵素
濃縮物を４℃において１晩貯蔵した。翌日、酵素濃縮物
を第２段階反応に加える前に、ＶＡＯとＰＲＯの画情性
に関して酵素濃縮物を再び検定した。酵素濃縮物を第３
段階に用いるまで４℃において再び保存した。この実験
では、第３段階を第２段階と同じ日に開始した。第２段
階と第３段階との間の経過時間が比較的短かったため、
第３段階の直前に、濃縮物の３回目の検定は実施しなか
った。従って、第３段階反応に対して第７表でリストし
たＬｉＰとＭｎＰの単位は第２段階の直前に実施した検
定からのＶＡＯｉ性とＰＲＯ活性とを用いて算出したも
のである。各段階で加えた酵素単位の算出に用いた酵素
濃縮物のＶＡＯＡ性とＰＲＯ活性との値を次に示す： ＶＡＯＡ性 段　　階　　　　　（Ｕ／ｍ１） １　　　　　１２．０ ２　　　　　１１．２ ３　　　　　１１．２ 第１段階 次の組成の　ＩＯＸ反応ミックスを調製した：２００ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｉｆ４．５）　　；　　０．５％
トウイーン８０　；　　４．Ｏｍ　Ｍベラトリル・アル
コール；　　１００ｍＭ乳酸塩；　　１．０ｍＭ硫酸マ
ンガン。この反応ミックスを水酸化ナトリウムによって
ｐｌ＋４．５に調製した。
反応ミックスを１１反応管と６対魚管の各々に加えた（
２．０ｍｌ／管）。次に洗浄バルブ１．６ｇ　（パルプ
乾ｆｆ１０．４ｇ）を６管に加えた。次に、全ての反応
ＰＲＯ活性 （Ｕ／ｍ１） ２３．８ ２２．５ ２２．５ 成分を加えた時に管あたりの最終反応量が２０　ｍｌに
なるために必要な量で、二重蒸留水を６管に加えた。酵
素濃縮物によって与えられるグルコースを除いて、最終
反応濃度が１０．０ｍ　Ｍになるように６管にグルコー
スを加えた。次に、管を旋回して混合した。管の中味を
通して３分間、酸素をバブルさせた。次に酵素濃縮物を
加えた。第６表は各反応管に加えたＬｉＰとＭ　ｎ　Ｐ
の単位を示す。最後に、グルコース・オキシダーゼ（１
，ＯＶ／μｐ）２０μｇを６管に加えた。６管の最終反
応量は２０ｍ１であった。グルコース・オキシダーゼを
加えた後に、管に栓をし、おだやかに旋回させて中味を
屈合し、バルブを分散させた。
実施例３に記述されたように、サンプルを１晩インキユ
ベートした。実施例３に記述されたように、インキュベ
ーション後に、各反応からのバルブを水酸化ナトリウム
で洗浄し、次に水で２回洗浄した。実施例３に記述され
たように、第２の水洗後にサンプルｌ−６からのバルブ
を酢酸で洗浄して、１晩風乾させ、白色度、リグニン含
量及び粘度に関して検定した。第７表はこれらの分析結
果を示す。
第２段階 サンプル７〜１７からのパルプに対して、蒸留水約２５
０　ｍｌによる新たな水洗を実施した。この最後の水洗
後に、これらのサンプルからのパルプを再び反応管に入
れ、第１段階で上述したと同様に、酵素濃縮物と共にイ
ンキュベートした。第６表は第２段階反応に加えたＬｉ
ＰとＭｎＰの単位を示す。
第２段階反応を実施例３に述べたように５時間インキュ
ベートした。次に、各反応からのバルブを水酸化ナトリ
ウムで１回及び水で２回、第１段階で述べたように、洗
浄した。実施例３に述べたように、第二の水洗後にサン
プル７〜１１からのパルプを酢酸で洗浄し、１晩風乾さ
せ、白色度、リグニン含量及び粘度に関して検定した。
第７表はこれらの分析結果を示す。
第３段階 サンプル１２〜１７からのパルプに対して蒸留水約２５
０　ｍｌによる新たな水洗を実施した。この最後の洗浄
後にサンプル１２〜１７からのパルプを再び反応前に入
れ、第１段階で上述したように、酵素濃縮物と共にさら
にインキュベートした。第６表は第３段階反応に加えた
ＬｉＰとＭ　ｎ　Ｐの単位を示す。
実施例３で述べたように第３段階反応を１晩インキユベ
ートした。次に、各反応からのパルプを、第１段階で上
述したように、水酸化ナトリウムと水で洗浄した。実施
例３で述べたように第二の水洗後にサンプル１２〜１７
からのパルプを酢酸で洗浄し、１晩風乾させ、白色度、
リグニン含量及び粘度に関して検定した。第７表はこれ
らの分析結果を示す。
結　　果 第６表は各段階のパルプ・サンプルに加えたＬｉＰとＭ
ｎＰの単位を示す。実施例３と同様に、バルブ乾ｍ　１
　ｇあたりのＬｉＰまたはＭ　ｎ　Ｐ　Ｑ３位及び反応
混合物量あたりの単位は、各反応が２０　ｍｌ量中にパ
ルプ乾Ｎｏ、４ｇを含むので、第６表の値から算出する
ことができる。
第７表はこの実験の結果−一処理パルブの白色度、リグ
ニン含量及び粘度を示す。反復実験も含める。サンプル
１〜６は第１段階後に検定した。
サンプル７〜１１は第２段階後に検定した。サンプル１
２〜１７は第３段階後に検定した。第６表は各パルプ・
サンプルに加えたＬｉＰとＭ　ｎ　Ｐの累積単位をも示
す。
南洋産軟水クラフト・パルプのＶＫＭ−Ｆ−１７６７酵
素濃縮物による１段階処理は、酵素濃縮物を受けていな
かった制御サンプルから得られるパルプと比較してパル
プの有意な脱リグニンを生じた。
２段階処理は１段階処理よりもリグニン含量がさらに低
いパルプを生じた。３段階処理は２段階処理よりもさら
に良好に作用した。１段階処理及び２段階処理によって
も有意な脱リグニンが達成されたが、パルプは増白され
なかった。この理由はリグニン含量が増白を生ずるほど
充分に低下しなかったためと考えられる。しかし、３段
階処理後には、リグニン含量が充分に低下し、増白が観
察された。パルプ粘度は酵素処理によって減少しなかっ
た。
部 表 部 段 階 ＬｉＰ ＭｎＰ ０．０ ０．０ ０、口 ９．６ ９．６ １９．２ １９．２ ０．０ １９、Ｏ １９，０ ３８，１ ３８，１ ０，０ ０，０ ９，６ ９，６ １９，２ ０，０ ０、Ｏ １９、Ｏ １９，０ ３８，１ 第　２ １Ｐ Ｏｏｏ ０．０ ４．８ ４．８ ９．６ 段 階 ＭｎＰ ０．０ ０．０ ９．６ ９．６ １９．３ 部 段 階 ＬｉＰ ＭｎＰ ２ ０．０ ０．０ ０．０ ０．０ ０．０ ０、Ｏ ０．０ ９，６ ９．８ １９．２ １９．２ ０、Ｏ Ｉ９．０ １９．０ ３８．１ ３８．１ ０．０ ４．８ ４．８ ９．６ ９．６ ０．０ ９．６ ９．６ １９．３ １９．３ ０．０ ０．６ ０．６ １．３ １．３ ０．０ １．２ １．２ ２．６ ２．６ ｆンプル 第７表 加えた酵素　白色度 の累積単位 ＬＩＰ　　ＭｎＰ ｏ、ｏ　　ｏ、。
ｏ、ｏ　　ｏ、。
（％Ｇ、Ｅ、）　　（ｕむヱ４し）包公３Ｂ　　　　　
　　２３．５ ３６　　　　　　２２．４ リグニン含量 粘度 １４．３ ９．８　　１９．０　　　　２Ｂ ９．８　　１９．０　　　　２７ １９．９　　　　２１．４ ２０．１　　　　１９．４ １９．２　　３８．１　　　　２ｇ １９．２　　３８．１　　　　２６ １７．９　　　　１ｇ、３ １９．４　　　　１９．５ ０．０　　　　Ｇ、０　　　　３５ ０．０　　　０．０　　　　３４ ２３、（１７，７ ２２，３１２，８ １４，４２ｇ、１３　　　　３１ １４．４　　２６．６　　　　３０ １６．０ １５．０ １４．３ ２６．８ ５７．４ ０ ｉ６．４ （５，９ ２ ３ （１，０ ０，０ ０，０３３ ０，０３５ ２０，１ ２０，４ １１，９ ４ ５ １５，０ １５，０ ２９，８ ２９，８ １２，４ １００２ １４，２ ６ ７ ３０，１ ３０，１ ８１）、０　　　　４０ ６００　　　　４３ １０．１　　　　１３．９ ｇ、７　　　　１４．３ 非処理洗浄バルブ ５ ２５．０ ［実施例５］　　ｃｈａ１ｎｉａ種［ＮＣＬ　８２−５
−１］からのキシラナーゼの調製 Ｃｈａｉｎ１ａ種［ＮＣＬ　８２−５−１］（ＡＴＣＣ
５３８１２）をポテトデキシトローズ（ｐｏｔａｔｏ　
ｄｅｘｔｒｏｓｅ）の寒天斜面培養基上で４℃で保った
