FI96783B - Aureobasidium pullulansin käyttö massan valkaisussa - Google Patents

Description

96783

AUREOBASIDIUM PULLULANSIN KÄYTTÖ MASSAN VALKAISUSSA -ANVÄNDNING AV AUREOBASIDIUM PULLULANS VID BLEKNING AV MASSA

5 Keksintö koskee hiivan kaltaisen sienen Aure- obasidium pullulansin sekä tämän entsyymien käyttöä puumassan ligniinipitoisuuden vähentämiseksi.

Puu on kompleksinen aine, joka koostuu selluloosasta, hemiselluloosasta ja ligniinistä yhdessä 10 muiden vähäisten komponenttien kanssa. Ligniini on liittynyt ja jopa kovalenttisesti sitoutunut selluloosa- ja hemiselluloosamatriisiin. Paperin valmistusprosessissa ligniini tulee poistaa puuaineesta, sillä se vähentää kestävyyttä, antaa ruskean värin ja muita ei-15 toivottuja ominaisuuksia valmiille tuotteelle. Tavanomaisesti puuhake ensin käsitellään natriumsulfidilla (NaS2) ja natriumhydroksidillä (NaOH) ligniinin hajoit-tamiseksi olennaisilta osiltaan. Tätä nimitetään sulfaatti- tai kraftprosessiksi. Valinnaisesti muita mene-20 telmiä voidaan käyttää esim. sulfiittiprosessia. Massaa, joka näin saadaan sanotaan kemialliseksi massaksi (sellu).

Kemiallinen massa esim. kraftmassa sisältää tavallisesti 4-12 p-% jäljellä olevaa ligniiniä, joka 25 antaa massalle ominaisen ruskean värin. Ligniininpois- | · '· ton tässä vaiheessa Kappa-luku, joka kuvastaa massan : ligniinipitoisuutta, on tavallisesti • · · · 10 - 45, useimmin 12 -40.

Jotta lignipitoisuus vielä vähenisi, massa 30 asetetaan alttiiksi sarjalle kemiallisia käsittelyjä, : joita tavallisesti sanotaan valkaisuksi. Monia teolli- ··· · siä valkaisuprosesseja on jo olemassa, mutta melkein • · · jokainen sisältää ainakin jonkun seuraavista vaiheista, • 1 eri järjestyksessä: 35 C klooraus kloorilla (happamassa liuoksessa) CD reaktio kloorin ja klooridioksidin kanssa « · I · · 2 96783 D reaktio klooridioksidin kanssa (happamassa liuok sessa) E alkaalinen uuttaminen

Eo alkaalinen uuttaminen hapen läsnäollessa korotetus-5 sa paineessa H reaktio hypokloriitin kanssa P reaktio peroksidin kanssa.

Tavallisimmin valkaisuprosessi alkaa kloori-10 käsittelyllä, jota seuraa kloorattujen ligniiniyhdis-teiden uuttaminen (C - E vaiheet). Tämän lisäksi prosessi käsittää 3 tai 4 reaktiovaihetta, jotka ovat tarpeellisia, jotta saadaan massa, jolla on toivottu valkoisuusaste. Tyypillinen prosessi käsittää vaihesar-15 jän CEHOED tai CEDED. (Tavanomaisen valkaisuprosessin lisäselitystä varten ks. Smook, G.A. (1982) Handbook for pulp and paper technologists, TAPPI, Atlanta, GA.)

Kloorikäsittely on kuitenkin hyvin ei-toivot-tu, koska päästöt vaiheista C - E (sanotaan E-l pääs-20 töiksi) sisältävät hyvin suuria määriä kloorattuja orgaanisia yhdisteitä, jotka ovat ympäristölle haitallisia esim. kloorattuja fenoleja. Lisäksi, riippuen niiden hyvin korrosiivisesta luonteesta, on päästöjä hyvin vaikea kierrättää. Täten ympäristön kannalta 25 katsoen on selvää, että valkaisutekniikat, jotka voivat vähentää saastumista, ovat hyvin tervetulleita.

• · · · Luonnossa on monia mikro-organismeja, jotka 3 96783 via entsyymejä vaan myöskin sellulaasia, joka vaikuttaa haitallisesti massan selluloosasisältöön.

Aureobasidium pullulans on hiivan kaltainen sieni, joka tuottaa hemisellulaaseja mukaan lukien 5 ksylanaaseja ja mannanaaseja, kuten voidaan osoittaa niiden vaikutuksella tässä järjestyksessä ksylaanin ja mannaaniin. A. pullulans-kannat, jotka tuottavat kohtalaisen suuria määriä ksylanaasia, ovat esim. A. pullulans Y-2311 ja Y-2311-1, molemmat saatavana NRRL Col-10 lection, Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, USA.

Nyt on havaittu, että A. pullulans'in hemisel-lulaasit ovat hyvin tehokkaita massan hemiselluloosasi-15 säilön hajoittamisessa, niin että ligniini tehokkaasti siirtyy paikaltaan hemiselluloosamatriisissa tai vapautuu irrotettavaksi. Ligniini voidaan tämän jälkeen erottaa tavanomaisella uuttamisella ja poistaa massasta. Itse asiassa, ksylanaasit pystyvät katalysoimaan 20 sekä lehtipuu- että havupuuhemiselluloosan, joka on erilaisten polysakkaridien muodostama polymeeri, hydro-lyysia, erityisesti ksylaanin, kun taas mannanaasi katalysoi mannaania sisältäviä hiilihydraatttien, havupuuhemiselluloosan pääkomponentin, hydrolyysiä.

