PT90776B - Processo para a deslenhificacao enzimatica de material lignocelulosico - Google Patents

Description

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PROCESSO PARA A DESLENHIFICACAO ENZIMATICA DE MATERIAL LIGNOCELULOSICO

Campo Técnico da Invenção

A presente invenção diz resoeito a um processo em um íini_ co andar ou em vários andares para a deslenhificação enzimatica de materiais 1ignocelulÕsicos. Mais particularmente, a invenção refere-se a um processo aperfeiçoado para a ^Hes1enhificação enzi mãtica de materiais 1ignocelulosicos para utilização na industria de polpa e de papel.

No processo químico de fabricação de polpa, o material 1ignocelulÕsico Õ tratado com oxidantes químicos severos que degradam a lenhina. A fabricação de polpa química é, na maior oarte das vezes, correntemente realizada com sulfito (sulfato) Kraft, carbonato de sodio e processos de sulfito modificados, que removem a maior parte de matriz de lenhina, libertando as fibras de celulose e provocando a formação de polpa. Por exemplo, o proces^ so Kraft (sulfato) origina uma poloa que contém apenas 5 - 8% em peso de lenhina residual, uma redução aoroximadamente de três a cinco vezes o teor de lenhina original. Os processos de formação de polpa acima descritos têm como resultado a obtenção de uma poj[ pa intensamente corada, devido quase exclusivamente ã lenhina re si dual.

-2Para produzir um produto de papel desejavelmente claro, a polpa tem de ser clarificada ou branqueada. Os processos de branqueamento mais correntemente utilizados empregam cloro ou compostos que contêm cloro, tais como hipoclorito de cálcio, hipoclorito de sodio e dioxido de cloro.

Estes processos branqueiam a polpa principa1mente oor re moção da lenhina. Os primeiros andares, geraltoente cloração e ejç tracção alcalina, têm como resultado um branqueamento efectivo; no entanto, têm graves inconvenientes. Em primeiro lugar, a natjj reza severa destes tratamentos provoca uma significativa degrada, ção das fibras de celulose e uma diminuição do seu comprimento. Assim, um processo de branqueamento que minimizasse a degradação das fibras de celulose seria preferível.

Um outro inconveniente importante reside no facto de o efluente fortemente corrosivo conter um grande número de produtos de degradação de lenhina clorados, alguns dos quais sao toxj. cos e potencia 1 mente mutagénicos e/ou carcinogenicos. Estes efl£ entes apresentam um serio problema de despejo do esgoto. Outro inconveniente ê que os cloretos fortemente corrosivos atacam o equipamento da instalação e não permitem a reciclagem do efluente. Finalmente, a natureza corrosiva deste efluente torna-o perj. goso para o pessoal da fabrica. Por estas razões, tem sido vigorosamente procurados pela indústria processos de branqueamento alternativos que reduzam a quantidade de cloro necessária para o branqueamento.

Para evitar os vários inconvenientes dos processos de

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branqueamento acima mencionados, tem sido explorado o desenvolv^ mento de processos de branqueamento enzimaticos não poluentes. Diversos tipos de microganismos segregam enzimas que modificam ou degradam a lenhina sem atacar a celulose ou a hem cel ul ose . A classe mais largamente estudada de microrganismosque degradam a lenhina é constituída por fungos da podridão branca. 0 membro de£ ta classe mais conhecido e o °hannerochaete chrysosporium. No e£ tanto, o uso directo destes fungos para o branqueamento da polpa tem inconvenientes. A deslenhificação por fungos é muito lenta, necessitando de pelo menos sete dias nara se obter um embranquecimento apreciável. Outro reside no facto de os funqos também segregarem enzimas que degradam a celulose e a hemicelulose, um efeito secundário muito indesejável. Finalmente, o processo sõ pode realizar-se sob as condições circunscritas àquelas em que os fungos são viáveis. Para obviar alguns destes inconvenientes, explorou-se o uso de preparações de enzimas derivadas de culturas de fungos.

Os fungos da podridão branca presume-se que realizem a degradação completa da lenhina com obtenção de.diÕxido de carbono e de agua através da acção concertada de muitas enzimas. Os mec£ nismos que estão na base deste processo complexo estão agora ore cisamente a ser conhecidos.

Recentemente, isolaram-se e caracterízaram-se oarcialmen te enzimas do sistema ligninolTtico do fungo da podridão branca Phanerochaete chrysosporium. Membros de uma família de enzimas, designadas 1ignino-peroxidases (enzimas LiP), são normalmente considerados como sendo as enzimas mais directamente resDonsãveis

-4-j pela deslenhificação. As enzimas LiP necessitam de peróxido de hidrc) genio para serem activas. A actividade de des1enhificação destas enzimas é normalmente medida em termos da sua capacidade para oxj darem álcool veratrTlico (álcool 2,3-dimetoxi-benzTlico) com obtenção de aldeído veratrTlico (aldeído 2,3-dimetoxi-benzTlico) . 0 álcool veratrTlico foi assim utilizado na técnica como um composto modelo da lenhina, a oxidação do qual é o diagnóstico da presença de uma enzima que degrada a lenhina (também designada como 1i gni nase).

Outra enzima do Phanerochaete chrysosporium recentemente sugerida como participando no processo de des1enhificação é a peroxidase dependente de Mn(II) (também conhecida como peroxida_ se NADH oxidante), daqui por diante designada na presente memória descritiva como MnP. Tal como as enzimas LiP, a MnP necejs sita de peróxido de hidrogénio mas também necessita de Mn(II). A MnP não oxida o álcool veratrTlico. No entanto, ela oxida diversos corantes, incluindo 2,2¹-azino-bis-(3-eti1-6-benzotiazolino-sulfonato) (ABTS) K. Glenn e Μ. H. Gold, Purification Of

An Extracel1ular Mn(II)-Dependent Peroxidase from the Lignin-Degrading Basidiomycete, Phanerochaete chrysosoorium, Arch, Bi ochem. Biophys., 242 (2), oãginas 329 - 341 (1985) e vermelho de fenol. A oxidação do vermelho de fenol e normalmente utilizada C£ mo medida para a actividade de MnP/*M. Kuwahara e col., Separation and Characterization of Two Extracel1ular H^O^-Dependent Oxidases from Ligninolytic Cultures of Phanerochaete chrysospori um, FEBS Lett. , 162 (2), paginas 247 - 250 ( 1S84)_7. A verdadeira função de MnP no sistema 1 i gni nol T ti co é desconhecida. Es_ tabeleceu-se a hipótese de que a MnP participa no processo ligni

nolitico gerando o peróxido de hidrogénio necessário pelas enzimas LiP. Esta hipótese foi no entanto posta de lado, em parte , pela descoberta de que o peróxido de hidrogénio Ó produzido como um subproduto da oxidação da NADH por MnP ZY . Asada e col., An Extracel 1 ul ar NADH-Oxi d i z i ng Peroxidase Produced bv A lignin-Degrading Basidiomycete , Phanerochaete chrysosporium, J. Ferment. Technol . , 65(4), páginas 483-487 ( 1987).7.

A patente de invenção norte americana número 4 687 741, cojf cedida a Farrel e col., refere-se 1) a enzimas 1igninolTticas purificadas a partir da estirpe mutante SC26 da Phanerochaete chrysosporium; 2) a estirpe mutante SC26 de Phanerochaete chrysosoporium; e 3) e a um. processo para degradar e modificar a lenhina em polpa de madeira usando estas enzimas purificadas.

A patente de invenção norte-americana número 4 687 746 , concedida a Farrel, refere-se a um processo para melhorar as propriedades de resistência e a estabilidade de brancura de poloas mecânicas usando enzimas derivadas da estirpe SC26 de Phanerochaete chrysosporium.

A patente de invenção norte-americana número 4 690 895, concedida a Farrel, refere-se a um processo para o branqueamento de polpa de Kraft, usando enzimas derivadas da estirpe SC26 de Phanerochaete chysosporium.

Em contraste, a presente invenção refere-se a um novo pro cesso para a deslenhificação enzimática de material lignocelulósico, que difere substancialmente dos processos referidos nas patentes de Farrel.

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-6Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a um método Dratico para a deslenhificação eficiente de material lignocelulosico com preparações de enzimas derivadas de fungos.

Um objectivo da presente invenção e Droporcionar um processo que tem como resultado uma polpa 1ignocelulosica branqueada de elevada viscosidade e produtora de papel, que apresenta um branqueamento aperfeiçoado e propriedades superiores de resisteni cia mecânica em que os efluentes de cada andar e ooeração de lavagem podem ser reciclados para utilização na lavagem de polpa de outros andares.

Um objectivo adicional da presente invenção é Droporcionar um processo de branqueamento em andares múltiDlos que inclui uma ou mais fases de des 1 enhificação enzimática, assim como uma ou mais fases de branqueamento convencional.

De acordo com uma forma de realização, o material lignocelulosico é tratado como uma preparação de enzima lignolítica em condições reaccionais apropriadas, na presença de uma pequena co£ centração estacionaria de peróxido de hidrogénio. De acordo com uma forma de realização preferida, encontram-se também presentes, pelo menos, um dos seguintes reagentes: Mn(II); um ãcido alfa-hi_ droxi; um detergente não iÕnico ou an^otérico; e/ou um álcool aro matico substituído para servir como substrato para as enzimas lignolíticas.

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Numa formade realização preferida, a seguir ao tratamento enzimãtico, a polpa 1ignocelulÕsica Õ submetida a uma operação de extraeção alcalina, lavada com água e, em seguida, submetida a uma operação de extraeção com acido diluído. Uma operação de deslenhificação enzimática, seguida de operações de lavagem e de extraeção, constitui um processo de deslenhificação enzimática num andar, de acordo com a presente invenção. De acordo com uma segunda forma de realização preferida, o material lignocelulosico e submetido a um processo de deslenhificação em várias fa^ ses, compreendendo cada uma delas estas operações.

