NO178201B - Ligninnedbrytende enzymatisk preparat for behandling av masse av ved, og fremgangsmåte for bleking av masse - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et ligninnedbrytende enzymatisk preparat for behandling av masse av ved.

Videre vedrører den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for bleking av masse.

Disse og andre trekk fremgår av de etterfølgende patentkrav.

Ved fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen for bleking av masse av ved kan rå ligninperoksydase anvendes i nærvær av oksygen i stedet for hydrogenperoksyd som kosubstrat for å redusere lignininnholdet av massen av tre. Ligninperoksydasen kan anvendes i en modifisert form.

Ved/virke er et komplekst material sammensatt av cellulose, hemicellulose og lignin sammen med andre mindre vesentlige komponenter. Ligninet er assosiert med og endog kovalent bundet til en matriks av cellulose og hemicellulose. Ved papirfremstillingsprosesser bør ligninet fjernes fra massen av ved ettersom det reduserer styrken, medfører en brunaktig farge og meddeler andre uønskede egenskaper til sluttproduk-tet. Konvensjonelt blir flis først behandlet med natriumsulfid (Na2S) og natriumhydroksyd (NaOH) for i vesentlig grad å nedbryte ligninet. Dette benevnes sulfatprosessen eller Kraft-prosessen. Alternativt kan andre behandlinger anvendes, f.eks. sulfittprosessen. Massene oppnådd derfra benevnes "kjemiske masser".

Kjemisk masse som f.eks. Kraft-masse inneholder vanligvis omtrent 4-12 vekt% restlignin som gir massen en karakteristisk brun farge. Ved dette trinn av delignifiseringen er Kappa-tallet, som reflekterer lignininnholdet av massen, vanligvis fra 10 til 45, oftest fra 12 til 30. For å oppnå en masse med høy lyshet og lyshetsstabilitet bør lignininnholdet ytterligere reduseres ved hjelp av én eller flere behandlinger eller trinn som vanligvis benevnes bleking. Mange industrielle blekeprosesser foreligger allerede, men de fleste av dem er oppdelt i to hoveddeler, nemlig en komplementær delignifisering etterfulgt av "ekte bleking" for å forbedre lyshets-nivået. Den komplementære delignifisering starter typisk med et oksygentrinn eller et klorerings-ekstraksjonstrinn (C-E) eller begge deler. Klorering og ekstråksjon gjennomføres vanligvis i sekvens, hvor det først dannes klorerte ligninfor-bindelser som så oppløseliggjøres ved det etterfølgende ekstråksjonstrinn. Formålet er utelukkende å delignifisere massen ettersom meget liten lyshetsøkning oppnås ved C-E-trinnet. En komplementær prosess for lyshetsgjøring av ligninet kan ytterligere inkludere bruken av andre komponenter enn klor som f.eks. klorholdige kjemikalier som hypokloritt og klordioksyd eller oksygen og hydrogenperoksyd.

Effluentene som skriver seg fra den komplementære behandling (benevnt E-l-effluenter) inneholder et meget stort antall klorerte organiske forbindelser som er skadelige for omgivel-sene, f.eks. dioksiner. Også på grunn av deres meget korro-derende natur er det ganske vanskelig å resirkulere effluentene. Fra et miljøsynspunkt er det således klart at nye metoder for bleking som kan redusere forurensningen er meget ønskelige.

I naturen forekommer et antall mikroorganismer som delignifiserer ved og nedbryter og modifiserer lignin. De enzymer som er involvert ved en slik nedbrytning fører til klassene av oksydaser, peroksydaser og hemicellulaser. En enzymatisk behandling kan derfor fordelaktig erstatte minst én av de blekebehandlinger som involverer klorforbindelser ved masse-bleking.

Ligninperoksydaser (også benevnt ligninaser) og MnlI-avhengig peroksydase er enzymer av særlig interesse og som utskilles av mange mikrobestammer, spesielt filamentære fungi. Phanerochaete chrysosporium er en sopp som frembringer hovedsakelig begge typer av peroksydaser. Disse enzymer er i stand til å modifisere lignininnholdet i ved slik at ligninet frigis fra hemicellulosematriksen eller gjøres utløsbart etter vasking eller ekstraksjon.