。微生物をキシラン原（例えば５％の小麦ぬか（Ｗｈｅ
ａｔ　ｂｒａｎ）または１％のキシラン）と従来の栄養
剤（例えば１％イースト抽出物）を含有する無菌状の培
養地に移した。培養物を振盪フラスコ中で３０℃で、キ
シラナーゼ活性度（前述の試験法で測定して）がピーク
に達するまで（普通３ないし５日）激しく攪拌して培養
した。
活性度がピークに達したあと、微生物細胞と他の固体は
従来の方法（例えば濾過とか遠心分離）で除去し、清澄
な濾液あるいは上澄液を得た。濾液または上澄液は限外
濾過または真空蒸発に供する前に典型的な濃縮を行なっ
た。培養物より得られたキシラナーゼの収率は、５％の
ｗｈｅａｔ　ｂｒａｎを媒体としたときは約１０１０１
ｌ７、ｉｘキシランが媒体のときは約２５υ／ｍｌであ
った。
［実施例（ｉ］　　　Ｃｈａ１ｎｌａ種［ＮＣＬ　８２
−５−１１キシラナ−ゼとＡ　ＶＫＭ−Ｐ−１７６７未
分別酵素濃縮物の組合せによる硬水クラフトパル プの処理：併行処理対連結処理 本実験では北部産硬水クラフトバルブをＣｈａｌｎｉａ
　Ｆｌｉ［ＮＣＬ　８２−５−１１（ＡＴＣＣ５Ｈ１２
）単独またはこれとファネロケーテ・クリソスポリウム
株ＶＫＭ−Ｐ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）からの
未分別酵素濃縮物と組合せたものについて、その濃度を
色々変えて処理した。
リグニン分解酵素濃縮物をキシラナーゼ処理と併行法と
連続法の両法に適用した。
パルプの調製 北部産硬水クラフトバルブは実施例３に述べた方法で本
質的に酵素処理された。湿っぽい“洗浄パルプ１は使用
するまで４℃で貯蔵した。この組成（コンシスチンシー
）は２６％（湿量パルプｇあたり乾量パルプ０．２６ｇ
）であった。
酵素の調製 本実施例で利用されるリグニン分解酵素製剤はファネロ
ケーテ・クリソスポリウムＶＫＭ−Ｐ−１７６７の未分
別リグニン分解酵素濃縮物であった。これはローラーボ
トルと生育媒体（Ｇｒｏｗｔｈ　ＭｅｄｌｕＩｌ）　Ａ
を使って実施例１に述べた方法で調製され、使用するま
で一７０℃で保存した。この濃縮物のＶＡＯおよびＰＲ
Ｏ活性度は解凍したのち前述の如く測定した。その活性
度は、Ｖ＾０活性度（すなわちｔｘｐ）は１７．５Ｕ／
ｍｌでＰＲＯ活性度（すなわちＵ／ｍｌ　ｎＰ　）は２
０．７Ｕ／ｍｌであった。
本実施例で利用された未分別のキシラナーゼ製剤はＣｈ
ａｌｎｉａ種［ＮＣＬ　８２−５−１１の培養上澄液か
ら実施例５で述べた真空蒸発によって得られたものであ
る。この粉末は２５００υ／ｇのキシラナーゼ活性度を
もっており、使用するまで２０℃で貯蔵された。
本実験の直前に、“キシラナーゼ岐″が作られたがそれ
は９１１５．０の５Ｏｎ＋Ｍ酢酸ナトリウムの　１ｍｌ
あたりこの酵素粉末の１０■を含有していた（すなわち
２５　Ｕ　／　ｍｌキシラナーゼ）。
酵素処理工程 サンプル１はサンプル２〜４に対しマイナスの酵素コン
トロールであった。サンプル２〜４はキシラナーゼ液の
みで、濃度を変えて処理された。
サンプル５はサンプル６〜１１に対するマイナスの酵素
コントロールであった。サンプル６はリグニン分解酵素
濃縮物のみで処理された。サンプル７〜１０はキシラナ
ーゼ液とリグニン分解酵素濃縮物の両者とひとつの培養
中で処理された。サンプル１１はサンプル１２−１４に
対するマイナス酵素コントロールであった。サンプル１
２−１４は、第一段階で各種の濃度のキシラナーゼ液で
処理され、第二段階でリグニン分解酵素濃縮物の１℃度
のもので処理された。各酵素処理は約２０ｍ１の体積の
、乾量で０．３ｇのパルプについて行われた。すべての
酵素培養は５０−ｍｌの底部円錐状のポリプロピレン遠
心管中で行われた。
Ａ、サンプルニー４ り＋！５．０の５０１１ｍＭ酢酸ナトリウムの２０ｍ１
と洗浄パルプの１．０７ｇ　（乾量パルプとして０．３
ｇ＞をサンプル管１−４に添加した。ついでキシラナー
ゼ液（２５Ｌｌ／ｍｌ）をサンプル管２−４に添加し、
パルプの乾量Ｉｇあたりキシラナーゼ単位をＴａｂ　ｌ
　ｅ■の比とした。ついで管の蓋をして、静かにかきま
ぜて内容物を混合し、６０ｒｐｍにセットされた回転振
盪器に水平にとりつけ、５０℃で６時間培養した。
培養後、多管に０．５Ｎの水酸化ナトリウムを添加し全
量を約５０ｍ１とした。多管の内容物をホットマン（Ｗ
ｂａＬｍａｎ　）　３Ｍの濾紙をつけた各個ノシンター
ド（ｓ　１ｎｔｅｒｅｄ）ガラス漏斗に添加した。つい
で空になった反応管を約３０ｍ１の０．５Ｎ水酸化ナト
リウムで洗浄しこれらの洗浄物を適当なフィルター漏斗
に添加した。各フィルター漏斗中のパルプはついで真空
濾過で集められた。ついで約２５０　ｍｌの蒸溜水を各
フィルター漏斗に添加し攪拌して再びパルプを集めた。
最後に各フィルター漏斗に約２５０　ｍｌの０．１７Ｎ
酢酸を添加し攪拌してパルプを再び集めた。
このパルプパッド（ｐａｄ）はすくなくとも　３時間空
気乾燥したのちその光沢度とリグニン含有量を実施例３
で述べた方法で測定した。
６、サンプル５−９ 次の組成をもつりグニナーゼ反応混合物を調製した： ２０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，３；　　０．０２５
％Ｔｗｅｅｎ　８０　；０．ｔｓＭベラトリルアルコー
ル；　　０．２＋Ｍ硫酸マンガン；　１０ｍＭラクテー
ト（ｌａｃＬａｔｅ）　　；　３ｍＭグルコース。
この反応混合物のｐＨを丁度４．３に調節し、前記液を
通して酸素を３分間バブルさせた。
リグニナーゼ反応混合物の２０ｍ１と洗浄パルプの１．
０７　ｇ　（乾量で０．３ｇ）をサンプル管５−９に添
加した。ついでキシラナーゼ液（２５０／ｍｌ）および
／または未分別リグニン分解酵素濃縮物（１７，５Ｕ／
ｍｌ　Ｌｉｐ；　２０．７Ｕ／ｍｌ　ＭｎＰ）をサンプ
ル管８−９に添加し、パルプの乾量１ｇあたりの酵素単
位をＴａｂｌｅ■に示される比とした。最後に、サンプ
ル管６−９に２０μｐのグルコースオキシダーゼ（シグ
マ化学会社二零Ｇ−６５００．１．ＯＵ／μｐ）を添加
した。容管に短時間、酸素をフラッシュし、蓋をして静
かにかきまぜて内容物を混合した。護管を、８０ｒｐｍ
にセットされた回転振盪器に水平にとりつけ、３７℃で
１８時間培養した。
培養後、バルブサンプルを加工して光沢度とリグニン含
有量をパルプサンプルｌ−４で述べた方法で分析した。
Ｃ，サンプル１０−１４ 第一段 ｐＨ５，０の５０ｍ　Ｍ酢酸ナトリウムの２０ｍ１と洗
浄パルプの１．０７ｇ　（乾量で０．３ｇ）をサンプル
管１０−１４に添加した。ついでキシラナーゼ液（２５
Ｕ／ｍｌ　）をサンプル管１１−１４に加え、パルプの
乾ｆｆ１１ｇあたりの酵素単位をＴａｂｌｅ■の比とし
た。ついで護管に蓋をし、静かにかきまぜて内容物を混
合し、８０ｒｐＩｍにセットされた回転振盪器に水平に
とりつけて、５０℃で６時間培養した。
キシラナーゼ液で培養された後、各サンプル管の内容物
はホットマン３Ｍ濾紙をつけた別々のシンタートガラス
漏斗に加えられ、真空濾過でパルプが集められた。各漏
斗中のパルプをついで約２５０ｍ１の蒸溜水中に再び懸
濁し、攪拌して再び真空濾過をしてパルプを集めた。こ
の水洗は２度くりかえした。
第二段 サンプル管１０−１４からのパルプを再び別々の管内に
いれた。ついで容管にリグニナーゼ反応混合物（サンプ
ル５−９で上述した）の２０ｍ１を加えた。
未分別リグニン分解酵素濃縮物（１７，５ＬＩ／ｍｌ　
Ｌｉｐ　；２０．７Ｕ／ｍｌ　　ＭｎＰ）をついでサン
プル管１１−１４にＴａｂ　１ｅ■に示されるように添
加した。最後に２０μρのグルコースオキシダーゼ（シ
グマ化学会社：　ＩＩＧ−６５００，１、ＯＵ／μＩＩ