25 Lisäksi on havaittu, että A. pullulans erittää • · ; hyvin pieniä määriä sellulaasia ja että A. pullulansia tai A. pullulans-viljelmästä saatua supernatanttia t*:‘: voidaan tämän takia käyttää selektiivisesti massan ♦ ligniinisisällön poistamiseen, kun selluloosasisältö • · 30 jää oleellisen koskemattomaksi. Siksi tälläinen käsit- . ^ tely voidaan yhdistää kemialliseen valkaisuprosessiin, • · · joka sisältää vähennetyn määrän käsittelyjä (vähemmän • · · *·’ ’ kuin 5 tai 6, jotka tavallisesti kuuluvat tavanomaiseen *:"i prosessiin) ja jossa kloorimäärä myös vähenee, sillä 35 tyydyttävä valkaisuaste voidaan silti saada.

Lopuksi, on myös havaittu että paperilla, joka tuotetaan massasta, joka on altistettu biologiselle 4 96783 käsittelylle, A. pullulans-villelmälle tai A. pullu-lansin entsyymeille yhdistettynä kemialliseen valkaisuun, on paremmat ominaisuudet kuin paperilla, joka on tuotettu tavanomaisesti valkaistusta massasta. Tämä on 5 erityisen yllättävää, koska voisi olettaa, että ksy-laanin poiston tuloksena olisi paperin ominaisuuksien, kuten puhkaisu- ja repäisyindeksien huonontuminen (kts., esim. Jeffries et. ai., 1989 Biotechnology in the Pulp and Paper Industry, 4 th International Confe-10 rence, Raleigh, NC sivut 59 - 60).

Tämän mukaisesti keksintö tuo esille massan valkaisuprosessin, joka käsittää a) massan ligniinisi-sällön solubilisoinnin käsittelemällä massa A. pullu-lans viljelmällä tai entsymaattisella järjestelmällä, 15 joka sisältää vähintään yhden A. pullulansin hemisellu-laäsin ja b) solubilisoidun ligniinin poiston massasta.

"Valkaisuprosessilla" tarkoitetaan tässä menetelmää, jolla parannetaan puumassan valkoisuutta tai valkoisuusastetta tai molempia.

20 Termillä "solubilisoida" tarkoitetaan tässä massassa olevaan ligniinin viitaten, jokaista ligniiniin aikaansaatua vaikutusta, joka on seuraus he-miselluloosan hajoittamisesta tai modifikaatiosta ent-symaattisen aktiivisuuden avulla. Täten ligniini voi-25 daan tehokkaasti siirtää hemiselluloosamatriisista tai jättää irrotettavaksi.

: "Ligniinillä" tarkoitetaan tässä ei ainoastaan : luonnollisia, ei-modifioituja muotoja, vaan myös niitä :Y: muotoja, joita esiintyy kemiallisesti käsitellyssä 30 massassa, jotka ovat kokonaan tai osittain kemiallises-: .*. ti modifioituja erilaisilla aineilla kuten sellaisilla, joita käytetään kraft- tai sulfiittimassaprosessissa.

• · · "Biologisella käsittelyllä" tarkoitetaan tämän jälkeen massan käsittelyä, jossa käytetään A. pullulans 35 viljelmää tai entsymaattista järjestelmää, joka sisäl-tää ainakin yhden A. pullulansin hemisellulaasin.

Jokainen A. pullulans-kanta voidaan tämän 5 96783 keksinnön mukaisesti käyttää massan käsittelyyn tai entsymaattisen järjestelmän tuottamiseen. Edullisimpia kantoja ovat ne, jotka tuottavat suuria määriä hemisel-lulaaseja, erityisesti sellaiset kannat, jotka voidaan 5 karakterisoida "entsyymin ylituottajina". Ylituottaja A. pullulans-kannat ovat tavallisesti valkoisia tai värillisiä muunnoksia (pinkki, punainen, jne.) verrattuna tavallisiin sininen/musta kantoihin. Esimerkkejä näistä kannoista kuvataan julkaisussa Leathers, et. 10 ai., Biotech. Bioeng. Symp. (1984) 14: 225. Suosituimmat kannat ovat A. pullulans Y-2311-1 ja Y-2311.

Lehtipuu- ja havupuumassojen käsittelyyn edullisia kantoja ovat ne, jotka tuottavat suuria määriä ksylanaasia, edullisimpia ovat endo-ksylanaasit. Vaih-15 toehtoisesti voidaan myös edullisesti valita mannanaa-si-ylituottavia kantoja havupuumassan käsittelyyn.

Keksinnön mukaisen erään näkökannan mukaisesti A. pullulansia voidaan yksinkertaisesti kasvattaa massassa, edullisesti perusteellisen massasiirrostuksn 20 jälkeen, ajanjakson ajan, joka on riittävä saamaan aikaan toivotun vaikutuksen. Optimaaliaika on riippuvainen monesta eri tekijästä, mutta voi tavallisesti vaihdella 2-20 päivään ja pidemmät käsittelyajat ‘ voidaan jakaa vaiheisiin, joiden välillä massa pestään :.v 25 ja jota seuraa sienen uusi siirrostus. Edullisesti eri . [ : kasvatusajat ovat 2-12 päivää, edullisemmin 2-8 : päivää. Edullisten kantojen optimaalinen entsyymi- • · · · tuotanto tapahtuu tavallisesti noin 2-4 päivässä .·.·. viljelyn alusta.