Descrição Pormenorizada da Invenção

Os materiais 1ignocelulõsicos preferidos para utilização no processo de acordo com a presente invenção são as polpas de ma. deira preparadas pelos bem conhecidos processos do sulfito, sulfato ou Kraft, soda e sulfito modificados. 0 processo de acordo com a presente invenção produz uma deslenhificação significativa de polpa tanto de madeira dura como de madeira macia.

A presente invenção Õ particularmente uti1 para o branqueamento de polpa Kraft de madeira dura, em que o numero kapa da polpa não tratada Õ jã tão baixo que a deslenhificação enzimatica provoca facilmente o branqueamento. Também se observou um braji queamento significativo da poloa de madeira macia produzida oor extensivo processamento jçraft (tendo um valor kapa de pré-branquea_ mento igual a 8). No entanto, as polpas de madeira macia produz/ das pelos processos Kraft normais têm um teor de lenhina muito alto com o numero kapa de pré-branqueamento de pelo menos 20° . 0

grau de deslenhificação conseguido num processo de deslenhificação enzimatica de um ou dois andares com esta poloa com um elev£ do número kapa não foi ainda suficiente para ter como resultado um branqueamen to significativo. No entanto, o processo de acordo com a prese£ te invenção, que consiste em três ou mais andares de des1enhi ficação enzimatica, conseguiu uma des1enhificação suficiente -da po£ pa Kraft de madeira macia meridional tendo como resultado um brajn queamento mensurável.

A deslenhificação parcial de material 1ignocelulõsico con seguida pelo processo de acordo com a presente invenção tem o efe£ to benéfico de reduzir a quantidade de nrodutos químicos de bra£ queamento necessários para deslenhificar . e branquear completamente esta polpa. Assim, o nível de compostos orgânicos clorados presentes na corrente efluente de esgoto da fabrica de branqueamento é reduzido.

Também se prevê que se possa utilizar na deslenhificação enzimatica de polpas mecânicas, poloas termomecãnicas e poloas quimiotermomecânicas.

Alem disso, como o processo de des1enhificação de acordo com a presente invenção tem um efeito benéfico sobre a formação da polpa, a deslenhi fi cação e o branqueamento de materiais lignc) celulósicos parcialmente transformados em poloa oode originar uma polpa apropriada para utilização directa na fabricação do papel

Os materiais lignocelulõsicos deslenhificados de acordo com o processo da presente invenção podem ser lavados com água,

Τ, ou tratados de qualquer outra forma, antes da des1enhificação e£ zimãtica. As polpas químicas podem também ser lavadas com ãcido eti1enodiamino-tetracetico diluído (EDTA) (5 a 100 mM) ou outro agente quelante e, em seguida, lavados extensamente com ãgua antes da des1enhificação enzimática. Pode também ser vantajoso l£ var o material 1 i gnocel ul õs i co com ãcido diluído, por exemplo ãci_ do acético 10 a 200 mM, antes de se efectuar a des1enhificação enzimática. A consistência da polpa estã normalmente compreendida entre 0,1 e 10,0% durante estas ooerações de lavagem.

As preparações de enzimas 1igninolíticas derivadas de fungos da podridão branca, funvos da podridão castanha ou fungos da podridão seca são úteis para as finalidades da presente invenção .

São também úteis enzimas derivadas de estirpes mutantes destes fungos que ocorrem naturalmente, especialmente se a estime mutaji te for escolhida pela sua Drodução aumentada de enzimas 1igninolíticas desejadas. Preferivelmente, empregam-se enzimas derivadas de um fungo de podridão branca. E particularmente preferido o uso de enzimas derivadas de Phanerochae te chry-s os po rrum . Muito embora se possa utilizar qualquer estirpe deste fungo, os exemplos de estirpes desejáveis incluem SC25 //Northern Regional Research Laboratory(NRRL ) NQ 15978, ME-446 (American Tyoe Culture Collection (ATTC) Número 3454]_7 e VKM-F- 1 767 (ATTC Número 25725 ).

Usualmente, as enzimas 1igninolíticas pretendidas são se gregadas pelo fungo para o meio de cultura extracelular. Este meio é recolhido e processado para se atingir o grau pretendido de concentração e purificação das enzimas. As condições de cu£ tura e o tempo de colheita influenciam a quantidade total de actq

10vidade 1 i gn i no 1 T ti ca recuperada, assim como as proporções relatj[ vas de cada uma das varias enzimas 1igninolíticas.

Os meios de cultura recolhidos podem ser usados directamente no processo de deslenhificação desde que estejam relativamente isentos de enzimas, indesejáveis, tais como celulases ou proteases. Preferivelmente, no entanto, o meio de cultura é con centrado antes de se usar na reacção de des1enhificação.

Pode usar-se qualquer método de concentração que preserve a actividade enzimática como, por exemplo, 1 i ofi 1 i zação, precipitação com um elevado teor de sais, po1ieti1eno-glicol, acetona , e ãlcool. Se se utilizar qualquer destas técnicas de concentração, as enzimas devem ser reconstituídas num tampão apropriado (por exemplo, acetato de sódio, tartarato de sodio, dimetil-succinato de sódio ou succinato de sódio, a pH 3 - 5) para se orodjj zir um concentrado não fraccionado de enzimas para utilização na reacção ou des1inhificação . Como variante, o liofilizado ou o precipitado podem ser accionados directamente ã reacção de desle nhificação.

método de concentração preferido é por diálise sob pre£ são do meio de cultura extracelular. 0 concentrado de enzimas extracelular típico contém 0,5-20,o U/ml de actividade de oxidação de ãlcool veratrílico (VAO). Define-se uma unidade de actividade VAO, para as finalidades do presente pedido de patente de invenção, como a quantidade de enzima que é capaz de oxidar uma micromole de ãlcool veratrílico por minuto a 25°C, sob as condições normais de ensaio descritas abaixo.

A actividade de VAO e quantificada por meio de alteração de absorvãncia no ensaio da solução a 310 nm. Usam-se três reagentes preparados: (A) tartarato de sodio 0,25 molar, ajustado a pH 3,0 com t^SO^; (B) álcool veratrTlico 10,0 nM (Aldrich Che mical Co., Milwaukee, WI , Numero D13, 30U-0); e (C) peroxido de hidrogénio 98 mM (Fischer Scientific, Fairlawn, NJ, numero H325-5) (preparada diariamente fresca).

Para realizar o ensaio de actividade de VAO:

a)	adicionam-se 400 veta de quartzo;	microlitros de reagente A a uma cu-
b)	adicionam-se 200	mi crolitros de reagente B;
c)	adicionam-se 390 tra da enzima;	microlitros de agua bidesti 1ada/amos

d) misturam-se os conteúdos da cuveta.;

e) adicionam-se 10 microlitros de reagente C;

f) mistura-se imediatamente o conteúdo da cuveta; e

g) mede-se a absorvãncia a 310 nm durante 30 segundos a 25°C .

Calculam-se as unidades de actividade de VAO por ml de uma amostra de ensaio (U/ml) da maneira seguinte, usando um valor ,de 9300M^-cm~ 1 como o coeficiente de extinção para álcool ve ratrTlico: ( A, A/minuto) (9300) (1000) /volume da amostra ensaiada (ml)J^_1. Para as finalidades do presente pedido de p^

2tente de invenção, uma unidade de Li P é igual a uma unidade de actividade de VAO.

A Δ A^ig/minuto e linear em relação ã concentração de LiP dentro do intervalo de 0,1 a 0,5 Δ A^ig/minuto. Amostras de enzima que originem velocidades fora deste intervalo não são utilizadas para calcular a actividade. Em vez disso, reduz-se o volume da amostra de ensaio por cuveta ou aumenta-se de modo que a velocidade medida fique dentro da gama de variação linear.

Em certas circunstâncias, pode ser desejável usar subfra£ ções parcialmente purificadas dos meios de cultura recolhidos.Por exemplo, pode ser vantajoso o uso de uma subfracção contendo ligninas e que não contenha celulases. Como variante, pode ser dese jãvel separar as enzimas LiP de quaisquer enzimas MnP de modo que estas actividades enzimaticas possam ser usadas independentemente. Podem também ser usadas por enzimas 1igninolTticas que foram puri ficadas até quase ã homogeneidade e misturas destas enzimas puri ficadas.

Uma caracterlstica nova importante e inesperada da presente invenção ê que MnP purificada de Phanerochaete chrysosoorium é efectiva na des1enhificação de polpa de madeira usando o oroces so de acordo com a presente invenção. Com base na técnica anterior, o termo MnP aplica-se a qualquer peroxidasedependente de manganês que é caoaz de modificar ou degradar lenhina, indeoende£ temente do facto de a enzima ser presentemente conhecida na técnica.

As enzimas 1igninolTticas recombinantes que tém ou activi

-13Lip ou actividade de MnP são também úteis no processo de acordo com a presente invenção.

A reacção de des1enhificação enzimática pode realizar-se em qualquer recipiente do tamanho desejado, desde que se prevejam meios para a mistura, oxigenação e regulação da temperatura do cojn teiído. Alem disso, têm de ser proporcionados mecanismos convenieji tes para a introdução de componentes da reacção não gasosos e p_a ra a eliminação dos produtos da reacção. A ordem de adição dos componentes da reacção não e crítica; no entanto, prefere adicionar-se as enzimas no fim. A mistura reaccional bãsica compreende material 1ignoce1ulÓsico a ser des1enhificado , uma preparação de enzimas 1 i gni nolTti cas activas e peróxido de hidrogénio a uma cori centração estacionaria pequena, tudo numa solução mantida ao valor de pH apropriado. Preferivelmente, a mistura reaccional coji tem também um ou mais dos seguintes componentes:

a) um detergente não iónico ou anfoterico;

b) Mn(II),

c) um alfa-hidroxi-aciio e/ou

d) um álcool aromático substituído capaz de servir como substrato para as enzimas 1ignino 1íti cas.

Mais preferivelmente, todos estes componentes se encontram p resentes.

Se o material 1ignoce1ulõsico a ser branqueado for polpa de madeira, ele deve encontrar-se presente na mistura reaccional

com uma consistência (gramas de peso seco de polpa por grama de peso húmido de polpa) de 0,1 a 10% e, preferivelmente, de 0,5 a 4,0%.

