PT95273A

PT95273A - Processo de branqueamento da polpa de madeira com enzimas

Info

Publication number: PT95273A
Application number: PT9527390A
Authority: PT
Inventors: Beat Gysin; Theophile Griessmann
Original assignee: Sandoz Sa
Priority date: 1989-09-12
Filing date: 1990-09-11
Publication date: 1991-05-22
Also published as: NO903924D0; AU646403B2; NO903924L; BR9004525A; EP0418201A3; EP0418201B1; NO178201C; FI904456A0; JPH03104993A; AU6232390A; ES2067719T3; CA2025079A1; EP0418201A2; DE69015294D1; DE69015294T2; NO178201B

Description

O presente invento diz respeito a uffl novo processo enzimático para o branqueamento de polpa de rr,Qde;ir.a caracterizado por se utilizar peroxidase de lenhina ern bruto na presença de oxigénio de preferencia a per Óxido de hidrog§nio co(no co-substra-to para reduzir o teor de lenhina da polpa cle madeira. A peroxidase de lenhina pode ser utilizada sob urna f0|^ mocj^ ficada.. A madeira é um material comple><0 constituído por celulose, hernicelulose e lenhina, além de outros componentes menores.. A lenhina está associada e mesmo covalentemente ligada a uma matriz, constituída por celulose e por |-1Prn:j celulose» Mos rocessos de fabrico de papel, a lenhina deVe ser removida da polpa de madeira uma vez que reduz a resistência, confere uma cor-acastanhada e confere outras caracteristicas indesejáveis ao produto final... Convencionalmente, as aparas de madeira sSo primeiramente tratadas com sulfureto de sódio (NagS) e hidróxido de sódio (NaOH) de rnodo a degradar substancialmente a lenhina.. Este processo é designado por processo Kraft ou processo do sulfato.. Alternativarnente, podem utilizar-se outros tratamentos, piar exemplo o processo do sulfito. As polpas assim obtidas são designadas por "polpas químicas".. A polpa química, por exemplo a polpa Kraft, contém geralmente percentagens ponderais de lenhina residual compreendidas entre cerca de 4% e cerca de 12%, o que lhe confere uma cor castanha caraeteristica. Neste estádio da deslenhificaçao, o Índice Kappa que reflecte o teor de lenhina da polpa esta geralmente compreendido entre 10 e 45, mais frequentemente entre 12 e 30» Para se obter uma polpa com uma pureza de cor e uma estabilidade da pureza de cor elevadas, deverá reduzir-se axnda mais o teor de lenhina em um ou mais tratamentos ou etapas vulgarmente designadas por branqueamento. Jã existem muitos processos industriais de branqueamento que na sua quase totalidade ®e dividem em duas

V

partes principais? uma deslenhificação coffipie,írieritc5r seguida por um "verdadeiro branqueamento" destinado a mel*lorar a Pureza da cor. A deslenhificação complementar inicia-se tipicamente com uma etapa de oxigenação ou uma etapa de clsrinaÇSo"eKtracÇ'ão <C~E> ou com ambas. A clorinaçãc e a extracç^0 sSo ger<*l mente efectuadas em sequfncia, formando primeira^®*”11-® compostos de lenhina clorinada que são depois soluhilibadas no subsequente «passo de extracção» 0 objectivo é skcIusivamecta a ueslenhifi-cação da polpa uma vez que ê reduzida a purs-s-3 crum^tica conse guida na etapa 0 pureza de cor da h. Um processo complementar para aumentar lenhina poda incluir ainda a ui.ilicaçao de outros componentes além de contendo cloro., por exemplo cl oro tais rOfno produtos quxmicos hipocloreto e dióxido de cloro, ou oxigénio e peréxido de hidrogénio.

Os efluentes resultantes do tratamento complementar (designados por efluentes- E— 1) contêm um número elevado de compostos clorinados que são nocivos para o meio ambiente, por exemplo dioxinas. Além disso, devido à sua natureza altamente corrosiva, a reciclagem dos efluentes é extremamente difícil. Consequentemente e do ponto de vista ambiental, é bastante desejável o aparecimento de novas técnicas de branqueamento menos poluentes.