）をサンプル管１１−１４に添加した。容管に、ついで
短時間酸素をフラッシュし、蓋をして静かにかきまぜて
内容物を混合した。６０ｒｐｍ＋にセットされた回転振
盪器に平行にとりつけ、３７℃で１８時間培養した。
リグニン分解酵素濃縮物で培養後、パルプサンプルを加
工し上述のサンプルｌ−４で述べた如く光沢度とリグニ
ン含有量を分析した。
結果 各酵素処理段階に存在するパルプの乾ｆｆｉ　Ｉｇあた
りの酵素単位をＴａｂｌｅ■に示す。Ｌ１ｐ単位は［発
明の詳細な説明］で述べられたように定義されて測定さ
れたＶＡＯ活性度の単位を表わす。Ｍｎｐの単位は〔発
明の詳細な説明］で述べられたように定義されて測定さ
れたＰＲＯ活性度の単位を表わす。キシラナーゼの単位
は［発明の詳細な説明］で述べられたように定義されて
測定されたものである。“酵素添加“という頭書きの欄
の下の記載事項は、各バルブサンプルがうけた酵素処理
を表わしている。例えば“Ｘ”とあるのはキシラナーゼ
液を用いた処理法を”ＩＯＸ”とあるのはキシラナーゼ
液を１０倍量用いた処理法を表わしている。”Ｘ十Ｌ“
はキシラナーゼ液とリグニン分解酵素濃縮物の両者を１
つの培養中で処理したことを表わす。
Ｘ／Ｌは一段目にキシラナーゼ液処理を二段目にリグニ
ン分解酵素濃縮物を用いて処理したことを表わす。
Ｔａｂｌｅ　ＩＸはこれらの実験の結果−処理されたバ
ルブサンプルの光沢度とリグニン含有量−を示す。
Ｔａｂｌｅ　Ｘは、酵素処理されたバルブサンプルにつ
いて光沢化されたパーセントおよび脱リグニンされたパ
ーセントを適当なマイナスの酵素コントロールと比較し
て示す。（例えばサンプル６−ＩＯの光沢化のパーセン
トはパルプサンプル５と関連したものである）。
啼７ブル Ｔａｂ　ｌ　ｅ　　■ 各段階でバルブの乾ｆｆ１１ｇあたりに添加された酵素
単位 第一段 １１１ｉＪＩ　　　Ｌｉｐ　　　　　ＭｎＰ　　　キシ
ラナーゼ０．０　　　　０．０　　　　０．Ｏ Ｘ　　　　　Ｏ，００，０１６、７ ２Ｘ　　　　　Ｏ，００，０３３，３ １０Ｘ　　　　　Ｏ，００，０１６６、７０、Ｏ Ｌ　　　　　４８．３ Ｘ＋Ｌ　　　　４８．３ ２Ｘ＋Ｌ　　　４６、３ １０Ｘ＋Ｌ　　　４ｇ、３ ｏ、ｏ　　　　ｏ、。
５７．３　　　０．０ ５７．３　　　１６、７ ５７．３　　　３３．３ ５７．３　　１６６．７ 第二段 −／− Ｘ／Ｌ ２Ｘ／Ｌ １０Ｘ／Ｌ ０．０ ０．０ ０．０ ０．０ ０．０ ０．０ ０．０ ０．０ ０．０ １６、７ ３３．７ １６８．７ ０．０ ４８．３ ４８．３ ４８．３ ０．０ ５７．３ ５７．３ ５７．３ ０．０ ０．０ ＯｏＯ Ｏ９０ サンプル Ｔａｂｌｅ　　ＩＸ 酵素添加　光沢度 （％Ｇ、Ｅ） ４１．９ Ｘ　　　　４４．０ ２Ｘ　　　　４６、２ １０Ｘ　　　　４７．２ リ グニン含有量 （μ　　カフバー） １２．０ １０１２ １０１０ ９，４ ｘ＋Ｌ ２ｘ±Ｌ １０Ｘ＋Ｌ １０Ｘ＋２Ｌ ４１．９ ５２．５ ４７．３ ４５．２ ４４．９ ４３．２ １１．６ ８．４ ９．８ ９．８ ｔｏ、ｅ ０６７ 一／− Ｘ／Ｌ ２Ｘ／Ｌ １０Ｘ／Ｌ ４３．１ ５６、３ ５５．１ ５５．１ １１．８ ６、９ ７．２ ６．５ Ｔａｂｌｅ　　Ｘ 酵素添加　光沢化％ ５ ２Ｘ　　　　　　　１０ １０Ｘ　　　　　　　１３ Ｌ　　　　　　２５ ｘ＋ｔ、　　　　　　　ｔａ ２Ｘ＋Ｌ　　　　８ ｔｏｘ＋ｔ、　　　　７ １０Ｘ＋２Ｌ　　　　　　　　３ Ｘ／Ｌ　　　　３１ ２Ｘ／Ｌ　　　　２ｇ １０Ｘ／Ｌ　　　　２６ ＴａｂｌｅｌＫおよびＴａｂｌｅＸのデーターから次の
ことが示される。すなわち、硬水クラフトパルプをキシ
ラナーゼで、ついでリグニナーゼで連続的に処理すると
キシラナーゼやりグニナーゼ単独で処理する時より大き
な光沢化％と大きな脱リグニンＳが得られる。
思いがけないことだが、キシラナーゼおよびリグニン分
解酵素を用いて同じ一培養中で処理するとリグニン分解
酵素単独で処理する時より低い光沢化と脱リグニン度を
示した。
〔実施例７］ Ｃｈａ［ｎ１ａ　ＦＩｉ［ＮＣＬ　８２−５−１］キシ
ラナーゼとＶＫＭ−Ｐ−１７６７未分別酵素濃縮物とを
用いた硬水クラフトパルプの連続処理二段数と順序の影
Ｖｔ この実験は、キシラナーゼの単独処理およびキシラナー
ゼとりグニナーゼの連続処理を用いた硬水クラフトパル
プの一段法および多段法の段数の影響を決定するために
設定された。これらの酵素製剤を用いた連続処理の色々
な順序の影響についても研究した。
バルブの調製 北部性の硬水クラフトパルプを実施例３に述べたように
酵素処理するために調製した。湿った“洗浄”パルプは
２６．３％の組成（バルブの湿ｆｆ１１ｇあたり乾量で
０．２６３ｇ）であった。
酵素の調製 この実験に使用される未分別リグニン分解酵素濃縮物は
Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉ
ｕａ　ＶＫＭ−Ｐ−１７６７から実施例Ｂに記述した方
法でつくられた。この調製剤の特性は、ＶＡＯ活性度（
Ｌｉｐ）が１２．４Ｕ／ｍｌ。
ＰＲＯ活性度（ＭｎＰ）が３１．５Ｕ／ｍｌであった。
この実験で用いられた未分別キシラナーゼ製剤（ｐＨ５
，０の５０ｍＭ酢酸ナトリウム中２５　Ｕ　／　ｍｌの
キシラナーゼ）はＣｈａｉｎｉａ種　［ＮＣＬ８２−５
−１］（ＡＴＣＣ５３８１２）培養上澄液から実施例６
に記述した方法で作られた。
酵素処理段階 各バルブサンプルの関与した酵素処理段階の構成をＴａ
ｂｌｅ　ＸＩの“処理順序“の頭書の下に示した。
未分別キシラナーゼ液でパルプを培養する工程よりなる
処理段階を°゛Ｘ”で表わした。未分別リグニン分解酵
素濃縮物（ＬｉｐとＭｎＰの両者を含有している）でパ
ルプを処理する工程より成る処理段階を”Ｌ”で表わし
た。リグニン分解酵素とキシラナーゼのいづれもが存在
しない処理工程（すなわちマイナス酵素コントロール）
を”０“で表わした。連続的に処理する段階を”ｌ”の
記号で表わした。
すべての酵素培養物を容量約２０ｍ１で底部が円錐状の
ポリプロピレン製の５０ｍ１遠心管に入れた。各サンプ
ル管に湿量で１．９ｇの洗浄パルプ（乾量で０．５ｓｒ
）を入れた。各パルプサンプルの処理に用いられた累積
酵素単位をバルブの乾１１ｇあたりでＴａｂｌｅ　ＸＩ
に示した。
キシラナーゼ処理段階 キシラナーゼ処理段階は次の如く行われた。各バルブサ
ンプルにｐＨ５，０の５０１１ｍＭ酢酸ナトリウム２０
ｍ１を添加して処理した。ついで０　、５　ｍｌのキシ
ラナーゼ液（２５Ｕ／ｍｌ）を培養中でバルブの乾量１
ｇあたりキシラナーゼが２５．０単位となるように添加
した。この管についで蓋をし、静かにかきまぜて内容物
を混合し、８０ｒｐｍにセットされた回転振盪器に水平
につけて５０℃で培養した。第一段または第三段でのキ
シラナーゼ培養は１６時間であった。第二段または第四
段でのキシラナーゼ培養は６時間であった。
ひきつづきもうひとつの酵素処理段階がなされるべきキ
シラナーゼ培養では、培養後蒸溜水でパルプを洗浄した
。洗浄するために６管の内容物をホットマン３Ｍ濾紙を
つけた個別のシンタートガラス漏斗に添加された。空に
なった反応管はついて約２０〜３０　ｍｌの蒸溜水で洗
浄し、これらの洗浄物を適当なフィルター漏斗に添加し
た。各フィルター漏斗中のパルプはついで真空濾過で集
められた。
ついで各フィルター漏斗に約２５０ｍ１の蒸溜水を加え
、攪拌しながら再びバルブを集めた。この水洗は２回く
りかえした。最後にバルブを反応管に戻しひきつづく酵
素処理用とした。
リグニン分解酵素処理段階 リグニン分解酵素処理段階は次の如くであった。
次の組成をもつｌＯｘリグニナーゼ反応反応物合物製し
、ついでｐｌ＋を４，５に調節した：　　２００ｍＭ酢
酸ナトリウムｐｌ＋４．５　　；　　０．２５％Ｔｖｅ