30 Keksinnön mukaisen toisen näkökannan mukaises- . . ti, entsymaattinen järjestelmä, joka sisältää ainakin • · ® yhden A. pullulansin hemisellulaasin, voi myös olla • · * *·* * käyttökelpoinen. Vaikka "entsymaattisella järjestelmäl lä" tarkoitetaan mitä tahansa entsyymivalmistetta, 35 jossa ei ole elinkykyisiä A. pullulans organismeja, esimerkiksi puhtaassa muodossa olevaa tai sieniviljel-·'·’ män raaka-uutoksesta saatua, on edullinen valmiste su- 6 96783 pernatantti, joka on saatu A. pullulans-viljelmästä. Vaikka supernatanttia voidaan käyttää sellaisenaan, sitä edullisesti väkevöidään ennen käyttöä. Edullinen väkevöimismenetelmä käsittää yksinkertaisen ultrasuoda-5 tuksen, sopivasti tarkoitettu saamaan aikaan 5-25 kertaisen väkevöitymisen ja joka tapauksessa saamaan konsentraatin, joka sisältää olennaisesti kaikki entsyymit, jotka vaikuttavat ligniiniin tai hemisellu-loosaan. Tällaiset könsentraatit ovat vielä olennaises-10 ti vapaita sellulaasi-aktiviteetista eivätkä täten vahingoita massan selluloosasisältöä.

Edullisimmin supernatantti saadaan A. pullulans-viljelmästä, joka kasvatetaan sellaisen hiililäh-teen läsnäollessa, joka on sopiva indusoimaan tai sti-15 muloimaan sienen hemisellulaasituotantoa. Näihin kuuluvat edullisesti ksylaani, ksyloosi, mannaani (galakto-mannaani, glukomannaani, galaktoglukomannaani), mannoo-si, mekaanisia ja kemiallisia massoja, hake, sahajauhot tai muut aineet, jotka sisältyvät hemiselluloosaan tai 20 saadaan hemiselluloosasta. On myös havaittu, että hiili lähde, jolla sienet kasvatetaan, saattaa vaikuttaa sienen tuottaman hemisellulaasin lämpöstabilisuuteen. Siksi erityisen edullisia hiililähteitä ovat lehtipuu-ja havupuumassat, mannaania sisältävät hiilihydraatit 25 ja ksylaani, tämän viimeksi mainitun ollessa edullisin.

. Y Keksinnön mukaista menetelmää käytettäessä on • · · _ J*Y edullista ottaa talteen supernatantti 2-12 päivän A_^ *.*‘ pullulans-villelmästä, jolloin saadaan optimaalinen • · S.V entsyymituotanto. Yleisenä sääntönä entsyymipitoisuus 30 voi olla alueella 0,1 - 500 (XU) ksylanaasi yksikköä/g : uunikuivattua massaa, edullisesti 1 - 100 XU/g, edulli- • ·· · :*j*; semmin 5-50 XU/g, edullisimmin 15 - 30 XU/g. Yksi * ksylanaasiyksikkö vastaa yhtä pmol/min ksylanaasista muodostuneita pelkistäviä sokereita minuutissa 50°C 35 lämpötilassa.

Käytettäessä entsymaattista järjestelmää, menetelmä suoritetaan edullisesti lämpötilassa, joka 7 96783 lisää entsymaattista aktiviteettia, esim. 10 - 80°C, edullisemmin 20 - 60°C, edullisimmin 40 - 50°C. Aika, joka tarvitaan toivotun vaikutuksen aikaansaamiseksi, on riippuvainen monesta tekijästä. On kuitenkin osoi-5 tettu, että hyviä tuloksia saadaan entsyymikäsittely-ajan ollessa 1-8 tuntia, edullisesti 2-5 tuntia. Vaikka aika pidennetään 30 tuntiin ja vieläkin pidemmäksi, saadaan ainoastaan vähäisiä lisäetuja.

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa 10 moneen eri puumassaan, jonka jäljellä olevaa lig-niinisisältöä tulee vähentää. Valkaisematon puumassa, jota voidaan käsitellä keksinnön mukaisella menetelmällä, on sopivasti kuumahierre (TMP), kemimekaaninen massa (CMP), kemikuumahierre (CTMP) ja kemiallinen 15 massa (CP) kuten sulfIitti- ja Kraft-massa, viimeksi mainittujen ollessa edullisia.

Noudatettaessa alkuperäistä biologista käsittelyä, jossa käytetään A. pullulans-villelmää A. pullu-lans entsymaattisen järjestelmän kanssa, solubilisoidun 20 ligniinin poisto massasta voidaan suorittaa joko pesemällä, suodattamalla tai uuttamalla, edullisesti uuttamalla. Pesu esim. vedellä tehdään sopivasti lämpötilassa 40° - 80eC, sopivammin 60°C. Sopivia tavanomaisia uuttamisaineita ovat esim. emäkset, kuten alkalimetal-25 lihydroksidit yksin tai yhdessä vetyperoksidin, dime- . Y tyyliformamidin, dioksaanin, asetonin ja alkoholin • · · ··Y kanssa. Laimenettua vesipitoista natriumhydroksidiuut- V * toa suositaan tavallisesti. Tyypillinen uuttamisvaihe voidaan suorittaa sulppusakeuden ollessa 3 - 20 %, 30 edullisesti 5 - 15 % lämpötilassa 60 - 80°C. Lopullinen : pH on yli 10,8, edullisesti yli 11, muuten ligniinin • ♦· ♦ .γ: poisto on epätäydellinen. Retentioaika voi olla 30 min - 3 h, edullisesti 45 min - 2 h.

On erityisen sopivaa suorittaa uuttaminen, 35 esim. alkaliuuttaminen, hapen tai peroksidin läsnäollessa. Sopivasti happi lisätään paineen alaisena. Tämä .···. ei ole edullista ainoastaan valkaisun aikaansaamiseksi • · 8 96783 vaan myös parantaa massan valkoisuusastetta.