Optimaliseringen av forsøksbeskrivelsene ved en enzymatisk blekeprosess har imidlertid ennå ikke blitt oppnådd. Dette har forblitt en vesentlig utfordring ettersom en enzymatisk prosess må være i stand til å konkurrere med en kjemisk prosess i industriell målestokk.

Ligninperoksydaser er hittil beskrevet som enzymer som krever nærvær av H202 for å være effektive ved nedbrytning av lignin med eventuelt nærvær av oksygen. I EP 345715 Al angis at dette system virker uten bruk av oksygen, men i nærvær av oc-hydroksysyrer og detergenter. Det angis samtidig at peroksydet må fremstilles enzymatisk in situ. I DE 3636208 Al angis at visse oksydasjonsmidler og reduksjonsmidler må være tilstede og redokspotensialet må opprettholdes ved et visst nivå under hele reaksjonsforløpet. De prosesser som er beskrevet i disse to patentskrifter er ikke kommersielt gjennomførbare på grunn av de høye omkostninger med de kosubstrater som trenges. Ved en senere publikasjon (Holzforschung 1989, 43(6), 375-384) vises at ligninperoksydaser i nærvær av hydrogenperoksyd alene ikke nedbryter lignin. Ved ennå en ytterligere publikasjon (Enzyme Microbiol. Technol. 1985, 7(11), 564-566) vises at immobiliserte ligninperoksydaser i kombinasjon med hydrogenperoksyd alene ikke delignifiserer lignocelluloseholdig material.

Det er nå overraskende funnet at meget gode resultater kan oppnås ved enzymatisk delignifisering av masse av ved når massen behandles med en ligninperoksydase i fravær av et peroksyd og når enzymene først modifiseres kjemisk på en slik måte at de ikke adsorberes til massen.

Oppfinnelsen tilveiebringer således et ligninnedbrytende enzymatisk preparat for behandling av masse av ved, som er kjennetegnet ved at det omfatter minst én ligninperoksydase avledet fra en soppkultur som er kjemisk modifisert slik at den ikke kan adsorberes på massen.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for bleking av masse, som er kjennetegnet ved at den omfatter å behandle massen med det ligninnedbrytende preparatet i samsvar med oppfinnelsen.

I en utførelsesform utføres fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen i vesentlig fravær av tilsatt peroksyd og i nærvær av tilsatt oksygen.

Med "blekeprosess" som anvendt heri menes en fremgangsmåte for delignifisering av masse av ved eller forbedring av hvitheten eller lysheten av massen av ved eller begge deler.

Med "lignin" som anvendt heri menes ikke bare naturlige, umodifiserte former, men også formene som finnes i kjemisk behandlede masser som helt eller delvis er blitt kjemisk modifisert ved hjelp av forskjellige midler som f.eks. dem som anvendes ved Kraft-, organosolv- eller sulfittmasseprosessen og i effluentene fra disse prosesser.

Med "vesentlig fravær av tilsatt peroksyd" menes fravær av en vesentlig mengde tilsatt peroksyd som ville være effektiv ved å indusere nedbrytningen av ligninet. Ved fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen kan et peroksyd således tilsettes reaksjonsblandingen i en ikke-effektiv mengde.

Betegnelsen "ligninnedbrytende enzym" som anvendt heri menes å omfatte et hvilket som helst enzym som modifiserer ligninet eller hemicellulosekomponenten i ved slik at ligninet frigis fra hemicellulosematriksen eller gjøres utløsbart etter vasking eller ekstråksjon. Egnede ligninnedbrytende enzymer er hemicellulaser, oksydaser og peroksydaser, idet de sistnevnte spesielt foretrekkes. Eksempler på hemicellulaser er manna-naser, xylanaser, galaktomannanaser og arabinosidaser, mens laccaser faller under gruppen oksydaser. Foretrukne peroksydaser er MnII-avhengige peroksydaser og ligninperoksydaser (også benevnt ligninaser). Ligninnedbrytende enzymer utskilles av mange mikrobestammer og særlig filamentære sopp. Betegnelsen "ligninperoksydaser" som anvendt heri menes å omfatte det rå enzympreparat som fremstilles av soppen under ligninolytiske betingelser såvel som de individuelle lignin-peroksydaseisoenzymer fra naturlige eller rekombinante produ-senter .

