PT96461B - Processo de producao de uma preparacao com actividade enzimatica na deslenhificacao e processo de tratamento de pasta de madeira - Google Patents

Processo de producao de uma preparacao com actividade enzimatica na deslenhificacao e processo de tratamento de pasta de madeira Download PDF

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Description

MEMáRIA DESCRITIVA
presente invento refere-se ao processo de produção de uma preparação exibindo actividade enzimática, preparação esta que tem a capacidade de deslenhificar pasta de madeira a uma temperatura de pelo menos 65°C e a um pH de pelo menos 9. 0 processo compreende a -fermentação aeróbia de uma estirpe seleccionada de Bacillus stearothermophilus. 0 presente invento re-fere-se também a duas estirpes isoladas de Baci Ilus stearothermophilus e a seus mutantes e variantes. 0 presente invento re-fere-se também a aplicações da preparação da invenção, nomeadamente, a um processo compreendendo o tratamento de pasta de madeira com uma preparação produzida de acorda com a invenção, e a uma pasta de madeira e a uma pasta de -felpa tratada com uma preparação produzida de acordo com a invenção e também a um papel, um cartãp'. e a -felpa -fabricados a partir de uma pasta de madeira tratada com uma preparação produzida de acordo com a invenção.
Antecedentes
Na indústria da pasta e do papel -fazem-se grandes es-forços para reduzir o uso de produtos químicos nos processas de deslenhi-ficação e de branqueamento, uma vez que estes produtos químicos e, especialmente, os compostos orgânicos com cloro, nos e-fluentes das instalações de branqueamento, originam poluição do meio ambiente.
Uma aproximação para reduzir o uso de produtos químicos na produção de pasta e no branqueamento tem-se debruçado sobre o uso de microrganismos que degradam a lenhina. Têm também sido sugeridas enzimas que degradam ou modificam a lenhina. Em Criticai Reviews TM in Biotechonology, vol. 6, Issue 1, 1987, pp. 1-60, Ed. Stewart, G.G. and Russell, I., CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida, publica-se uma revisão bibliográfica da biodegradação da lenhina.
7Ε 035
Ref: S909550/BLN/LG
-3Outra aproximação tem-se preocupado com a remoção da lenhina usando hemícelulases para quebrar as ligaçães de hemícelulases. Em Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, vol. 3E, 1976, pp . Ξ77-352 publica-se um artigo de revisão Hemicellulases; Their Occurence, Purification, Properties, and Mode of Action, por Dekker e Richards, G.N.
De entre as hemícelulases, as xilanases têm atraído mais a atenção para uso na produção biológica de pasta e no biobranqueamento. Na FR S557S94-A1 descreve-se o tratamento de pasta de papel com uma solução enzimática que não tem qualquer actividade de celulase e que contém xilanase. □ tratamento é efectuado a 30-60°C, especialmente a 40°C, e no Exempla 6 refere-se que o pH deverá ser 5. Contudo, as indústrias do papel e dá pasta estariam interessadas em tratar pasta de madeira a temperaturas mais elevadas e a pH mais elevados, por razões económicas e conveniência, uma vez que alguns processos de branqueamento estabelecidos são conduzidos a temperaturas superiores a 65°C e a pH superior a 9.
Não é conhecido que alguém tenha descrito o tratamento de pasta de madeira com uma preparação exibindo actividade enzimática e possuindo a capacidade de deslenhificar pasta de madeira a uma temperatura de pelo menos 65°C e a um pH de pelo menos 9.
Descrição da Invenção presente invento refere-se ao processo de produção de uma preparação exibindo actividade enzimática, preparação esta que tem a capacidade de deslenhificar pasta de madeira a uma temperatura de pelo menos 65°C e a um pH de pelo menos 9.
Na presente descrição e nas reivindicaçães a expressão pasta de madeira deve ser interpretada, genericamente, e assim pretende-se que compreenda todos os tipos de materiais lenhocelulósicos.
73. 035
Ref: 2909550/BLN/LG
-4Um aspecto do presente invento refere-se ao processo de produção de uma preparação exibindo actividade enzimática, no qual a preparação é obtida por fermentação aeróbia, num meio adequado, de uma estirpe de Bac i1lus stearothermoph ilus seleccionada de entre as estirpes depositadas NCIMB 40221 e NCIMB 40222 e de entre os seus mutantes e variantes possuindo substancialmente a mesma capacidade de produzir a referida preparação do que as referidas estirpes NCIMB 40221 e NCIMB 40222 possuindo, a referida preparação, a capacidade de deslenhificar pasta de madeira a uma temperatura de pelo menos 65°C e a um pH de pelo menos 9. Numa concretização deste aspecto da invenção, a preparação pode ser obtida por fermentação aeróbia, num meio adequado compreendendo glucose como fonte de carbono, de uma estirpe mutante do Baci1lus stearothermophilus da estirpe NCIMB 40222. Numa outra concretização do processo do presente invento, a preparação compreende uma enzima que inclui a sequência de aminoácidos seguinte:
-Lys-Asn-A1a-Asp-Sei—Tyi—A1a-Lys-Lys-Pro-H i s-11e-Sei—Ala-Leu-Asn-Ala-Pro-Gln-Leu-Asn-Gln-Arg-Tyi—Lys-Asn-Glu-Phe-Thi—Ile-Gly-Ala-A1a-Va1-G1u-Pro-Ty ι—G1n-Leu-G1n-As που de um seu homóloga, a enzima inteira exibindo actividade enzimática num meio de pasta de madeira. Neste contexto, um homólogo da referida sequência de aminoácidos é uma sequência homóloga possuindo algumas substituiçães, extensães ou delecçães de aminoácidos que não conduzem à eliminação da actividade enzimática da enzima inteira num meio de pasta de madeira. Adicionalmente, um homólogo da referida sequência de aminoácidos e qualquer sequência que é suficientemente homóloga, ao nível dos nucléótidos, para ser reconhecida por qualquer sonda de ADN ou de ARN derivada, da referida sequência. Ainda noutra concretização deste aspecto da invenção a preparação é um caldo de cultura clarificado. Ainda numa outra concretização deste aspecto da invenção, a preparação é uma fracção parcialmente purificada do caldo de cultura exibindo actividade enzimática num meio de pasta de madeira. A fracção parcialmente purificada pode ser obtida por
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Re-f: 2909550/BLN/LG
-5precipitação com sul-fato de amónio. Numa concretização adicional deste aspecto da invenção, a preparação é uma -fracção altamente puri-ficada do caldo de cultura c tar i-f içado , que pode ser obtida pelo uso de um permutador de catiães, estando, a referida •fracção, na -forma de uma xilanase exibindo actividade enzimática num meio de pasta de madeira. Numa concretização particular, a xilanase tem um peso molecular aproximado compreendido entre 41000 e 42000 dalton, determinado por SDS-PAGE e -filtração em gel e a composição em aminoácidos, aproximada, seguinte, determinada por análise de aminoácidos, na -forma do número de resíduos de aminoácido por molécula: Asx 53; Thr 12; Ser 10; Glx 44; Pro 24; Gly 20; Ala 30; Cys 1; Vai 28; Met 2; Ile 26; Leu 14; Tyr 22; Phe 16; Lys 38; His 6; Arg 12.