Massan laadun parantamiseksi, keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää yhdistettynä toisiin tavanomaisiin kemiallisiin käsittelyihin, kuten johdan-5 nossa kuvattuihin, esim. C, CD, D, E, Eo, H tai P. Täten keksinnön mukainen menetelmä voi myös sisältää massan esikäsittelyn tai jälkikäsittelyn kemiallisilla aineilla, kuten uuttamisaineilla tai klooria sisältävillä aineilla, esim. kloorilla. Valinnaisesti kemiallinen 10 käsittely voi seurata biologista käsittelyä välittömästi, jolloin solubilisoidun ligniinin poisto tehdään myöhemmin. Edullisesti kemiallinen käsittely tehdään biologisen vaiheen jälkeen siten, että kemialliset valkaisuaineet eivät häiritse entsymaattista aktiviteet-15 tia. Keksinnön mukaista menetelmää seuraa sopivasti sarja 2 tai useampia käsittelyjä, edullisemmin ei enemmän kuin 4, edullisimmin ei enemmän kuin 3 käsittelyä.

Lisäksi on havaittu, että käsiteltäessä massa A. pullulans-vlHelmällä tai A. pullulansln entsymaat-20 tisella järjestelmällä ennen massan kemiallista valkaisuprosessia, saadaan yllättäviä edullisia tuloksia valkaisussa tarvittavien kemikaalien vähentyneen määrän muodossa.

‘ Mitä tulee tavanomaiseen valkaisuprosessiin, 25 määrä klooria sisältäviä yhdisteitä (Chl), esim. kloo-. : : ria, joka on tehokas parantamaan massan valkaisuastet- • :1: ta, määritetään tavallisesti seuraavan kaavan I mukaan: • · · · • · · i.: : • \ Chl[ilmaistuna % (W/W) uunikuivattua massaa1] = 0,2xK (I) • · « 30 . . jossa K on käsiteltävän massan Kappa-luku • · · • · · • ·· · • · » *·1 1 1 kuivatus tehdään 2-10 tuntia noin 105°C.

35 Esimerkiksi, jos Kappa-luku on 15, niin kloo- rimäärän tulisi olla 3 %. CD-käsittelyssä osa klooria on korvattu klooridioksidilla. Kloorin suhde klooridioksi- 96783 9 diin voi vaihdella riippuen tehtaan vaatimuksista, mutta on tyypillisesti suhteessa 9:1.

Jos massaa käsitellään biologisesti ennen asettamista alttiksi C- tai C -vaiheille, niin tarvitta-

D

5 van kloorin määrää, jolla saadaan toivottu valkaisuas-te, voidaan huomattavasti vähentää. "Klooritarve" on vähintään 20 % pienempi kuin määrä, joka saadaan käyttämällä kaavaa I, esim. pienempi kuin Chl = 0,2K, jossa K on' massan Kappa-luku ennen biologista käsittelyä. 10 Edullisesti määrää voidaan vähentää 20 % ja jopa vielä edullisemmin vähintään 30 %, edullisimmin noin 50 %. Tämä on erityisen mielenkiintoista, koska vähemmän klooria valkaisuprosessissa saa aikaan vähemmän haitallisia päästöjä.

15 Keksintöä havainnollistetaan lisäksi seuraa vasti : YLEISIÄ MENETELMIÄ 20 A. Aureobasidlum pullulans-viljely A. puilulans-kanta Y-2311-1 viljellään ja säilytetään petrimaljoissa, joissa on YM elatusainetta, kun siirroste on osa nestemäisestä viljelmästä.

t · YM elatusaine sisältää: ···; 25 • · 3 g hiivauutetta • · : 3 g mallasuutetta • · · ι,ί : 5 g peptonia *Y: 10 g glukoosia 30 20 g agaria : .·. 11 tislattua vettä * · · ♦ ·· · 1 I i « · • · · • · ·

Kun siirroste otetaan kiinteästä viljelmästä, esim. yksittäinen pesäke kasvatettu YM petrimaljassa, kanta 35 kasvatetaan ensin seuraavassa nestemäisessä perusela-tusaineessa: 10 96783 0,67 % hiiva typpi emäs 0,2 % asparagiinia 0,2 % kaliumfosfaattia (yksiemäksinen) 1,0 % glukoosia 5

Sterilointi-tehdään suodattamalla 0,22 mikronin suodattimen läpi.

Suurempia viljelyltä varten hiililähde (glukoosi) YM elatusaineessa korvataan 1 % ksylaanilla, 1 % 10 mannaanilla tai 1 % kraftmassalla (uunikuivattu paino). Suurempi viljelmä siirrostetaan osalla viljelmästä, joka on kasvatetu peruselatusaineessa 1 % pitoisuudessa (vol/vol). Viljelmiä kasvatetaan 2-8 päivää 28 -30°C. Ksylanaasiaktiviteetti määrätään tyypillisesti 2 päivän 15 jälkeen. Viljelmän linkouksen jälkeen supernatantti otetaan talteen. Kun massaa käytetään hiililähteenä, elatusaineen sulpun sakeus on tavallisesti 1 %. [sulpun sakeus määritellään standardimenetelmällä massan kuiva-painona (2-10 tunnin kuivatuksen jälkeen noin 105°C) 20 ilmaistuna prosentteina kokonaisuudesta mitattuna tilavuuksina] B. Kappa-luvun määritys ,·, , Ligniinin poiston määrä voidaan osoittaa Kap- 4 « < ! 25 pa-luvulla kuten standardimenetelmässä, jota seloste- ,Y taan julkaisussa TAPPI Test Methods (Tappi, Atlanta,- « « «

Ga.) Voi. 1, 1988 "Kappa number of pulp - T 236 cm 85".

l.‘* Kappa-luku on 0,1 N kaliumpermanganattiliuoksen tila- • s *.V vuus (millilitroissa), jonka yksi gramma kuivaa massaa 30 (uunikuivattu massa; kuivatus tehdään 2-10 tuntia i noin 105°C) kuluttaa olosuhteissa, joita edellä olevas- sa menetelmässä selostetaan. Tulokset korjataan vastaa- 9 maan lisätyn permanganaatin 50 % kulutusta. Matala

Kappa-luku on toivottu, sillä se osoittaa, että massas-35 sa on jäljellä vähemmän ligniiniä.