Existem na natureza alguns microrganismos capazes de deslenhificar a madeira, e de degradar e modificar a lenhina. As enzimas envolvidas neste processo de digestão pertencem à classe das oxidases, peroxidases e bemicelulases. Consequentemente, pode substituir-se vantajosamente pelo menos um dos tratamentos químicos utilizando compostos de cloro por um tratamento enzimá-tico no processo de branqueamento. 4

As peroxidases de lenhina (também designadas por lenhinases) e a peroxidase dependente de ΜηIX. são encimas particularmente Citeis que são segregadas por muitas estirpes de micróbios, especialmente por fungos filamentosos,, Phanerochaete írlLr..y..§S.sp£^o,ujin é um fungo que produz essencial mente ambos os tipos de peroxidases.. Estas enzimas têm a capacidade de modificar o teor em lenhina da madeira permitindo a libertação da lenhina da matriz hemícelulósica ou tornando possível a sua libertação após lavagem ou extracção..

Contudo, a optimização das condições experimentais de um processo de branqueamento enzimático não foi ainda alcançada.. Permanece um desafio uma vez que um processo enzimático terá de competir corn os processos químicos a urna escala industrial..

As peroxidases de lenhina foram descritas até à data corno enzimas que necessitam da presença de Rar9 serem eficazes no processo de degradação da lenhina na presença facultativa de oxigénio.. Mo pedido de. patente europeia n9. 345715 Al reivindica—se o funcionamento deste sistema na ausência de oxigénio e na presença de e—hidroxi—ácidos e detergentes."

Reivindica-se simultaneamente a necessidade de preparação enzima..... tica insi tu do per óxido,. Mo pedido de patente DE 3636208 Al reivindica-se a presença obrigatória de determinados agentes oxidantes e redutores e a manutenção obrigatória num determinado nível do potencial redox no decurso da reacçao.. (..) processo descrito nestes dois pedidos de patente não e comerciaimente viável devido ao elevado custo dos co.....substratos requeridos..

Numa publicação recente (Holzforschung, 4.3(6), 375—384 (1.989)) revela.....se que as peroxidases de lenhina não degradam a lenhina quando na presença exclusiva de perõxido de hidrogénio.. Numa outra p u b 1 i c a ç ã o (E n z y rn e M i c r o b i o 1... I e c h η u .1.. J_ (.11.), 5 0 4 .... 5 0 0 (1985)) revela.....se que as peroxidases de lenhina imobilizadas de hidrogénio não tíesle··· combinadas axc 1 usivs.m-rjíte com peróxido nhificam as lenhoceluloses»

Qs presentes inventores descobriram recentemente com surpresa ser possível obter muito bons resultados ao deslenhificar enzimaticaments a polpa de madeira quando se trata essa polpa cofR uma peroxidase de lenhina na ausência de peróxido e quando as ensi^ss são primeiro quimicamente modificadas de modo a não serem adsorvidas pela polpa»

Consequeutemente, o presente invento revela um processo para o branqueamento de polpa da madeira caracterizado por se tratar a polpa com pelo menos uma peroxidase de lenhina na ausência substancial de peróxido adicionado e na presença de oxigénio» 0 presente invento revela ainda uma composição enzimá— tica <preparação de enzimas) constituída por pelo menos uma peroxidase de lenhina obtida, a partir de uma cultura de fungos quimicamente modificada tíe modo a não poder ser absorvida sobre a polpa» anqueasisn to “ designa. na ^'su para a de· slenhificação brancura ou a pureza da ac terísticas« A expressão “processo de presente memória descritiva-, um processo para da polpa de madeira ou para aumentar a cor da polpa de madeira uu ambas a.s baracterística^" A expressão “lenhina” designa, na presente memória desuriuiva, não apenas a.·» suas formas naturais não modificadas como também as formas encontradas nas polρ-as- quimicamente tratadas que são quimicamente modificadas na sua totalidade ou em parte por diversos agentes cais como os ytilizados nos processos de fabrico de po&pa {••.rai organusoiv ou. s-u.If ito e nos- efluentes destes processos»

