JPH06506593A - 新規微生物及び新規酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規微生物及び新規酵素 技術分野 本発明は新規微生物及び新規酵素に関連する。より詳しくは、本発明はディクチ オグロムス（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ　）属の新しい種、及びディクチオグロ ムス属より獲得できるキシラン分解活性（ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉ ｔｙ）を有する新規の酵素に関連する０本発明はまたバルブ及び製紙産業におけ るこれら新規キシラン分解酵素の利用に関連する。

背景技術 ディクチオグロムスの３種類の単離体しか報告されておらず（Ｐａｔｅｌ、　Ｂ 、に、、　Ｍｏｒｇａｎ、　ＨＪ、、　Ｗｉｅｇｅｌ、　Ｊ、及びＤａｎｉｅｌ 、　Ｒ，Ｍ。

（１９８７）　；　Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１４７２１−２４　：　 ５ａｉｋｉ、　Ｔ、、　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、　Ｙ、。

Ｋａｗａｇｏｅ、　Ｋ、及びＢｅｐｐｕ、　Ｔ、（１９８５）　；　Ｉｎｔ、Ｊ 、５ｙｓｔ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　３５２５３−２５９　；及び５ｖｅｔｌｉ ｃｈｎｉｉ、　Ｖ、Ａ、と５ｖｅｔｌｔｃｈｎａｙａ、　Ｔ、Ｐ、（１９８Ｂ） 　；Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｙａ　（英語翻訳板）５７３６４−３７０　（Ｄ 、タージダス（Ｄ、　ｔｕｒｇｉｄｕｓ））　）　、そしてり、サーモフィルム （Ｄ、　ｔｈｅｒｗｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｓａｉｋｉら、１９８５　）が本発明の 微生物を擬するこの属の唯一の有効な構成員であり、そして唯一の公開された種 である。Ｄ、サーモフィルムは好熱性であり、非常に嫌気性であり、化学合成有 機栄養真性細菌であり、これは天然の温泉より単離され、他方、本発明の微生物 はあらゆる天然の好熱性箇所とはかけ離れた人工的環境より単離された。キシラ ンのみしか利用しない本発明の生物とは異なり、Ｄ。

サーモフィルムは増殖のために広範囲にわたる炭水化物を利用する。

増殖の際、Ｄ、サーモフィルムは大量の酢酸塩、乳酸塩及びＣＯ，、並びに若干 のＨｚ及びエタノールを発酵生成物として生成する。本発明の生物は増殖の際に 主たる発酵生成物として酢酸塩のみを作り、そして少量の、即ち１−Ｈ以下のＨ ２及びＣＯｌを生成する。更に、本発明の微生物の定常期培養物において、若干 の酪酸塩であって、ディクチオグロムスの発酵生成物として今まで報告されてい ない化合物が生成される。本発明の生物とり、サーモフィルムの両者は環形であ り、そしてそれらともう一種の他の無縁の生物の群とによってのみ通常形成され る球形体を形成している。細菌の主たるゲッタイブ特徴であるり、サーモフィル ムの細胞性デオキシリポ核酸の報告されているグアニン／シトシン含有量は２９ ％であり（熱変性により測定）、高性能液体クロマトグラフィーにより測定され た３４％のグアニン／シトシン含有量を有する本発明の生物のそれとは有意に異 なる。Ｄ、サーモフィルムは熱安定性アミラーゼを有し、これはＥ。

コリ（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　）の中へとクローンされている。本発明の生物は基質と してのアミロースを伴って増殖せず、そしてアミラーゼ活性は検出されていない 、ある報告は、ディクチオグロムス様生物における単一キシラナーゼの検出を述 べているが、しかしこれがり、サーモフィルムにおいて示されるかは不明である 。

本発明の生物の抑えられた基質利用率、その従来述べられていない発酵生成物、 及びその細胞性デオキシリポ核酸の異なるグアニン／シトシン比から考えて、本 発明の生物は少なくともディチオグロムスの新しい種を示す。更に、本発明の生 物より同定したキシラナーゼは過去に報告されたどのディクチオグロムスに関し て述べられているどの酵素とも異なる。特に、それらは紙バルブ及び紙の製造に おいて利用するのにそれらを有用なものとする極めて良好な特徴を有している。

発明の概要 その第１の観点において、本発明はディクチオグロムス属の新積に属する従来述 べられていない微生物に関する。

別の観点において、本発明は、キシラナーゼ活性を存し、そして５．０〜９．０ （６０℃テ２０分後）の範囲における広域な最適ｐＨ１６０〜９０′ｃ（ｐＨ６ ，０で２０分後）の範囲における最適温度、及び８１株、ＤＳＭ　Ｎｏ。

６２６２に由来するキシラナーゼのそれと同−又は部分的に同一な免疫化学特性 を有する新規酵素に関連する。

第３の観点において、本発明は本発明にかかわる酵素の製造のための方法を提供 し、この方法は、本発明の生物のキシラナーゼ生産株の、炭素及び窒素源、並び に無機塩類を含む適当な栄養培地の中での培養、それに続く本質的に知られる方 法による所望の酵素の回収を含んで成る。