ｅｎ８０　；　１．０ｍＭ硫酸マンガン；　１０ｈＭラ
クテート；　１００ｎ＋Ｍグルコース。
２　ｍｌのＩＯＸリグニナーゼ反応反応物合物８ｍ１の
蒸溜水を各バルブサンプルに添加して処理した。ついで
混合物を通して酸素を３分間バブルした。ついで０．５
ｍｌのリグニン分解酵素濃縮物（１２，４Ｕ／　ｍｌｔ
、ｔｐ　：　３１，５０／　ｍｌ　Ｍｎｐ）を添加し培
養中でパルプの乾＝ｔｇあたりＬＩｐが６．２単位、パ
ルプの乾量ｔｇあた一す　ＭｎＰがｉ５．８単位の比と
した。最後に２０μｇのグルコースオキシターゼ（シグ
マ化学会社１ｔ（ｉ−６５００；１．ＯＵ／ｌｌＮ　）
を添加した。これらの管をついで酸素で短時間フラッシ
ュし、蓋をして静かにかきまぜて内容物を混合し、ＢＯ
ｒｐｍにセットされた回転振盪器に水平にとりつけて３
７℃で培養した。一段目または三段目の培養は１６時間
行われた。二段目または四段目の培養は６時間行われた
。
ひきつづきもうひとつの酵素処理される未分別リグニン
分解酵素濃縮物はその各培養の後、そのバルブをアルカ
リで抽出した。６管に水酸化ナトリウム（０，５Ｎ）を
添加し全量を約５０　ｍｌとした。６管の内容物をホッ
トマン３Ｍ濾紙をつけた個別のシンタートガラス漏斗に
添加した。空になった反応管をついで約３０ｍ１の０．
５Ｎ水酸化ナトリウムで洗浄し、これらの洗浄物を適当
なフィルター漏斗に添加した。次に各フィルター漏斗内
のバルブを真空濾過により集めた。該バルブをその反応
管に戻しひきつづく酵素処理用とした。
マイナス酵素コントロール バルブサンプル１８と１９は“マイナス酵素″コントロ
ールであった。バルブサンプル１８は、キシラナーゼ処
理段階で述べたように、緩衝液中で培養されついで水で
洗浄された。この段階を３回くりかえしついで以下に述
べるようにバルブを抽出した。バルブサンプル１９はリ
グニン分解酵素処理段階用として述べたように、緩衝液
中で培養しついで抽出が行われた。上述したようにこの
段階を３度くりかえしついでバルブは以下に述べる方法
で抽出された。
処理の各順序の最終段階における酵素処理後のバルブ抽
出 リグニン分解酵素またはキシラナーゼを用いた培養工程
のあとで行われる各処理順序の最終の酵素処理段階では
、バルブはアルカリで抽出され、蒸溜水で洗浄されつい
で希酸で抽出された。これらの抽出および洗浄は本質的
に実施例Ｂに記載された方法で行われた。生成したバル
ブパッドを少なくとも３時間空気乾燥しそのあと実施例
３に述べた方法で光沢度とリグニン含有量を測定した。
これらの分析結果をＴａｂｌｅ　ＸＩに示す。
Ｔａｂｌｅ １ ９ ０１０１０１０ ０１ｏ ０．０ Ｏ２０ ４ ｉ２，６ ［実施例８］ 硬水クラフトバルブのＣｈａｌｎｉａ種［ＮＣＬ　８２
−５−１１キシラナーゼとＶＫＭ−Ｐ−１７６７未分別
酵素濃縮物による連続処理二段数と順序の影響（■） この実施例では硬水クラフトバルブは （ａ）Ｃｈａｉｎｉａ種［ＮＣＬ　８２−５−１］から
得られた未分別キシラナーゼ製剤を用いて一段および二
段処理、（ｂ）　Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒ
ｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ種ＶＫＭ−Ｐ−１７６７から得ら
れた未分別酵素濃縮物を用いて一段、二段および三段処
理、および（Ｃ）これらの酵素製剤の両者を用いて、色
々な二段、三段および四段処理を施された。
バルブの調製 クラフトバルブ（軟木；〜２３％、硬水５〜７７％）を
水でよく洗浄し酵素処理用に調製した。バルブ（湿量で
約１００ｇ）を英国製の紙分解答（Ｂｒ１ｔ１ｓｈＳｈ
ｅｅｔ　Ｄｉｓ！ｎｔｅｇｒａｔＯｒ）を使って約２ｇ
の蒸溜水中に４ないし５分分散した。ついでこのバルブ
を１５ｆｆの蒸溜水を用いて実施例３に述べた方法で洗
浄し、使用まで密封したプラスチック袋の中で４℃で保
存した。混った“洗浄パルプは２７．２％の組成（バル
ブの湿ｆｆ１１ｇあたりバルブの乾量０．２７２ｇ）で
あった。この洗浄バルブは光沢度が３５％Ｇ、Ｅ、でカ
ッパー数は１６．２μカツパーであった。
酵素の調製 この実施例には二種の異なる未分別リグニン分解酵素濃
縮物が用いられた。再濃縮物は実施例６に述べた方法で
Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｃｔｅ　ｃｈｒｓｏｓｐｏｒｌｕ
ｍ　　ＶＫＭ−Ｆ−１７８７カら調製された６ａ縮物Ａ
の特性４；！　ＶＡＯＡ性度（ＬＩＰ）が１．１７Ｕ／
ｍｌでＰＲＯ活性度（ＭｎＰ）は１４Ｌｌ／ｍｌでこれ
らはＴａｂｌｅ　Ｘ　Ｉｆに示された実験の直前に分析
されたものである。濃縮物への特性はＴａｂＩｅＸ　ｍ
に示された実験の直前の分析では１．１５０７ｍ１Ｌｉ
Ｐおよび１６、４Ｕ／ｍｌ　ＭｎＰであった。濃縮物Ｂ
はＶ＾Ｏ活性度（ＬｊＰ）が４５．８Ｕ／　ｍｌでＰｌ
？０活性度（ＭｎＰ）は５２１．３　Ｕ／ｍｌであった
。
この実施例に使用した未分別キシラナーゼ製剤は実施例
６に述べた方法でＣｈａｉｎｉａ種［ＮＣＬ　８２−５
−１１の培養上澄液より調製されたキシラナっゼ液（ｐ
１１５．０の５０．ｍＭ酢酸ナトリウム中２５０／ｍｌ
）であった。
酵素処理 各パルプサンプルに施された酵素処理段階の順序をＴａ
ｂｌｅ　Ｘ　ＩＩとＸ■に“処理順序”と頭書して示す
。処理段階の順序を示すのに使った記号の意味は実施例
７に先述しである。
再現性をみるために実質的に同じ実験を実質的に同じ方
法で日を異にして行った。さらにこれらの実験で一対の
バルブサンプルによって各処理順序の評価を行った。こ
れらの２つの個々の実験結果をＴａｂｌｅ　Ｘ　Ｕおよ
びＴａｂｌｅＸ　ｍにそれぞれ示す。
すべての酵素培養は底部が円錐状のポリプロピレン製の
容量５０ｍ１の遠心管中で容量を２０ｍ１として行った
。洗浄バルブの湿ｆｆ１１．４７ｇ　（乾量で０．４ｇ
　）を各サンプル管に入れた。各パルプサンプルの処理
に伴った累積酵素単位はバルブの乾ｆｆ１１ｇあたりで
ＴａｂｌｅＸ　ＩＩとＴａｂｌｅＸ　ＩＩＩに示しであ
る。
キシラナーゼ処理段階 キシラナーゼ処理段階は次のようにして行った。
処理すべき各パルプサンプルに、ｐＨ５，０の５０ｍＭ
酢酸ナトリウム（２，０ｍ１）と蒸溜水＜１６．４ｍ１
）を添加した。この管を短時間かきまぜて緩衝液中のバ
ルブを分散させた。キシラナーゼ培養（１，６ｍ１）を
添加しキシラナーゼの比を容ｆｆ１２０ｍ１中のバルブ
の乾量ｉｇあたり　１００単位とした。この管をついで
蓋をして１５０ｒｐ１１にセットされた回転振盪器に水
平にとりつけ５０℃で２時間培養した。
他の酵素処理段階がつづいて行われる各キシラナーゼ培
養では、そのあとバルブを実施例６で本質的に述べたよ
うに約２０ｍ１の０．５Ｎ水酸化ナトリウムで抽出しつ
いで３杯の蒸廂水を用いて（各〜２５０ｍ１）洗浄した
。抽出と水洗の後、バルブパッドを反応混合物を含有す
る適当な管に移し次の段階に供した。
リグニン分解酵素処理段階 リグニン分解酵素処理段階は次の如くおこなわれた。次
の組成の　ｌＯｘリグナーゼ反応混合物を調製した。　
　ｐＨ４，０の　２００ｍＭ酢酸ナトリウム、　０．１
Ｍグルコース、　０．１Ｍラクテート；ｌａ＋Ｍ硫酸マ
ンガン：１％Ｔｗｅｅ＋ｌ［ｌｏ　この反応混合物をｐ
Ｈ４，ＤＪ＝　：Ｊ５　ＪＴ７　した。
反応混合物（２ｍｌ）に二度蒸溜した水を処理されるべ
き各パルプサンプルに添加し最終的な反応混合物を２０
ｍ１とした。この管を短時間かきまぜてバルブを分散さ
せた。
ついでＶＫＭ−Ｐ−１７８７未分別リグニン分解濃縮物
〈八またはＢ）を加え培養中の比を一般的にバルブ乾量