X A expressão "ausSncis substancial de peróxido adicionado" significa a ausência de uma quantidade substancial de peróxx-dc adicionado qu.e induziria eficazmente a degradação da lenhina. Consequentemente , o Smbito do presente invento pretende abranger um processa caracterizado por se adicionar uma quantidade ineficaz de um peróxido ao meio de reacção. A expressão “enzima degradadora de lenhina" abrange, na presente memória descritiva, todas as enzimas com capacidade de modificação da lenhina ou dos componentes hemicelulósicos da madeira de modo a permitir a libertação da lenhina da matriz hemicelulósica ou a tornar possível a sua libertação após lavagem ou extracção» São enzimas deqnadadoras de lenhina adequadas as hemicelulases, as οχidases e as peroxidases, sendo as últimas particularmente preferidas. · SSo exemplos de hemicelulases as mananases, as xilanases, as galactomananases e as arabinosidases. As lactases são exemplos do grupo das oxidases. As peroxidases preferidas são as peroxidases dependentes de Μη II e as peroxidases de lenhina itambém designadas por lenhinases)» As enzimas tíegradadoras de lenhina são segregadas por muitas estirpes de micróbios, em particular pelos fungos filamentosos. A expressão "peroxidases de lenhina" abrange, na presente memória descritiva, a preparação de enzimas em bruto produzida pelo fungo sob condições lenhinoiíticas e ainda as isoenzimas peroxidase de lenhina individuais obtidas a partir de produtores naturais ou reconbinantes.

Utiliza-se preferencialmente a peroxidase de lenhina obtida a partir de um funqo de putrefeeção branco, por exemplo P. chrysosporlum« quer sob a sua forma natural quer sob a forma recombinante. A forma recombinante de uma peroxidase de lenhina .... 7 -

ν'

Λ

Γ|η £ __ Pode ser obtida Pelo processo descrito no pedl^i patente PCI n2 88/2023.

No processo de acordo com o presente invento preferido a composição enzimatica pode encontrar.....se sob uma forma substan cialmente purif içada,. 1 refere ->t·..., contudo, que a composição enzimatica seja um extraeto em bruto, um filtrado ou um sobrena-dante de uma cultura de um fungo de putrefacçíSo branco, por exemplo p çhrvsosporiui.

As estirpes de K ,...Sto.s.aspo.m»n estão comercializadas e os métodos para a preparação de culturas destes fungos em meios com teores de C ou N .limitados são já do conhecimento dos tecni..... cos. A titulo de exemplo, um meio de cultura adequado ê o meio ΚϊXX X/glucose com um teor limitado de azoto que contém tartrato de amónio 1, 08 x 10 3 M. KH2P04 4? x 1θ'“"2 M, MgSO ·· 7H,„0 2, 03 x IO""'3 M, CaCl2" 2H20 6, 8 x l(f4 M, tiamina· HC1 2, 96 x ío“6^M e 10 ml L J" de uma solução de componentes vestigiais.. A solução de componentes vestigiais contém ácido nitrilo.....acético 7, 8 x IO™3 M, MgS04» 7H2G 1,2 x 1.0 2M, NaCl 1, 7 x l(f 2M, FeS04» 7H20 3, 59 x 10 4M, CoC12 7, 75 x 10"~4M, CaCl2 9, 0 x 10 4M„ ZnSO^ 3,48 x 10 4M, CuS04· 5H20 4 x 10~°M, AlkfSO^ L/ 12H20 2,1 x l(fbM, H3BU3 1» 8 x 10 4fv|, Na lvlo 0^" 2H20 4, 1 χ 10~'°M e MnSOn 1-1,.0 2, 8 x 10~3M. " ' - 42 A enzima degradadora de lenhina utilizada no processo de acordo com o presente invento pode ser quimicamente modificada mediante a ligação covalente ou não covalente a compostos polimé— rico,., .r.)laveis em água ou insolúveis ern água que evitam a adsor..... e çau da enzima sobre a polpa no decurso do tratamento.. São compu,,too μ oi. irner leu s adequados, por exemplo, o polietileno giicol (PEG), 0 polipropileno glicol (PPG) as poliacrilamidas e os açucares poliméricos com diversos graus de polimerizaçSo (-3 composições tais como Uri-cεIu. 1 oss, celulose, agarose, alginato quitosano. 0 composto polimérico preferido έ o PEB»