Se se utilizar uma preparaçao de enzimas que compreende pelo menos actividade LiP e isenta de actividade MnP, esta deve encontrar-se presente na mistura reaccional a uma concentração de 0,05 a 10,0 U/ml de actividade de VAO e, preferive1mente, 0,4 a 2,0 U/ml. Se se utilizar uma preparação de enzimas que compreer^ de pelo menos uma MnP e é isenta de actividade de LiP, ela deve encontrar-se presente na mistura reaccional a uma concentração de 0,04 a 20,0 U/ml e, preferivelmente, 0,25 a 10,0 U/ml de actividade de oxidação do vermelho de fenol (PRO).

Uma unidade de actividade de PRO ê definida como a quantidade de enzima que provoca uma alteração da absorvância da sol£ ção de ensaio, a 530 nm, igual a uma unidade de absorvância Dor minuto, a 25°C, sob condições de ensaio normais.

Nos ensaios de determinação da actividade de PRO, asam-se três reagentes. 0 reagente A consiste em 0,11 grama/litro do sal de sódio do vermelho de fenol (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0, numero p-5530), 1,1 gramas/litro ou albumina e 2,5 ml/litro de ãcido láctico a 85% em succinato de sódio 20mM, de pH 4,5.

reagente B é sulfato de manganês 10 mM em succinato de sódio 20 mM, pH 4,5.

reagente C ê peróxido de hidrogénio 9,8 mM (Fischer Che-15mical Co.) (prepaoado fresco diariamente).

Para realizar o ensaio de actividade de PRO, adicionou-se 900 microlitros de reagente A a uma cuveta; adicionam-se 100 microlitros de amostra de enzima/agua βΐdesti1ada; adicionam-se 10 microlitros de reagente B; mistura-se o conteúdo da cuveta imedia_ tamente; o espectrofotometro é submetido a um ensaio em branco a 530 nm com esta cuveta; adicionam-se 10 microlitros de reagente C; mistura-se imediatamente o conteúdo da cuveta: e regista-se a absorvância a 530 nm durante 30 segundos a 25°C,

As unidades de actividade de PRO por mililitro de uma amostra de ensaio (U/ml) são calculadas usando a seguinte equação: [ Δ A/minuto) (volume da amostra de ensaio usada no ensaio (ml)_7 \ Para as finalidades da presente invenção, uma unidade de MnPe igual a uma unidade de actividade PRO.

Λ a ΖΔ Asso/minuto e linear em relaçao ã concentração de MnP dentro do intervalo de 0,05 a 0,20 Δα_53Ο7 minuto. As amosttras de enzima que originam velocidades fora deste intervalo não são utilizadas para calcular a actividade. Pelo contrário, reduz-se ou aumenta-se o volume da amostra de ensaio por cuveta, de mo do que a velocidade medida fique compreendida dentro do intervalo de variação linear.

Se se utilizar uma preparação de enzima que comoreende uma ou mais enzimas LiP e uma ou mais enzimas MnP, elas devem encontrar-se presentes na mistura reaccional nas concentrações especificadas anteriormente.

-16Uma propriedade caracterTs ti ca importante da presente i£ venção e a conservação de uma concentração no estado estacionário de peroxido de hidrogénio pequena, de 0,001 a 0,5 mM, pre feri ve1mente de 0,005 a 0,1 mM, na mistura reaccional durante toda a reacção de deslenhificação. A concentração de peróxido de hidr£ génio pode ser mantida convenientemente ao nTvel desejado media_n te formação enzimática i n s i tu, por exemplo por acção de glucose-oxidase sobre a glucose. Por consequência, pode usar-se uma adição ã mistura reaccional de 0,1 a 10,0 U/ml de glucose-oxidase e 0,1 a 20,0 mM de glucose, tipicamente, 1,0 U/ml de glucose-oxj_ dase e 0,1 a 10,0 mM de glucose. Como variante, o peróxido de hidrogénio pode ser fornecido mediante adição contínua medida. A adição medida é o método preferido para manter a concentração de peróxido de hidrogénio nas reacçoes de deslenhificação em larga escala. A concentração de peróxido de hidrogénio pode também ser grosseiramente mantida mediante adição periódica.

valor do pH deve ser mantido entre 2 e 8 ao longo da reacção de des1enhificação, preferivelmente dentro do intervalo de cerca de 3 a 5. 0 pH pode ser mantido por quimicoestatização - adição medida ou periódica de quantidades apropriadas de ãcido ou de base. A quimi ostatização é o método oreferido de conservação do pH em reacçoes em larga escala.

Como variante, o pH pode ser mantido utilizandoum tampão na mistura reaccional. Pode utilizar-se qualquer tamoão con veniente que seja eficaz dentro da gama de pH desejada. Os exem pios de tampões apropriados ao valor preferido de pH incluem acetato, succinato de dimetilo, tartarato e ãcido trans-aconí co. 0 tampão é geral mente adicionado a mistura reaccional a uma concentração compreendida entre cerca de 5 e 50 mM e, pref£ rivelmente, entre 15 e 25 mM.

Prefere-se a adição de um detergente não iónico ou anfoterico a mistura reaccional. Na maior parte das vezes, utiliza-se um detergente não iónico. Os exemplos de detergentes não ió nicos apropriados incluem octi1 -glucÓsido, polioxieti 1eno-g1icol e compostos das series de detergentes Triton e Tween, Prefere-se Tween 80. 0 detergente pode ser adicionado a uma concentração de

0,001 a 0,1 % em volume/volume e, preferivelmente, a 0,01 a 0,05% em volume/volume.

Se a preparação de enzima 1igninolTtica utilizada compre ender uma MnP, na mistura reaccional Ó necessãrio Mn(II). Quando a preparação de enzima 1igninolTtica utilizada compreender pe lo menos uma LiP e exclui MnP, a adição de Mn(II) não Ó essencial. 0 Mn(II) pode convenientemente ser adicionado sob a forma de um sal, por exemplo, sulfato de manganês ou acetato de maji ganês, normalmente sulfato de manganês, a uma concentração de 0,05 a 1,0 mM e, preferivelmente, 0,10 a 0,50 mM.

Quando se adiciona Mn(II) ã mistura reaccional, e prefe rTvel adicionar-se pelo menos um alfa-hidroxi-ãcido também. Os alfa-hidroxi-ácidos apropriados incluem os aniões malato, tartarato, citrato, lactato, feni1-1actato, glocolato, 2-hidroxi-butirato e respectivos sais. Preferivelmente, utiliza-se lactato.

a 1fa-hidroxi-acido deve encontrar-se presente na mistura rea£ cional a uma concentração de 0,5 a 20,0 mM e, preferivelmente, a

1,0 a 10,0 mil.

Se a preparação de enzimas 1igninolíticas utilizada com preender pelo menos um enzima LiP, é preferível adicionar ã mis tura reaccional 0,05 a 0,60 mM de um álcool aromatico substituí do capaz de servir como substrato oara as enzimas liqninolíticas. Mais preferivelmente, adiciona-se álcool veratrílico.

oxiqénio é necessário oara a des1enhificacão enzimãtica. E oreferível saturar a mistura reaccional com~oxiqénio antes da adição das enzimas. Tipicamente, depois de todos os componentes da mistura reaccional terem sido adicionados, o vaso reaccional é lavado com oxigénio durante um curto intervalo de tempo e depois vedado para criar uma atmosfera enriquecida em oxi géni o .

A m]stura reaccional deve ser incubada a 15 a 50°C durante 0,25 a 18 horas, preferivelmente a 30 a 50°C durante duas a oito horas. Mais preferivelmente, a reacção de des1enhificação realiza-se a 45°C.

E desejável prooorcionar a mistura dos comoostos da mistura reaccional durante a reacção de des1enhificação.

processo de deslenhificação enzimãtica de um andar consiste apenas na operação de se tratar material 1ignocelulÕsi co com uma preoaração de enzima 1ignino 1íti ca , como se descreveu antes. Preferivelmente, no entanto, um processo de um andar com preende as operações subsequentes de extracção e lavagem do mate

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rial 1ignocelulÕsico depois da operação de des1enhificação enz] mati ca.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o material 1ignoce1ulÕsico ê submetido a uma ορέ ração de extracção alcalina depois da operação de des1enh i ficação enzimática. Esta operação de extracção alcalina envolve a adição de uma solução alcalina ã mistura reaccional, seguida de uma incubação opcional durante ate duas horas a 25 atê 100°C, com uma consistência de 0,1 a 10% de material 1ignocelalÕsico . Preferivelmente, a incubação demora cerca de 0,1 hora a 25°C, com uma consistência de 0,3 a 1,0%. Depois da incubação, a mi£ tura é geralmente filtrada para separar o material lignocelulÕsico da solução alcalina. A concentração final da base nesta o peração de extracção ê preferivelmente 0,1 a 1,0 N,

Se se pretender reutilizar as enzimas na mistura reacci£ nal, elas devem ser separadas do material 1ignohelulosico antes da extracção alcalina, por exemplo por filtração sob vazio, Dre cipitaçao e sedimentação. Normalmente, esta separação realiza-se por filtração. Depois de as enzimas terem sido separadas, adiciona-se a solução alcalina ao material lignocelulósico.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente inyenção, o material lignocelulósico é lavado com ãgoa a seguir ã operação de extracção alcalina mediante dispersão em agua a uma consistência de 0,1 a 10% e, em seguida, mediante TiJ_ tração. Preferivelmente, esta lavagem deve ser repetida uma a três vezes.·

Na forma de realização mais preferida da presente invenção, o material 1ignoce1ulÕsico é submetido a uma operação de extraeção com acido a seguir a operação de extraeção alcalina, ou se o material 1ignoce1u1Õsico for submetido a uma operação de lavagem com ãgua depois da operação de extraeção alcalina, realiza-se a operação de extraeção com ãcido depois da operação de lavagem com ãgua. A operação de extraeção com ãcido verificou-se origi_ nar aperfeiçoamentos particularmente importantes na brancura da polpa Kraft que foi submetida a deslenhificação enzimática na ore sença de Mn(II). 0 material 1ignoce1ulõsico e recolhido, suspen^ so em acido diluído e incubado durante 0,1 a 10 minutos a 10 a 100°C, preferivelmente durante cerca de 0,1 minuto a 25°C. A solução de ãcido diluído compreende, preferivelmente, 0,05 a 0,5 nM de ãcido. Os ácidos apropriados incluem os aniões acetato, suc cinato, lactato, sulfito e outros ácidos minerais fracos. Prefere-se ãcido acético. A operação de extraeção com ãcido realiza-se com cerca de 0,15 a 2,5 litros de solução de acido diluído por grama de material 1ignocelulõsico seco.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o material 1 ignocelulÕsico é submetido a um pro cesso de deslenhificação enzimática de andares múltiplos, em que cada andar compreende uma operação de extraeção alcalina, co mo se descreveu antes, e comoreende ainda uma operação de lavagem com ãgua, como também se descreveu antes. 0 andar final com preendera, preferivelmente, uma operação de extraeção com ãcido.