11 96783 C. Entsyymivalmiste

Kun viljely on lingottu 5000 rpm 20 minuuttia, supernatantti kerätään ja valinnaisesti väkevöidään 10-kertaisesti käyttäen YM-10 Amicon ultrasuodatinta.

5 Konsentraatti dialysoidaan deionisoitua vettä vastaan 24 - 48 tuntia. Entsyymit voidaan säilyttää 4°C useita viikkoja tai -70°C vielä pidempiä aikoja.

D. Analyysejä entsyymiaktiviteetin määrittämiseksi 10 1. Endo-ksylanaasi aktiviteetti: 5 ja 10 μΐ sopivasti laimennettua entsyymikon-sentraatiota sekoitetaan 50 mM natriumsitraattipusku-rin, pH 4,8 (puskuri A) kanssa. Tämä lisätään 250 μΐ 15 substraattia (1 % kauran spelttiksylaania puskurissa A), joka on esi-inkuboitu 50°C. Reaktion annetaan jatkua 30 minuuttia 50°C. 0,5 ml DNSA-liuosta (kts alla) lisätään tämän jälkeen entsyymi-substraatti liuokseen ja lämmitetään 5 minuuttia 100°C. Lisätään 5 ml deioni-20 soitua vettä ja mitataan absorbanssi 540 nm. Kalibroin-tikäyrästä, käyttäen ksyloosia standardina, määritetään pelkistävien sokerien määrä. 1 yksikkö endo-ksylanaasi aktiviteettia määritellään 1 mikromooliksi pelkistävää sokeria, joka muodostuu minuutissa 50°C, 25 30 minuutin kokeessa.

• · i,: : DNSA liuos: ί 1 g 3,5-dinitrosalisyylihappo lY* 1,6 g natriumhydroksidla 30 30 g natriumkaliumtartraattia ; .·, 100 ml deionisoitua vettä.

Il» m · n· l « t • · · 2. Endo-sellulaasi aktiviteetti: Käytetään samaa menetelmää kuin endo-ksylanaa-35 sianalyysissä, paitsi että käytetään 0,5 % karboksime-tyyliselluloosaa (CMC) substraattina 1 % ksylaanin sijasta. Kun analyysia on jatkettu 30 minuuttia, ei 12 96783 mitään mitattavaa endo-sellulaasiaktiviteettia ollut havaittavissa A. pullulansin tuottamissa entsyymeissä. Pieniä määriä aktiviteettia voidaan osoittaa vain pidemmän ajan kuluttua (17 tuntia).

5 3. Mannanaasiaktiviteetti: Tämä analyysi on identtinen endo-ksylanaasiak-tiviteettianalyysin kanssa, paitsi että galaktomannaani tai joitakin muita mannaania sisältäviä hiilihydraatit) teja käytetään ksylaanin sijasta.

4. Ksylosidaasi-, glukosidaasi- ja ara-binosidaasiaktiviteetit: 50 μΐ entsyymiä lisätään 150 μΐ puskuri A. 15 Tämä lisätään 100 μΐ lOmM substraattiliuosta (kts. alla) ja kasvatetaan 37°C 10 minuuttia. 0,5 ml natrium-karbonaattia (IM) lisätään tämän jälkeen näytteisiin ja absorbanssi mitataan 400 nm. 1 yksikkö aktiviteettia määritellään mikromoleina p-nitrofenolla, jota vapautuu 20 minuutissa 37°C.

Substraatti voi olla: p-nitrofenyyli-fl-D-ksylopyranosidi (ksylosi-daasiaktiviteetti) p-nitrofenyyli-fi-D-glukopyranosidi (glukosi-25 daasiaktiviteetti) ,. p-nitrofenyyli-fi-D-arabinopyranosidi (arabino- ; :’i sidaasiaktiviteetti) ··« · ' S · · .y. ESIMERKKI 1: Pohjoisen havupuun kraftmassan valkaisu • · 30 käyttäen A. pullulans-viljelmästä saatua . 4.t supernatanttia • · · “!*.* 2 g:n uunikuivattuja näytteitä pohjoisen havu- • · · *** ’ puun kraftmassasta pestään deionisoidulla vedellä, suodatetaan ja suspendoidaan 80 ml puskuri A. Entsy- :·· 35 maattiset valmisteet, joita käytettiin tutkimuksessa, valmistettiin käyttäen ksylaania, pohjoisen lehtipuu- r « > kraftmassaa tai pohjoisen havupuu-kraftmassaa hiililäh- t · i * 13 96783 teenä A. pullulansin kasvatuksessa ja väkevöitiin kuten edellä on kuvattu. Näytteet käsitellään osalla entsymaattista liuosta 15,5 tuntia, pestään 1 litralla de-ionisoitua vettä ja käsitellään tämän jälkeen toisen 5 kerran samalla määrällä entsyymiä 5 tuntia. Toisen entsymaattisen käsittelyn jälkeen näytteet uutetaan 80 ml 2,5 % (w/v) natriumhydroksidia 90 minuuttia 60°C ja pestään tämän jälkeen sopivasti 2,5 litralla deionisoi-tua vettä, jotta saadaan neutraali pH. Massan Kappa-10 luvut esitetään ohessa.