Alternativamente, a enzima pode sor desgiicosilada de modo a que os resíduos hidrocarboneto geralmente envolvidos no mecanismo da adsorçSo sejem pelo menos parcialmente removidos» A desglicosilaçlo pode ser efectuada por métodos conhecidos, por exempla mediante o tratamento ra de lenhina com uma enzima de uma -amostra de enzima degradado-tal como uma endoglicosidase capaz de degradar os duos hidrocarboneto n h consposxçao oe acoroo com o presente invento poae ser preparada mediante a modificação química de um sxtracto em bruto, filtrado ou sobrenadante obtido a partir de uma cultura de fungos, de preferência após concentração» Alternativamente, as enzimas podem ser purificadas a partir de fungos antes de qual quer pero tratamento químico» έ particularmen idas-es de lenhina obtidas a partir de ,e vaiitajo u.síj de uma espécie ou estirpe que não produz celulases especialmente nos casos em que a enzima não é purificada» Usa—se de preferência a peroxidase de lenhina de um fungo de putrefacção branco, por exemplo P» chrysosporium atrás referido» 0 processo de acordo com o presente invento pode se ser aplicada a uma ampla variedade de polpas de madeira cujo teor de lenhina residual se pretende reduzir» Vantajosamente, as polpas não branqueadas que podem ser tratadas pelo processo de acorda exemplo polpa de tais como polpa po 1 pa q u i m i o t e r-coíso as polpas com o presente invento são polpas mecânicas, por madeira moída, incluindo as polpas termomecSnicas termo-mecânica (TMP), polpa quimiomecânica (CMP) » momecânica ÍCTMP) e as polpas químicas ÍCP) tais sulfito e Kraft, sendo estas últimas as preferida 9

Como regra estar comρreend idas gerai , as concentrações os enzima podem entre Θ,001 e 1&&& (unidades V'AO)/Cq de polpa) (a unidade VAO è determinada pela conversão de veratrilál-cooi em veratrilaldeído a 31Θ nm = 9,3 u.molcm “ e a 3ã°C, pH 3,5)? de preferencia entre θ,1 e 50 (unidades VAO) / {g de polpa), com maior preferência entre 1 e 2@ (unidades VAO)/Cg de polpa). A concentração enzimática óptima depende da origem comercial da polpa e do seu tipo» A polpa de madeira é vantajosamsnte submetida a extrac— çâo alcalina antes de ser enzimat.icaments tratada. 0 tratamento enzimático é vantajosamente efectuado com polpa de consistência compreendida entre Θ,1% e 15%, de preferência entre 1% e 5%. A consistência da polpa é determinada por um procedimento padrão como sendo o peso escorrido da polpa após secagem por um per.iodo de 2 a 1Θ horas a cerca de 1 v;5°C = Para atingir uma consistência óptima para a polpa a polpa não branqueada pode ser diluída com água desionizada, água fresca ou água da torneira no decurso do processo de branqueamento. Contudo, por motivos económicos, prefere-se a água fresca ou água da torneira, uma vez que se as características da água não têm qua Ique os resu11ados f i na i s» A expre ssão !! água d i rect aroen te e xtra ida * de 1aqos, lagoas OU Γ influ.~ É preferível lavar a polp; -sn r.irfS do tra tamento enzimático ou. af& co depois de uma etapa alcalina. ΟΟΓ queamento com oxigénio ou. etapa t„ j.n—

U período de tempo necessário para o tratamento da polpa pode variar consideravelmente, consoante a qualidade do substrato e a natureza da modificação enzimática, entre alguns minutos e várias horas. As condições óptimas de temperatura s pH

1.0 devem ser adaptadas è enzima particular a ser utilizada No entanto e geralmente, a temperatura está compreendida entre 20 e 50° O, de preferencia entre 40 e 50*C. 0 pH do sistema está geralmente compreendido entre 2 e 5, de preferência entre 3 ,,, 4 0 tempo de reacçáo está yeraimente compreendido entre 20 ο B0 minutos.. A seguir ao tratamento enzimatico efectua-se a remoção da lenhina solubilizada mediante lavagem, filtração ou extranção, de preferência mediante esta ultima.. os agentes de extracçao adequados incluem. por exemplo. bases tais como hidróxidos de metal, alcalino, dirnetil. furmamida, dioxano acetona e álcool.. Prefere-se em geral uma solução aquosa diluída de hidróxido de sódio.. Um passo da extracçáo tipico pode ser relalizado com polpa de consistência compreendida entre 1 e 20%, de preferência 1 e 5%, a uma temperatura compreendida entre 40 e 60° C. 0 pH final está de preferência compreendido entre 1.0 e 11. 0 tempo de reacção pode estar compreendido entre 30 minutos e 3 horas, de preferência entre 45 minutos e 2 horas. A extensão da deslenhificação da polpa pode ser indicado pelo Índice Kappa tal como é medido por um método padrão descrito ern TAPPI Test Methocls (Tappi, Atlanta, Ga.. ), Vol- "U 1.983, "Kappa nurnber of pulp ··· ϊ 236 cm 85". 0 índice é o volume (ern mililitros) de uma solução de permanganato de potássio 0, 1 N consumido por um grama de polpa isenta de humidade sob as condições especificadas no método atrás referido- Ê desejável, um índice Kappa baixo uma vez que indica a presença de uma quantidade menor de lenhina na polpa.