Foretrukket anvendes ligninperoksydasen fra en hvitråtesopp som f.eks. P. chrysosporium enten fra dens native kilde eller i rekombinant form. Den rekombinante form av en ligninperoksydase av P. chrysosporium kan oppnås som beskrevet i PCT patentsøknad 88/2023.

Ved en utførelsesform av fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen kan det enzymatiske preparat være i en vesentlig renset form. Det foretrekkes imidlertid at det enzymatiske preparat er en rå ekstrakt, et filtrat eller en supernatant av en kultur av hvitråtesopp, f.eks. P. chrysosporium.

Stammer av P. chrysosporium er generelt tilgjengelige og fremgangsmåter for dyrking av dem i et N- eller C-begrenset medium er allerede kjent. Som et eksempel er et passende dyrkingsmedium det nitrogehbegrensede Blll/glukosemedium inneholdende 1,08 x IO"<3> M ammoniumtartrat, 1,47 x IO"<2> M KH2P04, 2,03 x IO"<3> M MgS04-7H20, 6,8 x 10"4 M CaCl2- 2H20,

2,96 x 10~<6> M tiamin-HCl og 10 ml* L"1 av en sporelementopp-løsning. Sporelementoppløsningen inneholder 7,8 x 10"<3> M nitriloeddiksyre, 1,2 x IO"<2> M MgS04-7H20, 1,7 x 10~<2> M NaCl, 3,59 x 10"<4> M FeS04-7H20, 7,75 x 10~<4> M CoCl2, <9,>0 x 10"<4> M CaCl2, 3,48 x 10~<4> M ZnS04, 4 x IO"<5> M CuS04- 5H20, 2,1 x IO"<5> M A1K(S04)2-12H20, 1,6 x IO"<4> M H3B03, 4,1 x IO"<5> M NaMo04-2H20 og 2,9 x IO"<3> M MnS04-<H>2<0.>

For bruk ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan det ligninnedbrytende enzym kjemisk modifiseres ved hjelp av kovalent eller ikke-kovalent binding til vannoppløselige eller vannuoppløselige polymere forbindelser som forhindrer at enzymet kan bli adsorbert på massen under behandlingen. Egnede polymere forbindelser er f.eks. polyetylenglykol (PEG), polypropylenglyokol (PPG), polyakrylamider og polymere sukker-arter med forskjellige polymerisasjonsgrader og sammen setninger tilsvarende CM-cellulose, cellulose, agarose, alginat og chitosan. PEG er en foretrukket polymer forbindelse .

Alternativt kan enzymet deglykosyleres slik at karbohydratrestene som vanligvis er involvert i adsorpsjonsmekanismene i det minste delvis fjernes. Deglykosylering kan gjennomføres ved hjelp av kjente metoder, f.eks. ved behandling av en prøve av ligninnedbrytende enzym med et enzym som f.eks. en endoglykosidase som er i stand til å nedbryte karbohydratrestene på et glykoprotein.

Preparatene i samsvar med oppfinnelsen kan fremstilles ved kjemisk modifisering av en rå ekstrakt, filtrat eller supernatant oppnådd fra en soppkultur, foretrukket etter konsen-trering. Alternativt kan enzymene renses fra et fungalt material før noen kjemisk behandling. Det er særlig fordelaktig å anvende ligninperoksydaser fra en species eller stamme som ikke frembringer cellulaser, særlig når enzymet ikke er renset. Foretrukket anvendt er ligninperoksydase av en hvitråtesopp, f.eks. P. chrysosporium som indikert i det foregående.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan anvendes på en lang rekke forskjellige masser av tre hvor ligninrestinnholdet skal reduseres. Ublekede masser av ved som kan anvendes ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er fordelaktig mekaniske masser, f.eks. slipmasse, inkluderende de termomekaniske masser som termomekaniske masser (TMP), kjemi-mekaniske masser (CMP), kjemitermomekaniske masser (CTMP) og kjemiske masser (CP) som f.eks. sulfittmasser og Kraft-masser, idet de sistnevnte foretrekkes.