De acordo com o presente invento, no processo de produção de uma preparação exibindo actividade enzimática, submete-se uma estirpe de Bacillus stearothermophilus. seleccionada de entre as estirpes NCIMB 40221 e NCIMB 40222, e de entre os seus mutantés e variantes possuindo substancialmente a mesma capacidade de produção da re-ferida preparação do que as re-feridas estirpes NCIMB 40221 e NCIMB 40222, a -fermentação aeróbia num meio adequado, possuindo, a re-ferida preparação, a capacidade de deslenhificar pasta de madeira a uma temperatura de pelo menos 65°C e a um pH de pelo menos 9. Numa concretização particular do processo de acordo com a invenção, submete-se uma estirpe mutanté do Bacillus stearothermophilus da estirpe NCIMB 40222 a •fermentação aeróbia num meio adequado compreendendo glucose como •fonte de carbono. Numa outra concretização deste aspecto da invenção o caldo de -fermentação é clarificado, opcionalmente, por centrifugação. Ainda numa outra concretização, o caldo de -fermentação clari-ficado é submetido a precipitação com sul-fato de amónio e, opcionalmente, a ressuspensão num meio líquido, obtendo-se uma -fracção parcialmente purificada do referido caldo de cultura clarificado exibindo actividade enzimática num meio de pasta de madeira a uma temperatura de pelo menos 65°C e a um pH de pelo menos 9. Numa concretização adicional do processo de acordo
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Ref: 2909550/BLN/LG
com a invenção o caldo de fermentação clarificado é purificado e concentrado usando um permutador de catiães, obtendo-se uma fracção altamente purificada na forma de uma xilanase exibindo actividade enzimática num meio de pasta de madeira a uma temperatura de pelo menos 65°C e a um pH de pelo menos 9.
Ainda num seu outro aspecto, o presente invento refere-se às estirpes NCIMB 40221 e NCIMB 40222 do Bacillus stearothermophilus e aos seus mutantes e variantes, possuindo os referidos mutantes e variantes substancialmente a mesma capacidade de produzir uma preparação exibindo actividade enzimática do que as referidas estirpes NCIMB 40221 e NCIMB 40222, possuindo a referida preparação a capacidade de deslenhificar pasta de madeira a uma temperatura de pelo menos 65°C e a um pH de pelo menos 9.
Ainda num seu outro aspecto o presente invento refere-se a um processo de tratamento de pasta de madeira, caracterizado por compreender o tratamento da pasta de madeira, em pelo menos um passo com uma preparação produzida de acordo com a invenção. Numa concretização deste aspecto da invenção, a pasta de madeira a ser tratada é pasta de. sulfato. Noutra concretização a pasta de sulfata a ser tratada é uma pasta de sulfata parcialmente deslenhifiçada. Ainda numa outra concretização deste aspecto da invenção a pasta *de sulfato parcialmente deslenhifiçada a ser tratada é pasta de sulfato deslenhifiçada com oxigénio. 0 processo compreendendo o tratamento de pasta de madeira é realizado, adequadamente, a uma temperatura de pelo menos 65°C num meio possuindo um pH de pelo menos 9.
Um aspecto adicional da invenção refere-se ao processo de produção de produtos obtidas a partir de pasta de madeira que foi tratada, em pelo menos um passo, com uma preparação produzida de acordo com a invenção. Assim, este aspecto da invenção compreende o processo de produção de pasta de madeira e de pasta de felpa fluff” que compreende o tratamento, em pelo menos um passo, com uma preparação produzida de acordo com a invenção, e de papel, de
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Ref: 2909550/BLN/LG
-7caFtãó ; e de fél-pa : f luff produz idos a partir de pasta de madeira que foi tratada em pelo menos um passo com uma preparação produzida de acordo com a invenção.
Num seu aspecto adicional a invenção refere-se a uma sonda de ADN ou de ARN que reconhece a sequência de nucleótidos codificando a sequência de aminoàcidos seguinte;
-Lys-Asn-Ala-Asp-Ser-Tyr-Ala-Lys-Lys-Pro-His-Ile-Ser-Ala-Leu-Asn-Ala-Pro-Gln-Leu-Asn-6ln-Arg-Tyi—Lys-Asn-Glu-Phe-Thr-Ile-Gly-Ala-Ala-Val-Glu-Pro-Tyr-Gln-Leu-Gln-Asn-.
Adicionalmente, um aspecto da invenção refere-se a um anticorpo que se liga á sequência de aminoàcidos
-Lys-Asn-Ala-Asp-Sei—Tyi—Ala-Lys-Lys-Pro-Hi s-11e-Ser-Ala-Leu-Asn-Ala-Pro-Gln-Leu-Asn-Gln-Arg-Tyi—Lys-Asn-Glu-Phe-Thr-Ile-Gly~Ala-Ala-Val-Glu-Pro-Tyi—Gln-Leu-Gln-Asn- .
Estes dois últimos aspectos da invenção são úteis para detectar enzimas possuindo a capacidade de deslenhificar pasta de madeira a uma temperatura de pelo menos 65°C e a um pH de pelo menos 9.
Isolamento de microrganismos produtores de enzima estável termicamente
As fontes de microrganismos foram amostras de água e de lama colhidas nos tanques de tratamento de água nas fábricas de pasta e de papel de Korsnas, Gávle, Suécia. 0 meio de enriquecimento (XM) continha 0,01% de extracto de levedura, 0,04% de triptona e 0,2% de xilano, a pH 7,0. 0 mesmo meio a pH 8,1 e 9,6 continha, adicionalmente, NagCOg. Adicionaram-se amostras de água e de lama aos meios XM e cultivaram-se aerobiamente a 65°C. De 2r3 em 2-3 dias transferiram-se amostras das culturas para meios frescos. Após quatro transferências, diluiram-se amostras das culturas e espalharam-se em placas de ágar com XM (XM contendo 2% de ágar).
Seguindo três procedimentos de enriquecimento independentes, isolaram-se 30 estirpes que eram capazes de crescer em placas de ágar com XM a 65°C. Não se obtiveram isolados a partir do meio XM
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Re-f: 2909550/BLN/LG
-8a pH 9,6. Dos 30 isolados, 10 produziram zonas claras à volta da colónia sugerindo que produzem uma xilanase extracelular. Seleccionaram-se para depósito dois destes dez isolados (estirpes T2 e T6).
Depósitos de microrganismos nomeadamente das espécies tratado de Budapeste na and Marine Bactéria Ltd
Depositaram-se duas estirpes,
Bacillus T2 e T6, de acordo com o National Collections o-f Industrial (NCIMB), Aberdeen, em 8 de Novembro de 1989. Os números de acesso atribuídos para as estirpes T2 e T6 -foram respectivamente NCIMB 40221 e NCIMB 40222.
Identificação das estirpes T2 e T6
As aerób i os est irpes Bacillus estirpes T2 e T6 são bastonetes -formados de esporos gram-positivos, capazes de crescerem a 65°C. Estas são consideradas, pela NCIMB, estirpes di-ferentes de stearothermophilus, com base nos resultados dos testes seguintes:
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Ref: 2909550/BLN/LG
Bacil lus Testes da segunda fase
1 1 Isolado NS ΤΞ (NCIMB 40ΞΞ1) T6 1 (NCIMB 40S2S) | 1
| Testes a °C 60°C 1 60°C | I
1 Forma dos esporos3 E 1 E |
I EsporSngio distendido !