Outro processo semelhante de particular interesse envolve também o tratamento de agua de resíduos aquosos libertados no decurso do processo de transforrnação da madeira em polpa -Ν , du do processo de branqueamento da polpa ds madeira com o objec-tivo de degradar ainda mais o componente lenhina,, Uma água residual típica que pode ser tratada com uma peroxidase de oxigénio como co-substrato lenhina na presença exclusiva de efluente Ei do processo Kraft. 0 prssen invento é ilustrado pelos seguintes tHSírr pios EXEMPLO 1

Tratamento de polpa de madeira com peroxidase de lenhina recombi— nante {lenhinase} I) Produção de lenhinase recombinante A apo lennmsíá recombinance de F~a_t_,iry sp^oorium e recuperada da fracção granulosa de um lisato de uma cultura de E. coli <pBSR3) NRRL-18068 mediante extracção em ureia 4 M* acetato de sódio 50 mn,, ditiotreitol <DTT) 10 mM» 0 extracto sobrenadante é então separado do grânulo mediante centrifugação adequada e aplicado sobre uma coluna de permuta aniónica BEftE—sefarose» Fas-se passar um gradiente de NaCl entra Θ e 1 M através do templo de extracção* As fracçoes são recolhidas e analisadas quanta á sua imunorreactividade com um anticorpo anti-ienhinase* As fracçoes mais fortemente imunoreactivas são reunidas e aplicadas a uma coluna de caiibração (3-300 Sephacrylj Pharmacia) em ureia 4M? ΚΗ.-,ΡΟ^ 50 mMs E?TT 4 m.Ms pH 7. As frscçSss são novamente analisadas quanto à sua imunorreactividade e as fracçoes mais

' ίί-ί-X fortemente reactivas são reunidas e submetidas a diálise contra Tris—HC1, pH 8, DTT IrnM, glicerol a 20% (v/v)..

Adiciona-se Protoheme IX (Sigma) dissolvida em KOH 0,1 M à solução dialisada. Esta mistura é submetida a diálise, de um dia para o outro e a 4oC, contra Tris-HCl 50 mM, pll 8, glutationa reduzida 1 mM, glutationa oxidada 100 j.iM. Por fim, a amostra é submetida a diálise contre acetato de sódio 10 mM, pH tí,. 2) Processo de branqueamento com lenhinase recombinante

Extraem.....©e 2, 5 g de polpa Kraft obtida a partir de madeira rija primeiramente com hidróxido de sódio a 2, 5% durante 1 hora a 50° C e depois com agua da torneira.. A consistência da polpa é ajustada para 2,5% (correspondendo aproxiinadarnente a 2,5 g de polpa diluída ern 100 ml de agua da torneira) e o pH ê reduzido até ao valor 3, 5 com ácido clorídrico. A mistura é então lavada sob pressão com oxigénio ao mesmo tempo que é agitada.

Adicionam-se 50 (unidades; VA0)/(g de polpa) de lenhinase reconstituída è mistura e deixa-se reagir durante urna hora a 40°C. Prepara-se também uma amostra de controlo com enzima desnaturada por acçao do calor bem como uma amostra sem enzima.

Interrompe-se a reacção mediante a lavagem com água da torneira e determina-se o índice Kappa da preparação enzirnaticamente tratada da amostra de controlo. Surpreendentemente, a preparação tratada com a lenhinase recombinante na presença exclusiva de oxigénio como co-substrato exibe urn índice Kappa mais baixo que o da

EXEMPLO 2

Tratamento de polpa de madeira com u.m filtrado de uma cultura de F« chrvsosporiuin imite S! MW** 1 0 00¾ ?) de uma •«y j·»· prepar «ida pe 1 o método de Tech i-H 0 c i n JL ii 2 ÍSi 1 / ? i 988« enzim è.ti CS. de 1 n>ez i JL.\J ( uni d ades _I _ cr Ufef 5 mg / ml i_Di ϊTυΓmS Qt5 ter—