Som en generell regel kan enzymkonsentrasjonen være fra

0,001 til 1000 VAO-enheter/g masse (en VAO-enhet bestemmes ved omdannelse av veratrylalkohol til veratrylaldehyd ved 310 nm =

9,3 (imol.cm-<1> ved 30°C, pH 3,5), foretrukket fra 0,1 til 50 VAO-enheter/g masse, mer foretrukket fra 1 til 20 VAO-enheter/g masse. Optimal enzymkonsentrasjon avhenger av den kommersielle opprinnelse og type av massen.

Masse av ved underkastes foretrukket alkalisk ekstråksjon før den behandles enzymatisk. Den enzymatiske behandling gjennom-føres fordelaktig med en massekonsistens fra 0,1 til 15 %, foretrukket fra 1 til 5 %. Massekonsistensen bestemmes ved hjelp av en standard prosedyre som tørr vekt av massen etter tørking i 2 til 10 timer ved omtrent 105°C. For oppnåelse av en optimal massekonsistens kan den ublekede masse av ved for-tynnes med avionisert vann, ferskvann eller vannledningsvann under blekeprosessen. Av økonomiske grunner foretrekkes imidlertid ferskvann eller vannledningsvann ettersom det er funnet at egenskapene av vannet ikke påvirker sluttresulta-tene. Med "ferskvann" menes vann som er pumpet direkte f.eks. fra vann, dammer eller elver.

Det er foretrukket å vaske massen med en alkalisk oppløsning før den enzymatiske behandling eller å gjennomføre den enzymatiske behandling etter et alkalitrinn, f.eks. oksygen-bleke-trinn eller E-trinn.

Tidsperioden nødvendig for behandling av massen kan variere sterkt med hensyn til kvaliteten av substratet og arten av enzymmodifisering fra noen få minutter til flere timer. Optimale temperatur- og pH-betingelser bør tilpasses det spesielle enzym som anvendes. Temperaturen er imidlertid generelt i området fra 20 til 50°C, foretrukket fra 40 til 50°C. pH i systemet er vanligvis i området fra 2 til 5, foretrukket fra 3 til 4. Reaksjonstiden er vanligvis 30 til 60 minutter.

Etter den enzymatiske behandling kan fjernelse av det opp-løseliggjorte lignin fra massen gjennomføres enten ved vasking, filtrering eller ved ekstraksjon, foretrukket ved ekstraksjon. Egnede ekstraksjonsmidler inkluderer f.eks. baser som alkalimetallhydroksyder, dimetylformamid, dioksan, aceton og alkohol. En fortynnet, vandig natriumhydroksydekstraksjon foretrekkes generelt. Et typisk ekstraksjonstrinn kan gjennom-føres ved en massekonsistens fra 1 til 20 %, foretrukket fra 1 til 5 % ved en temperatur mellom 40 og 60°C. Den endelige pH er foretrukket fra 10 til 11. Reaksjonstiden kan være fra 30 minutter til 3 timer, foretrukket fra 45 minutter til 2 timer.

Graden av delignifisering av massen kan indikeres ved Kappa-tallet som målt ved den standardmetode beskrevet i TAPPI Test Methods (Tappi, Atlanta, Ga.) Vol 1, 1988 "Kappa number of pulp - T 236 cm 85". Kappa-tallet er volumet (i milliliter) av 0,1 N aliumpermanganatoppløsning som forbrukes av 1 gram fuk-tighetsfri masse under betingelsene angitt i den ovenfor nevnte metode. Et lavere Kappa-tall er ønskelig ettersom dette indikerer at en mindre mengde lignin er tilstede i massen.