第４の観点において、本発明はリグノセルロース系バルブの処理のための方法を 提供し、この方法において、リグノセルロース系パルプを本発明の酵素により処 理する。

第５の観点において、本発明はリグノセルロース系バルブの処理において利用す るための試薬を提供し、この試薬は本発明の酵素を含んでいる。

図面の簡単な説明 本発明を添付図面を参照しながら更に説明し、ここで：図１は本発明の生物の増 殖に関するｐＨ曲線を示し；図２は本発明の生物の増殖に関する温度曲線を示し ；図３は６８℃でインキュベートした培養上漬物より獲得した本発明の酵素調製 物のｐ）ｌ依存活性（相対％）を示しく一８１株キシラナーゼ調製物；ムＤ、サ ーモフィルム、ＤＳ？Ｉ　３９６０のキシラナーゼ調製物）；図４は８１株の培 養物より獲得した本発明の酵素調製物の温度依存活性（相対％）を示しく層６８ °Ｃでインキュベートした培養物由来の上清液；・７８°Ｃでインキュベートし た培養物由来の上清液）；図５はり、サーモフィルム株、ＤＳＭ　３６９０の培 養物より獲得した本発明の酵素調製物の温度依存活性（相対％）を示しく一６８ °Ｃでインキュベートした培養物由来の上清液；ロア８°Ｃでインキュベートし た培養物由来の上清液）； 図６Ａは表示の温度（０７０°Ｃ；［０°Ｃ；・９０℃；及び１９８°Ｃ）での 熱処理後の８１株の６８°Ｃでの培養物より獲得した本発明の酵素調製物の残留 活性（相対％）を示し； 図６Ｂは半減期の片対数プロットを示しく矢印は熱活性値（８９°Ｃ）を示す） ； 図７は本発明の酵素調製物のキシラン分解活性（相対％）のｐＨ曲線を示し； 図８は本発明の酵素調製物のキシラン分解活性（相対％）の温度曲線を示し； 図９は本発明の酵素調製物のキシラン分解活性（相対％）の残留活性曲線を示し ； 図１０は本発明の酵素調製物のキシラン分解活性（相対％）の熱安定性を示し； 図１１は本発明の酵素調製物で処理した後の濾液に放出されたリグニンを示す吸 光スキャン曲線を示し；そして図１２は本発明の酵素調製物で処理した後に得ら れる酸加水分解濾液の単＄１組成を示す。

発明の詳細な開示 微生物 第１の観点において、本発明はディクチオグロムス属に属する新規微生物に関連 する。

微生物はフィンランド国カークニーミ（ｌＮｒｋｎｉｅ慣ｉ）で集めた。サンプ ルはパルプ工場のパルプマス及びパルプマス冷却タンクからの水である。微生物 は基質としてのぶなの木（ｂｅｅｃｈ）のキシランを有する７０’Ｃ，ｐＨ８， ３の濃縮培養物から単離した。

本発明のかかる新規微生物の代表的な単離体を８１株と命名し、これはブタペス ト条約に従う特許手続の目的のためにＤＳＭ、　（ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌ ｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔ ｕｒｅｎ　ＧｓｂＨ，ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ　ＩＢ＋　Ｄ−３３００Ｂ ｒａｕｎｓｗｅｉｇ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）に１９９０年１１月２８日にて寄託し ており、そして寄託番号ＤＳ門６２６２が付与されている。

この生物はＩｎｄｒａ　Ｍ、Ｍａｔｈｒａｎｉ（Ｐｈ、Ｄ、）　とＢｉｒｇｉｔ ｔｅ　Ｋ、Ａｈｒｉｎｇ（Ｐｈ、Ｄ）により特徴付けられ、そしてその特徴はＧ ｅｒｍａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ａｎ ｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓのディレクターである叶、ＨａｎｓＨｉｐｐｅ により確認されている。

ディクチオグロムス　サーモフィルムの基準培養物は１９８５年に寄託されてお り、従ってＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｓｓｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｏｏｒｇａｎ ｉｓｍｅｎ　ｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄ ｅｒ　Ｗｅｇ　１ｂ＋　Ｄ−３３００Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ＋Ｇｅｒｍａｎ ｙより寄託番号ＤＳＭ　３６９０で公共的に入手できる。

本発明の生物のコロニー及び細胞形態 基質としてのぶなの木キシラン（４ｇ／Ｉ）を有するｐＨ８，２のゲル固形化（ Ｇｅｌｒｉｔｅ（商標））培地を含む無酸素ロールチューブにおいて、表層コロ ニーは黄かっ色であり、そして円形であり、全体に縁どりを有し、そして凸面型 であり、表層下のコロニーはレンズ型であった。これらのコロニーは玉虫色の粒 状な内部を有し、そして採取したコロニーの顕微鏡検査は大きな平行の列の中で 横に並んで重なった培養物の長く薄い細胞（棒形）を示した。細胞のこのような 平行の列は光を屈折させることができ、従ってコロニーの玉虫色を生じせしめう る。

対数増殖期培養における微生物の液体培養物は、長さが５〜２０μｍ、そして幅 が０．３μｍであり、丸い先端を有する細胞を含む。

細胞は狐立して、対を成して、及び並んで横たわって結束している。

対数期における細胞はグラム陽性染色されず、そしてサフラニンとよく結合せず 、それ故ダラム染色調製の後にほぼ無色である。内生胞子は認められず、そして 生物は自動性ではない、培養物は自発的にスフェロプラストを形成せず、そして スフェロプラストはりゾチームにより誘導されない、しかしながら細胞はりゾチ ームによる溶解を受け易く、これはＤＮＡの放出又は顕微鏡観察により実証され た。

後期対数期培養物において細胞結束体はしばしば膨潤し、そして一時的に球状の 「撚り糸の玉（ｂａｌｌ　ｏｆ　ｙａｒｎ）　Ｊ構造（この球体の表層上に細胞 が横たわっている）が形成されるのが観察される。この球状構造は５〜２５μｍ の直径を有し、そしてこの土構造を高い倍率でよく観察すると、この土構造は膜 又は壁を有することがわかり、そして古い培養細胞においては、この土構造から の剥離を認めることができ、そして全体がむき出しの球体が存在しているのが認 められうる。対数期培養物において、この土構造は空洞であるか、定常期培養物 においては、若干の大きな球体、特にそれより細胞が剥れ落ちたものは、少量の 異種物質を含んでいた。この球状構造は３％（重量／体積）のドデシル硫酸ナト リウムにより溶解し易いが、しかし細胞はドデシル硫酸ナトリウムの中で安定で あり、細胞は完全であり、溶解は認められず、たとえそれらが位相差顕微鏡で観 察されたときに正常なものほど暗色でないにしても、よ（分散しており、結束体 又は球体は目視できなかった。