Uma mistura de enzima lenhinolitica concentrada contendo essencialmente lenhinases e peroxidases dependentes de Mn é obtida mediante uitrafiltração (limite- "MW" cultura de F. chrysosporium ATCC 24 71 Linko descrito em Enzyme Microb» Ts Esta mistura tem uma actividade en: VAO)/ml. 0 teor proteico da mistura é minado pelo método de Bradford e outros descrito em Anal B i oc hem, /Zn ZVtí. 197i

Extrairam-se primeiramente 7%5 g de polpa Kraft obtida a partir de madeira rija com hidróxido de sódio a 253% durante uma hora a 5©°C e em seguida lavam—se com água da torneira até à neutralidade» Ajusta-se a consistência da polpa para 2?5% (correspondendo aproximadamente a 2*5 g de polpa diluída em 1 ml de água da torneira) e o pH ê reduzido para o valor 3?5 com ácido clorídrico» A preparação è dividida em três amostras» Uma é suplementada com H?Q~ 1ΘΦ μΜ, outra é suplementada com H.-Cu iΘΦ μΜ e lavada s-ob pressão com oxigénio e a terceira é apenas lavada sob pressão com oxigénio» 14

Adicionam-se 50 (unidades VA0)/(g de polpa) da mistura enzimãtica a cada uma das amostras e deixam-se reagir durante uma hora a 40°C sob agitação. A reacçíSo é interrompida mediante lavagem oorn água da torneira e determinam se os indicas Kappa das amostras..

Surpreendentemente obtêm.....se melhores resultados na deslenhifioação da polpa na presença exclusiva de oxigénio como co.....substrato do que na presença de peróxido de hidrogénio suple mentado ou não com oxigénio,. EXEMPLO 3

Modificação da preparação enzimãtica

Preparou-se peroxidase de lenhina em bruto a partir de

Fhan eroçhaete......chrysQSEyâOillI quer de acordo com procedimentos publicados (por exemplo o descrito por H„ Janshekar e A„ Fiechter em J. of Biotechnology, §, 97-112, 1988) quer adquiridos a Cultor Ltd. , Helsínquia, Finlândia. a) Modificação com metoxipolietileno glicol activado

Diluiu-se 1 ml de uma preparação de peroxidase de lenhina em bruto (actlvldade„ 110 unidades VAO, teor proteico; 5 mg (Bradford e outros, Anal.. Biochem. 72, 248, 1976) ern 9 ml de tampão acetato 50 mil. Depois de ajustar o pH para ?v 5v adicio nou-se 1 g de metoxipo..Lieti.J.eno g..Li.co.l activado com cloreto cianurico (Sigma ní.~ M—3277). A solução foi agitada de um dia para o outro a 4oC„ 0 valor da actividade enzimãtica apos o tratamento era 75% do valor da actividade da mistura origina..!.,, Mac se procedeu a qualquer purificação posterior.. b) Modificação com ConA-Sepharose (Concanavalin A-Agarose)

Misturou-se 1 ml de urna preparação de peroxrj dase de lenhina em bruto (como em A), com 1 g de ConA-Sepharose (Pharmacia) em 10 ml de tampão acetato (100 mM, pH 7) cje um ^ para o outro a 4oC. 0 complexo solido foi então lavado ,-.om -[qq ml do mesmo tampão. 0 rendimento, no que se refere à actividade foi de 50%.. c) Desglicosilação

Diluiu-se 1 ml de uma preparação de perox^g^p, lenhina em bruto (tal como na alínea a)) em 1 ml C|e tampão acetato (100 mM, pH 5), Em seguida adicionaram-se 10 unidades de endoglicosidase F:' (Boehrínger) á preparação e deixou-se reagi r durante 2 horas a 37°C. 0 rendimento, no que se refere à activi -dade, foi de 30%.. EXEMPLO 4

Tratamento da polpa de madeira

Extraíram.....se 2, 5 g da polpa apropriada Pr:imeirarne,,.vt,e com hidróxido de sódio (a 2,5% por 9 de polpa seca, consistência

10%) durante urna hora a 50°C e, em seguida, lavaram-se com água da torneira até à neutralidade. Apôs a adição de 100 rnl c|e ggUa da torneira, o pH foi reduzido para 3, 5 com ácido cloriclri o o A mistura foi então lavada sob pressão com oxigénio sob agitarão A preparação enzirnática obtida do rnodo descrito no Exemplo 3 foi então adicionada â suspensão de polpa e deixou-se processar a reacção durante uma hora a 40° Π. Interromp r- .¾ reacção mediante filtração e subsequente extracção de hidróxido de sódio tal corno atrás se descreveu.. 0 grau de deslenhificação é determinado através da medição do Índice Kappa. Alenhina também é analiticamente detectãvel no filtrado/(extracto alcalino) combinado, por exemplo mediante erornatografia liquida de elevado rendimento com filtração através de gel, sendo utilizada detecçáo.