Um processo de andares múltiplos consegue uma maior des^ lenhificação do material 1ignocelu1Õsico do que no caso do pro

cesso de um único andar, usando as mesmas unidades totais de pre paração 1igninolíti ca aplicada â mesma quantidade de material li gnoce1ulÕsico. Cada andar num processo de dois ou três andares necessita, aparentemente, menos unidades de actividade ligninolT tica do que o andar anterior, para conseguir o mesmo grau de des lenhificação. No entanto, um processo de um, dois ou três.andares de des1enhificaçao enzimática pode ser DreferTvel a um processo de cinco andares, se processo de des1enhificação enzimãtica for combinado com andares de branqueamento convencionais para produzir um produto completamente branqueado.

A presente invenção também compreende processos de branqueamento de andares múltiplos dos quais um ou mais andares de deslenhificaçao enzimática constituem pelo menos um componente. Um ou mais andares de des1enhificação enzimática são combinados em série com um ou mais andares de branqueamento convencionais.

São exemplos de operações de branqueamento suolementares efectivas andares que utilizam dióxido de cloro, cloro, hipoclo rito, oxigénio, ozono, peróxido de hidrogénio, outros agentes oxidantes fracos e de branqueamento electro-redutor. Mesmo que se utilizem andares de branqueamento adicionais ã base de cloro nesta forma de realização a quantidade total de compostos orgânicos clorados presentes no efluente da fábrica de branqueamento sera significativamente reduzida Dela inclusão de um ou mais andares de des1enhificação enzimática.

A fim de que a presente invenção seja mais completamente compreendida, descrevem-se os Exemplos seguintes do processo de acordo com a presente invenção. Estes exemplos destinam-se ap£ nas a servir como ilustração da presente invenção, que não deve ser considerada como limitada a qualquer descrição neles usada.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparação de concentrado de enzimas 1igninolTticas não fraccionadas

Prepararam-se concentrados de enzimas 1igninolTticas a partir de duas estirpes de Phanerochaete chrysospori um SC26 (NRRL 15978) e VKM-F-1767 (ATTC 24725).

A cultura da esti rpe VKM-F-1 767 iniciou-se a partir de um inoculo de esporos preparado da seguinte forma:

1) propagação das culturas em agar, a 24°C durante catorze a vinte e oito dias, em placas que contêm meio de indução de esporos /2'Meio N, descrito por H. J. Vogel em Di s tri buti on of Lysine Patyways Among Fuji gi : Evolutionarv Implica tions, Am. Nat., XCVIII(903), paginas 435 - 46 (1 964^ preoarado com uma diluição de 1/500 da solução de oligoelementos , uma diluição de 1/100 da Solução de Biotina, sem clorofórmio e suplementada com 2% em peso/volume de extracto de malte e 3% em peso/volume de extracto de levedura.

2) após desenvolvimento suficiente de esporos (como e evidenciado pela aparência encrespada das placas) , a lavagem da superfície de agar de cada placa com

100 x 15 mm com cerca de 3 a 10 ml de agua esterili zada para libertar os esporos; e

3) a passagem da agua de lavagem, contendo esporos, atra vés de un funil esterilizado, cheio com lã de vidro esterilizada, para remover micélios de fungo containi nantes.

Determinou-se então a absorvância da suspensão de esporos resultante a 650 nm, sendo uma absorvância igual a 1 a 650 nm aproximadamente equivalente a 5 χ 10⁶ esporos/ml. Estas preparações de esporos foram armazenadas a 4°C atê ã sua utilização.

Para iniciar as culturas de VKM-F-1767, inoculou-se Meio de Crescimento A com a suspensão apropriada de esooros, até uma 5 concentração final de pelo menos 0,5 x 10 esporos/ml e usualmeji 5 te igual a 2,5 x 10 esporos/ml. 0 Meio de Crescimento A e o meio descrito em T. K. Ki rk e col., Influence of Culture Parameters On Lignin Metabolism by Phanerochaete chrysosporium ,

Arch. Microbiol . , 117, páginas 277 - 285 (1978), com osMinerais adicionados a uma concentração sete vezes maior e suplementado com os seguintes reagentes, com as concentrações indicadas: ta£ tarato de amonio 1 mM; Tween 80 0,1 % em volume/volume; sulfato de manganês 1,8 micromolar; acetato de sodio 20 mM, pH 4,5; álcool benzílico 6mM; glucose a 2% em peso/volume (para servir como foin te de carbono).

A cultura da estirpe SC26 iniciou-se a partir de culturas iniciais preparadas por transferência directa de micélios do fungo de placas de agar para 10 ml de Meio de Crescimento A. As culturas de iniciação foram preparadas como variante misturando uma cultura de fungos existente num misturador Waring esterili. zado. Estas culturas de iniciação foram incubadas a 37°C durante pelo menos três dias, antes de se utilizarem.

Para se iniciar uma cultura de SC26 , inoculou-se Meio de Crescimento A com 1% em volume e, usualmente, com 10% em volume, de uma cultura de iniciação.

Todas as estirpes de fungos foram cultivadas de acordo com a maneira habitual em volumes de 0,1 a 1,0 litro, em recipj_ entes esterilizados de 2 litros (ou balões de Erlenmeyer ou balões redondos). Depois da inoculação, as culturas foram purgadas com oxigénio e incubadas a 37°C num agitador rotativo a 50 rotações por minuto (se se utilizar um balão de Erlenmeyer) ou num i_n cnbador de balões de rolamento a quarente rotações por minuto .

A mistura começou imediatamente depois da inoculação.

Controlou-se o meio extracelular das culturas relativamente a actividade de VAO, a começar no quarto dia apÕs a inoculação. Quando se tiver detectado oelo menos cerca de 0,05 U/ml de actividade de VAO, o meio de cultura foi colhido e substituí do por Meio de Crescimento B. 0 Meio de Crescimento B é uma ver são com baixo teor de carbono do Meio de Crescimento A, diferindo do Meio de Crescimento A pelo facto de conter tartarato de amónio 3,6 mM e 0,2% em peso/volume de glucose. Se uma cultura ί >

5individual não tiver atingido o nível pretendido de actividade enzimática dentro de quinze dias, o meio foi substituído por Meio de Crescimento A, para incrementar a actividade enzimaU ca.

Quando o meio de cultura extracelular tiver atingido o nível pretendido de actividade de VAO, separou-se o micélio do fungo despejando a cultura através de um funil contendo lã de v^ dro. 0 concentrado de enzima 1igninolítica foi então preparado a partir deste meio activo por diãlise sob Dressão, usando uma célula de u1trafi1 tração Amicon do Modelo 8400 , adaptada com membrana de diãlise PM 10. A ultrafi1 tração realizou-se sob 2

1,4 Kg/cm (20 psi) de azoto.

Quando o volume do meio foi reduzido para aproximadameri te 5 a 10% do seu volume original, o concentrado foi despejado. Armazenou-se o concentrado a -70°C até a sua utilização. Esta preparação concentrada de enzimas 1igninolíticas continha tipicamente 0,1 a 1,0 U/ml de actividade de VAO.

Exemplo 2

Des1enhificação e branqueamento de poloa Kraft de madeira dura

setentrional	por meio de	□ma fracção de concentrado	de enzima de
SC26 contendo	actividade	de PRO mas	substanci almente	isenta de
actividade de	VAO

Fraccionou-se o concentrado de enzimas não fraccionadas da estirpe SC26 de Phanerochaete chrysosporium por cromatogra^

fia de permuta anionica. As fracções foram ensaiadas relativamente ã sua actividade de VAO e a sua actividade de oxidação de ABTS (ABTSO) (ABTS) Õ um substrat) de peroxidase que Õ fundame£ talmente resistente a enzimas LiP). Mediu-se também a absorvãncia da fracção a 280 nm e 407 nm.

Seleccionaram-se as fracções com base na actividade enzj_ mãtica e combinaram-se para originar três tipos. As fracções combinadas para formar o tipo I continham actividade de ABTSO, mas não actividade detectãvel de VAO. As fracções combinadas para formar o tipo III continham actividade de VAO, mas eram substancialmente isentas de actividade de ABTSO. As fracções combinadas para formar o tipo II apresentavam ambos os tioos de actividade .

Os três tipos de concentrados foram então ensaiados rela^ tivamente a sua actividade de VAO, ^DR0 e ABTSO e relativamente ã sua absorvãncia a 280 nm e 407 nm. Finalmente, ensaiou-se a capacidade de estes tipos de misturas de enzimas des1enhtfiçarem e branquearem polpa Kraft de madeira dura. 0 resultado suroreeji dente foi que o concentrado do tipo I, que e totalmente isento de actividade de VPO mensurável e, assim, presumivelmente, não contên qualtuer LiP activa, foi muito eficaz no branqueamento da polpa. Todas as ooerações foram realizadas a temperatura ambien te, a menos que se indique de outro modo.