走査型電子顕微鏡 微生物の後期対数期培養物の低温凍結固定により得た走査型電子顕微鏡写真は、 弧立した単独細胞及び結束した玉状構造、並びに球状構造における細胞のまわり 及び単独細胞上の細胞外スライム様物質を示す、サンプルの調製中、水の昇華は 土構造の崩壊を起こし、平らなスフェロイドを残し、低温調製の後の細胞は幅が ０．２４μｍと測定された。土構造の「撚り糸の玉」の状態は容易に見ることが でき、球体のまわりを細胞が包み、そして表層の上で平行に並んでいた。

透過型電子顕微鏡写真 透過型電子顕微鏡写真で調べた後期対数培養物の薄切片は、この微生物が、光学 顕微鏡では見ることのできない、且つ、細胞の壁の外側で見られる細胞壁とは区 別される厚い細胞外コートを有することを示した。細胞内において特別な内部特 徴は見られなかった。土構造にわたる薄切片は、それらが空洞であり、そして位 相差顕微鏡で観察されたように調製の後の玉の内部に膜又は壁様の構造線分は認 められなかった。

基質及び栄養要件 試験した全ての基質のうちで、本発明の微生物は炭素及びエネルギー源としてぶ なの木又はオートスベルト（ｏａｔ　５ｐｅｌｔ）のキシランのみを利用するで あろう。キシロース、キシロビオース、アラビノース、グルコース、フルクトー ス、スクロース、ガラクトース、マンノース、マルトース、ラムノース、ラクト ース、デンプン、セロビオース、セルロース、ペプトン及び酵母抽出物による増 殖又は代謝は認められなかった。更に、Ｃｅｒｅｓｔａｒ　（商標）（キシロー ス４８〜５５％；アラビノース９〜１３％；ラムノース３〜５％；マンノース０ ．５〜１．５％；ガラクトース３〜６％；及びグルコース８〜１３％を含む）由 来のキシロースシロンブを基質として試験した。全ての基質は４及び１ｇのキシ ラン／リットルで試験した。キシラン由来の主たる発酵生成物は、酢ＩＩＩ　（ ２５ｓＭまで）、微量の水素ガス（１ｍＭまで）及び二酸化炭素であ、た、乳酸 塩、ギ酸塩又はエタノールは検出されなかった（検出限界０．２５ａＭ）　。

増殖は酵母抽出物及びビタミンの両方の存在により刺激した（しかしながらいづ れも増殖のために必須ではない）。

比較のため、表１の中に現存のディクチオグロムス株のいくつかの主たる特徴を 入れている。

増殖のための最適ｐＨ及び温度 本発明の微生物は比較的高いＩ’ｌｌで単離され、そしてこのことはそれらの８ ．０以上そして９付近のｐＨ値にて増殖する能力を反映している。最適増殖は６ 付近から８を超えるｐＨの幅広い範囲にわたって起こり（図１　）　、ｐＨ５， ０ではゆっくりとした増殖となり、そしてｐＨ９では増殖は認められなかった。

該微生物の増殖速度に対する温度の効果を図２に示す、増殖は下は６０″Ｃがら 上は７５℃を超えて起こり、しかし８０°Ｃでは起こらなかった。最良の増殖は 下は６５℃から７５℃を超えて起きた。

抗生物質感受性 本発明の微生物の抗生物質感受性は典型的な真性細菌のそれと似かよっていた。

こればクロラムフェニコール、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン 、テトラサイクリン及びパンコマインンに対して感受性であった（全て１００ｍ ｇ／　１で）、シかしながら、この微生物は１０翻ｇ／Ｉでのアンピシリン、ク ロラムフェニコール及びテトラサイクリンにより影響されながった。

ＧＣ含有決定 本発明の生物の全細胞ＯＮへのうちのグアノシン及びシトノンの含有量をＩ（Ｐ ＬＣ分析によって決定した。これにより、平均ＧＣ含量は３４層０１％と測定さ れた。

酵素調製物 第２の観点において、本発明はキシラン分解活性を有する新規の酵素調製物に関 連する。

本発明のキシラナーゼ調製物は本発明の微生物の培養、好ましくは株ＤＳＭ　Ｎ ｏ、６２６２と本質的に同一な微生物の株又はそれらの突然変異体もしくは変異 体の培養により生産可能である。本発明のキシラナーゼ調製物はり、サーモフィ ルム株、ＤＳＭ　３９６０又はその突然変異体もしくは変異体の培養によっても 生産可能である。たいていこれらの生物はキシラナーゼの複合体を生産すること が可能であり、これは決定される広域なｐＨの範囲及びｐｔ値により示唆される 。

本発明のキシラナーゼ調製物は組換ＤＮＡ工学によっても得ることができる。

本発明のキシラナーゼ調製物は下記の特徴によって説明できる。

物理化学特性 キシラン分解活性に及ぼすｐＨの影響は、本明細書に記載のキシラナーゼ活性分 析に関する方法（２０分のインキュベーション、６０”Ｃ）を利用する実施例２ 〜３に従って決定した。決定の結果を図３及び７に示す、キシラナーゼ調製物は 下は５．０から上は１１．０のｐＨ値に活性を有していた。このキシラナーゼは ｐＨ５，０〜９．０の範囲におけるｐＨにて最適活性を存していた。このような 広域なｐａｌの範囲は複数のキシラナーゼ化合物の存在を示唆している。

温度活性の関係は、本明細書に記載のキシラナーゼ活性分析に関する方法（２０ 分のインキュベーション：　ｐＨ６，０）を用いる実施例２及び４に従って決定 した。決定の結果を図４，５及び７に示す、このキシラナーゼは下は５０℃から 上は１００℃の温度で活性を有していた。このキシラナーゼは６０℃〜９０℃、 より特別には６５°Ｃ〜８５°Ｃの範囲において最適活性を有していた。このよ うな広域な温度の範囲は複数のキシラナーゼ化合物の存在を示唆している。