En ytterligere liknende prosess av særlig interesse involverer også behandlingen av vandig avløpsvann som frigis fra masse-fremstillingsprosessene fra ved eller fra blekeprosessen for masse av ved for ytterligere å nedbryte ligninkomponenten. Et typisk avløpsvann som kan behandles med en ligninperoksydase i eksklusivt nærvær av oksygen som et kosubstrat er El-effluenten fra Kraft-prosessen.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere som følger:

Eksempel 1

Behandling av masse av tre med rekombinant ligninperoksydase (ligninase).

1) Fremstilling av rekombinant ligninase

Rekombinant apo-ligninase av P. chrysosporium isoleres fra pelletfraksjonen av et kulturlysat av E. coli (pBSR3) NRRL-18068 ved ekstraksjon i 4M urea 50 mM natriumacetat lOmM ditiotreitol (DTT). Supernatantekstrakten separeres så fra pelleten ved passende sentrifugering og tilføres en DEAE-Sepharose anionbytter-kolonne. En gradient på 0 til IM NaCl gjennomføres i ekstraksjonsbufferen. Fraksjoner samles og analyseres for deres immunoreaktivitet med et anti-ligninase antistoff. De sterkeste immunoreaktive fraksjoner samles og tilføres en graderingskolonne (S-300 Sephacryl, Pharmacia) i 4M urea 50 mM KH2P04 4mM DTT pH 7. På nytt kontrolleres frak-sjonene for deres immunoreaktivitet og de sterkeste reaktive fraksjoner samles og dialyseres mot Tris-HCl pH 8 ImM DTT 20 %

(volum/volum) glyserol.

Protoheme IX (Sigma) oppløst i 0,1N KOH tilsettes til den dia-lyserte oppløsning. Denne dialyseres mot 50mM Tris HC1 pH 8. ImM redusert glutation 100JJ.M oksydert glutation over natten ved 4°C. Til slutt dialyseres prøven mot lOmM natriumacetat pH 6. 2) Blekeprosess med den rekombinante ligninase 2,5 g Kraft-masse oppnådd fra løwed ekstraheres først med 2,5 % natriumhydroksyd i 1 time ved 50°C og vaskes så med vannledningsvann til nøytralitet. Konsistensen av massen innstilles til 2,5 % (omtrent tilsvarende 2,5 g masse fortynnet i 100 ml vannledningsvann) og pH senkes til pH 3,5 med saltsyre. Blandingen blir så gjennomboblet med oksygen under omrøring. 50 VAO-enheter/g masse av den rekonstituerte ligninase tilsettes til blandingen og reaksjonen gjennomføres i 1 time ved 40°C. En kontrollprøve med varmedenaturert enzym fremstilles også som en prøve uten enzym.

Omsetningen stanses ved vasking med vannledningsvann og Kappa-tallet av det enzymatisk behandlede preparat og kontrollprøven måles. Overraskende fremviser preparatet behandlet med den rekombinante ligninase i eksklusivt nærvær av oksygen som kosubstrat et lavere Kappa-tall ved sammenlikning med kontrollprøven, og dette viser at en vesentlig delignifisering var oppnådd.

Eksempel 2

Behandling av masse av ved med et filtrat fra en kultur av

P. chrysosporium.

En konsentrert ligninolytisk enzymblanding hovedsakelig inneholdende ligninaser og Mn-avhengige peroksydaser oppnås ved ultrafiltrering (molekylvektgrense 10000) av en kultur av P. chrysosporium ATCC 24 725 fremstilt ved hjelp av metoden til Linko, Enzyme Microb. Technol. 1988, 10, 410-417. En slik blanding har en enzymatisk aktivitet på 125 VAO-enheter/ml. Proteininnholdet av blandingen er 5 mg/ml bestemt ved hjelp av metoden til Bradford et al., Anal. Biochem. (1976) 72: 248. 7,5 g Kraft-masse oppnådd fra løwed ekstraheres først med 2,5 % natriumhydroksyd i 1 time ved 50°C og vaskes så med vannledningsvann til nøytral reaksjon. Konsistensen av massen innstilles til 2,5 % (omtrent tilsvarende 2,5 g masse fortynnet i 100 ml vannledningsvann) og pH senkes til pH 3,5 med saltsyre.