1 distintamente - 1
1 Posição dominante do i
1 esporo*3 T T 1 I
1 Crescimento anaeróbio - 1 1
1 Crescimento em NaCt a 5% - 1
1 Crescimento em NaCl a 7% — 1 I
1 Crescimento em NaCl a 10% - 1 1
I Crescimento em caldo a pH 5,7 - 1
1 Acido a partir de glucose d ' + 1
1 Gás a partir de glucose^ — 1 I
1 VP (acetoína) - 1 1
| Opacidade em ágar Não houve Não houve |
1 de gema de ovo crescimento crescimento J
1 Decomposição de caseína + + 1
1 Decomposição de gelatina + (+) J 1
I Aesculina + 1 1
I Hidrólise de amido +R +R j
1 NOg” a N0g~ - 1
1 N Residual 1_ — 1 1
(Cont i nua)
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Re-f: 2909550/BLN/LG
-10Bacillus
Testes da segunda -fase (cont i nuação)
1 J Isolado NQ T2 (NCIMB 40221) -—, T6 (NCIMB 40222) J 1
1 j Testes a °C 1 60°C 1 60°C j |
1 | Citrato de Koser - 1
| Azida de dextrose - 1
j pH em caldo VP 5,5 6,3 | 1
1 j Leite de tornassol 1 i
j coagulação - - 1
| acidificação - 1
| Catalase + + 1
] Oxidase 1 + + 1 1
1 J Temperaturas de crescimento °C 1 1
j 25°C - 1
j 37°C - 1
| 65°C + + 1
| 70°C 1_ — 1 :i
aE, elípticos ou cilíndricos; S, esféricos ou aproximadamente esféricos; ^C, central; T, terminal ou subterminal; CT, central a terminal; cem ágar e glucose; dpeptona, água e açúcar, indicador de Andrade; restringido
Composição em ácidos gordos das estirpes T2 e T6
Os isolados T2 e T6, xilanase-positivos, termofίlicos, foram enviados para Microbial ID, INC. Newark, DE, E.U.A. para determinação da composição em ácidas gordos. Os resultados recebidos foram os seguintes:
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Re-f: 2909550/BLN/LG
-11Composição em ácidos gordos <*/♦) dos termó-filos xilanase-positivos
Γ Isolado: T2 -j T6 ]
Acido gordo 1 1
9:0 12:0 0,73 1 0,64 | 0,46 |
14:0 iso 1
14:0 0,85 1 ,92 |
15:0 iso 44,41 46,2 |
15; 15:0 anteiso 2,59 2,35 | 0,53 J
16: iso 6,25 4,15 |
16:1 4,24 5,53 |
16:0 5,29 6,14 |
17:1 iso H 2,41 2,6 |
17:0 iso 26,07 22,58 |
L 17:0 18:0 anteiso 7,15 5,82 | 1,09 | 1
J
Características de crescimento das estirpes T2 e T6 e preparagão de sobrenadantes em bruto, concentrados, a partir das estirpes cultivadas
Meio de crescimento: meio XMP contendo em g/litro: casaminoácidos sem vitamina, 4; extracto de levedura, 0,2; MgSOq., 0,01; (NHq.)gSOi|., 2; KsHP04, 0,46; KHgP04, 0,1; xilosé, 5; MGPS (ácido 3-CN-mor-fol inolpropanossulfónico) , 10,4; e elementos vestigiários. 0 pH do meio era 7,0.
Actividade de xilanase:
A actividade de xilanase -foi determinada incubando uma
ZC. !.·Ό·_Ι
Ref 5 2909550/BLN/L6
solução fresca de xilano com fluído de sobrenadante extracelular e analisando para determinar um aumento nos açúcares de redução pelo método do ferricianeto (Spiro, R.G. 1966, Methods in Enzymology 8: 7-9). 0 tampão de ensaia era Tris.HCl 50 mM, pH 7,0, e 0,5% de xilano (espeltas de aveia, Sigma). As unidades de actividade para a xilanase são Mmole de açúcar de redução gerada por minuto a 65°C.
Turvação celular do meio:
A turvação celular do meio é dada em unidades Klett. 1 UK = 0,004 g de peso de células secas (PCS)/litro. Assim que a cultura atinge a sua densidade máxima há a tendência para ocorrer a lise das células tal como é indicado por uma diminuição súbita da turvação da cultura.
As estirpes ΤΞ e T6 foram cultivadas em meio XMP durante 24 horas num fermentador New Brunswick Microferm de 7,5 litros. 0 crescimento foi realizado num volume de trabalho de 4 litros, a 60°C, com uma velocidade de agitação de 600 rpm e um caudal de arejamento de 7 litros por minuto. A formação de espuma foi controlada automaticamente por adição de agente antiespuma de silício (5%, Fluka) e o volume de trabalho foi mantido adicionando água esterilizada. 0s inóculos de partida iniciais tinham turvaçães de 10 UK (0,04 g de PCS/litro). Durante as primeiras 8 horas das fermentaçães a turvação celular aumentou para 540 e 700 UK, para as estirpes T6 e ΤΞ, respectivamente. Após 24 horas a turvação celular diminuiu.
líquido de cultura foi arrefecido até à temperatura ambiente e centrifugado (8000 g, 10 min, 20°C) para remover as células. □ sobrenadante isento de células continha 1,0-1,4 e 2,0-2,4 unidades de xilanase por ml, respectivamente, para as estirpes T2 e T6, e cerca de 0,02 mg de proteína, por ml, para ambas as estirpes. Concentrau-se a proteína adicionando, ao sobrenadante, sulfato de amónio sólido até 80% de saturação a 4°C e centrifugando a mistura (9000 x g, 15 min.) após 12 horas a
12. 035
Ref: 2909550/BLN/LG
uséíife
-134°C. Dissolveu-se o precipitado num volume total de 100 ml de tampão fosfato 10 mM, pH 7,0, e dialisou-se três vezes contra 5 litros do mesmo tampão a 4°C. A solução dialisada (~120 ml) continha cerca de 7 mg/ml de proteína e 15-20 e 35-40 unidades de xilanase, respectivamente, para as estirpes T2 e T6.
Crescimento da estirpe T6
Tempo <h) UK Xilanase (U/ml)
0 10 nd
2 25 nd
4 140 nd
6 400 1 ,48
8 540 1 ,88
11 540 1 ,78
14 528 2,26
24,5 280 2,42
Crescimento da estirpe T£
Tempo (h)
UK Xilanase (U/ml)
0 10 nd
2 30 nd
4 160 0,75
6 430 0,58
8 700 0,98
11 600 1 ,05
24 250 1 ,28
035
Ref: 2909550/BLN/LG
-14Será de notar que a actividade de xilanase das estirpes T2 e T6 não diminuiu no final da fermentação.
A composição exibindo actividade enzimática de acordo com a invenção
Os sobrenadantes isentos de células, resultantes do crescimento das estirpes T2 e T6 em meio XMP, contêm pelo menos uma xilanase, uma vez que mostraram ..... exibir actividade de xilanase. Os referidos sobrenadantes (também designadas por preparaçães de enzima em bruto) e as suas fracçães parcialmente purificadas têm sido usados no tratamento de pastas de sulfato de madeira macia, não branqueadas e semibranqueadas com oxigénio.
Amostras de pasta não branqueada e semibranqueada com oxigénio
As amostras de pasta eram amostras de pasta de sulfato, de madeira macia, colhidas na fábrica Korsnas.
A amostra de pasta não branqueada era uma amostra colhida após digestão alcalina num digestor Kamyr, analisada em laboratório e lavada, e a referida amostra foi seca de um dia para o outro a 50°C. Nas experiências usou-se a amostra semi-seca e designou-se por K8. Este material foi seco a 105°C, até peso constante, obtendo-se um teor de água de 6,35’/..
A amostra de pasta semibranqueada com oxigénio, era uma amostra que tinha sido tratada na linha 3 de fibras de Korsnas e foi colhida após o segundo tratamento com oxigénio, analisada em laboratório e lavada. Na comunicação de 26 de Setembro de 1989, pág. 20 e em Nordisk Cellulosa 1989 No. 6, p. 8-11 foi publicada uma descrição geral da fábrica de tratamento de pasta de Korsnas.
A pasta semibranqueada com oxigénio foi designada por Kll.