キシラナーゼの残留活性は本明細書に記載のキシラナーゼ活性分析に関する方法 （２０分のインキュベーション；　ｐＨ６，０；　６０℃）ヲ用いる実施例２及 び５に従って決定した。決定の結果を図６Ａ、６Ｂ及び９に示す、７０’Ｃで１ ０時間のインキュベーションの後、５０％以上の残留活性、好ましくは７０％以 上の残留活性が検出できた。８０℃で１０時間のインキュベーションの後では、 ４０％以上の残留活性、好ましくは５０％以上の残留活性が検出できた。９０’ Ｃで４時間のインキュベーションの後では、２０％以上の残留活性が検出できた 。

熱安定性は本明細書に記載のキシラナーゼ活性分析に関する方法（２０分のイン キュベーション；ｐＨ９，０，７０’Ｃ）を用いる実施例２及び６に従って決定 した。決定の結果を図６Ｂ及び１０に示す。粗調製物についてのキシラナーゼ活 性の半減期は２０と４０時間の間、３０時間付近であることが認められた。６０ 時間のインキュベーションの後では２０〜３０％のキシラナーゼ活性が残ってい た。

免疫化学特性 本発明の酵素調製物は８１株、ＤＳＭ　Ｎｏ、６２６２に由来するキシラナーゼ と同−又は部分的に同一（即ち、少なくとも部分的に同一）免疫化学特性を有し ている。

この免疫化学特性は交差反応同定試験によって免疫学的に決定できる。この同定 試験は周知のアウターコロニー二重免疫拡散手順、又はＮ、Ｈ，Ａｘｅｌｓｅｎ 　；　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉ＋ａｓｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　 −４ｎ−Ｇｅ１Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　；　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔ ｉｆｉｃ　Ｐｕｂ目ｃａｔｉｏｎｓ（１９８３）第５及第１４章に記載のタンデ ム交差型免疫電気泳動によって行われうる「抗原同一性」及び「部分的抗原同一 性Ｊはこの本の第５，１９ヒ２０章に説明されている。

キシラナーゼ活性分析 キシラナーゼはオートスベルトキシランより遊離する還元糖についてアッセイす ることによって決定する（ＸＵ−法）。

このアッセイは基質として、４０５ＭのＢｒ１ｔｔｏｎ　＆　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ 緩衝液（使用前に１００°Ｃで３０分間熱処理）の中で調製した０、５％のオー トスベルトキシラン（Ｓｉｇｍａ　−Ｘ−０６２７）によって行った。このアッ セイは、共に６０″Ｃに予備加熱した０、１０抛Ｉの酵素溶液と０．１００ｍ１ の基質を用いて６０’Ｃで２０分間行った。この混合物を６０℃で２０分間イン キュベートする。次に０．２０（１＋＋１の溶液’Ｉ　（３５，１ｇのＭａＪＰ Ｏａ　’　２ＬＯ。

４０．０ｇのＫＮａＣａＨｉＯ＊　・４ＨｚＯを５００＋＋１の脱イオン水に懸 濁し、１１０ｍ１のＩＮのＮａＯＨ；　８．ＯｇのＣｕ５Ｏａ　・５ＨｔＯ；　 １８０　ｇのＮａｚＳＯａを加え；脱イオン水を１リツトルの総容量となるまで 加える）を加えた０次にこの溶液を１００℃に２０分間加熱し、そして０．２０ ０＠ｌの溶液ＩＩ　（５０ｇの（ＮＨａ）ＪｏｔＯｚｍ　・４ＨｚＯを９００＋ ＋１の脱イオン水に懸濁し；　４２ｍ１の濃そして吸光光度計（ＰＹＥ　Ｕｎｒ ＣＡｌ’Ｉ　ＰＵ８６００　ｔｌＶ／ＶＬｓ、　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ）　”ｔ？（ ７）吸りもとめた。ＩＸＵは、１ｍｌ当り又は１ｇの培養培地当り、１秒間で１ ｍＭのキシロースが遊離することに相当する。

引き下げる。

その温度安定性に基づき、本発明の酵素は、過酸化水素又はオゾン漂白の前のバ ルブ処理の複合工程においても採用されうる。

リグノセルロース系バルブの脱リグニン化のための本発明のキシラナーゼの使用 に関して、このキシラナーゼを顆粒、好ましくは無塵顆粒、液体、特に安定化液 体、スラリー、又は保護化酵素の形態で供すべきことが好ましい。

更なる好ましいｍ様において、その試薬は少なくとも２０％、好ましくは少なく とも３０％の総酵素タンパク質の量におけるキシラナーゼを含む。

キシラン分解活性はキシラナーゼ単位で測定できる。本明細書においては２通り の単位、ＦＸＵ及びＥＸＩＩを利用している９分析方法により、キシラナーゼサ ンプルをレマゾール（ｒｅ■６ｚｏｌ）−キシラン基質とインキュベートする８ 分解していない着色基質のバンクグランドはエタノールによって沈殿する。上清 液に残る青色はキシラナーゼ活性に比例しており、従ってキシラナーゼ単位は標 準反応条件での酵素標準品に対して決定される。

この分析方法及び標準反応条件は２つのフォルター：　ＡＦ　２９３．６／１　 （ＦＸＵ）及びＡＦ　２９３．９／　１　（ＥＸＵ）　ニ説明されている。ＦＸ ＵはｐＨ６，０で決定され、そしてＥＸｔｌはｐＨ９，０で決定される。しかし ながら、ＰＸＵとＥＸＵは同じ桁の酵素活性を表わす。フォルターＡＦ　２９３ ．６／　１及び２９３．９／　１は注文によりＮｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／ Ｓ、デンマーク国より入手でき、このフォルターは引用することで本明細書に組 入れる。

好ましくは、本発明の方法は４０〜１００°Ｃ１より好ましくは５０〜９０°Ｃ １最も好ましくは６０〜８０°Ｃの温度で行う。

本発明にかかわる方法の別の好ましい態様において、酵素処理は５．０以上のｐ ）１、より好ましくは６，０以上のｐ［Ｉ、最も好ましくは７，０以上のｐＨで 行う。

本発明にかかわる方法の更に別の好ましい！１１１様において、酵素処理は５分 〜２４時間、より好ましくは１５分〜６時間、最も好ましくは２０分〜３時間の 時間内で行う。