１ｇあたりのＰＩ？Ｏ活性度　（ＭｎＦ’）が約２５単
位とした。
ＴａｂｌｅＸ　ＩＩに示される実験では濃縮物Ａ（１，
１７Ｕ／ｍ１ＬｉＰ　；　１４Ｕ／ｍｌ　ＭｎＰ）がす
べてのリグニン分解酵素処理段階に使用され、これらの
段階での濃度はバルブの乾Ｈｋ１ｇあたり　２．１単位
ＬｉＰであった。ＴａｂＩｅＸ　ｍに示される実験には
、濃縮物Ａ（１，１５Ｕ／ｍｌ　ＬＩＰ；　１６．４Ｕ
／ｍｌ　ＭｎＰ）がバルブサンプルｌから２０までのリ
グニン分解酵素の一回処理のすべての段階と、リグニン
分解酵素の２回処理の段階に使用され、これらの段階の
ＬＩＰはバルブの乾ｆｆｉ　Ｉｇあたり　１．８単位の
比であった。濃縮物Ｂ（４５，８Ｕ／ｍｌ　ＬｉＰ　；
５２１．３Ｕ／ｍｌ　ＭｎＰ）は残りのリグニン分解酵
素処理段階に使用されこれらの段階でのＬＩＰはバルブ
の乾Ｅａ　１ｇあたり　２．２単位の比であった。しか
しリグニン分解酵素を用いたサンプル２１と２２の二つ
の培前段階では、濃縮物Ｂが少し多く添加されその結果
この段階の比はパルプの乾量１ｇあたりＬｉＰが２．４
７単位、ＭｎＰが２６．２単位となった。最後に２０μ
ｐのグルコースオキシダーゼ（シグマ化学会社、１１Ｇ
−８５００、１，ＯＵ／μρ）を添加した。ついで管の
蓋をし静かにかきまぜて内容物を混合し１５０ｒり１０
にセットされた回転振盪器に水平にとりつけて５０℃で
２時間培養した。
他の酵素処理段階が続いて行われるリグニン分解の濃縮
物を用いた各培養では、そのあとキシラナーゼ処理段階
で上述したようにパルプを水酸化ナトリウムで抽出し、
ついで蒸溜水を用いて洗浄した。抽出と洗浄ののち、パ
ルプパッドを反応混合物を含有する適当な管に移し次に
工程に供した。
マイナス酵素コントロール パルプサンプル２３と２４はこの実施例での両実験に対
する“マイナス酵素コントロール“である。
これらは上述のリグニン分解酵素処理工程で述べたよう
に四段階のモック（ｍｏｃｋ）　（マイナス酵素）処理
に使われた。最終段階でのモック酵素培養のあとパルプ
は次の方法で抽出された。
各連続処理の最終の工程での酵素処理の後のパルプ抽出 各連続処理でリグニン分解酵素あるいはキシラナーゼを
用いた培養工程のあとの最終酵素処理段階でパルプサン
プルは実施例３で本質的に述べたような方法で約２０ｍ
１の水酸化ナトリウムで抽出され、−杯の蒸溜水（〜２
５０ｍ１）で洗浄され、−杯の０．１７Ｎ酢酸を用いて
抽出された。生成したパルプパッドを少くとも３時間空
気乾燥したのち実施例３に述べた方法で光沢度、リグニ
ン含有量および粘度を測定した。これらの分析結果をＴ
ａｂｌｅ　Ｘ■およびＸｍに示した。
Ｔａｂｌｅ　　ＸＩＩ サンプル　処理順序　パルプの乾量１ｇあたりの累積酵
素単位 ＬｉＰＭｎＰ　　キシラナーゼ Ｉ　　　　Ｌ　　　　　２．＋　　　２５．０　　　０
．０２　　　　Ｌ　　　　　２．１　　２５．０　　　
００３　　　　Ｘ　　　　　Ｏ，００，０１０Ｇ、０４
　　　　Ｘ　　　　　Ｏ，００，０１００，０５Ｘ／Ｌ
　　　　２．１　　２５．０　　　１００．０６　　　
　　Ｘ／Ｌ　　　　　　　２．１　　　　２５．０　　
　　１００．０７　　　　Ｌ／Ｘ　　　　　２．１　　
２５．０　　　１００．０８　　　Ｌ／Ｘ　　　　２．
１　　２５．０　　　１００．０９　　　　Ｌ／Ｌ　　
　　４．２　　５０．０　　　０．０１０Ｌ／Ｌ　　　
　４．２　　５Ｇ、０　　　０．ＯＩＩ　　　　Ｘ／Ｘ
　　　　Ｏ，００，０２００，０１２Ｘ／Ｘ　　　　Ｏ
，００，０２００，０１３Ｌ／Ｌ／Ｘ、　　　４．２　
　５０．０　　　１０Ｇ、０＋４　　　Ｌ／Ｌ／Ｘ　　
　４．２　　５０．０　　　１Ｇ０．０１５　　　Ｌ／
Ｘ／Ｌ　　　４．２　　５０．０　　１０Ｇ、０１８　
　　Ｌ／Ｘ／Ｌ　　　４．２　　５０．０　　　１００
．０＋７　　　Ｘ／Ｌ／Ｌ　　　４．２　　５０．０　
　　１００．０１ｇ　　　Ｘ／Ｌ／Ｌ　　　４．２　　
５０．０　　１００．。
＋９　　　　　Ｌ／Ｌ／Ｌ　　　　　８．３　　　７５
．０　　　　　　０．０２ＯＬ／Ｌ／Ｌ　　　６．３　
　７５．０　　　０．０２Ｌ　　　Ｌ／Ｌ／Ｌ／Ｘ　　
６，３　　７５．０　　　１００．０２２　　　　　Ｌ
／Ｌ／１．、／Ｘ　　　６．３　　　７５．０　　　　
１００．０２３　　０１０１０１０　０．０　　０．０
　　　０．０２４　　　０１０１０１０　　　Ｏ，００
，００，０未処ＰＰの洗浄パルプ 光沢度　　リグニン　　粘度 含有量 （％Ｃ，Ｅ、）　（μカッパー）　（ｃｐ）４１　　　
　１１．４　　２３．０ ４４　　　　１１．７　　２４．４ ４４　　　　１３．２　　２６．４ ４５　　　　１３．９　　２１１．７ ４７　　　　　＋０．２　　２３．９ ４８　　　　９．３　　２４．４ ４５　　　　１０、（ｉ　　　２４．０４４　　　　１
０．５　　２７．８ ５２　　　　９．５　　２＋、３ ５３　　　　１１．７　　２１．９ ４５　　　　１２．２　　２６．０ ４Ｂ　　　　　１１．１１　　２９．３５４　　　　７
．９　　２１．３ ５３　　　　７．８　　２２．２ ５３　　　　８．１　　２０．９ ５２　　　　　６、３　　１９．７ ５９　　　　５．９　　２１．４ ５７　　　　８．０　　２１．５ Ｂ＋　　　　　７．０　　１９．１ ８３　　　　６．０　　２０．０ Ｂ４　　　　７，６　　２２．０ ６５　　　　４．３　　２０．０ ４Ｂ　　　　　１３．４　　２６．４ ４７　　　　１３．５　　２７３ ３５　　　　１８．２ Ｔａｂｌｅ　　Ｘｍ サンプル　処理順序　パルプの乾ｆｆ１１ｇあたりの累
積酵素単位 ＬｉＰＭｎＰ　　キシラナーゼ Ｉ　　　　Ｌ　　　　　１．１１　　２５．０　　　０
．０２　　　　Ｌ　　　　　１．８　　２５．０　　　
００３　　　　Ｘ　　　　　Ｏ，００，０１００，０４
Ｘ　　　　　Ｏ，００，０１００，０５Ｘ／Ｌ　　　　
１．１１　　２５．０　　　１００．０６　　　　Ｘ／
Ｌ　　　　１．８　　２５．０　　　１００．０７　　
　　Ｌ／Ｘ　　　　１．８　　２５．０　　　　＋００
．０８　　　　Ｌ／Ｘ　　　　ｔ、ｇ　　　２５．０　
　　１００．０９　　　　Ｌ／Ｌ　　　　３．５　　５
０．０　　　０．０＋０　　　Ｌ／Ｌ　　　　３．５　
　５０．０　　　０．０１１　　　Ｘ／Ｘ　　　　Ｏ，
００，０２０Ｇ、０１２　　　Ｘ／Ｘ　　　　Ｏ，００
，０２００，０１３Ｌ／Ｌ／Ｘ　　　−３，５５０，０
１００，０１４Ｌ／Ｌ／Ｘ　　　３．５　　５０．０　
　　１０Ｇ、０１５　　　Ｌ／Ｘ／Ｌ　　　４．０　　
５０．０　　　１０Ｇ、０１６　　　Ｌ／Ｘ／Ｌ　　　
４．０　　５０．０　　　１００．０１７　　　Ｘ／Ｌ
／Ｌ　　　４．０　　５０．０　　　１００．０ＩＩＩ
　　　Ｘ／Ｌ／Ｌ　　　４．０　　５０．０　　　１０
Ｇ、０１９　　　Ｌ／Ｌ／Ｌ　　　５．１１　　　？５
．０　　　０．０２０　　　Ｌ／Ｌ／Ｌ　　　５．８　
　７５．０　　　０．０２１　　　　Ｌ／Ｌ／Ｌ／Ｘ　
　　６．５　　７８．２　　　１００．０２２　　　　
Ｌ／Ｌ／Ｌ／Ｘ　　　６．５　　７１＋、２　　　１０
０．０２３　　０１０１０１０　　Ｏ，００，００，０
２４０１０１０１００，００，００，０未処理の洗浄バ
ルブ 光沢度　　リグニン 含有ユ （％Ｇ、Ｅ、）　（μかソバ−） ４０　　　　１３．６ ３９　　　　　＋４．６ ４４　　　　１３．８ ４５　　　　１４．４ ４６　　　　１０．９ ４８　　　　１１．９ ４３　　　　１２Ｊ ４３　　　、　１２．８ ５０　　　　９．１１ ５０　　　　９．５ ４６、　　　　１３．１ ４５　　　　１１．８ ５３　　　　８．７ ’５５　　　　８５ ５７　　　　７．２ ５４　　　　７Ｊ ５９　　　　６．９ Ｂ＋　　　　　６．４ １３２　　　　７．５ ８３　　　　８．４ ６４　　　　４．７ ８５　　　　４．３ ４１１　　　　　＋３．６ ４５　　　　１２．６ ３５　　　　１６．２ 粘度 ［実施例９］ Ｃｈａ１ｎｌａ種［ＮＣＬ　８２−５−１１キシラナー