Fraccionamento do concentrado de enzimas SC26

Preparou-se concentrado de enzimas não fraccionado a par

tir da estirpe SC26 Phanerochaete chrysospori um, veu no Exemplo 1, mas com a diferença de se ter Meio de Crescimento B Dara substituir a glucose 0,2% em peso/volume. Concentrou-se um total de brenadante de cultura (reunido de três culturas) pressão, como se descreveu no.Exemplo 1.· como se descre modi fi cado o por gli cerol a 1,3 1i tros de s£ por d i ã1i s e sob

Fez-se passar o concentrado de enzimas de SC26 através de uma coluna com 1,5 x 6 centímetros, carregada com resina Amberlite XAD-2 (Mal 1inckrodt, Inc., Paris, KY, Número 3409), que tinha sido previamente equilibrada com ãgua bidestilada. A coluna XAD-2 foi em seguida lavada com agua bidestilada e este eluído foi reunido com a corrente anteriormente reunida. 0 volume total combinado de XAD-2 tinha um volume de 55 ml. Era ai£ da caracterizado pelos seguintes valores: ^A280^{= 2,5} ’ %07⁼ θ’⁵’ actividade de VAO = 0,81 U/ml; actividade de ABTSO = 9,0 U/ml.

Carregou-se todo o conjunto XAD-2 para uma colna de 6 x 10 cm contendo DEAE-Sephacel (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia), previamente equilibrada com ãgua bidestilada. De pois de carregada, a coluna foi lavada com 100 ml de ãgua bide£ tilada. A coluna foi em seguida eluída a um caudal de cerca de 100 - 200 ml/hora com um gradiente linear de 770 ml de 0,1 a 0,5 molar de cloreto de sódio em tarte-ato de sodio 5 milimolar, pH 4,8. Separaram-se as fracções (300 gotas/fracção) a nartir do instante em que se iniciou o gradiente.

8Selecção das fracções da coluna

Cada fracção foi ensaiada relativamente a actividade de VAO e à actividade de ABTSO, assim como relativamente ã absorva^ cia a 280 nm.

Definiu-se uma unidade de actividade de ABTSO como a quan tidade de enzima que provocava uma alteração da absorvância da solução de ensaio, a 415 nm, de uma unidade de absorvância oor minuto, a 25°C, sob as condições normais do ensaio. Empregaram -se três reagentes nos ensaios de ABTSO. 0 reagente A consistia em 0,045.gramas/1itro de ABTS (Boehringer Mannheim, Alemanha Fe deral, numero 102946), 10 ml/litro de lactato de sodio a 60% ,

3,4 grama/litro de albumina de soro bovino ou de gelatina, em succinato de sodio 50 mM, pH 4,5. 0 reagente B era constituído por sulfato de manganês 10 mM em succinato de sodio 50 mM, dH 4,5 0 reagente C era peroxido de hidrogénio 0,0171% em succinato de sodio 50 mM, pH 4,5 (preparado em fresco diariamente).

Para realizar o ensaio de ABTSO, adicionaram-se 900 microlitros de reagente A a uma cuveta de quartzo; adicionaram-se 100 microlitros da amostra de ensaio; adicionaram-se 10 microlftros do reagente Β; o conteúdo da cuveta foi' misturado imediata mente usando um laço de cabo; o espectrofotometro foi considerado igual a 0 a 415 nm com esta cuveta; adicionaram-se 10 micro litros de reagente C; misturou-se o conteúdo da cuveta imediata mente com um laço de cabo; e reaistou-se a absorvância a 415 nm durante trinta segundos a 25°C. Calcularam-se então as unidades de actividade ABTSO por mililitro de amostra de ensaio (U/ml),

-29usando a seguinte equação:

( ΔΑ/minuto) /(volume da amostra de ensaio utilizada (ml)J

Um pico complexo largo de actividade de ABTSO espalhava -se aproximadamente pelas fracções 18 a 60. Havia três picos discretos de actividade de VAO espalhados aproximadamente pelas fracções 35 a 50, 70 a 80 e 80 a 92.

Escolheram-se as fracções da coluna e combinaram-se para formar três tipos de eluído, que foram armazenados a -70°C ate a sua utilização. Estas fracções foram ensaiadas reiativamente a sua actividade de VAO, ABTSO e PRC¹, assim como ã sua ab_ sorvancia a 280 e 407 nm. As fracções da coluna combinadas para formar as associações assim como as caracteristicas destas associações estão indicadas no Quadro I.

QUADRO I

Assoei ação	I	II	Ί 11
Fracções	18-34	36-48	72-77 e
Actividade de ABTSO
(U/ml)	3,7	2,4	0,05
Actividade de PRO
(U/ml)	2,9	0,2	0,03
Actividade de VAO*
(U/ml)	0,00 + 0,00	0,16 + 0	,02 0,42 +
A280	0,43	0,15	0,20
A407	0,04	0,05	0,11

-30* Os valores para as actividades de VAO representam as ne dias de duas determinações indeoendentes ; indicam-se os desvios padrão. A Amostra I não apresentou actividade de VAO em qualquer das determinações.

Preparação da Polpa

Suspenderam-se 30 gramas de peso húmido de polpa Kraft de madeira dura setentrional em 2 litros de agua bidestilada e agitaram-se num misturador Waring (em altura) durante quinze S£ gundos. Separou-se a polpa mediante filtração sob vazio, ressus^ pendeu-se em 1 litro de EDTA 5 mM e recolheu-se novamente mediar^ te filtração sob vazio. Em seguida, ressuspendeu-se a polpa em 1 litro de acido acético 0,17 normal e separou-se mediante fij_ tração sob vazio. Por fim, ressuspendeu-se a poloa em 2 litros de ãgua bidestilada, separou-se mediante filtração sob vazio e depois armazenou-se a 4°C ate utilização. Esta poloa lavada húmida tinha uma consistência de 24% (0,24 grama de peso seco de polpa por grama de peso húmi do de polpa lavada).

Reacções com enzimas: Experiência A

Preparou-se uma mistura de base contendo os seguintes componentes reaccionais: 175 ml de agua bidestilada; 20 ml de £ cetato de sodio 0,2 molar, dH 5,0; 0,5 ml de 10% em volume/voljj me de Tween 80; 1,0 ml de lactato 2,0 molar; 1,0 ml de glucose 0,3 molar; 0,2 ml de sulfato de manganês 0,1 rolar; 0,8 ml de álcool veratrTlico 0,1 molar; e 0,5 ml de NÍDH (2 mg/ml).

-31Fez-se borbulhar oxigénio através desta mistura de base durante três minutos. A mistura reaccional foi então distribuída uniformemente por dez tubos de centrifugação de polipropileno de fundo cónico, de 50 ml (cerca de 20 ml por tubo) e a cada tubo adicionou-se 0,5 grama de peso molhado de polpa lavada (0,12 gr£ ma de polpa seca). Em seguida, adicionaram-se as fracções dos concentrados de enzima, nas seguintes proporções.

Reaccção	Conjunto de Enzimas	Volume (ml)
1		0
2	I	1
3	I	2
4	I	4
5	I	10
6	I	20
7	II .	2
8	II	5
9	III	2
10	III	5
Fi nalmente,	adicionaram-se a cada tubo	20 microlitros

de glucose-oxidase (Sigma Chemical, Co., numero 6500, 1,0 U/microlitro). Cada tubo foi em seguida lavado durante um curto i_n tervalo de tempo com oxigénio, tapado e incubado a 37°C durante dezoito horas, horizontalmente, num sacudidor rotativo a sessen ta rotações por minuto.

Depois da incubação, adicionou-se hidróxido de sõdio 0,5 N a cada tubo até se obter um volume final de aproximadameji te 50 ml. Adicionou-se o conteúdo de cada tubo a funis de filtro de vidro sinterizado individuais, equipados com filtros What. man 3M. Os tubos de ensaio vazio foram então lavados, cada um deles, com aproximadamente 30 ml de hidróxido de sódio 0,5 N e estas lavagens foram adicionadas ao funil de filtração apropria do. A polpa de cada funil de filtração foi separada med.iante filtração sob vazio. A cada funil de filtração, adieionaram-se cerca de 250 ml de agua bidestilada, com agitação, e separou-se a polpa. Em seguida, a cada funil de filtração adicionaram-se cerca de 250 ml de ãcido acético 0,17 N, com agitação, e separou-se de novo a polpa. Deixou-se que esta secasse ao ar durante três horas e determinou-se o grau de branqueamento (% G. E.],usaji do um Technidyne Corporation Model 54 Bri ghtimeter.

No Quadro II, apresenta-se o resumo dos resultados destes ensaios:

QUADRO II

Reacção	Actividade de VAO	Actividade de PRO	Brancura
	(U/ml) (U/g de polpa)*	(U/ml)	(U/g de polpa)*	(% de G.E.)
1	0,0	0,0	0,0	0,0	39,2
2	0,0	0,0	0,14	24,2	44,0
3	0,0	0,0	0,26	48,3	47,8
4	0,0	0,0	0,48	96,6	50,5
5	0,0	0,0	0,97	241,7	53,2
6	0,0	0,0	1 ,45	483,3	53,4
7	0,015	2,7	0,02	3,3	46,0
8	0,032	6,7	0,04	8,3	46,3
9	0,038	7,0	0,003	0,5	52,2
10	0,084	17,5	0,006	1 ,3	52,7
★	Unidades por	grama de	peso seco de polpa	na mistura reac
	cional
Rea cçõe	s com enzimas:	Experiência 8
	Adicionaram-se os seguintes reagentes a cada um de três
balões	de Erlenmeyer	de poli carbonato	de 250 ml, equipados com
tampas	roscadas: 125	ml de agua	bidestilada; 20 ml	de acetato de
sódio 0	,2 molar, pH 5	, 0 ; 0,5 ml	de Tween 80 a 10%	em volume/vo-

lume ; 1,0 ml de lactato 2,0 molar; 1,0 ml de glucose 0,3 molar; 0,2 ml de sulfato de manganês 0,1 molar; 0,8 ml de álcool veratrT lico 0,1 molar; e 0,5 ml de NADH (2 mq/ml).

Através da mistura reaccional, fez-se borbulhar oxioénio em cada balão durante três minutos. Em seguida, adi ci onara-m-se 5 gramas de polpa lavada de peso húmido (1,2 gramas de peso seco) a cada balão. Adicionaram-se 50 ml de agua bidestilada a reacção A; adicionaram-se 50 ml da mistura I ao balão de reacção B ; adicionaram-se 50 ml da mistura III ao balão de reacção C . Fi. nalmente, adicionou-se 0,2 ml de glucose-oxidase (1,0 U/microlj. tro) a cada balão.