適当なキシラナーゼの用量は通常は１０〜５０００ＦＸυ／ｋｇ又はεＸＵ／ｋ ｇドライパルプ、より好ましくは１００〜５０００ＦＸＵ／ｋｇ又はＥＸＵ／ｋ ｇドライパルプに相当する。

本発明にかかわる方法の更に好ましい１！様において、酵素処理は３〜３５％、 より好ましくは５〜２５％、最も好ましくは８〜１５％の稠度で行う。この稠度 はバルブの乾燥物質含有量である。３５％以上の稠度を有するバルブは酵素調製 物と効果的に混ぜ合わせることが難しく、そして３％以下の稠度を有するバルブ は水を多く有しすぎ、これは経済的な観点から不都合である。

その他のいくつかの好ましい態様において、本発明のキシラナーゼは例えば国際 特許出Ｉ　ＰＣＴ／ＤＫ９Ｌ１００２３９又は国際特許公開ｉ　９１１０２８３ ９に記載のものと本質的に同じリグノセルロース系バルブの処理のための方法に 含ませることができる。

本発明を、本発明の範囲を限定することは全く意図していない下記の実施例にお いて更に説明する。

実施例Ｉ ８１株のキシラナーゼの製造 ８１株のキシラナーゼ調製物は下記の通りに調製した。

８１株（、Ｏ５門６２６２　）を１１のガラスフラスコの中で２日間、７０’Ｃ で、下記の培地で増殖させた。

株Ｂ　１　、ＤＳＭ　６２６２のための厳密な酸素欠如培地の組成ＮＨ４Ｃｌ　 １．０　ｇ　／　ｌ ＮａＣｌ　Ｏ，１ｇ　／　１ −ｇｃｌｔ　０．１　ｇ　／　Ｉ ＣａＣＩｚ　０．０５　ｇ　／　Ｉ ＫＺＨＰＯ，、３ＨｔＯＯ，４ｇ　／　１酵母抽出物　０．７５ｇ／ｌ ぶなの木のキシラン（レンジング）　４．０ｇ／ｌレサズリン　０．０００５　 ｇ　／　１微量金属”　１．０ｗｌ ビタミン溶液　１．０ｍ１ ＮａＨＣＯｚ　３．Ｏｇ　／　Ｉ Ｈ！０　１　ｌとなるまで適量 ＊）微量金属溶液組成 ＦｅＣＩｘ’４ＨｚＯ２，Ｏｇ／Ｉ　ＨＪＯｘ　０．０５ｇ／ＩＺｎＣＩｔ　ｏ 、ｏｓ　ｇ　／　Ｉ　ＣｕＣ１ｚ　０．０３　ｇ　／　ｌＭｎＣｌ＊　０．０５ ｇ／ｌ　ＣＮＨａ）ｂＭｏｑＯｚａ−４Ｈｔ０　０．０５ｇ／ｌＡｌＣｌ３　０ ．０５ｇ／　Ｉ　ＣＯＣｌ２　・６Ｈｔ８　０．０５ｇ／　ｌＮｉＣ１ｚ　０． ０５　ｇ　／　ｌ　ＥＤＴＡ　０．５０　ｇ　／　ＩＮａｚＳｅＯｓ　’５Ｈｚ ６　０．１０ｇ／　Ｉ　ｆＡＨｃｌ　１．０１１１Ｎｔ／ｃｏ□（４：１）のも とでボトル当り１０ｍ１をフラッシュして分注した。Ｏ１不浸透性ストンパーで 栓をし、そして１４０℃で２０分間オートクレーブに付した。フィルター除菌し た酸素欠如溶液由来の０、１ｍｌのＤＳ？’Ｉビタミン溶液＃１溶液及１４１ト クレーブに付したストック溶液由来の０．２ｍｌの２．５ｇ／ＩのＮａｚＳ　Ｈ ９ＨｔＯを、滅菌無酸素シリンジ技術での接種の直前に加えた。下記の実験のう ちのいくつかについては６８℃で２日間のインキュベートを適用し、下記の実験 のうちのその他については７８°Ｃで２日間のインキュベーションを適用した。

Ｄ、サーモフィルム株、ＤＳＭ　３６９０は同じ方法で培養した。

増殖条件 上記の培地の中での８１株の増殖に及ぼすｐｔｔ及び温度の影響を調べた。培地 における様々なｐＨ値は培地の中のＨＣＯ３の濃度及びヘントスペースガスのＣ Ｏ□含量を変えることで得た。この緩衝液は高めのｐｉ値に必然的に弱いが、し かしながら全ての増殖速度の測定値は増殖曲線の初期において獲得しており、そ してｐＨはあまり変化していないことを確認するために測定しておいた。この培 養物を暗室で６８°Ｃで増殖させた。

濁ったキシラン含有培地を濁度法による細胞測定及びタンパク質測定に付し、こ れによって比酢酸塩生産速度から、増殖のための最適温度及びｐｉｆの同定に間 する比増殖速度μ（ｈ−’）を決定した。酢酸塩の生産と細胞数との相関を、細 胞を０．０２５％のドデシル硫酸ナトリウムで処理してその球状構造を熔解させ 、そして細胞を互いから分けた後にＰｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｅｒカウンティン グチャンバーにおいて計測することにより決定した（５ｖｓｔｌｉｃｈｎｉｉと ５ｖｅｔｌｊｃｈｎａｙａ、前掲を参照のこと）。

８１株の増殖速度に及ぼすｐＩ（及び温度の効果を図１〜２に示す。

酵素調製物 下記の研究のうちのいくつかに関して、全培養物を後期対数期又は初期定常期に おいて収穫し、次いで凍結乾燥し、これにより細胞内及び膜結合型酵素を遊離さ せ、全部で４ｇの粉末を得た。本明細書でＰ−０３７と呼ぶ全培養物であるこの キシラナーゼ調製物を、下記の実施例３〜８に従う更なる調査のために粗キシラ ナーゼ調製物として用いた。