Teor em lenhina das pastas K8 e Kll
Os teores em lenhina das pastas K8 e Kll foram determinados
12. 035
Re-f: 2909550/BLN/LG
-15pel.o procedimento de The Swedish Association o-f Pulp and Paper Engineers, Series CCA5. 0 teor em lenhina da amostra K8 (não branqueada) era de 2,87. e o teor em lenhina da amostra Kll (semibranqueada com oxigénio) era de 2,0’/.. Assim a amostra Kll, semibranqueada com oxigénio, tinha um valor do teor em lenhina reduzido em 257. em comparação com a amostra K8.
Experiências realizadas com preparações de enzima em bruto, obtidas a partir das estirpes T2 e Τβ de Bacillus stearothermophi lus, na deslenhi-f icação das pastas K8 e Kll.
Para a estimativa de quanta lenhina se consegue extrair usando as preparações enzimáticas da invenção usou-se um teste espectro-fotométr ico sensível. Mediram-se os valores de absorvância a 350 nm (A35Q) dos sobrenadantes líquidos das amostras e os valores medidos estão apresentados coma 7. de lenhina libertada.
Nas Tabelas 1-5 resumem-se as experiências e os resultados.
A partir dos valores que se apresentam nas Tabelas 1-5 pode-se concluir que as preparações de enzima em bruto, obtidas a partir das estirpes T2 e T6 de Bacillus stearothermophilus, são capazes de deslenhi-f icar tanto amostras de pasta não branqueadas, como amostras de pasta . semibranqueadas, a valores de pH de pelo menos 9 e a temperaturas de pelo menos 65°C. Adicionalmente, pode-se concluir que a 7. de lenhina libertada é dependente do tempo e da concentração.
035
Re-f: 2909550/BLN/LG
-16TABELA 1
Libertação de lenhina da pasta Kl-1 em -função das preparações de enzima em bruto, obtidas a partir das estirpes T2 e T6a de B. stearothermoph ilus
| I Enzima (mg/ml) -j ‘/. de lenhina libertada b 1
Total Corrigido 1
1 0 8 - 1
1 T2 (0,6) 14 6 I
| T2 (0,8) 17 9 j
| T2 (1,2) 20 12 |
] T2 (1,9) 22 14 |
| T6 (0,25) 16 8 Ί
| T6 (0,5) 18 10 |
[ T6 (1,1) 1 19 11 | 1
a As preparações de enzima eram precipitadas com sul-fato de amónio que -foram dissolvidos em tampão -fos-fato 10 mM, pH 9,0, até às concentrações de proteína indicadas. 0 controla -foi tampão -fosfato 10 mM, pH 9,0. A pasta Kll estava numa quantidade de 150 mg em 3 ml.
b A incubação foi realizada durante 18 h a 65°C e a pH 9,0. A ’/. de lenhina libertada é baseada no valor de A350 e é corrigida com o valor da absorvância da preparação da enzima em bruto na concentração apropriada.
ΊΒ 035
Ref: 2909550/BLN/LG
TABELA 2
Cinética da libertação de lenhina da pasta Kll usando a preparação de enzima em bruto, obtida a partir das estirpes T2 e T6a de B. stearothermophilus
Tempo (h) Enzimab 1 % de lenhina libertada 1
Total Corrigida 1
2 T2 17 12 |
4 T2 23 18 |
18 T2 29 21 |
2 T6 12 5 |
4 T6 15 8 1
6 T6 17 9 1
l 18 T6 18 10 | _1
a A experiência foi realizada como se descreve na Tabela 1 , a 65°C e a pH 9,0.
b As concentrações de enzima em bruto T2 e T6 foram, respectivamente, 2,8 e 1,5 mg de proteína/ml.
7S 035
Ref: E909550/BLN/LG
-18TABELA 3
Libertação de lenhina em função da temperatura usando preparações de enzima em bruto obtidas a partir das estirpes TE e T6a de B. stearothermophilus
1 | Temperatura | °C I Enzima*3 % de lenhina Total 1 libertada | Corrigido | I
! | 53 TS 16 1 6 I
| 65 TE 19 9 1
| 75 TS 20 5 1
1 | 53 T6 15 1 5 1
| 65 T6 18 8 1
1 75 1_ T6 Ξ0 5 1 ,1
a A experiência foi realizada como se descreve na Tabela l,a 65°C e a pH 9,0.
b As concentrações de enzima em bruto TS e T6 foram, respectivamente, 1,7 e 0,7 mg de proteína/ml.
035
Ref: 2909550/BLN/LB
TABELA 4
Libertação de lenhina da Kll em função do pHa
pH Enz ima^ ‘Λ de lenhina -1 libertada 1
Total Corrigido 1
7 T2 14 6,4 |
8 T2 14 6,1 j
9 T2 17 7,7 1
10 T2 18 8,3 |
7 T6 13 4 j
8 T6 15 6 1
9 T6 19 9 1
10 T6 18 7 j
10,5 T6 18 6 | 1
a A experiência foi realizada como se descreve na Tabela l,a 65°C durante 18 h.
k As concentraçães das preparaçães de enzima em bruto T2 e T6 foram, respectivamente, 1,7 e 1,5 mg de proteína/ml
035
Ref! 2909550/BLN/LG
TABELA 5
Libertação de lenhina de pasta KSa
1 | Preparação | de enzima I Concentração (mg/ml) ! */♦ de lenhina libertada |
Total Corrigido | 1
1 1 Te 0,8 16 1 5 1
1 T2 1,2 1.7 6 |
1 Te ι 1,6 20 9 1
1 1 T6 0,3 14 1 3 1
i T6 0,6 15 « 1
1 Tfe 1 1,1 17 6 1 1
a A experiência foi realizada como se descreve na Tabe-
la 1, a 65 °C e a pH 9,0, durante 18 h, usando a pasta
K8 em vez da pasta Kll.
Preparação de uma fracção altamente purificada a partir do crescimento da estirpe T6
Pode-se obter uma fracção altamente purificada (na forma de uma xilanase) do caldo de cultura, clarificado, obtido a partir do crescimento da estirpe T6, usando um permutador de catiães num único passo de concentração e purificação. Deste modo, a xilanase de T6 foi purificada e concentrada, directamente, a partir do sobrenadante isento de células, por adsorção no permutador de catiães CM-52 (Whatman). Contudo, com o meio XMP, o rendimento da recuperação foi apenas de 21%, presumivelmente, devido à elevada força iónica do meio. Quando o meio foi dialisado contra um tampão de baixa força iónica ou quando se omitiu o MOPS do meio,
035
Ref: 2909550/BLN/LG
os rendimentos da recuperação foram de cerca de 50%. Para determinar a quantidade mínima de CM-52 necessária para a adsorção eficaz a partir do meio de cultura clarificado, testaram-se diferentes quantidades de CM-52 quanto à . sua capacidade de purificar xilanase T6. Os rendimentos estão apresentados na Tabela 6.
TABELA β
Adsorção descontínua de xi-lanase T6 com diferentes quantidades de CM-52
CM-52/caldo Fracção Volume X ilanase Total Rendimento
(g/g) (ml) (U/ml) Unidades (%)
Sobrenadante 100 0,78 78,0 100,0
0,1 Extracto 40 1 ,04 41 ,6 53,3
Não adsorvido 100 0,055 5,5 7,0
0,05 Extracto 30 1 ,3 39,9 50,0
Não adsorvido 100 0,077 7,7 9,8
0,02 Extracto 15 1 ,94 29,1 37,3
Não adsorvido 100 0,16 16 ,0 20,5
0,01 Extracto 14 2,05 28,7 36,8
Não adsorvido 100 0,24 24,0 30,8
035
Ref: 2909550/BLN/LG
-22Coma se mostra na Tabela 6, para 5% de adsorvente, o rendimento é 50%. Outro permutador de catiães comercialmente disponível é o SE-52 (Whatman) (os grupos negativas são grupos sulfoxietilo ligados a celulose). 0 SE-52 é conhecido como tendo uma maior capacidade de adsorção do que o CM-52. Uma vez que o passo de purificação é também um passo de concentração, é vantajoso usar tão pouco adsorveqte quanto possível. Deste modo, tentou-se usar SE-52 para a adsorção de xilanase. Na Tabela 7 apresentam-se os resultados.