Näyte (Hiililähde) Entsyymimäärä* Kappa

Kontrolli 0 20,2 15 A. pullulans 100 18,6 (pohjoinen lehtipuu) A. pullulans 100 18,5 (ksylaani) A. pullulans 10 19,3 20 (pohjoinen havupuu) * yksikköä endo-ksylanaasi aktiviteettia grammassa uunikuivattua massaa.

ESIMERKKI 2. Havupuukraftmassan valkaisu käyttäen • · ·’ 25 ksylanaasia ja mannanaasia :.V 2 g painoisia uunikuivattuja näytteitä pöh- • ; ; joisen havupuukraftmassasta pestiin deionisoidulla : vedellä, suodatettiin ja suspendoitiin tämän jälkeen 80 ml puskuri A. Entsymaattiset valmisteet, joita tutki- • -r- .·.·. 30 muksessa käytettiin, valmistettiin kuten edellä on * * esitetty käyttäen A. pullulansin hiililähteenä joko . ksylaania ksylanaasin tuottoa indusoimaan, tai galak- • · · **?.* tomannaania indusoimaan mannaanaas i tuottoa. Näytteet kasvatetaan ksylanaasin tai ksylanaasin ja mannanaasin 35 läsnäollessa 18 tuntia 50°C vesi ravisteluhauteessa ja pestiin 1 litralla deionisoitua vettä, tämän jälkeen uutettiin 2,5 % (w/v) NaOH 60°C 90 minuuttia, ja pes- 14 96783 tiin sitten 2 litralla deionisoitua vettä. Kontrol-linäyte valmistettiin myös. Kappa-luvut esitetään ohessa .

5 (Yksikköä/grammaa massaa)

Ksylanaasi Mannanaasi Kappa-luku 0 0 19/5 100 0 17/9 10 100 15 16/0 ESIMERKKI 3: Lehtipuukraftmassan valkaisu käyttäen A. pullulans supernatanttia 2 g painoisia uunikuivattuja näytteitä poh-15 joisen lehtipuu-kraftmassasta pestiin deionisoidulla vedellä/ suodatettiin ja suspendoitiin tämän jälkeen 80 ml natriumhydroksidia (2,5 % w/v) 60 minuuttia 60°C. Näytteet pestiin tämän jälkeen deionisoidulla vedellä, kunnes pH on neutraali ja suspendoitiin tämän jälkeen 20 80 ml puskuri A. Entsymaattinen valmiste, jota käytet tiin tässä tutkimuksessa, on tuotettu, kuten edellä on esitetty käyttäen pohjoisen lehtipuun kraftmassaa hii-lilähteenä. Osa tätä entsymaattista valmistetta lisät-... tiin massasuspensioon. 7 tunnin jälkeen 40°C lämpöti- *' 25 lassa, seosta pestiin 1 litralla deionisoitua vettä ja v.‘ käsiteltiin sitten toisen kerran samalla määrää entsyy- • · : miä 15 tuntia 40°C. Toisen entsymaattisen käsittelyn : : : jälkeen näytteet uutettiin 80 ml 2,5 % (w/v) natriumhy- droksidia 90 minuuttia 60°C. Näytteet pestiin tämän 30 jälkeen 2,5 litralla deionisoitua vettä kunnes pH oli • · neutraali. Kappa-luvut on esitetty ohessa.

15 96783 (pohjoinen lehtipuu) A. pullulans 100 7,8 (pohjoinen lehtipuu) * yksikköä endo-ksylanaasiaktiviteettia grammassa uuni-5 kuivattua massaa.

ESIMERKKI 4: A. pullulansin kasvatus eri hiililähteillä 500 ml A. pullulans-villelmiä kasvatetaan 3 päivää 28°C peruselatusaineessa käyttäen hiililähteenä 10 1 % kauran spelttiksylaania, 1 % pohjoista havupuu- kraftmassaa (Kappa-luku: 22,6) tai 1 % pohjoista leh-tipuu-kraftmassaa (Kappa-luku: 18,6). Kolmen päivän jälkeen, viljelmät lingotaan 5000 rpm 2 tuntia ja su-pernatantti otetaan talteen, väkevöidään 10-kertaiseksi 15 käyttäen YM-10 Amicon ultrasuodatusmembraania ja dialy-soldaan tämän jälkeen vähintään 24 tuntia deionisoitua vettä vastaan. Rinnakkain hiililähteinä käytetyt massat uutetaan 80 ml 2,5 % natriumhydroksidia 90 minuuttia 60°C ja pestään tämän jälkeen deionisoidulla vedellä 20 kunnes pH on neutraali.

Lehtipuu-kraftmassan Kappa-luku pienenee alkuarvosta 18,6 arvoon 7,6. Jos saman tyyppistä massaa ei käsitellä A. pullulansilla vaan ainoastaan uutetaan, Kappa-luku pienenee vain arvosta 18,6 arvoon 11,4. Uut-: 25 tamisen jälkeen havupuu-kraftmassan Kappa-luku pienenee : alkuarvosta 22,6 arvoon 15,2 kun ensin käsitellään A^ . pullulansilla (pikemmin kuin arvosta 22,6 arvoon 18 • · : .·. ilman alkuperäistä biologista käsittelyä).

2 g painoisia lehtipuukraftmassanäytteitä · « *.*. 30 pestään deioniTsoidulla vedellä, suodatetaan ja suspen- « « · * * doidaan 80 ml puskuri A. 2 ml 10-kertaisesti väkevöityä entsymaattista valmistetta, joka on valmistettu, kuten • · · : edellä on selostettu, lisätään näihin suspensioihin.

Kontrollinäyte (ilman entsyymiä) valmistetaan myös.