Preparatet oppdeles i tre prøver. En prøve suppleres med

100 |XM H202, en annen prøve suppleres med 100 |1M H202 og spyles med oksygen, mens en ytterligere prøve bare spyles med oksygen. 50 VAO-enheter/g masse av den enzymatiske blanding tilsettes til hver prøve og reaksjonen gjennomføres i 1 time ved 40°C under omrøring. Reaksjonen stanses ved vasking med vannledningsvann og Kappa-tallet av prøvene måles.

Overraskende oppnås bedre resultater ved delignifisering av masse ved eksklusivt nærvær av oksygen som et kosubstrat enn i nærvær av hydrogenperoksyd supplert eller ikke supplert med oksygen.

Eksempel 3

Modifisering av enzympreparat

Rå ligninperoksydase fra Phanerochaete chrysosporium ble enten fremstilt i henhold til publiserte prosedyrer (f.eks. H. Janshekar, A. Fiechter, J. of Biotechnology 1988, 8, 97-112) eller innkjøpt fra Cultor Ltd., Helsinki, Finland. a) Modifisering med aktivert metoksypolyetylenglykol 1 ml rått ligninperoksydasepreparat (aktivitet: 110 VAO-enheter, proteininnhold 5 mg (Bradford et al., Anal. Biochem. 1976, 72, 248)) ble fortynnet i 9 ml acetatbuffer 50 mM. Etter innstilling av pH til 7,5 ble 1 g cyanursyreklorid-aktivert metoksypolyetylenglykol (Sigma Nr. M-3277) tilsatt. Denne oppløsning ble omrørt over natten ved 4°C. Den enzymatiske aktivitet etter behandlingen var 75 % av den opprinnelige blanding. Ingen ytterligere rensing ble gjennomført. b) Modifisering med ConA- Sepharose ( Concanavalin A- Agarose) 1 ml rått ligninperoksydasepreparat (som under a)) ble blandet med 1 g ConA-Sepharose (Pharmacia) i 10 ml acetatbuffer (100 mM) ved pH 7 over natten ved 4°C. Det faste kompleks ble så vasket med 100 ml av den samme buffer. Utbyttet med hensyn til aktiviteten var 50 %.

c) Deglvkosylering

1 ml rått ligninperokysdasepreparat (som under a)) ble fortynnet i 1 ml acetatbuffer (100 mM, pH 5). Deretter ble 10 enheter av endoglykosidase F (Boehringer) tilsatt til preparatet og reaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 2 timer. Utbyttet med hensyn til aktivitet var 30 %.

Eksempel 4

Behandling av masse av ved.

2,5 g av den aktuelle masse ekstraheres først med natriumhydroksyd (2,5 % av g tørr masse, 10 % konsistens) i 1 time ved 50°C og vaskes så med vannledningsvann til nøytral reaksjon. Etter tilsetning av 100 ml vannledningsvann senkes pH til 3,5 med saltsyre. Blandingen gjennombobles så med oksygen under omrøring.

Enzympreparatet fremstilt som beskrevet i eksempel 3 blir så tilsatt til massesuspensjonen og reaksjonen gjennomføres så i 1 time ved 40°C. Reaksjonen avsluttes ved filtrering og en etterfølgende natriumhydroksydekstraksjon som beskrevet i det foregående.

Graden av delignifisering måles ved bestemmelse av Kappa-tallet. Ligninet er også analytisk påvisbart i den kombinerte filtrat/alkaliske ekstrakt, f.eks. ved gelfiltrering-høy-ytelsesvæskekromatografi under anvendelse av UV/Vis-spek-troskopi for deteksjon.