TABELA 7
Adsorção descontínua de xilanase T6 com diferentes quantidades de SE-52
SE-52/caldc (g/g) ι Fracção Volume (ml) Xilanase (U/ml) Total Unidades Rendimento (%)
Sobrenadante 100 1,41 141 ,0 100,0
0,05 Extracto 30 2,4 72,0 51,1
0,02 Extracto 21 3,2 67,8 48,0
0,01 Extracto 20 2,9 58,0 41,1
Como se mostra na Tabela 7, apenas foram necessários 2% de SE-52 para obter uma recuperação de 48% da xilanase T6.
035
Ref: 3909550/BLN/LG
Caracterização da xilanase T6 peso molecular da xilanase T6 foi determinada por SDS-PAGE e filtração em gel, obtendo-se valores entre 41000 e 43000 dalton. □ facto de por ambos os métodos se obterem PM similares indica que a enzima é composta por uma única cadeia de polipéptido (a SDS PAGE separa as subunidades de proteína). 0 pl (o pH para o qual a carga total da proteína é zero) da enzima era de 9,0 tal como foi determinado por focagem isoeléctrica de alta voltagem. 0 pl relativamente elevado da enzima explica a carga positiva da enzima a pH neutro. 0 pH óptimo da enzima era de cerca de 7,0; a pH 9,0 a enzima tinha cerca de 50*/. da sua actividade a pH 7,0. Na Tabela 8 apresenta-se o perfil de temperaturas da actividade da xilanase T6.
TABELA 8
A actividade da xilanase T6 a temperaturas diferentes*
Temperatura °C Actividade Relativa ·/.
45 38
55 51
60 70
65 81
70 93
75 100
80 73
85 40
* Tempo de reacção; 5 minutos
035
Ref: 2909550/BLN/LS
Na Tabela 9 mostra-se a termostabi1 idade da xilanase T6 a uma temperatura de 65°C e a um pH de 9.
TABELA 9
Termostabi1 idade da xilanase T6 a 65°C e a pH 9
Tempo h Estabilidade relativa ·/.
0 100
0,25 82
0,5 78
1 75
2 72
4 63
Adicionalmente, pode-se referir detectou qualquer perda de actividade que a 65°C e durante mais a pH 7 não se do que 10 h.
Obtenção de mutantes constitutivos de xilanase a partir da estirpe TS
Para obter os mutantes, os inventores usaram o facto de, em muitos casos, a xilanase e a xilosidase estarem sob o mesmo controlo regulador (o mesmo repressor) . As estirpes que produzem xilosidase podem ser facilmente detectadas sobre placas de ágar contendo o substrato cromogénico p-nitrofenil-fê-D-xilopiranósido (ONPX). Apenas os mutantes constitutivos da xilosidase produzirão a cor amarela sobre placas de ágar xilosé. Para obter mutantes constitutivos submeteram-se as células a mutagénese (1-meti1-3-nitro-l-nitrosoguanidina) e depois espalharam-se sobre placas de ágar contendo ONPX sem xilosé. Cerca de uma em quinhentas células produziram colónias que resultaram amarela sobre as placas de ágar. Isolaram-se, deste modo, na ausência de da xilosidase, com MNNG na cor trinta
035
Ref: 2909550/BLN/LG
-25mutantes constitutivos de xilosidase e eram todos eles também constitutivos da xilanase. Nas Tabelas 10 e 11 apresentam-se os resultadas do crescimento e da produção de xilanase de dois destes mutantes (M-7 e M-28) , por crescimento na presença de xilose ou de glucose. Em ambos os meios (XMP e GMP) os mutantes e ο T6 exibiram velocidades de crescimento similares. Contudo, em meio XMP, os mutantes produziram níveis consideravelmente mais elevados de xilanase em comparação com ο T6. Em meio GMP (a glucose é a fonte de carbono) a estirpe T6 não produziu níveis detectáveis de xilanase enquanto que os mutantes produziram um nível elevado de actividade de xilanase. A xilanase da estirpe da
M-7 foi purificada e mostrou propriedades idênticas às/xilanase de T6.
TABELA 10
Crescimento e produção de xilanase de mutantes constitutivos de xilanase T6 em XMP
Est irpe Tempo (h) Turvação (UK) Xilanase (U/ml)
T6 0 10 -
T6 2 40 -
Tfe 4 150 0,5
Tfe 6 200 0,8
Tfe 12 310 2,1
Tfe 24 290 2,3
Tfe 30 270 -
M7 0 10 -
M7 2 30 -
M7 4 190 0,9
M7 6 270 1,6
M7 12 350 £,1
(continua)
035
Re-f; 2909550/BLN/LG
-26TABELA 10(continuação)
Est irpe Tempo (h) Turvação (UK) Xilanase (U/ml)
M7 24 310 2,3
M7 30 310 -
M28 0 20 -
ΜΞ8 1 20 -
M28 4 40 0,6
M28 6 120 2,0
M28 10 370 5,5
M28 24 320 7,2
TABELA 11
Crescimento e produção de xilanase de mutantes constitutivos de xilanase T6 em GMP
Est irpe Tempo (h) Turvação (UK) Xilanase (U/ml)
T6 0 20 -
T6 2 30 0
T6 4 80 0,1
T6 6 230 0,1
T6 8 340 0,1
T6 23 390 0,1
T6 32 370 -
M7 0 20 -
M7 2 70 0,3
M7 4 100 0,6
M7 6 310 1,1
M7 8 340 1,4
(continua)
035
Ref: 2909550/BLN/LG
-27TABELA 11 (continuação)
Est irpe Tempo (h) Turvação (UK) Xilanase (U/ml)
M7 23 330 2,2
M7 32 300 -
M28 0 20 -
M2S 1 20 -
M28 4 30 0,1
ME8 6 100 0,9
MES 8 190 1,7
ΜΞ8 10 320 3,1
M28 23 330 4,8
Sequência e composição de aminoácidos do fragmento da xilanase T6
A partir de um fragmento suficientemente longo da sequência de aminoácidos do terminal N de uma proteína, pode-se identificar completamente a proteína. A sequência do fragmento da xilanase T6 foi determinada duas vezes no Instituto Weizman, Israel, num micro-sequenciador de fase gasosa, da Applied Biosystems, ABI 475A. A primeira amostra de proteína foi electro-manchada, em primeiro lugar numa membrana PVDF (Millipore) e deu apenas 20 aminoácidos. A segunda amostra de proteína foi purificada primeiramente numa coluna FPLC Superose 12 (Pharmacia) o que foi suficiente para obter a sequência de 41 aminoácidos. A sequência obtida é a seguinte:
-Lys-Asn-A1a-Asp-Ser-Tyi—A1a-Lys-Lys-Pro-H i s-11e-Sei—Ala-Leu-Asn-Ala-Pro-'Gln-Leu-Asn-6ln-Arg-Tyr-Lys-Asn-Glu-Phe-Thr--Ite-Gly-Ata-Ala-Val-Glu-Pro-Tyr-Gln-Leu-Glπ-Asn-.