IS na

Obbem-se melhores resultados na deslenhificaçSo da polpa com uma preparação enzirnática modifiçada do quts oom uma preparação enzirnática não modificada apesar de a actividade enzirnát::i..ca da preparação modificada por α η,- ·, , g de p0|pa ser dez vezes inferior ã da preparação não modificada (Quadro 1)

Gbtêm-se melhores resultados nn-„, , , . " MUundo se utiliza apenas oxigénio do que quando se utiliza apenas , .... 1 L~"cls peroxido de hidrogénio (Quadra 2).

Kraft de mecânica

Pode efectuar-se a deslenhifi,=acãci da polpa madeira rija, da polpa Kraft de madeira macia, da polpa mista e da polpa sulfito de madeira macia (Qu-ar|rn 3) QUADRO 1

Deslenhificação de polpa Kraft de madeira rija

Todas as misturas de reacçao foram lavadas sob pressão com oxigénio antes e no decurso da reacçao (1 hora).. (a) :: albumina de soro bovino modificada com PEG preparada pelo mesmo processo que a preparação enzimatica modificada Heme bovina (Sigma n2 li.....2250), 10 ,i.ig/ml... (b) :: 5 (unidades VA0)/(g de polpa).. (c) :: 50 (unidades VA0)/(g de polpa).. 18

QUADRO 2

Efeitos comparados do peróxido de hidrogénio e do oxigénio isolado

TIPO DE PREPARAÇÃO ENZIMÃTICA DΙΞ SI... E N ΗI. FIC A Ç Ã 0 (Redução j::jercentua 1 do indico Kappa) H2°2 I sern enzirnas ...........................................................................f.......... I 0 0 [ | não modificada. 50 unidades/g | 0 6 | I recombinante, 50 unidades/g 1 0 18 | I modificada c/ PEG, 5 unidades/g 1 0 15 | | modificada c/ ConA, 5 unidades/g | .............................................................................1.......... 0 16 j ............................................................1 A concentração de per óxido de hidrogénio era de 1.00 j.ilvlo!I./'.I. :j o oxigénio era tal. corno no Quadro 1..

Deslenhificação de diferentes tipos de polpa

Tratamento da polpa de madeira

Repete-se o procedimento do Exemplo 4 utilizando 5@ (unidades VAO)/(g de polpa) da mistura enzimâtica tal como preparada no Exemplo 3, alínea c>» Quando adicionada à mesma concentração, a mistura enzimâtica tratada com endoglicosidase F á mais eficaz na deslenhificação da polpa do que uma mistura não modificada» EXEMPLO 6

Modificação da lenhina

Incubaram-se 200 p.g de lenhina organosolv (87/ό4@θ3, Organocell, Munique, RFA) obtidos a partir de uma solução a 2% em dioxano em 1 ml de tampão tartrato de sódio (iftw mM, pH 3,5) com 1 unidade VAO de uma preparação enzimâtica modificada de Conft™ -Sepharose a 4Θ°C durante uma hora simultaneamente lavada sob pressão com oxigénio» Em seguida o pH foi ajustada para 1β»5 com hidróxido de sódio e a amostra foi filtrada através de um filtro de 0,45 pm para remover o complexo enzima/ConA» Preparou-~se simultaneamente uma amostra tratada do mesmo modo com ConA--Sepharose mas sem enzima»

Os produtos da reacção foram analisados por cromatogra— fia líquida de elevado rendimento CGLER) com permeação através de gel em duas colunas TBK (BMP W&L, 7,8 x 3ΘΘ mm) (Toys Soda, Japão) ligadas em série» 0 caudal era 1 ml/min e usou-se como eluente carbonato de sódio (:l& mn, pH 10,5) com polietileno y glicol (Pfc.8 6000) b úò'â nm por HiSio ííiOu aa de