35 Kaikki näytteet kasvatetaan 18 tuntia 45 - 50°C, uutetaan tämän jälkeen 80 ml 2,5 % natriumhydroksidia 90 minuuttia 60°C ja pestään deionisoidulla vedellä kunnes 16 96783 pH on neutraali.

Kun kontrollinäytteen Kappa-luku on 10,3, entsymaattisesti käsiteltyjen massanäytteiden Kappa-luvut ovat 6,7 tai 7,4 riippuen siitä, onko supernatantti 5 saatu A. pullulans-viljelmästä, joka on kasvatettu lehtipuumassalla tai ksylaanilla, vastaavasti.

Yhteenveto hiililähteiden ja entsyymiaktivi-teettien välisistä korrelaatioista on esitetty ohessa.

10 Entsyymiaktivitee- tit (yksikköä/ml)

Hiililähde Proteiini endo- endo- (mg/ml) ksyla- sellu- naasi laasi* 15 ksylaani 0,739 157 0,019 lehtipuu- 0,719 85 0,010 kraftmassa havupuu- 0,189 15 ei määri- kraftmassa tetty 20 * 17 tunnin näytteessä.

ESIMERKKI 5: A. pullulansin kasvatus kraftmassassa 500 ml A. pullulans-viHelmiä kasvatettiin joko 1 % lehtipuu-kraftmassassa (Kappa-luku 18,6) tai 1 25 % havupuu-kraftmassassa (Kappa-luku 22,6) peruselatus- • · aineessa 2-8 päivää 30°C. Tiettynä päivänä viljelmä : i suodatetaan massan poistamiseksi, supernatantti väke- • · * vöidään 10-kertaisesti käyttäen YM-10 Amicon ult- :T; rasuodatusmembraania, dialysoidaan tämän jälkeen dei- 30 onisoitua vettä vastaan vähintään 24 tuntia ja prote- • · iinpitoisuus ja endo-ksylanaasi- ja ksylosidaasi- akti-; viteetit määritetään. Suodatettu massa uutetaan 80 ml **!.* 2,5 %(w/v) natriumhydroksidia 60°C 90 minuuttia ja

’ pestään tämän jälkeen deionisoidulla vedellä kunnes pH

·:*: 35 on neutraali. Tulokset on esitetty alla.

tl 17 96783

Pohjoinen havupuu-kraftmassa hiililähteenä Entsyymiaktiviteetti (yksikköä/ml) Kappa- Päivä Proteiini Endo- ksylosi- luku 5 (mg/ml) ksyla- daasi naasi 2 0,394 3,3 0,024 16,9 4 0,299 6,5 0,028 16,2 6 0,384 3,9 0,030 18,4 10 8 ND ND ND 15,7

Alkuperäinen Kappa-luku = 22,6

Kappa-luku massanäytteestä, joka on uutettu natriumhy-droksidilla ilman, että sitä on käytetty A. pullulansin substraattina = 18,0.

15

Pohjoinen lehtipuu-Kraftmassa hiililähteenä Entsyymiaktiviteetit (yksikköä/ml) Kappa- Päivä Proteiini endo- ksylosi- luku 20 (mg/ml) ksyla- daasi naasi 2 0,678 86,7 0,051 8,6 4 1,613 118,2 0,118 9,6 6 1,200 66,0 0,120 9,6 25 8 ND ND ND 8,6

Alkuperäinen Kappa-luku = 18,6 • ·

Kappaluku massanäytteestä, joka on uutettu natriumhy- : droksidilla ilman, että sitä on käytetty A. pullulansin • · « '1'..’ substraattina = 11,4.

• · * ; . 30 ND = ei määritetty : : : • · ESIMERKKI 6: Eri substraateilla kasvatettujen A. pullu • ♦ : länsin tuottamien entsyymien stabiliteetti.

Supernatanttien, jotka saatiin A. pullulans-35 viljelmistä, joita on kasvatettu joko ksylaanilla tai pohjoisen lehtipuu-kraftmassalla, entsymaattisten aktiviteettien stabiliteetti määriteltiin 50°C lämpöti- • · 18 96783 lassa. Supernatanttien osaa kasvatettiin ensin 50 °C lämpötilassa ja sekä endo-ksylanaasiaktiviteetti että ksylosidaasiaktiviteetti analysoitiin välittömästi tämän jälkeen.

5 Entsyymeillä, joita tuotetaan, kun ksylaani on

hiililähde, on suurempi lämpöstabiliteetti kuin entsyymeillä, joita tuotetaan, kun kraftmassa on hiililähde. Ksylaanin ollessa hiililähde, endo-ksylanaasiaktiviteetti on 100 % alkuperäisestä aktiviteetista 50 °C

10 lämpötilassa 30 tunnin altistuksen jälkeen. Ksylosidaasiaktiviteetti laskee 94 %:iin alkuperäisestä aktiviteetista. Käänteisesti entsyymillä, jota tuotetaan käyttäen lehtipuu-kraftmassaa substraattina, on ainoastaan 17 % alkuperäisestä endo-ksylanaasi-aktiivi-15 suudestaan 50°C lämpötilassa 30 tunnin altistuksen jälkeen ja 90 % alkuperäisestä ksylosidaasiaktiviteetis-taan.

ESIMERKKI 7: Ligniinin poisto kraftmassasta sulpun 20 sakeuden ollessa suuri 2 g (kuiva paino) pohjoista lehtipuu-kraftmassaa pestään deionisoidulla vedellä ja suodatetaan kuivaksi. Puskuri A ja ksylanaasi (100 yksikköä per gram-maa kuivaa massaa) lisätään antamaan sulpun sakeus 10 < · ; ’ 25 %. Näytteitä kasvatetaan huoneen lämpötilassa 7 päivää.