Para caracterizar adicionalmente a enzima, realizou-se uma análise de aminoácidos na xilanase T6 purificada. Na Tabela 12 mostram-se os resultados desta análise.
7Ξ 035
Ref: 2909550/BLN/LG
-28TABELA 12
Composição de aminoácidos de xilanase T6
Núm. do pico Tempo de retenção Nome do Concentração Resíduos por molécula'
componente (nmoles)
1 8,08 Acido aspártico 4,705 58b
2 9,76 Treonina 0,851 12
3 10,45 Serina 0,672 10
4 14,05 Acido glutâmico 3,639 44c
5 15,52 Prolina 1 ,950 24
6 18,80 Glicina 1 ,640 20
7 19,84 Alanina 2,439 30
8 20,80 Cist ina 0,061 1
9 21 ,81 Vaiina 2,250 28
10 23,60 Met ionina 0,150 2
11 24,64 Isoleucina 2,064 26
12 25,39 Leucina 1 ,027 14
13 28 ,75 T irosina 1 ,613 22
14 29,87 Fenilalanina 1,269 16
15 38,37 Lisi na 3,124 38
16 39,95 Amoníaco 3,691
17 42,65 Hist idina 0,560 6
18 48,05 Arginina 0,904 12
a Com base num peso molecular de 42 000 dalton; as correcçães -foram -feitas para ter em conta os aminoácidos instáveis.
b □ ácido aspártico é a soma do ácido aspártico e da asparag i na (Asx) .
c 0 ácido glutâmico é a soma do ácido glutâmico e da glutamina (Glx) .
ΊΈ. 035
Ref: 2909550/BLN/LG
Experiências realizadas com enzima em pasta K14
A amostra de pasta K14 era uma pasta de madeira macia, semibranqueada com oxigénio, da fábrica de Korsnas. A enzima era a xilanase termofílica T6 purificada.
Investigaram-se vários parâmetros que afectam o grau de deslenhificação da pasta K14.
Na Tabela 13 resume-se o efeito da concentração de fibras.
TABELA 13
Efeito da concentração de fibras no tratamento com xilanase*
Xilanase Fibras Lenhina libertada (valor corrigido)
(U/ml) (%) (%)
5,1 4,7 4,9
5,1 2,5 6,6
20,4 4,7 9,3
20,4 2,5 11 ,8
15,0 1,0 15,0
40,8 2,5 13,9
45,0 1,0 16,7
* Condições: pH 9,0, 65°C, 2 h, pasta K14; em cada caso subtraiu-se o valor do controlo sem enzima.
Como se observa na tabela 13, a diminuição da concentração de fibras de 4,7 para 2,5 e para 1,0% de peso seco de fibras, melhorou o processo. Uma vez que o tratamento enzimático é realizado sem mistura é provável que houvesse um contacto pobre entre a enzima e o substrato insolúvel. Por razões práticas
035
Re-f: 2909550/BLN/LG
-30escolheu-se trabalhar com 2,5’/. de -fibras.
Na Tabela 14 mostra-se o efeito do pH.
TABELA 14
Efeito do pH no tratamento com xilanase» pH Tampão Lenhina libertada (valor corrigido) (X)
8.5 9,0 9.5 Fosfato 0,01 M 8.3 8.4 6,3
8,5 NagSCq. 0,1 M 10,9
9,0 10,2
9,5 8,2
* Condições: 2,57« de pasta K14, 15 U/ml de xilanase, 2 h, 65°C.
Como se observa na Tabela 14, a enzima é muito eficaz a pH 8,5 - 9,0 tanto em fosfato de potássio como em sulfato de sódio. Experiências anteriores indicaram actividades mais baixas para pH inferior a 8,0 e superior a 9,5.
Ί2 035
Ref! 2909550/BLN/LG
Na Tabela 15 mostra-se o efeito da concentração de NagSOq..
TABELA 15
Efeito da concentração de NagSOq.»
NagSDq (M) Lenhina libertada (valor corrigido) (’/.)
0 7,2
0,01 8,6
0,05 9,9
0,10 10,8
0,15 11,5
0,20 10,7
» Condições: 3,5% de pasta K14, 10 U/ml de xilanase, pH 9,0, 65°C, 2 h.
□ tratamento foi eficaz para uma concentração de NagSOq. de 0 até 0,2 M com uma actividade óptima para NagSOq 0,15 M.
035
Re-f: 2909550/BLN/LG
-32Na Tabela 16 resume-se o efeito da concentração de xilanase.
TABELA 16
Libertação de lenhina em função da concentração de xilanase*
Xilanase (U/ml) Tampão Libertação de lenhina (% Klason)
0 Fosfato de potássio 0,01 M 0
5 3
10 10
15 12
45 14
0 NagSOq. 0,1 1*1 0
5 12
10 13
15 14
45 16
* Condições: 2,5% de fibra seca K14, 2 h, pH 9, 65°C.
Como se observa na Tabela 16, verificou-se uma libertação de lenhina dependente da concentração até, aproximadamente, 15 U/ml, tanto em tampão de NagSOq. 0,1 1*1 como em tampão de fosfato de potássio. As concentrações mais elevadas de enzima ou um período de incubação mais prolongado (4 h) apenas aumentaram, ligeiramente, o valor corrigido de lenhina libertada.
Preparação de amostras de 10 q e de 50 q de K14 tratada para testes adicionais
Trataram-se amostras de 10 g de pasta K14 com 15 U/ml e 45 U/ml de xilanase durante 2 h e 4 h, conjuntamente com os controlos apropriados. Todas as amostras foram preparadas em duplicado. As incubações foram todas realizadas a pH 9,0 e a
ΊΈϊ. 035
Ref; 2909550/BLN/LG
-3365°C. Nas Tabelas 17 (tampão de fosfato) e 18 (NagSGzj. 0,1 M) mostra-se a análise espectrofotométrica da libertação de lenhina. 0 valor corrigido de lenhina libertada estava compreendido entre 10,3 e 14,9%, obtendo-se com 45 U/ml de enzima e com períodos de incubação de 4 h, valores ligeiramente superiores aos que se obtêm com 15 U/ml e 2 h.
Trataram-se amostras recentes de 50 g de pasta, em duplicado, para análises adicionais. 0 valor corrigido de lenhina libertada.foi de 10,8% para 15 U/ml de enzima, durante 2 h, e de 12,6% para 15 U/ml durante 4 h.
TABELA 17
Tratamento com xilanase de amostras de 10 g de pasta K14 em tampão de fosfato*
Xilanase Tempo Lenhina libertada (%)
(U/ml) (h) Total Corrigido
0 2 5,3 0
15 2 15,6 10,3
45 2 17,9 12,6
0 4 6,3 0
15 4 17,4 11,1
45 4 20,1 13,8
* CondiçtJes: 2,5% de pasta K14, pH 9,5, 65°C; média de duas experiências
035
Re-f; 2909550/BLN/LG
-34TABELA 18
Tratamento com xilanase de amostras de 10 g de pasta K14 em Nã2S04 0,1 M
Xilanase Tempo Lenhina libertada (’/»)
(U/ml) (h) Total Corrigido
0 2 5,9 0
15 2 17,6 11 ,7
45 2 19,8 13,9
0 4 7,0 0
15 4 19,4 12,4
45 4 21 ,9 14,9
* Condições; Como na Tabela 17.