ゼとＶＫＭ−Ｐ−１７６７未分別酵素濃縮物を用いた軟
木クラフトパルプの連続処理二段数および順序の影響■
この実施例では軟木クラフトパルプを （ａ）ＣｈａｉｎｌａＦｌｉ［ＮＣＬ　８２−５−１］
（＾ＴＣＣ５３８１２）から調製した未分別キシラナー
ゼ製剤を用いた３段および４段処理、（ｂ）　Ｐｈａｎ
ｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｅｈｒｙｓｏｓｐｏｒｌｕｍ種Ｖ
ＫＭ−Ｐ−１７８３から調製した未分別酵素濃縮物を用
いた３段および４段処理、および（Ｃ）この両者の酵素
製剤を三段および四段の色々な順序の処理に供した。
パルプの調製 軟木クラフトパルプを水で十分に洗浄して酵素処理に用
いた。パルプ（湿量で約１００ｇ）を約２ｇの蒸溜水中
に英国製の紙分解答を使って４〜５分間分散させた。つ
いでこのパルプを実施例３で述べた方法で１５ＩＩの蒸
溜水を用いて洗浄し、使用するまで封をしたプラスチッ
ク袋中で４℃で貯蔵した。湿った“洗浄パルプ°は１８
．５７％（パルプの湿量１ｇあたり乾量でＯ，１８Ｂｓ
ｒ　）の組成であった。
この洗浄パルプのカッパー数は２７．４μカツパーであ
った。
酵素の調製 この実施例に用いられた未分別リグニン分解酵素濃縮物
はＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒ
ｉｕａ＋　　ＶＫＭ−Ｆ−１７８７から実施例６の方法
で作られた。この濃縮物の特性はＶＡＯ活性度（ＬＩＰ
）が１．８４ＩＩｍｌ　、　　ＰＲＯ活性度　（ＭｎＰ
）が３９．５Ｕ／ｍｌであった。
この嚢胞例に用いられた未分別キシラナーゼ製剤はＣｈ
ａｌｎ’Ｊａ　ＦＪ［ＮＣＬ　Ｈ−５−１３の培養上澄
液から実施例６の方法で調製されたキシラナーゼ液（ｐ
Ｈ５，０で５０ｍＭの酢酸ナトリウムの緩衝液中で２５
０７ｍ１）であった。
酵素処理 各パルプサンプルに施された酵素処理段階の順序はＴａ
ｂｌｃ　ＸＩＶに“処理順序０の頭書の下に示しである
。処理段階の順序を示すのに使われた記号の意味は先に
実施例７で述べである。再現性を評価するために各処理
順序について一対のバルブサンプルが用いられた。結果
をＴａｂｌｅＸＩＶに示す。
すべての酵素培養は５０ｍ１の底面が円錐形のポリプロ
ピレン遠心管中で２０ｍ１の容量で行われた。各サンプ
ル管には湿量で２．１５ｇ　（乾量で０．４ｇ）のパル
プが入れられた。各バルブサンプルの処理に伴った累積
された酵素単位はパルプの乾ｍ１ｇあたりとしてＴａｂ
ｌｅＸ　ＩＶに示しである。
キシラナーゼ処理段階 キシラナーゼ処ｆＩＪ！段階は次の如く行われた。
ｐ１１５．０の５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（２ｍ
ｌ）と水（１５，４４ｍ１）を処理すべき各バルブサン
プルに添加した。管を短時間かきまぜてパルプを分散さ
せた。
キシラナーゼ液（２，５８ｍ１）を添加し容ｆｆ１２０
ｍ１中、パルプの乾ｊｌ１ｇ当りキシラナーゼを１６０
単位の比とした。ついで管に蓋をし、１５０ｒｐｍｌこ
セットされた回転振盪器に水平にとりつけて５０℃で２
時間培養した。
もうひとつの酵素処理段階にすすむべき各キシラナーゼ
培養の場合は、その後、実施例６で本質的に述べた方法
で約２０ｍ１の０．５Ｎ水酸化ナトリウムを用いてパル
プを抽出しついで３杯の蒸溜水（各〜２５Ｇｍｌ）を用
いて洗浄した。抽出と水洗の後バルブを反応混合物を入
れた適当な管に移し次の工程に供した。
リグニン分解酵素処理工程 リグニン分解酵素処理工程は次の如くして行われた。次
の組成をもつｆｏｘリグニナーゼ反応混合物を調製した
。　　ｐＨ４，０の２００ｇＭ酢酸ナトリウム；０．１
Ｍグルコース；　０．１Ｍラクテート；　　ｌａＭ硫酸
マンガン；　１％Ｔｗｅｅｎ８０゜反応混合物（２ｍｌ
）に二度蒸溜した水を最終的な反応量が２０ｍ１となる
ように添加し、これに処理すべき各バルブサンプルを添
加した。管は短時間かきまぜてパルプを分散させた。
ついでＶＫＭ−Ｐ−１７６７未分別リグニン分解濃縮物
を添加し培養中のバルブ乾ｆｆ１１ｇあたりのＰＲＯ活
性度（ＭｎＰ）が５０単位に、またＶＡＯ活性度（ＬＩ
Ｐ　）が２．３単位の比とした。最後に２０μＤのグル
コースオキシダーゼ（シグマ化学会社、＄Ｇ−６５００
　　；　　１．ＯＵ／μρ）を添加した。ついで管に蓋
をつけ静かにかきまぜて内容物を混合し、１５０ｒｐｍ
ｌこセットされた回転振盪器に水平にとりつけて５０℃
で２時間培養した。
もうひとつの酵素処理段階がつづくようなリグニン分解
濃縮物を用いた各培養では、培養後に上述のキシラナー
ゼ処理段階で述べたようにパルプを水酸化ナトリウムで
抽出しついで蒸蒲水で洗浄した。抽出と洗浄のあとパル
プパッドは反応混合物を入れた適当な管に移し次の工程
に供した。
マイナス酵素コントロール パルプサンプル２１と２２はこの実施例における実験に
対する“マイナス酵素コントロール°である。
これらはリグニナーゼコントロールとして処理された。
これらは上述のリグニン分解酵素処理工程で述べたよう
に四段階のモック（Ｉｌｏｃｋ）　（マイナス酵素）処
理に使われた。最終段階でのモック酵素培養のあとパル
プを以下に述べる方法で抽出した。
呂連続処理の最終工程での酵素処理の後のパルプ抽出 リグニン分解酵素またはキシラナーゼを用いた培養工程
の後の各連続処理の最終酵素処理段階で、パルプサンプ
ルは実質的に実施例３で述べたような方法で約２０ｍ１
の水酸化ナトリウムで抽出され、１杯の蒸溜水（〜２５
０ｍ１）で洗浄され、１杯の０、１７Ｎ酢酸を用いて抽
出された。生成したパルプパッドを少くとも３時間空気
乾燥した後、実施例３で述べた方法で光沢度、リグニン
含有量および粘度を測定した。これらの分析結果をＴａ
ｂｌｅＸ　ｒＶに示す。
サレブル 処理順序 ａｂｌｅ パルプの乾ｆｆ１１ｇ あたりの累積酵素単位 ＩＶ 光沢度 リグニン 含有量 粘度 Ｘ／Ｘ／Ｘ Ｘ／Ｌ／Ｘ Ｘ／Ｌ／Ｘ Ｘ／１．／Ｌ Ｘ／Ｌ／Ｌ ４Ｂ０．０ ３２０．０ ３２０．０ １６０．０ １１ｉｏ、０ Ｌ／Ｌ／Ｘ Ｌ／Ｌ／Ｘ Ｌ／Ｌ／Ｌ Ｌ／Ｌ／Ｌ Ｘ／１．／ＸＡ。
Ｘ／Ｌ／Ｘ／Ｌ Ｌ／Ｘ／Ｌ／Ｘ Ｌ／Ｘ／Ｌ／Ｘ Ｌ／Ｌ／Ｌ／Ｌ Ｌ／Ｌ／Ｌ／Ｌ Ｘ／Ｘ／Ｘ／Ｘ Ｘ／Ｘ／Ｘ／Ｘ ０１０１０１０ ０１０１０１０ ｉｅｏ、。
ｌｅＯ，０ ０，０ ０，０ ３２０，０ ３２０，０ ３２０，０ ３２０，０ ０，０ ０，０ ５４０，０ ５４０，０ ０，０ ０ ［実施例１０］ Ｃｈａｉｎｉａ種［ＮＣＬ　８２−５−１１キシラナー
ゼとＶＫＭ−Ｐ−１７６７未分別酵素濃縮物を用いた軟
水クラフトパルプの連続処理二段数および順序の影ｙｇ
　１１この実施例で用いた軟木クラフトパルプを（ａ）
　Ｃｈａｉｎｉａ種［ＮＣＬ　８２−５−１１から調製
した未分別キシラナーゼ製剤を用いた二段処理、 （ｂ）Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｙｓｏｓｐｏ
ｒｉｕｍ種ＶＫＭ−ｒ’−１７６７から調製した未分別
酵素濃縮物を用いた二段および二段処理、および（Ｃ）
これらの両酵素製剤を用いた巴々な二段および三段の連
続処理に供した。
パルプの調製 酵素処理用の軟水クラフトパルプは実施例９で述べた方
法で水で十分洗浄して調製した。湿った“洗浄パルプ”
の組成は２６．６％　（パルプの湿量１ｇあたり乾量で
０．２６８ｇ　）であった。この洗浄パルプのカッパー
数は２９．６であった。
酵素調製 この実施例に供した未分別リグニン分解酵素濃縮物を実