下記ノ研究のうちのその他については、後期対数期又は初期定常期で収穫した培 養上清液を約５０００Ｘｇで２０分間の遠心により清澄化させている。細胞外可 溶性酵素を含む培養上漬物であるこのキシラナーゼ調製物を、下記の実施例２に 従う更なる調査のために粗キシラナーゼ調製物として用いた。

実施例２ 上清キシラナーゼに及ぼすｐＨ及び温度の効果下記の特性化は、実施例１に記載 の通りにそれぞれ獲得した８１株及びり、サーモフィルム株、ＤＳＭ　３９６０ 由来の上清キシラナーゼ調製物に基づいて行った０本明細書のはじめの方で記載 したＸＬＩ法を利用し、そして全てのアッセイは６０°Ｃで２０分間にわたって 行った。

ｐＩ（の特性化のため、アッセイは間隔を開けてｐＨ５〜１０において行い、そ して６８°Ｃでインキュベートした培養上清液を利用した。その結果を図３に示 す８両者のキシラナーゼ調製物（８１株及びり、サーモフィルム株、ＤＳＭ　３ ６９０のそれぞれ）は下はｐＨ５から約ｐＨ１０に至る範囲においてキシラン分 解活性を有していた。このキシラナーゼ調製物は広域ｐ）ｌ活性範囲を特徴とし 、ｐＨ５，０〜ｐＨ９，５、より特別にはｐＨ５，５〜ｐ＋＋　９．０の範囲に おける最適ｐＨを示す、この広域活性範囲はこの調製物中の複数種のキシラナー ゼ成分の存在を示唆している。

温度の特性化のため、アッセイを間隔を開けて約５０°Ｃから約９０゛Ｃにわた って行った。ある実験においては６８°Ｃでインキュベートした培養上清液を利 用した。両者のキシラナーゼ調製物（８１株及びり。

サーモフィルム株、ＤＳＭ　３６９０のそれぞれ）は下は４８゛Ｃから上は９０ °Ｃに至る範囲においてキシラン分解活性を有していた。両者のキシラナーゼ調 製物は８０°Ｃ付近で最大活性を示した。８１株は２箇所の局所的な最適温度を 示し、一方は７０″Ｃ付近、そして他方は８０℃付近であった。８０’Ｃでの活 性は７０°Ｃでの活性より３０〜５０％高めであった。

８０℃に比べて９０°Ｃでは３０〜８０％の活性を可溶性酵素は保持した。その 結果は図４及び５に示している。

第２の実験において、温度の特性化のために７８℃でインキュベートした培養上 清液を利用し、そしてこの可溶性キシラナーゼの温度プロフィールは上記のプロ フィールとはかなり相違していた。７８℃でインキュベートした培養物より得た キシラナーゼ調製物は高温でより活性であり、約９２°Ｃ以上の温度でかなりの 活性指数を有していた。その結果を図４及び５に示す。

上清キシラナーゼの熱安定性 未処理サンプルに対する、基質なしで６８°Ｃでインキュベートした８１株の培 養上滑液に残っている％活性を図εＡ及び６Ｂに示す。

図面から明らかな通り、本発明のキシラナーゼは非常に熱安定性である。７０℃ で１０時間のインキュベーションの後、５０％以上の残留活性、好ましくは７０ ％以上の残留活性が検出できた。８０°Ｃで１０時間のインキュベーションの後 、４０％以上の残留活性、好ましくは５０％以上の残留活性が検出できた。９０ ’Ｃで４時間のインキュベーションの後、２０％以上の残留活性が検出できた。

図６Ｂは温度の関数としての本発明の上清キシロース調製物の活性の熱半減期の 片対数プロットを示す、７０°Ｃでは、熱半減期は４０時間以上、約４６時間で あった。８０°Ｃでは、熱半減期は１０時間以上、約１３時間であった。９０° Ｃでは、約１時間でかなりの活性の値がまだ存在していた。

このデーターは直線を描き（ｒ”＞９５％）、そして熱活性指数、即ち、１時間 の半減期を導く温度は８９°Ｃであった。

実施例３ 最適ｐ）Ｉ ８１株におけるキシラナーゼ活性のｐＨ特性は、実施例１に記載の粗キシラナー ゼ調製吻Ｐ−０３７、及び５〜１１のｐＨの範囲で行う本明細書のはしめの方に 記載したＸＵ法を利用して調べた。この粗調製物の最適ｐＨはｐＨ５〜７の間で あった（図７）。キシラナーゼ活性の１０〜２０％がｐＨ９で維持された。実施 例２からの所見を考慮し、そして酵素混合物の活性を％相対活性として示してい ることから、図７のｐＨプロフィールは６付近に最適ｐｔ＋を有するかなり大量 の１又は複数の様々なキシラン分解酵素の存在に基づきうる。

実施例４ 最適温度 Ｂ１におけるキシラナーゼ活性の温度プロフィールを実施例１に記載の粗キシラ ナーゼ調製物Ｐ−０３７、及び５０〜１００”Ｃの温度範囲においてｐ）１６で 行うはじめの方で記載したＸＵ法を用いて決定した。

全てのアッセイは２０分間行った。粗調製物の最適温度は６０〜８０°Ｃの間で あることが認められ（図８）、７０“Ｃ付近の最適ｐＨを示唆する。

キシラナーゼ活性の３０〜４０％が９０°Ｃで残った。

実施例５ 残留活性 Ｂ１のキシラナーゼの熱安定性を、実施例１に記載の粗キシラナーゼ調製＠！Ｉ Ｐ−０３７を用い、熱処理の後の残留活性として測定した。

キシラナーゼ溶液を６０〜１００°Ｃで３０分間熱し、そしてその後、はじめの 方に記載したＸＵ法を用いてｐＨ６，６０°Ｃｌ２Ｏ分により測定した。

決定の結果は図９に示している。この図より、該キシラナーゼは７０℃で２０分 後に５０％以上、より特別には７０％以上、最も特別には９０％以上の残留活性 を有することが明らかである。８０°Ｃで２０分後には、このキシラナーゼは２ ０％以上、より特別には４０％以上の残留活性を有していた。９０”Ｃで２０分 後には、このキシラナーゼは２０％以上の残留活性を有していた。