Lavou-se cada balão com oxigénio, tapou-se e incubou-se a 37°C durante dezoito horas num sacudidor rotativo a 60 rotações por minuto.

Depois da incubação, a polpa de cada balão de reacção foi separada mediante filtração sob vazio em funis de filtro de vidro sinterizado, equipados com filtro de paoel Whatman 3M. Ressuspeji deu-se cada almofada de polpa, com agitação, em aproximadamente 200 ml de solução de hidroxido de sodio 0,5 normal e deoois separou-se mediante filtração. Repetiu-se esta lavagem com hidróxido de sodio. Finalmente, as polpas foram ressusoensas, com agi tação em cerca de 250 ml de acido acético 0,17 N e separadas mediante filtração. As almofadas de polpa foram secas ao ar durante pelo menos quatro horas antes de se medir o teor de lenhina (número ka. pa) e o Tndice de brancura (% de G. E.). 0 número de micr~kapas foi determinado essencialmente como descrito em V. Berzins, A

Rapid Procedure For The Determination Of Kappa Number, Tappi ,

48(1) , paginas 15 - 18 (1955). Os resultados destas estão reunidos no Quadro III.	análises
	QUADRO	III '
Reacção	A	B	C
Actividade de VAO
(U/ml)	0,0	0,0	0,11
(U/g de polpa)*	0,0	0,0	17,5
Actividade de PRO
(U/ml)	0,0	0,73	0,01
(U/g de polpa)*	0,0	120,8	1 ,3
Brancura
(% G. E.)	41,1	54,5	51 ,0
Teor de Lenhina
(Valor de ukappa)**	7,9 + 0,5	6,2 +1,2 7	,0 + 0,5

Unidades por grama de peso seco de polpa em cada balão de reacção

Os valores para o numero de microkappa representam as medias de duas determinações independentes; indicam-se os desvios padrão.

-36Exemplo 3

Des lenhificação e branqueamento de polpa Kraft de madeira dura setentrional por um tratamento em vãrios andares com concentrado de enzimas não fraccionadas VKM-F-1767

Submeteu-se polpa Kraft de madeira dura setentrional a um tratamento em um, dois ou três andares, com concentrado de eri zimas não fraccionadas VKM-F- 1 767 de Phanerochaete chrysospori nm, Cada andar, antes do andar final do tratamento em dois ou três andares, consistiu em três operações sequenciais:

1) incubação da polpa com o concentrado de enzimas;

2} extracção da polpa com substâncias alcalinas; e

3) lavagem da polpa com água.

tratamento do andar final do processo em vãrios andares ou o unico andar do tratamento em um único andar compreendia a quarta fase adicional de extracção da polpa com acido diluído.

Em cada andar, ensaiaram-se três concentrações diferentes do concentrado de enzimas. Todas as condições de reacção excepto uma foram experimentadas em duplicado. Realizaram-se reacções de controlo na ausência de concentrado de enzimas em triplicado rela tivamente ã analise em cada andar.

Preparação da Polpa

Preparou-se polpa Kraft de madeira dura setentrional para o tratamento com enzimas lavando com agua destilada Polpa (100 - 200 gramas de peso húmido) foi dispersa em aproximadamente 1 litro de água destilada, usando um British Sheet Disinteara tor, durante quatro a cinco minutos. Recolheu-se a polpa median te filtração sob vazio num funil de Buchner sobre papel de filtro Whatman 3M; lavou-se com aproximadamente 30 litros de agua destj_ lada por 100 gramas de polpa, peso húmido, em alíqaotas e eliminou-se a agua mediante filtração sob vazio e adicionou-se outra alíquota de agua. Repetiu-se este processo ate a polpa ter sido lavada com o volume pretendido de agua.

A polpa lavada húmida tinha uma consistência de 23,4% (0,234 grama de peso seco de polpa por grama de peso húmido de polpa), uma brancura de 38% G. E., um número de microkappa igual a 13,3 e uma viscosidade de 28,0 cp.

Preparação do Concentrado de Enzimas

Os concentrados de enzimas não fraccionados de VKM-F-1767 foram preparados como se descreveu no Exemplo 1, usando balões de rotação e Meio de Crescimento A e armazenados a -70°Catê serem utilizados. Usou-se a mesma preparação de concentrado para todas as reacções do andar 1. Utilizou-se uma segunda preparação de concentrado nas reacções do andar 2 e do andar 3. Este concentra do foi guardado a 4°C entre estes andares. As actividades de VAO e de PRO dos concentrados de enzimas foram medidas imediatamente

antes de cada andar de acordo com o protocolo descrito antes. Essas actividades foram as indicadas em seguida.

Actividade de VAO Actividade de PRO

Andar ( U/ml)_ _( U/ml )_

1	8,7	13,4
2	3,0	12,1
3	1 ,9	12,0

Andar 1

Preparou-se uma mistura reaccional contendo todos os com ponentes reaccionais excepto polpa, concentrado de enzima e gl£ cose-oxidase, Utilizou-se uma solução de acetato de sodio, pH 4,5 de base e ajustou-se a mistura reaccional, depois da preparação, a pH 4,5 com hidróxido de sodio 1,0 N.

Adicionou-se a mistura reaccional a cada um de dezassete tubos de reacção (tubos de centrífuga de fundo cónico de 50 ml , de polipropileno), e nove tubos de reacção de controlo, para se obterem as condições reaccionais finais (excluindo quaisquer com ponentes da reacção que Dossam contribuir para o concentrado de enzimas) de : acetato de sódio 20 mM, pH 4,5; Tween 80 0,025% ; glucose 10 mM; álcool veratrílico 0,45 m.M; acido láctico 10 mM; sulfato de manganês 0,1 mM.

Fez-se borbulhar oxigénio através da mistura reaccional dentro de cada tubo, durante tres minutos. Em seguida, adicionou-se a cada tubo 1,7 gramas de polpa lavada (0,4 grama de polpa seca) a cada tubo e os tubos foram ligeiramente rodados Dara dis^ persar a polpa. A cada tubo, adicionaram-se 20 microlitros de glucose-oxidase, (1,0 U/microlitro , Sigma Chemical Co., número G 6500). Adicionou-se concentrado de enzimas e/ou ãgua bidpstilada, para se obter o volume reaccional final de 20,0 ml em cada tubo: cinco tubos receberam 5,0 unidades de LiP e 7,7 unidades de MnP (amostras 4-5, 13 e 21-22); seis tubos receberam 10 unida^ des de LiP e 15,4 unidades de MnP (amostras 6-7, 14-15 e 23-24); seis tubos receberam 20 unidades de LiP e 30,8 unidades de MnP (amostras 8-9, 16-17 e 25-26); e nove tubos serviram como contro los (amostras 1-3, 10-12 e 18-20), recebendo apenas ãgua btdesti_ lada, sem concentrado de enzimas. (Ver Quadro IV). Finalmente, os tubos reaccionais foram purgados com oxigénio durante um curto intervalo de tempo, tapados e invertidos cuidadosamente vãrias ve zes para promover a mistura.

Os tubos de reacção foram incubados durante a nofte a 37°C num G24 Environmental Incubator Shaker (New Brunswick Sctentific Co. , Inc., Edison, NJ), numa Dosição horizontal durante a incuba^ ção, a aproximadamente 125 rotações Dor minuto.

Em seguida, as polpas de cada vaso de reacção foram adicionadas a funis de vidro sinteizado separados, equipados com fi1 tros de papel Whatman 3M. Em seguida, adicionaram-se 80 ml de hi droxido de sódio 0,5 N a cada funil de filtração, agttaram-se os conteúdos do filtro e recolheram-se as polpas mediante filtração sob vazio. Ressuspendeu-se a polpa existente em cada funil de filtração em aproximadamente 250 ml de agua destrlada e recolheu-

-40-se novamente mediante filtração sob vazio. Repetiu-se esta lavagem duas vezes com ãgua.

Depois da última lavagem com agua, as polpas das amostra 1 a 9 foram cada uma delas novamente ressuspensas em aproxi madameji te 250 ml de ãcido acético 0,17 N e em seguida separadas por fij_ tração. Estas almofadas de polpa foram secas ao ar durante pelo menos doze horas antes de se^medir a brancura (% de G. Ε.), o teor de lenhina (número de microkappa) e a viscosidade (cp) das polpas. 0 G. E. percentual e o número de microkappa foram determinados co mo se descreveu no Exemplo 2. A viscosidade foi determinada essencialmente como se descreveu em Viscosity of Pulp; Capillary Viscometer Method, TAPPI, Test Method N9 T230os-76, Atlanta, GA (1976). 0 Quadro V reune os resultados destas analises.

Andar 2

As polpas das amostras 10 a 26 foram novamente colocadas em tu bos de reacção separados contendo mistura reaccional oxigenada , com pH ajustado, como se descreveu antes. Os tubos foram rodados cuidadosamente para dispersar as polpas e, a cada tubo de reacção, adicionaram-se 20 microlitros de glucose-oxidase. Adicionou-se concentrado de enzima e/ou agua bidestilada da seguinte maneira, de modo a obter-se um volume reaccional final de 20,0 ml em cada tubo; três tubos receberam 2,0 unidades de LiP e 3,1 unidades de MnP (amostras 13 e 21-22) ; quatro tubos receberam 4,0 unidades de LiP e 16,1 unidades de MnP (amostras T4-25 e 23-24); quatro tubos receberam 8,0 unidades de LiP e 32,3 unidades de MnP (amos tras 16-17 e 25-26); e seis tubos que serviram como controlos

-41(amostras 10-12 e 18-20) não receberam concentrado de enzimas (ver Quadro IV). Finalmente, os tubos de reacção foram purgados com oxigénio durante um curto intervalo de tempo, tapados e invertidos cuidadosamente para misturar.