施例６に述べた方法でＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈ
ｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｆｌｌＶＫＭ−Ｆ−１７６７から
調製した。この濃縮物の特性はＶＡＯ活性度（ＬｉＰ）
が１．９２Ｕ／ｍｌ。
ＰＲＯ活性度　（ＭｎＰ）が１５．５Ｕ／ｍｌであった
。
この実施例に用いられたキシラナーゼ製剤はＣｈａｉｎ
ｌａ種［ＮＣＬ　８２−５−１］の培養上澄液から実施
例Ｂで述べた方法で作られたキシラナーゼ液（ｐＨ５，
。
で５０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中で２５０／ｍｌ）で
あった。
酵素処理 各バルブサンプルに施された酵素処理段階の順序をＴａ
ｂｌｅＸ　Ｖに“処理順序°の頭書の下に示す。
処理段階の順序を示した記号の意味はさきに実施例７に
示しである。再現性を調べるために一対のバルブサンプ
ルを使って各処理順序について評価した。その結果をＴ
ａｂｌｅＸ　Ｖに示す。
すべての酵素培養を底部が円錐形の５（１ｍｌのポリプ
ロピレン遠心管中で２０ｍ１の容量について行った。
各サンプル管に湿量で１．４９ｇの洗浄バルブ（乾量で
０．４２６ｇ）を入れた。各バルブサンプルを処理する
のに用いた累積酵素単位をバルブの乾量１ｇあたりの１
１１位でＴａｂｌｅＸ　Ｖに示す。
キシラナーゼ処理段階 キシラナーゼ処理段階は次のようにして行われた。　９
１１５．０の　５００ａ＋Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（２
ｍｌ）と水（ｌｆ３．８１ｍ１）を処理すべき各バルブ
サンプルに添加した。管を短時間かきまぜてバルブを分
散させた。キシラナーゼ液（１，［１ＩＩｌｌ）を添加
し２０ｍ１の容量中でキシラナーゼがバルブの乾ｆｆ１
ｌｓ−当り　１６０単位となるような比とした。ついで
この管の蓋をし、１５０ｒｐＩＩｌにセットされた回転
振盪器に水平にとりつけて５０℃で２時間培養した。
さらに他のひとつの酵素処理段階がつづくべきキシラナ
ーゼ培養ではその各培養のあとバルブを実施例６で本質
的に述べた方法で０．５Ｎ水酸化ナトリウム約２０　ｍ
ｌを用いて抽出し、ついで３杯の蒸溜水（各〜２５０ｍ
１）を用いて洗浄した。抽出と水洗ののち、このバルブ
パッドを反応混合物を入れた適当な管中に移し次の工程
に供した。
リグニン分解酵素処理工程 リグニン分解酵素処理工程は次の如く行われた。
次の組成をもつ　ＩＯＸのりゲナーゼ反応混合物を調製
した。　　ｐＨ４，０の　２００ａ＋Ｍ酢酸ナトリウム
；　０．１Ｍグルコース、０．１Ｍラクテート；　　１
１１１Ｍ硫酸マンガン；１％Ｔｖｅｅｎ８０．反応混合
物（２ｍｌ）に二度蒸瑠した水を加え最終的に反応容量
を２０ｍ１とし、これを処理すべき各バルブサンプルに
添加した。この管を短時間かきまぜてバルブを分散させ
た。
ついでＶＫＭ−Ｆ−１７８７未分別リグニン分解濃縮物
を加え培養中でバルブの乾ｆｆ１１ｇあたりのＰＲＯ活
性度（ＭｎＰ）が５０単位、ＶＡＯ活性度（ＬＩＰ）が
６．１６単位となるような比とした。最後に２０μＪの
グルコースオキシダーゼ（シグマ化学会社、ＪＩＧ−６
５００。
１、ＯＵ／μＩＩ）を添加した。ついでこの管の蓋をし
て静かにかきまぜて内容物を混合し、１５０ｒｐａ＋に
セットされた回転振盪器に水平にとりつけて５０℃で２
時間培養した。
さらにもうひとつの酵素処理段階がつづくべきリグニン
分解濃縮物を用いた培養ではその各培養のあと上述のキ
シラナーゼ処理段階で述べた方俵のようにバルブを水酸
化ナトリウムで抽出しついで蒸溜水で洗浄した。抽出と
洗浄のあと、バルブパッドを反応混合物を入れた適当な
管中に移し次の工程に供した。
マイナス酵素コントロール バルブサンプル９〜１０および１１〜１２はこの実施例
の丈験に使われた“マイナス酔素コントロール″である
。これらはりグニナーゼコントロールとして処理された
。サンプル９〜１０および１１〜１２はリグニン分解酵
素処理工程で前述したようにそ・れぞれ二段および三段
のモック（ｍｏｃｋ）　（マイナス酵素）処理に供され
た。最終段階でのモ・ツタ酵素培養のあとバルブを次に
述べる方法で抽出した。
各連続処理の最終段階における酵素処理の後のバルブ抽
出 リグニン分解酵素またはキシラナーゼを用いる培養工程
のあとの各連続処理の最終酵素処理段階において、バル
ブサンプルは実施例３で述べた方性と本質的に同じく、
約２０ｍ１の水酸化ナトリウムで抽出され、−杯の７Ｘ
ａ水て（〜２５［１ｍ１）で洗浄され、−杯の０．１７
Ｎ酢酸で抽出された。生成したバルブパッドを少くとも
３時間空気乾燥しそのあと実施例３で述べた方法で光沢
度、ＩＪり゛ニン含有量および粘度を測定した。これら
の／１）析審吉果をＴａｂｌｅＸＶに示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）各々のリグニン分解酵素処理段階が、効果的
    な量のリグニン分解酵素製剤を含むリグニン分解反応混
    合物中でリグノセルロース材料を培養する工程を含む一
    段またはそれ以上のリグニン分解酵素処理段階および （ｂ）各々のキシラナーゼ処理段階が、効果的な量のキ
    シラナーゼ製剤を含むキシラナーゼ反応混合物中でリグ
    ノセルロース材料を培養する工程を含む一段またはそれ
    以上のキシラナーゼ処理段階を含む二段またはそれ以上
    の酵素脱リグニン工程を含むことを特徴とするリグノセ
    ルロース材料の脱リグニン方法。 ２、前記リグノセルロース材料がウッドパルプであるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記リグニン分解酵素製剤が白腐れ菌 （ｗｈｉｔｅｒｏｔｆｕｎｇｕｓ）からつくられたもの
    であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
    法。 ４、前記白腐れ菌がファネロケーテクリソスポリウム（
    Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕ
    ｍ）株であることを特徴とする特許請求の範囲第３項記
    載の方法。５、前記ファネロケーテクリソスポリウム株
    は、ＮＲＲＬ１５９７８の同定特性を有するＳＣ２６，
    ＡＴＴＣ２４７２５の同定特性を有するＶＫＭ−Ｆ−１
    ７６７およびＡＴＣＣ３４５４１の同定特性を有するＭ
    Ｅ−４４６より成るグループから選ばれたものであるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、前記リグニン分解酵素製剤は白腐れ菌の細胞外培養
    媒体濃縮物より成る未分別酵素濃縮物であることを特徴
    とする特許請求の範囲第３項記載の方法。 ７、前記リグニン分解酵素製剤は少なくともひとつのリ
    グニンパーオキシダーゼを含むことを特徴とする特許請
    求の範囲第１項記載の方法。 ８、前記リグニン分解酵素製剤は少なくともひとつのＭ
    ｎ（ＩＩ）−依存性のパーオキシダーゼを含むことを特
    徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、前記リグニン分解酵素製剤は少なくともひとつのリ
    グニンパーオキシダーゼと少なくともひとつのＭｎ（Ｉ