実施例６ 熱安定性 Ｂ１におけるキシラナーゼ活性の熱安定性を、実施例１に記載の粗キシラナーゼ 調製物Ｐ−０３７、及びはじめの方に記載のＸＵ法を用いて決定した。サンプル を適当な間隔で取り、そしてはじめの方で記載したｐＨ９，７０°Ｃｌ２Ｏ分で のＸＵ法を用いて残留活性を測定した。

この決定の結果を図１０に示す。粗調製物に関するキシラナーゼ活性の半減期は ２０〜４０時間の間、３０時間付近であることが認められた。

キシラナーゼ活性の２０〜３０％が６０時間のインキュベーションの後に残って いた。

実施例７ キシラナーゼ活性のｐＩ 第１の実験において、ＩＪＢ両性ＰＡＧプレートｐＨ３，５−９，５及び実施例 １に記載の粗キシラナーゼ調製物Ｐ−０３７の溶液を用いてキシラナーゼ活性の ｐｉを決定した。電気泳動した後、このゲルを水で１回、トリス緩衝液ｐＨ９で １回、１５分間にわたり２回洗い、次いで０．５％のオートスベルトキシラン、 １％のアガロースｐＨ９より成る検定アガーの薄いコートを覆った。この覆われ たゲルを５０℃で一夜インキユベートした。そのキシラナーゼ活性をコンゴレッ ド染色を利用して識別化させたく０．１％のコンゴレッドで１０分間染色し、次 いでＩＭのＮａＣ１で２×１５分間脱色した）、コンゴレッドは４〜７．４の間 のｐＩ値の成分で検出でき、キシラン分解活性は４〜７の範囲において検出でき た。

第２の実験において、ＬＫＢ両性ＦＡＧプレートｐＨ３，５−９，５及び実施例 １に記載の粗キシラナーゼ調製物Ｐ−０３７の溶液を用いてキシラナーゼ活性の ｐｉを決定した０次に、第１セツトの試験においては、何ら中間処理することな くこの溶液を電気泳動に付し、そして第２セットの試験においては、この溶液を ７０℃、ｐＨ１０（０，１Ｍの炭酸水素緩衝液）で６０分間加熱処理した。

電気泳動した後、ゲルを０．５のトリス緩衝液ｐ）ｌ　７．０で２０分づつ２回 洗い、そして第１セントの試験においては、０．５％のオートスベルトキシラン 、１％のアガロース、ｐＨ６，０（０，１Ｍのリン酸緩衝液を伴う）の薄いコー トを覆い、そして第２セツトの試験においては、０．５％のオートスベルトキシ ラン、１％のアガロース、ｐＨ１０，０（０，１Ｍの炭酸水素緩衝液を伴う）の 薄いコートを覆った。

これらのゲルを７０’Ｃで一夜インキュベートし、そして０．５Ｍのトリス緩衝 液、ｐＨ７，０の中で２０分間洗った。キシラナーゼ活性をコンゴレッド染色を 用いて識別化した（０．１％のコンゴレッドで１０分間染色し、次いでＩＭのＮ ａＣｌで２×１５分脱色した）。

平行して、等電点ｉｓ物を既知のｐｉを存するタンパク質の混合物に基づいて流 し、そしてクマジー染色の後、キシラナーゼ活性のｐｒが同定できた。

この実験の結果を下記の表２に示す。

麦−１ 土之立±二漸蛮立■計 ｐＨ６，０４，９；（８，２）；　８．９　４．９　；　５．９　：　７．４　 ；（８，２）；８．９ｐＨ１０，０５，８；　６．８　；　８．９　４．７　； 　８．９明らかに、この調製物はキシラン分解活性を有する酵素の複合物を含む 、上記で決定したｐｉとは別に（４〜７の範囲におけるキシラン分解活性を有す る４成分）　、７．４．８．２及び８．９で他のキシラナーゼ活性についてのｐ ｉが認められ、このうちで８．９でのバンドが最も強力であった。活性の影は７ ．４と８．９との間に認められ、そのため数値をかっこの中に入れた（８．２） 。

８．９でのキシラナーゼ活性は全ての試験で認められた。

実施例日 漂白増強 本実施例においては、スクリーニング法によって漂白増強効果を示す、スクリー ニング法であるので、この実験は工業的に関連する条件では行っていない。

この実験のため、２部の５ｇのドライバルブ（スウェーデン製０□脱リグニン化 パインクラフト）を水の中に８時間浸け、その後Ｂｒ１ｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓ ｏｎｌｌ衝液ｐＨ６，０の中で３分間再パルプ化した。過剰の液体をバルブから 優しくしぼり出し、その後このバルブを２５０ｍ１のエーレンマイヤーフラスコ に移し、そして新鮮な緩衝液の中に３．５％の乾燥物質の稠度となるように懸濁 させた。２部のバルブを７０°Ｃで１５分間ブレインキュベートし、次いで酵素 を１００ＥＸＵ／ｋｇドライパルプ付近の用量で１つのフラスコに加えた。コン トロールのフラスコには水を入れた。

加水分解を７０’Ｃ（ｐＨ６）で４８時間行い、その後ブフナーろう斗上で液体 を排液した。その濾液から、吸光度の測定（遊離リグニンは２８０ｎ−で吸収を 示す）及び攻撃された炭水化物（ヘミセルロース及び／又はセルロース）の種類 の決定のためにサンプルを取った（下記参照）、バルブを洗い、そして力、バー 指数を決定するためにプレートを作った。カッパー指数はリグニン含有量の尺度 であり、そして５ＣＡＮ−Ｃ１７７（Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ　Ｐｕ１ｐ、　 Ｐａｐｅｒ　ａｎｄ　Ｂｏａｒｄ　ＴｅｓｔｉｎｇＣｏ＋ｍｍ　ｉ　ｔｅｅ　） の中に定義されている。