A lenhina enzimaticamente tratada foi extensivaniente ifiçada* ubservdu-3 suspensão de lenhina absorção de UV para e um substancial aumento da pureza da cor após o tratamento enziraático-.. G espectro 25ô? 310 e 360 nm dos componentes indivi duais da lenhina após separação por através de gel foi extensivaments al c rornatog raf i teradOu côas permeação

Claims

REIVZNDICAÇÚES: is

Processo de branqueamento da polpa de madeira. tratamento da polpa com pelo caracterizado por compreender i menos uma percxidase de linhina na ausência substancial de peróxido adicionado e na presença de oxigénio adicionado., 2ã - Processo de acorda com a Reivindicação 1, carac-terizado por a composição enzimática ser seleccionada a partir de um extracto bruto, de um filtrado ou de um sobrenadante de um fungo de putrefacção branco» 3ã Processa de acordo com a Reivindicação terizado por a composição Bsiizimâtica i=-sí um extracto bruto, de um filtrado ou d Phaneroc haete chrvsosporium,, carac-slsccionada a partir de im sobrenadante do
41 - Processo de acordo com a Reivindicação í„ carac- terizado por a peroxidase de linhina recombinante« ser obtida numa forma Sã - Processo de acordo com qualquer uma das Reivindx— caçoes 1 a 4, carac terizado por se branquer polpa Kraft, ore* ano- solv ou polpa sulfito» 61 - Processo para o tratamento de áqua residual proveniente do tratamento d S pGlpcS de madeira ou do pro cesso de branqueamento da polpa de madeira, o tratamento da áqua residual com caracterizado por compreender pelo menos uma peroxidase de* linhina. na ausência de um peróxido e na presença de oxigénio, 7ã Processo de acorde? com a Reivindicação 6, :arac~ terizado por compreender o tratamento da água residual com uma composição enzimática que é seleccionada. a partir de um ext.ra.cto bruto, de um -filtrado ou de um sobrenadante do Phanerochaste c hrysospor ium „ 8ã - Processo de acordo com a Reivindicação 6 ou 7, caracterizado por a água residual ser o efluente EI.
91 - Processo para a preparação de uma composição enzimática, esracterizada por se incluir na referida composição pela menos uma peroxida.se de linhina derivada de uma cultura de fungos que ê quimicamente modificada de forma a não poder ser ads-orvida sobre a ρα 1 pa = re pa raç ão de uma composição de caracteri; :ado por a reter ida bruto, de um filt.ra.do ou de um i@a - Processo para a acordo com a Reivindicação 9, composição derivar de um extraci sobrenadante de uma cultura de fungo de putrefaeçáo branco, 1 lã ~ Processe? para a preparação de uma composição de acordo com a Reivindicação 1Θ? caracterizada por a enzima ser uma peroxida.se do P» chrysosporium„
121 - Processo para a preparação de uma composição ue acordo com qualquer uma das· Reivindicações 9 a 11, caracfcerizado por a peroxidase de linhina estar associada a um composto poli-mérico solúvel ou. insolúvel na água por ligação covalente ou. não-cova1ente = 131 — Processo para a. preparação de uma composição de acordo com a Reivindicação 12, caractsrizado por o composto sei* μα i. iuiÉri.i_u solQyel poli propi1eno-gIicoI, seIeccionado entre çúcares poliméricos e ρο1ie 11lenu-qIicu1,, ρο1i ac r iIami das„ í 4ã - Processo para a preparação de uma composição de acordo com qualquer uma das Reivindicações 9 a ii, caracterizado por compreender uma peroííidase da linhina que se encontra pelo rnen os pa rc i a I men te desg 1 i c os i 1 ad a„ 15ã - Processo de branqueamento da polpa da madeira,, caracterizado por compreender o tratamento da polpa com uma composição de acorda com qualquer uma das Reivindicações 9 a 14= lòs - Processo de ac terizado por se efectuar na adicionado e na presença de o>;i ordo coma Reivindicação 15s carac— ausência substancial de peróxido génio adicionado. Processo para o tratamento da água residual atamento da polpa ds madeira ou do processo de ρο1pa de made i ra, car acterizado por compreei nder gua residual com uma composição de acordo com Reivindicações 9 a 14 na ausência de um peró x ido oxigénio. 17ã - proveniente do- tr branqueamento da o tratamento da á qualquer uma das e na presença de Lisboa, 11 de Setembro de 1ν9Θ

J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VtCTOR CORDON, 10-A 3.· 1200 LISBOA