    Ｉ）−依存性のパーオキシダーゼを含むことを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０、前記キシラナーゼ製剤は、アスペルギラス（Ａｓ
    ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、スポロトリチュム（Ｓｐｏｒｏ
    ｔｒｉｃｈｕｍ）、スクレロチム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕ
    ｍ）、チャエトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、シゾ
    フイラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、チャイニア
    （Ｃｈａｉｎｉａ）、クロストリヂウム（Ｃｌｏｓｔｒ
    ｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙ
    ｃｅｓ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびトリコ
    デルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株より成るグループ
    から選ばれた微生物からのものであるか、またはチャイ
    ニアもしくはストレプトマイセス株からのものであるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１、前記株は、ＡＴＣＣ１５８９６の同定特性を有す
    るストレプトマイセススクレロチアルス（ｓｃｌｅｒｏ
    ｔｉａｌｕｓ）、ＡＴＣＣ１９３４７の同定特性を有す
    るストレプトマイセスフラビスクレロチカス（ｆｌａｖ
    ｉｓｃｌｅｒｏｔｉｃｕｓ）、ＡＴＣＣ１９３４５の同
    定特性を有するスプレプトマイセスフミガチスクレロチ
    クス（ｆｕｍｉｇａｔｉｓｃｌｅｒｏｔｉｃｕｓ）、Ａ
    ＴＣＣ１７７５７の同定特性を有するスプレプトマイセ
    スミヌチスクレロチクス（ｍｉｎｕｔｉｓｃｌｅｒｏｔ
    ｉｃｕｓ）、ＡＴＣＣ１７７５６の同定特性を有するス
    トレプトマイセスニゲル（ｎｉｇｅｒ）、ＡＴＣＣ１５
    ８１４の同定特性を有するストレプトマイセスオクラセ
    イスクレロチカス（ｏｃｈｒａｃｅｉｓｃｌｅｒｏｔｉ
    ｃｕｓ）、ＡＴＣＣ１５７２３の同定特性を有するスト
    レプトマイセスポオネンシス（ｐｏｏｎｅｎｓｉｓ）、
    ＡＴＣＣ１７７５５の同定特性を有するストレプトマイ
    セスロゼイスクレロチカス（ｒｏｓｅｉｓｃｌｅｒｏｔ
    ｉｕｓ）、ＡＴＣＣ２７９４６の同定特性を有するスト
    レプトマイセス種およびＡＴＣＣ４３９６２の同定特性
    を有するチャイニアヒグロアトロシアナ（ｈｙｇｒｏａ
    ｔｒｏｃｙａｎｅａ）より成るグループから選ばれた株
    であることを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載の
    方法。 １２、前記リグニン分解反応混合物はさらに、過酸化水
    素を含みかつ該過酸化水素は約０．００１ないし０．５
    ｍＭの安定状態の濃度で保持されていることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。 １３、前記リグニン分解反応混合物はさらに、０．５な
    いし１．０ｍＭのＭｎ（ＩＩ）を含むことを特徴とする
    特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、前記リグニン分解反応混合物はさらに、０．５な
    いし２０ｍＭのアルファ−ハイドロキシアシッド（α−
    ｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ）を含むことを特徴とする特許
    請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、前記リグニン分解反応混合物はさらに、非イオン
    性および両性イオン洗剤より成るグループより選ばれた
    洗剤の０．００１ないし０．１％を含むことを特徴とす
    る特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １６、前記リグニン分解反応混合物はさらに、非イオン
    性および両性イオン洗剤より成るグループより選ばれた
    洗剤の０．００１ないし０．１％を含むことを特徴とす
    る特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １７、前記過酸化水素の濃度は、その場での過酸化水素
    の酵素発生によって安定状態のレベルに保持されたもの
    であることを特徴とする特許請求の範囲第１２ないし第
    １６項のいづれかに記載の方法。 １８、０．０１ないし２０ｍＭのグルコース上で０．０
    ０１ないし１０Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼの作
    用によってその場で過酸化水素を発生することを特徴と
    する特許請求の範囲第１７項記載の方法。 １９、前記過酸化水素の濃度は、過酸化水素を時間をは
    かりまたは定期的に添加してその安定状態のレベルを保
    持されることを特徴とする特許請求の範囲第１２ないし
    第１６項のいづれかに記載の方法。 ２０、前記Ｍｎ（ＩＩ）は、硫酸マンガンとして供給さ
    れることを特徴とする特許請求の範囲第１３、第１４ま
    たは第１５項に記載の方法。 ２１、前記アルファ−ハイドロキシアシッドは、乳酸で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第１４または第１
    ５項記載の方法。 ２２、前記酵素膜リグニン工程の各々はさらに、ひきつ
    づいてリグノセルロース材料をアルカリで抽出する工程
    を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
    法。 ２３、一段またはそれ以上の酵素脱リグニン工程はさら
    に、リグノセルロース材料を水を用いて十分に洗浄する
    工程を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
    の方法。 ２４、前記酵素脱リグニン工程の各々はさらに、ひきつ
    づいてリグノセルロース材料を水を用いて十分に洗浄す
    る工程を含むことを特徴とする特許請求の範囲第２２項
    記載の方法。 ２５、最終酵素処理工程がさらに、ひきつづいて希酸溶
    液を用いてリグノセルロース材料を抽出する工程を含む
    ことを特徴とする特許請求の範囲第２２、２３または２
    ４項記載の方法。 ２６、（ａ）リグニン分解酵素製剤を用いた培養が１５
    〜５５℃で、０．２５〜１８時間行われ、そして（ｂ）
    キシラナーゼ製剤を用いた培養が２０〜７０℃で、０．
    ２５〜１８時間行われる ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ２７、少なくとも１つの従来の漂白工程および少なくと
    も２つの酵素膜リグニン工程を含むことを特徴とする特
    許請求の範囲第１項記載の方法。
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