Análise de amostras de 10 q tratadas com xilanase
Nas Tabelas 19-23 resumem-se os resultados das análises. Os parâmetros apresentados nas Tabelas -foram obtidos de acordo com a série de testes SCAN, excepto para os valores “Zero-span que -foram medidos de acordo com as instruções dos -fabricantes (Pulmac Instruments Ltd. , Canadá). Na Tabela 19 apresentam-se os valores obtidos usando pasta que tinha sido tratada durante 2 h a 65°C, pH 9,0, etfl Na2S0z). 0,1 M, sem enzima (controlo) e com 15 U/ml de enzima. Como se pode observar , ver i-f icou-se uma reprodut ib i l idade excelente com as amostras em duplicado, preparadas com intervalos de duas semanas. 0 maior e-feito -foi o do teor em pentosano, que diminuiu 17,4‘/.. Verificaram-se pequenas mas significativas diminuições no número de Kappa e nos índices de ruptura, e aumentos no brilho, na viscosidade e nos valores Zero-span.
Os valores das propriedades anteriores para a pasta ou para
12. 035
Ref: 2909550/BLN/LG
folhas feitas a partir da pasta, não foram muito diferentes para 15 U/ml e 45 U/ml de enzima, com 2 h e 4 h de tratamento e usando fosfato de potássio 0,01 ΙΊ e NagSO^ 0,1 M (Tabelas 20 e 21) .
Para analisar a significência destes resultados, nas Tabelas e 23 apresentam-se os valores das propriedades da pasta e do papel como variaçães em percentagem em comparação com os controlos apropriados. As conclusães são as seguintes:
1. 0s pentosanos são removidos parcialmente (10,4 - 22,2*/.); níveis superiores de enzima removem mais pentosanos.
2. Existe um pequeno mas significativo aumento na viscosidade; isto pode ser explicado pela remoção dos pentosanos (cerca de 1*/. do peso seco da K14) . Não existe qualquer evidência da degradação da celulose, mesmo para a concentração mais elevada da enzima, durante 4 h a 65°C, pH 9.
3. 0 número de Kappa diminuiu em todas as oito condiçães examinadas (gama: 5,5 - 9,1%). Uma vez que os valores não diminuíram mais para concentraçSes de enzima mais elevadas (enquanto que os pentosanos sim), os teores mais elevados de enzima pareceram remover os pentosanos que não estavam ligados à lenhina.
4. Em todas as oito condiçães testadas, as folhas mostraram pequenos aumentos de brilho e dos valores zero-span e diminuiçães nos índices de ruptura.
035
Re-f: 2909550/BLN/LG
-36TABELA 19
Tratamento com xilanase de pasta K14#
Parâmetro Controlo Tratado Var iação
com enzima média (’/.)
NQ de Kappa 17,3, 16,8 16,0, 15,5 - 7,6, (± 0,1)
Viscosidade 1066, 1045 1072, 1059 + 0,8, (± 0,1)
(dm2/kg)
Pentosano (·/.) Falhas (75 a/m2) 9,1, 9,3 7,7, 7,5 -17,4, <± 1,8)
Br i 1 ho 32,5, 32,8 33,4, 33,8 + 2,9, <± 0,1)
(% ISO)
/ índice de ruptura 20,9, 20,4 19,0, 19,3 - 7,2, (± 1,8)
(Nm/g)
Zero-span (Húmido) 95,2, 97,3 101,5, 104,3 + θ ,3 , (± 0,3)
(Nm/g)
* CondiçSes: 15 U/ml de enzima , pH 9 ,0, 2 h, NagSOq. 0,1 M.
035
Ref: 2909550/BLN/LG
-37TABELA 20
Tratamento com x ilanase de pasta K14 em NagSO^. 0,1 M*
Parâmetro 0/ml 2h 15 U/ml 2h 45 U/ml 2h 0/ml 4h 15 U/ml 4h 45 U/ml 4h
Kappa 17,1 15,8 16,0 17,0 15,4 15,8
Viscosidade 1055 1066 1072 1061 1075 1075
Pentosano 9,2 7,6 7 ,3 9,0 7 ,5 7,0
Brilho 32,6 33,6 34,1 32,6 34,1 34,4
Ruptura 20,7 19,2 20,7 21 ,2 19,6 19,8
Zero-span 97 103 104 100 104 103
* Média de duas experiências , condíçSes como na Tabela 19.
TABELA £1
Tratamento com xilanase de pasta K14 em tampão de fosfato 0,01 M»
Parâmetro 0/ml 15 U/ml 45 U/ml 0/ml 15 U/ml 45 U/ml
2h Eh 2h 4h 4h 4h
Kappa 17,0 15,9 16,0 17,2 16,0 16,2
Viscosidade 1065 1073 1076 ‘ 1060 1070 1073
Pentosano 9,1 8,2 7,4 9,0 7,9 7,4
Brilho 31 ,8 33,2 33,6 32,6 33,2 33,7
Ruptura 21 ,0 19,2 20 ,4 20,9 19,4 20,3
Zero-span 101 101 107 99 102 104
* Média de duas experiências
035
Ref: 2909550/BLN/LG
-38TABELÃ 22
Tratamento com xilanase de pasta K14#
Parâmetro Variação (X)
15 U/ml 2h 45 U/ml 4h 15 U/ml 2h 45 U/ml 4h
Kappa - 7,6 9,1 - 5,9 - 7,1
Viscosidade + 0,8 + 1,4 + 1 ,5 + 1 ,4
Pentosano -17,4 -16,5 -20,6 -22,2
Brilho + 2,9 + 4,4 + 4,7 + 5,3
Ruptura - 7,2 -7,5 - 6,8 - 6,4
Zero-span + 6,3 + 3,7 + 7,1 + 3,0
* NagSOq. 0,1 M, valores da Tabela 20 -
Tabela 23
Tratamento com ι xilanase de pasta K14#
Variação
Parâmetro 15 U/ml 45 U/ml 15 U/ml 45 U/ml
2h 4h 2h 4h
Kappa - 7,3 “ 7,0 - 6,7 - 5,5
Viscosidade + 0,8 + 0,9 + 1 ,0 + 1,2
Pentosano -10,4 -12,7 -20,7 -18,4
Brilho + 4,3 + 2,8 + 5,3 + 3,2
Ruptura - 8,8 - 7,4 - 3,3 - 2,9
Zero-span 0,7 + 8,3 + 5,8 + 5,2
* Fosfato 0,01M; valores da Tabela 21
035
Ref: 2909550/BLN/LG
-39Teste de branqueabilidade
Usou-se a pasta K14 com um número kappa de 18,5 para testar o efeito do tratamento com enzima na branqueabilidade. A pasta K14 foi exposta ao tratamento com enzima a uma concentração de 15 unidades/ml de xilanase produzida a partir da estirpe T6. Após o tratamento enzimático a pasta foi branqueada com a sequência de branqueamento, usada na fábrica Korsnãs: dióxido de cloro (DO) Extracção alcalina reforçada com oxigénio (E0) - Dióxido de cloro (Dl) - Dióxido de cloro (D2).
□ tratamento enzimático reduzia o teor em lenhina da pasta até um número kappa de 15,9. Uma pasta tratada da mesma forma que a pasta tratada com enzima, i.e., a 65°C e a pH 9 em tampão de NagSOq. 100 mM, mas sem a adição de enzimas, foi deslenh i f içada até um número kappa de 17,2. 0 efeito do tratamento enzimático foi uma deslenhificação de um número kappa de 17,2 para 15,9,
i.e., uma deslenhificação de 8%.
A pasta tratada com enzimas no sistema de tampão de sulfato consumiu 47 kg de dióxido de cloro (cloro activo)/tonelada de pasta durante o branqueamento até um brilho ISO de 83%, com a sequência de branqueamento DO(ED)D1D2. 0 consumo correspondente para a pasta tratada meramente com solução tampão foi de 59 kg de dióxido de cloro (cloro activo)/tonelada de pasta, i.e., a pasta tratada com enzima consumiu menos 20% de dióxido de cloro.