Os tubos foram depois incubados como se descreveu antes, para o Andar 1. As polpas foram então retiradas dos tubos e lavadas separadamente uma vez com hidróxido de sódio e três vezes com ãgua, como se descreveu antes. Depois da ultima lavagem com agua, as polpas das amostras 10 a 17 foram lavadas com ãcido acé tico 0,17 normal, como se descreveu acima. As almofadas de polpa resultantes foram secas ao ar pelo menos durate doze horas a£ tes de se medir a brancura (percentagem de G. F.), teor de lenh^ na (numero de microkappa) e viscosidade (cp) das polpas, como se descreveu antes.

Andar 3

As polpas das amostras 18 a 26 foram de novo colocadas em tubos de reacção separados contendo uma mistura -reaccionai oxi genada com pH ajustado, como se descreveu acima. Os tubos foram rodados cuidadosamente para dispersar as polpas e, a cada cubo de reacção, adicionaram-se 20 microlitros de glucose-oxidase. Adicionou-se concentrado de enzimas e/ou ãgua bidestilada, como segue, originando um volume reaccionai final de 20,0 ml em cada tubo; dois tubos receberam 1,0 unidade de Lip e 6,3 unfdades de MnP (amostras 21-22); dois tubos receberam 2,0 unidades de Lf.P e

12,6 unidades de MnP (amostras 23-24); dois tubos receberam 4,0 unidades de LiP e 25,3 unidades de MnP (amostras 25-26); e tres .— -42tubos serviram como controlos (amostras 18-20), não recebendo cori centrado de enzimas (ver Quadro IV). Finalmente, os tubos reaccionais foram purgados com oxigénio durante um curto intervalo de tempo, tapados e invertidos cuidadosamente várias vezes para misturar.

Os tubos foram incubados como se descreveu acima, no Andar 1. As polpas foram então lavadas separadamente uma vez com hidroxido de sodio e três vezes com agua, como se descreveu antes Depois da última lavagem com agua, as polpas das amostras 18 a 26 foram lavadas com acido acético 0,17 normal. Estas almofadas de polpa foram secas ao ar pelo menos doze horas antes de se medir a brancura (percentagem di e G. Ε.), o teor de lenhina (número de microkappa) e a viscosidade (cp) das polpas, como se descreveu antes.

Resultados

Quadro IV mostra as unidades· de LiP- e de MnP adicionadas por amostra de polpa em cada andar. As unidades de LiP repre sentam unidades de actividade de VAO. As unidades de MnP representam unidades de actividade de PRO.

As unidades por grama de peso seco de poloa e as unidades por volume reaccional podem ser calculadas a partir dos valores indicados no Quadro IV porque cada tubo de reacção continha 0,4 grama de peso seco de polpa num volume de 20' ml,

Quadro V reune os resultados desta experiência - bra£

-43cura, teor de lenhina e viscosidade das polpas tratadas. ns duplicados estão agrupados conjuntamente. As amostras 1 a 9 foram ensaiadas depois de um andar. As amostras 10 a 17 foram ensaiadas depois de dois andares. As amostras 18 a 26 foram ensaiadas depois de três andares.

Quadro V também contém as unidades cumulativas de LiP e de MnP aplicadas a cada amostra de polpa. Por exemplo, o valor indicado como unidades cumulativas de LiP para a amostra 26 (32,0) representa a soma das unidades de LiP aplicadas nos andares 1, 2 e 3. (20,0 + 8,0 + 4,0).

tratamento de um andar de polpa Kraft de madefra dura com concentrado de enzimas VKM-F-1767 teve como resultado uma de£ lenhificação significativa e um branqueamento significativo da polpa em comparação com as polpas das amostras de controlo que não receberam enzima.

Os tratamentos em dois andares originaram polpa com menor teor de lenhina e maior brancura do que os tratamentos num único andar.

Os tratamentos em três andares funcionaram ainda melhor do que os tratamentos em dois andares. Obtiveram-se teores de lenhina reduzidos e brancuras aumentadas com diminuições aceitáveis de viscosidade.

-44OUADRO IV

Unidades de LiP e de MnP Adi-

cionadas por Reacção

ANDAR UM

Amos tra	Li_P_	MnP
1	0,0	0,0
2	0,0	0,0
3	0,0	0,0
4	5,0	7,7
5	5,0	7,7
6	10,0	15,4
7	10,0	15,4
8	20,0	30,8
9	20,0	30,8	ANDAR	DOIS
			LiP	MnP
10	0,0	O o	0,0	0,0
11	0,0	0,0	0,0	0,0
12	0,0	0,0	0,0	0,0
13	5,0	7,7	2,0	8,1
14	10,0	15,4	4,0	16,1
1 5	10,0	15,4	4,0	16,1
16	20,0	30,8	8,0	32,3
1 7	20,0	30,8	8,0	32,3	ANDAR	TRÊS
					LiP	MnP
1 8	0,0	0,0	0,0	0,0	O o	0,0
19	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
20	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
21	5,0	7,7	2,0	8,1	1,0	6,3
22	5,0	7,7	2,0	8,1	1,0	6,3
23	10,0	15,4	4,0	16,1	2,0	12,6
24	10,0	15,4	4,0	16,1	2,0	12,6
25	20,0	30,8	8,0	32,3	4,0	25,3
9R	n	r	r . n	3? . 3	4.0	25.3

-45nUADRO V

Teor de

Unidades de Enzimas Lenhina

Amostra	Andar	Acumuladas adicionadas'	Brancura (ukappa	’'i s cos i dade (cp)
Li P	MnP	(% G.E.)	NÇ)
1	1	0,0	0,0	46	12,2	27,3
2	1	0,0	0,0	48	10,6	28,2
3	1	0,0	0,0	48	n,i	2 7,6
4	1	5,0	7,7	46	11,2	26,7
5	1	5,0	7,7	52	8,9	24,9
6	1	10,0	15,4	53	7,9	24,9
7	1	10,0	15,4	53	8,5	24,7
8	1	20,0	30,8	54	8,0	24,5
9	1	20,0	30,8	55	5,2	24,6
10	2	0,0	0,0	49	10,7	26,4
11	2	0,0	0,0	49	11,7	26,9
12	2	0,0	0,0	49	11,2	25,2
13	2	7,0	15,8	68	8,8	20,4
14	2	14,0	31,5	67	6,1	20,4
15	2	14,0	31 ,5	66	6,1	20,2
16	2	28,0	63,1	66	4,5	19,8
1 7	2	28,0	63,1	67	5,2	20,3
18	3	0,0	0,0	51	10,4	27,4
19	3	0,0	0,0	50	25,5
20	3	0,0	0,0	51	1 0,0	25,5
21	3	8,0	22,1	75	4,3	20,1
22	3	8,0	22 ,1	76	4,3	20,0
23	3	16,0	44,1	76	4,3	18,7
24	3	16,0	44,1	76	4,3	18,8

-46Exemplo 4

Des1enhificação de polpa Kraft de madeira macia meridional por um tratamento de um, dois ou tres andares com concentrado de enzimas não fraccionadas de VKM-F-1767

Submeteu-se polpa Kraft de madeira macia meridional a um tratamento em um andar, dois andares ou tres andares com concentra, do de enzimas não fraccionado VKM-F-1767 de Phanerochaete chrysospori um. A experiência realizou-se como se descreveu no Exemplo 3, com as modificações indicadas abaixo.

Preparação da polpa

A polpa Kraft de madeira macia meridional húmida lavada tinha uma consistência de 25,4%, uma brancura de 25% G. E. e um nú mero microkappa igual a 25,0.

Preparação do Concentrado de Enzimas concentrado de enzimas não fraccionado de VKM-F-1767 foi preparado como se descreveu no Exemplo 1, usando balões de Rolamen to e Meio de Crescimento A e foi armazenado a -70° atê ã utilização. Utilizou-se a mesma preparação de concentrado em todas as reacções.

concentrado de enzimas foi descongelado e a sua actividade de VA medida imediatamente antes da sua adição nas reacções do andar 1; estes valores estão indicados no quadro mais adiante. 0 valor in dicado para a actividade de PRO do concentrado de enzima usado nas reacções do andar 1 representa a media da actividade PRO do concentrado antes de ser congelado e a actividade de PRO do con centrado medida imediatamente antes do andar 2.

Antes de retirar as amostras para utilização no andar 1 , armazenou-se o concentrado de enzimas durante a noite a 4°C. 0 concentrado de enzimas foi ensaiado novamente no dia seguinte pa_ ra a determinação tanto das actividades de VAO como das activida^ des de PRO, antes da sua adição às reacções do andar 2. 0 concentrado de enzimas foi novamente guardado a 4°C ate ao andar 3.

Nesta experiência, o andar três iniciou-se no mesmo dia que o andar 2. Como o intervalo de tempo entre o segundo e o ter ceiro andares foi reiativamente curto, o concentrado não foi ensaiado uma terceira vez imediatamente antes do terceiro andar . Portanto, as unidades de LiP e de MnP indicadas no Quadro VII pa^ ra as reacções em três andares foram calculadas usando valores das actividades de VAO e de PRO de ensaios realizados imediatame£ te antes do andar 2. Os valores das actividades de VAO e de PRO do concentrado de enzimas, utilizados para os cálculos das unid£ des de enzimas aplicadas em cada andar foram:

Actividade de VAO Actividade de PRO Andar (U/ml)_ (U/ml)_

1	12,0	23,8
2	Π.2	22,5
3	11,2	22,5

Andar 1

Preparou-se uma mistura reaccional 10 x com a seguinte composição: acetato de sódio 200 mM, pH 4,5; Tween 80 0,5%; ãl cool veratrílico 4,0 mM; lactato 100 mM; sulfato de manganês 1,0 mM; ajustou-se esta mistura reaccional a pH 4,5 com hidróxido de sodio.