Bedre resultater ved delignifisering av massen oppnås med et modifisert enzympreparat enn med et ikke-modifisert enzympreparat selv om den enzymatiske aktivitet av det modifiserte preparat pr. g masse var 10 ganger lavere enn for det ikke-modifiserte preparat (tabell 1).

Bedre resultater oppnås når oksygen alene anvendes enn når hydrogenperoksyd alene anvendes (tabell 2).

Delignifisering av løwed-kraftmasse, nåletre-kraftmasse blandet mekanisk masse og nåletre-sulfittmasse kan oppnås (tabell 3).

Eksempel 5

Behandling av masse av ved.

Eksempel 4 gjentas under anvendelse av 50 VAO-enheter/g masse av den enzymatiske blanding som fremstilt i eksempel 3 c). Når denne tilsettes med samme konsentrasjon er den enzymatiske blanding behandlet med endoglykosidase F mer effektiv ved delignifisering av massen enn en ikke-modifisert blanding.

Eksempel 6

Modifisering av lignin.

200 jig Organosolv-lignin (87/64003; Organocell, Munchen, Tyskland) fra en 2 % utgangsoppløsning i dioksan i 1 ml natriumtartatbuffer (100 mM) pH 3,5 ble inkubert med 1 VAO-enhet av et ConA-Sepharose-modifisert enzympreparat ved 40°C i 1 time under spyling med oksygen. Etter dette ble pH innstilt

til 10,5 med natriumhydroksyd og prøven ble filtrert gjennom et 0,45 |lm filter for å fjerne enzym/ConA-komplekset. En prøve behandlet på samme måte med ConA-Sepharose, men uten enzym ble fremstilt samtidig.

Reaksjonsproduktene ble analysert ved hjelp av gelpermeasjon-høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) på to seriekoblede TSK (GMP W&L, 7,8 x 300 mm) kolonner (Toya Soda, Japan). Strømnings-takten var 1 ml/min og natriumkarbonat (10 mM, pH 10,5) med 0,05 % polyetylenglykol (PEG 6000) ble anvendt som eluerings-middel. Absorpsjon ved 250, 310 og 360 nm ble bestemt under anvendelse av en dioderekke UV-detektor.

Det enzymbehandlede lignin var sterkt modifisert. Vesentlig lysgjøring av ligninsuspensjonen ble iakttatt etter enzym-behandlingen. UV-absorpsjonsspektra ved 250, 310 og 360 nm av de individuelle ligninkomponenter etter separering ved hjelp av gelpermeasjonskromatografi var sterkt endret.

Alle reaksjonsblandinger ble spylt med oksygen før og under reaksjonsforløpet (1 time).

a: PEG-modifisert bovint serumalbumin fremstilt på samme måte som det modifiserte enzympreparat, bovint Heme (Sigma Nr. H-2250), 10flg/ml.

b: 5 VAO-enheter/g masse,

c: 50 VAO-enheter/g masse.

Hydrogenperoksydkonsentrasjonen var 100 jiMol/liter; oksygen-innholdet var som i tabell 1.

Claims (6)

1. Ligninnedbrytende enzymatisk preparat for behandling av masse av ved, karakterisert ved at det omfatter minst én ligninperoksydase avledet fra en soppkultur som er kjemisk modifisert slik at den ikke kan adsorberes på massen.

2. Preparat som angitt i krav 1, karakterisert ved at ligninperoksydasen er assosiert med en vannoppløselig eller -uoppløselig polymer forbindelse ved kovalent eller ikke-kovalent binding.

3. Preparat som angitt i krav 1, karakterisert ved at det omfatter en ligninperoksydase som er i det minste delvis deglykosylert.

4. Preparat som angitt i ett eller flere av kravene 1-3, karakterisert ved at det er avledet fra en rå ekstrakt, et filtrat eller en supernatant av Phanerochaete chrysosporium.

5. Fremgangsmåte for bleking av masse, karakterisert ved at den omfatter å behandle massen med et preparat som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 4.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at den utføres i vesentlig fravær av tilsatt peroksyd og i nærvær av tilsatt oksygen.