035
Ref: 2909550/BLN/LG

Claims (19)

  1. R Ε I V I N D I C ft g ΰ E S
    1 - Processo de produção de uma preparação exibindo actividade enzimática, caracterizado por se submeter uma estirpe de Baci1lus stearothermophilus, seleccionada de entre as estirpes NCIMB 40221 e NCIMB 40222 e seus mutantes e variantes possuindo substancialmente a mesma capacidade de produzirem a referida preparação do que as referidas estirpes NCIMB 40221 e NCIMB 40222, a fermentação aeróbia num meio adequado, possuindo a referida preparação a capacidade de deslenhificar pasta de madeira a uma temperatura de, pelo menos, 65°C e a um pH de, pelo menos, 9.
  2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado par a referida preparação compreender uma enzima incluindo a sequência de aminoácidos
    -Lys-Asn-Ala-Asp-Sei—Tyi—Ala-Lys-Lys-Pro-His-Ile-Sei—Ala-Leu-Asn-Ala-Pro-Gln-Leu-Asn-Gln-Arg-Tyr-Lys-Asn-Glu-Phe-Thr-Ile-Gly-Ala-Ala-Val-Glu-Pro-Tyr-Gln-Leu-Gln-Asnou uma sua homóloga, exibindo a enzima completa actividade enzimática num meio de pasta de madeira.
  3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se submeter uma estirpe mutante da estirpe NCIMB 40222 de Bacillus stearothermophilus a fermentação aeróbia num meio adequado compreendendo glucose como fonte de carbono.
  4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o caldo de fermentação ser clarificado, opcionalmente, por centrifugação.
    Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteriza13 035
    Re-f: 2909550/BLN/LG
    -41do por o caldo de -fermentação clarificado ser submetido a precipitação com sulfato de amónio e, opcionalmente, ressuspensão num meio líquido, para se obter uma fracção parcíalmente purificada do referido caldo de cultura clarificado exibindo actividade enzimática num meio de pasta de madeira a uma temperatura de, pelo menos, 65°C e a um pH de, pelo menos, 9.
  5. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o caldo de fermentação clarificado ser purificado e concentrado usando um permutador de catiões, para se obter uma fracção altamente purificada, na forma de uma xilanase exibindo actividade enzimática num meio de polpa de madeira a uma temperatura de, pelo menos, 65°C e a um pH de, pelo menos, 9.
  6. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a referida xilanase ter um peso molecular aproximado compreendido entre 41000 e 42000 Dalton determinado por SDS PAGE e por filtração em gel e por ter a seguinte composição em aminoácidos aproximada, determinados como resíduos aminoácidos por molécula, por análise de aminoácidos:
    Asx 58; Thr 12; Ser 10; Glx 44; Pro 24; Gly 20; Ala 30; Cys 1; Vai 28; Met 2; Ile 26; Leu 14; Tyr 22; Phe 16; Lys 38; His 6; Arg 12.
  7. 8 - Processo de obtenção de estirpes NCIMB 40221 e NCIMB 40222 de Bac i1lus stearothermophilus e seus mutantes e variantes, possuindo os referidos mutantes e variantes substancialmente a mesma capacidade de produção de uma preparação exibindo actividade enzimática do que as referidas estirpes NCIMB 40221 e NCIMB 40222, possuindo a referida preparação a capacidade de deslenhificar pasta de madeira a uma temperatura de pelo menos 65°C e a um pH de pelo menos 9, caracterizado por
    a) se isolarem as referidas estirpes a partir de uma fonte natural apropriada, ou
    b) se obterem as referidas estirpes sujeitando as estirpes
    72 035
    Re-f: 2909550/BLN/LG
    -42existentes a mutagenização e selecção.
  8. 9 - Processo de tratamento de pasta de madeira caracterizado por compreender o tratamento de pasta de madeira, em pelo menos um passo, com uma preparação exibindo actividade enzimática num meio de pasta de madeira a uma temperatura de, pelo menos, 65°C e a um pH de, pelo menos, 9, obtenível por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7.
  9. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a re-ferida pasta de madeira ser pasta de sul-fato.
  10. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a re-ferida pasta de sul-fato ser uma pasta de sul-fato parcialmente deslenhifiçada.
  11. 12 -' Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a re-ferida pasta de sul-fato parcialmente deslenhi-f içada ser uma pasta de sul-fato deslenhi-f içada com oxigénio.
  12. 13 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 9-12, caracterizado por o re-ferido tratamento ser efectuado a uma temperatura de pelo menos 65°C, num meio possuindo um pH de pelo menos 9.
  13. 14 - Processo de produção de pasta de madeira deslenhifiçada, caracterizado por a pasta de madeira ser tratada, em pelo menos um passo com uma preparação exibindo actividade enzimática num meio de pasta de madeira a uma temperatura de pelo ménos 65°C e a um pH de pelo menos 9, obtenível por um processa de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7.
  14. 15 - Processo de produção de pasta em felpa (fluff), caracterizado por se fazer pasta em felpa a partir de pasta de madeira que foi tratada em pelo menos um passo com uma preparação
    72 035
    Ref: 2909550/BLN/LG exibindo actividade enzimática num meio de pasta de madeira a uma temperatura de pelo menos 65°C e a um pH de pelo menos 9, obtenível por um processa de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7.
  15. 16 - Processo de fabricação de papel, caracterizado por o papel ser feito a partir de pasta de madeira que foi tratada, em pelo menos um passo com uma preparação exibindo actividade enzimática num meio de pasta de madeira a uma temperatura de pelo menos 65°C e a um pH de pelo menos 9, obtenível por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7.
  16. 17 - Processo de fabricação de cartão, caracterizado por se fazer cartão a partir de pasta de madeira que foi tratada em pelo menos um passo com uma preparação exibindo actividade enzimática num meio de pasta de madeira a uma temperatura de pelo menos 65°C e a um pH de pelo menos 9, obtenível por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7.
  17. 18 - Processo de fabricação de felpa (fluff) , caracterizado por a felpa ser feita a partir de pasta de madeira.
  18. 19 - Processo de identificação de enzimas possuindo a capacidade de deslenhificar pasta de madeira a uma temperatura de pelo menos 65°C e a um pH de pelo menos 9, caracterizado por se usar uma sonda de ADN ou de ARN que reconhece a sequência de nucleótidos que codifica a sequência de aminoácidos
    -Lys-Asn-A1a-Asp-Bei—Ty i—A1a-Lys-Lys-Pro-Hi s-11e-Ser-A1a-Leu-Asn-Ala-Pro-Gln-Leu-Asn-Gln-Arg-Tyi—Lys-Asn-Glu-Phe-Thi—Ile-Gly-Ala-A1a-Va1-G1u-Pro-Ty i—G1n-Leu-G1n-As n-.
  19. 20 - Processa de identificação de enzimas possuindo a capacidade de deslenhificar pasta de madeira a uma temperatura de pelo menos 65°C e a um pH de pelo menos 9, caracterizado por se usar um anticorpo que se liga à sequência de aminoácidos
    72 035
    Ref: S909550/BLN/LG
    -44-Lys-A sn-A 1 a-Asp-Ser-Tyi—A l a-Lys-Lys-Pro-H i s-11 e-Sei—A 1 a-Leu-Asn-Ala-Pro-Gln-Leu-Asn-GIn-Arg-Tyi—Lys-Asn-Glu-Phe-Thr-Ile-Gly-Ala-A1a-Val -G lu-Pro-Tyι—Gln-Leu-Gln-Asn- .
    Lisboa, l0 >1991'
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