Adicionou-se a mistura reaccional (2,0 ml por tubo) a c£ da um dos onze tubos de reacção e seis tubos de reacção de contro lo. Em seguida, adicionaram-se a cada tubo 1,6 gramas de polpa lavada (0,4 grama de polpa seca). A cada tubo adicionou-se então agua bidestilada com um volume necessário para se obter um vo lume reaccional final igual a 20 ml por tubo quando todos os componentes da reacçção tivessem sido adicionados. Adicionou-se gl^ cose a cada tubo para se obter uma concentração reaccional final de 10,0 mM, excluindo qualquer glucose que tivesse sido provocada pelo concentrado de enzimas. Os tubos foram então feitos rodar cuidadosamente para misturar. Fez-se borbulhar oxigénio atra^ vés do conteúdo dos tubos durante três minutos. Adicionou-se então o concentrado de enzimas; o Quadro IV mostra as unidades de LiP e de MnP adicionadas a cada tubo de reacção. Finalmente, a cada tubo, adicionaram-se 20 microlitros de glucose-oxidase (1,0 U/microlitro). 0 volume reaccional final em cada tubo foi de ml. Depois da adição de gl ucose-oxi dase, os tubos foram tapa, dos e rodados cuidadosamente para misturar o conteúdo e dispersar a polpa.

As amostras foram incubadas durante a noite. Depois da

-4.

incubação, as polpas de cada vaso de reacção foram lavadas com hidróxido de sodio e depois lavadas por duas vezes com agua. Em seguida, as polpas das amostras 1 a 6 foram lavadas com ãcido £ cético, deixadas secar ao ar durante a noite e ensaiadas relativamente a brancura, teor de lenhina e viscosidade. 0 Quadro VII mostra os resultados destas anãlises.

Andar 2

As polpas das amostras 7 a 17 foram submetidas a outra l£ vagem com água com aproximadamente 250 ml de ãqua destilada. Depois desta última lavagem, as polpas destas amostras foram novamente colocadas nos tubos de reacção e submetidas a outra incuba, ção com o concentrado de enzimas, de maneira idêntica a que se descreveu antes para o Andar 1. 0 Quadro VI indica as unidades de LiP e de MnP adicionadas no caso das reacçoes do andar 2.

As misturas reaccionais do andar 2 foram incubadas duraji te cinco horas, como se descreveu no Exemplo 3. As polpas de ca da vaso de reacção foram então lavadas uma vez com hidróxido de sodio e duas vezes com agua, como se descreveu para o andar 1. Então, as polpas das amostras 7 a 11 foram lavadas com ãcido acé tico, deixadas secar ao ar durante a noite e ensaiadas relativamente a brancura, teor de lenhina e viscosidade. 0 Ouadro VII indica os resultados destas anãlises.

Andar 3

As polpas das amostras 12 a 17 foram submetidas a outra lavagem com agua com aproximadamente 250 ml de agua destilada então, as polpas das amostras 12 a 17 foram novamente colocadas em tubos de reacção e submetidas a outra incubação com concentr^ do de enzimas, como se descreveu antes oara o andar 1. 0 Quadro

VI indica as unidades de LiP e de MnP adicionadas a estas misturas reaccionais do andar 3.

As misturas reaccionais do andar 3 foram incubadas duran te a noite. As polpas de cada reacção foram então lavadas com hidróxido de sódio e agua, como se descreveu para o andar 1. Em seguida, as polpas das amostras 12 a 17 foram lavadas com ãcido acético, deixadas secar ao ar durante a noite e ensaiadas relati_ vamente a brancura, teor de lenhina e viscosidade. 0 Quadro VII reune os resultados dessas analises.

Resultados

Quadro VI indica as unidades de LiP e de MnP adicionadas por amostra de polpa em cada andar. Como no Exemplo 3, as unidades de LiP ou de MnP por grama de peso seco de polpa e as unidades por volume de mistura reaccional podem ser calculadas a partir dos valores indicados no Quadro VI, visto que cada tubo de reacção continha 0,4 grama de peso seco de polpa num volume de 20 ml.

Quadro VII indica os resultados desta exoeriência - bra£ cura, teor de lenhina e viscosidade das polpas tratadas. Os duplicados estão agrupados em conjunto. As amostras 1 a 6 foram ensaiadas depois de um andar. As amostras 7 a 11 foram ensaiadas

depois de dois andares. As amostras 12 a 17 foram ensaiadas depois de tres andares. 0 Quadro VI também indica as unidades ac£ muladas de Li P e de MnP aplicadas a cada amostra de polpa.

-510 tratamento de um andar de poloa Kraft de madeira macia meridional com concentrado de enzimas VKM-F-1 767 teve como resuj_ tado uma des lenhi fi cação significativa da polpa. Os tratamentos de dois andares produziram polpas ainda com menores teores de le nhina. Os tratamentos de três andares conseguiram obter melhores resultados do que os tratamentos em dois andares.

Muito embora se tenha conseguido uma des1enhificação sig nificativa com os tratamentos de um andar e de dois andares, as polpas não estavam branqueadas, provavelmente por causa de o teor de lenhina não ter sido dimunuído suficientemente para provocar o branqueamento. No entanto, depois do tratamento em três andares, o teor de lenhina tinha diminuído suficientemente e observou-se a brancura. A viscosidade da polpa não foi diminuída pelos tratamentos enzimaticos.

QUADRO VI

Unidades de LiP e de MnP adicionadas por Reacção

Amostra	ANDAR LiP	UM MnP
1	0,0	0,0
2	0,0	0,0
3	9,6	19,0
4	9,6	19,0
5	19,2	38,1
6	19,2	38,1

ANDAR	DOIS
LiP	MnP

7	0,0	0,0	0,0	0,0
8	0,0	0,0	0,0	0,0
9	9,6	19,0	4,8	9,6
10	9,6	19,0	4,8	9,6
11	19,2	38,1	9,6	19,3
					ANDAR	TRÊS
					LiP	MnP
12	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
13	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
14	9,6	19,0 ·	4,8	9,6	0,6	1 ,2
15	9,6	19,0	4,8	9,6	0,6	1 ,2
16	19,2	38,1	9,6	19,3	1,3	2,6
17	19,2	38,1	9,6	19,3	1,3	2,6

QUADRO VII

Amostra	Unidades de Enzimas	Teor de lenhina
Andar	acumuladas	Brancura (% G. E.)	(jjkappa NÇ)	Viscosidade (cp)
LiP	MnP
1	1	0,0	0,0	36	23,5
2	1	0,0	0,0	36	22,4	14,3
3	1	9,6	19,0	28	19,9	21,4
4	1	9,6	19,0	27	20,1	19,4
5	1	19,2	33,1	28	17,9	18,3
6	1	19,2	38,1	28	1.9,4	19,5
Ί /	1	0,0	0,0	35	23,0	7,7
8	1	0,0	0,0	34	22,3	12,8
9	1	14,4	28,6	31	16,0	14,3
10	2	14,4	28,6	30	15,0
11	2	28,8	57,4	30	16,4	15,9
12	2	0,0	0,0	33	20,1
13	2	0,0	0,0	35	20,4	11,9
14	2	15,0	29,8	35	12,4
15	2	15,0	29,8	40	10,2	14,2
16	2	30,1	60,0	40	10,1	13,9
17	2	30,1	60,0	43	8,7	14,3

Polpa lavada não tratada

Claims (15)

1. Reivindicaçoe

   1.- Processo para a deslenhificação enzimática de material lignocelulosico, compreendendo uma ou mais fases de deslenhificação enzimática, caracterizado pelo facto de cada fase compreender a operação que consiste em incubar o material lignocelulõsico com uma quantidade eficaz de uma preparação de enzimas ligninolíticos, em uma mistura reaccional que compreende peróxido de hidrogénio, a uma concentração estacionária de cerca de 0,001 a 0,5 mM durante a reacção de deslenhificação e

   a) 0 a 1,0 mM de Mn(II);

   b) 0 a 20 mM de um -hidroxi-ácido;

   c) 0 a 0,6 mM de um álcool aromático substituído capaz de servir como substrato para o referido enzima ligninolítico; e

   d) 0 a 0,1 % de um detergente escolhido do grupo que consiste em detergentes não iónicos e anfotéricos.

   -552. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o álcool aromático substituído se encontrar presente em uma quantidade compreendida entre 0,005 e 0,5 mM.
2. 3. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o material lignocelulõsico ser uma polpa de madeira.
3. 4. - Processo de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de a concentração de peróxido de hidrogénio ser mantida ao nível estacionário por formação enzimática in situ de peróxido de hidrogénio ou pela adição periódica ou controlada de peróxido de hidrogénio.
4. 5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de o -hidroxi-ácido ser um lactato e o álcool aromático substituído ser álcool veratrílico.
5. 6.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a preparação de enzima lignolítico derivar de um fungo de podridão branca.
6. 7.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o fungo da podridão branca ser uma estirpe

   -56de Phanerochaete chrysosporium.
7. 8.- Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a estirpe de Phanerochaete chrysosporium ser escolhida do grupo que consiste em SC26 tendo o número de identificação característico de HRRL 15987; VKM-F-1767 tendo o número de identificação característico de ATCC 24725; e ME-446 tendo o número de identificação característico de ATCC 34531.
8. 9.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de a preparação de enzima ligninolítico ser um concentrado de enzima não fraccionado que consiste num meio de cultura extracelular concentrado do fungo da podridão branca.
9. 10.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a preparação de enzima ligninolítico compreender pelo menos uma lenhina-peroxidase.
10. 11. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de a preparação de enzima ligninolítico compreender pelo menos uma peroxidase dependente de Mn(II).
11. 12. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a preparação de enzima lignolítico consistir essencialmente numa ou mais lenhina-peroxidases.
12. 13.- Processo de acordo cora a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a preparaçao de enzima ligninolítico consistir essencialmente numa ou mais peroxidases dependentes de Μη(II).
13. 14. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2 , caracterizado pelo facto de cada operação de deslenhificação enzimática compreender ainda as operações subsequentes que consistem em:

    a) extrair o material lignocelulósico com uma substância alcalina depois da operação de incubação com a preparação de enzima ligninolítico e

    b) lavar extensamente o material lignocelulósico com água.
14. 15. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de se extrair o material lignocelulósico com uma solução ácida diluída depois da operação de extracção com a substância alcalina.
15. 16.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender pelo menos uma fase de branqueamento além das referidas uma ou mais de deslenhificação enzimática ,