*·*.· Näytteet uutetaan tämän jälkeen 2,5 % (w/v) NaOH 90 : : minuuttia 60°C ja pestään deionisoidulla vedellä, kun- • · ·.· I nes pH on neutraali. Kontrollinäyte (ei ksylaanilisäys- tä) valmistetaan ja käsitellään samalla tavalla.

30 Kontrollinäytteen Kappa-luku on 14,4. Entsy- • · maattisesti käsitellyn massanäytteen Kappa-luku on 11,4.

• · « ··· · ESIMERKKI 8: 35 Identtisiä massanäytteitä (Kappa-luku = 15) käsitellään eri valkaisujärjestyksessä (kts. alla). "Klooritarve" määritellään ensin tavalliseen tapaan « · * · tl: 19 96783 kaavan I mukaan, perustuen käsittelemättömän massan Kappa-lukuun. Määrä klooria, joka todellisuudessa lisätään reaktioliuokseen, on pienempi kuin määrä, joka saatiin laskemalla kaavasta I, paitsi testikontrollissa 5 1. Entsymaattinen käsittely tehdään ksylanaasiannoksen ollessa 23 XU/g 23 tuntia. Valkaisumenetelmän lopussa massan valkoisuusaste mitataan TAPPI standarditesti-menetelmän T 452 mukaan. Massalla, joka on sopiva käytettäväksi paperiteollisuudessa, pitäisi olla valkoi-10 suusaste 88 tai korkeampi.

Tämän jälkeen valkaistut massanäytteet käytettiin paperinvalmistukseen, käyttäen kaikille näytteille samaa menetelmää. Paperin repäisykerroin, puhkaisu vetolujuus ja katkeamispituus määriteltiin TAPPI testi-15 menetelmän T414, T403 ja T404 mukaan tässä järjestyksessä. Mitä korkeampia arvot ovat, sitä parempia ne ovat.

Tulokset on esitetty oheisessa taulukossa. Kontrolli Kontrolli Esim. Esim. Esim.

20 12 12 3

Valkaisu järjestys CnE DED BE CnE D XEC.E D XE CnE D XE CnE D

* Do o D o D o o D o o D o % klooria 25 lisätty 3,0 2,10 2,25 1,65 1,50 vaiheessa • « C_

• · D

i Lopullinen • · · *!!.' valkoisuus- t : ; 30 aste 88,9' 86,2 89,4 89,1 87,8 *·*·' Puhkaisu- lujuuden 7,1 8,9 10,0 10,8 10,7 ;.· : mittaluku

Repäisy- 35 kerroin 62,8 71,0 70,7 75,0 78,4

Katkeamispituus 958 1039 1146 1154 1195 4 I I « t • · 96783 20 B: vain puskuri käsittely X: entsymaattinen käsittely käyttäen A. pullulans ksylanaasia.

5 ESIMERKKI 9:

Koe 2 esimerkistä 8 toistettiin kahdesti käyttäen 1,8 % klooria, entsymaattinen käsittely lyhennettiin 6 ja 3 tuntiin. Käsitellyn massan valkaisuaste on 88,1 ja 89,3 tässä järjestyksessä.

10 ♦ · • · • · « · • · · • · · • · · 1 ♦ ·· t : : * ♦ · : : : • « • · t · · • · · »·· · « · · • · il 1 ·

Claims (10)

1. 96783
2. 1. Menetelmä massan valkaisemiseksi, tunnettu siitä, että 5 (a) massaa käsitellään Aureobasidium pullu- lans- viljelmällä tai entsymaattisella järjestelmällä, joka sisältää vähintään yhtä A. pullulans'in hemisel-lulaasia ja (b) massasta poistetaan solubilisoitu lignii- 10 ni.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsymaattinen järjestelmä saadaan A. pullulans-vlljelmästä, jota on kasvatettu hiililähteen läsnäollessa, joka hiililähde pystyy in- 15 dusoimaan tai stimuloimaan sienen vähintään yhden he-misellulaasin tuottoa.
4. 3. Patenttivaatimuksien 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsymaattinen järjestelmä on supernatanttia, joka on saatu A. pullu- 20 lans- viljelystä.
5. 4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsymaattinen järjestelmä sisältää vähintään yhtä A. pullulans'in endo-ksylanaasia.
6. 5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen ; menetelmä, tunnettu siitä, että A. pullulans ψ m on kanta Y-2311 tai Y-2311-1. • · * · : 6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen • · · *".·* menetelmä, tunnettu siitä, että solubilisoitu : : : * . 30 ligniini poistetaan alkaliuuttoa käyttäen. 2 · ·
7. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solubilisoitu ligniini • « : poistetaan alkaliuutolla hapen läsnäollessa.
8. 8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen 35 menetelmä, tunnettu siitä, että massalle suori- t tetaan ainakin yksi ja korkeintaan kolme kemiallista käsittelyä käyttäen kemiallisia valkaisuaineita. I 1 « I I · t « < I · I · 4 · 96783
9. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että massaa jälkikäsitellään klooria-sisältävällä ainemäärällä, joka on ainakin 20 % matalampi kuin määrä, joka saadaan laskemalla kaavasta 5 (I) Chl [ilmaistuna % (paino/paino) uunikuivatusta massasta] = 0.2xK (I) 10 jossa K on massan Kappa-luku ennen biologista käsittelyä.
10. 10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen menetelmä kemiallisen massan valkaisemiseksi. I t \ ( I » » • m • • · • · » · « · > · i • « · ··· · • M I · < • * · • · !* · • I • a • « • · · f » · • » » · i i « « · t I f « » I · I • I r > k • I · I » f » 96783