酵素処理工程の後の濾液のサンプルを０．４５μｍのフィルターに通し、凍結乾 燥し、２Ｎ−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で１００°Ｃにて２時間加水分解し、 その後ＴＦＡをエハボレーシゴンによって除去し、そしてサンプルを脱ミネラル 水に再熔解させた。次にこの加水分解サンプルの単糖組成をイオン交換ＨＰＬＣ システム、それに続（電気化学検出によって決定した（参考のため、Ｈａｒｄｙ ら、（１９８８）　；　ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１ ７０５４〜６２を参照のこと）。

カッパー指数は、コントロールについては１３．５、そして酵素処理バルブにつ いては１２．７と分析された。これは６％の低下を示し、このことはこの処理に おけるこの工程での有意義な向上である。

吸光スキャン曲線を図１１に示す。リグニンは２８０ｎ鏑付近の光を吸収するこ とで知られ、そしてこの曲線は、コントロールに比べて酵素処理パルプからより 多くのリグニンが遊離されることを明らかに示している。

酸加水分解濾液の単糖組成を下記の図１２に示している。第１に、コントロール に比べて酵素の有意義な効果があることが認められ、そして第２に、このキシロ ースは９０％の総単垢を含んで成り、他方、グルコースはほとんど存在していな い（−１％）。このことはセルラーゼのほとんどないキシラーゼ作用を示す。こ れは効果的であり、なぜならセルラーゼ作用は最終製紙の収量又は強度の低下を もたらしうるからである。

上記した３通りの方法は全て、本発明の酵素が祇バルブに対する有効な漂白増強 効果を有することを実証している。

比増殖速度μ（ｈ−） 潟判廃１％ Ｆｉｇ、　４ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成５年１０月ノ２−日

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．ディクチオグロムス属に属し、キシラナーゼを生産する能力の備った種の生 物学的に純粋な培養物。
2. ２．微生物が本明細書に本質的に記載の通りの形態学、生理学及び増殖特性を有 する、請求項１に記載の培養物。
3. ３．株ＤＳＭ　Ｎｏ．６２６２と本質的に同一である微生物の株の生物学的に純 粋な培養物。
4. ４．キシラナーゼ活性を有し、そして下記の特徴：（ａ）（６０℃で２０分後に ）ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０の範囲における最適ｐＨ；（ｂ）（ｐＨ６．０で２０ 分後に）６０℃〜９０℃の範囲における最適温度ｐＨ；及び （ｃ）Ｂ１株、ＤＳＭ　Ｎｏ．６２６２由来のキシラナーゼと同一又は部分的に 同一な免疫化学特性； を有する酵素調製物。
5. ５．ディクチオグロムス属の株より獲得できる請求項４に記載の酵素調製物。
6. ６．Ｄ．サーモフィルム又はＤ．ダーシタスの株より獲得できる請求項５に記載 の酵素調製物。
7. ７．Ｂ１株、ＤＳＭ　Ｎｏ．６２６２もしくはＤ．サーモフィルム株、ＤＳＭ３ ６９０、又はそれらの突然変異体もしくは変異体より獲得できる、請求項６に記 載の酵素調製物。
8. ８．更に下記の特徴： （ａ）７０℃及びｐＨ６．０で２０分後に５０％以上、好ましくは７０％以上の 相対残留活性；並びに （ｂ）７０℃及びｐＨ６．０で決定した、１５時間以上、より好ましくは２０時 間以上、最も好ましくは２５時間以上の半減期；を有する請求項４〜７のいづれ か１項に記載の酵素調製物。
9. ９．炭素及び窒素源並びに無機塩類を含む適当な栄養培地の中での請求項１〜３ のいづれか１項に記載の生物のキシラナーゼ生産株の培養、それに続く周知の方 法による所望の酵素の回収、を含んで成る、請求項４〜８のいづれか１項に記載 のキシラナーゼ調製物の製造のための方法。
10. １０．株ＤＳＭ　Ｎｏ．６２６２もしくはＤ．サーモフィルム株、ＤＳＭ　３６ ９０、又はその突然変異体もしくは変異体と本質的に同一な微生物の株を培養す る、請求項９に記載の方法。
11. １１．請求項４〜８のいづれか１項に記載の酵素調製物でリグノセルロース系パ ルプを処理する、リグノセルロース系パルプの処理のための方法。
12. １２．前記の方法を４０〜１００℃、好ましくは５０〜９０℃、最も好ましくは ６０〜８０℃で行う、請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記の方法を５．０以上、より好ましくは６．０以上、最も好ましくは７ ．０以上のｐＨで行う、請求項１１〜１２のいづれかに記載の方法。
14. １４．前記の方法を５分〜２４時間、好ましくは１５分〜６時間、最も好ましく は２０分〜３時間の時間内で行う、請求項１１〜１３のいづれか１項に記載の方 法。
15. １５．前記の方法において、酵素用量が１０〜５０００ＦＸＵ／ｋｇ又はＥＸＵ ／ｋｇドライパルプ、より好ましくは１００〜５０００ＦＸＵ／ｋｇ又はＥＸＵ ／ｋｇドライパルプのキシラナーゼ活性に相当する、請求項１１〜１４のいづれ か１項に記載の方法。
16. １６．前記の方法を３〜３５％、より好ましくは５〜２５％、最も好ましくは８ 〜１５％の乾燥物質の稠度で行う、請求項１１〜１５のいづれか１項に記載の方 法。
17. １７．顆粒、好ましくは無塵顆粒、液体、特に安定化液体、スラリー又は保護化 酵素の形態に施されている、請求項４〜８のいづれか１項に記載のキシラナーゼ 調製物を含む試薬。
18. １８．前記キシラナーゼ調製物が総酵素タンパク質の少なくとも２０％、好まし くは少なくとも３０％を構成している、請求項１７に記載の試薬。