JPS6229973A - キシラナ−ゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技　　術　　分　　野 本発明は、新規なキシラナーゼ及びその製造法に関する
。

発　　明　　の　　背　　叩 キシランは、稲藁等の植物細胞壁、樹木の外囲構造組織
体等を構築している強固な多糖類であり、キジローズを
主要構成糖として、アラヒノース、マンノース、グルコ
ース等を微量構成糖として成り、セルローズとは異なる
物質として知られている。該キシランは、セルラーゼ等
のセルロース分解酵素を含む各種の酵素製剤により部分
的に分解されるが、完全には分解されない。従って、キ
シランを含む各種原料を有効利用でるためには、キシラ
ンに対して特胃性の高い酵素、特にキシラナーゼを作用
させる必要があるが、現在この種キシラナーゼとしては
、作用至適渇ｍ上限が約４５〜５０℃の中温のものが知
られているに過ぎない。

升−明　　の　　開　　示 本発明者らは、上記の如き実状に鑑み、稲ワラ等のキシ
ランを多く含む農産廃棄物等からキシ［１−ズを効率よ
く分解生成できる酵素の生産能を右づる微生物を自然界
に探索した。その結果、特殊な動物糞尿廃棄物中より、
クロストリゾ−ｒラム屈に属づる新しい耐熱性キシラナ
ーゼ生産菌を見出し、ここに本発明を完成するに至った
。

即ち、本発明は下記特性を有するキシラナーげＫＢ−１
０−Ｉ及びその製造法に係わる。

（１）基貿特巽性：キシランをよく分解する。セルロー
スは分解しない。

（２）至適１）Ｈ：約４．５付近。

本酵素をｒｌｌ−１３，０〜７．０の範囲で、６５℃に
て、基質溶液と接触させ、反応液中の還元糖量を測定し
て酵素活性（相対値）を求めた結果を下記第１表に示１
゜なお、Ｍ質溶液としては燐酵絽衝液（０，２Ｍ、ｐト
Ｉ７．０）に１％キシうン〈木材又は稲ワラ）を懸濁し
、電子レンジにて加熱溶解した溶液と、酵素液とを等容
量で使用し！、：。

また酵素活性は５５℃で１分間に１μモルのキジローズ
相当の還元糖を生成する醇索足を１単位とし、その相対
値は、最も高い活性値（１）Ｈ−４，５の場合）を１０
０％としこれに対する％にて表わした。

第１表 ｒｌＨ条件　　　　　相対活性（％） ３．０　　　　　　　　７１ ３、５　　　　　　　　８０ ４、０　　　　　　　　９０ ４．５　　　　　　　１００ ５、０　　　　　　　　９５ ５．５．　　　　　　　　９０ ６．０　　　　　　　　．８０ ６、５　　　　　　　　６０ ７、０　　　　　　　　５４ 上記第１表より、本酵素の至適ｐＨは約４．５付近にあ
ることが判る。

（３）至適温度：約７０℃付近。

本酵素をｐ　Ｈ５，Ｏｒ、０〜１００℃ニテ、上記（２
）と同様にして基質溶液と接触させ、反応液中の還元糖
量を測定して酵素活性（相対値）を求めた。結果を下記
第２表に示す。

第２表 濡面（”Ｃ）　　　　　相対活性（％）上記第２表より
、本酵素の至適温度は、約７゜℃、付近にあることが判
る。

（４）温良安定性：５５℃、１時間（１’１ｌ−１＝５
．０）の処理で残存活性１００％、７０’Ｃ１１時間（
ｐ　Ｈ＝５．０）の処理で残存活性９０％を示ず。

本酵素をｐ）１５．０で、０〜１００℃にて１時間、上
記（２）と同様にして基質溶液と接Ｉｔ！！させ、反応
液中の還元糖量を測定して酵素活性を求め、その残存活
性（％）を求めた。結果を下記第３表に示づ。

第３表 温度（’Ｃ）　　　　残存活性（％） 温度（℃）　　　　残存活性（％） 上記第３表より、本酵素は５５℃、，１時間（ｆ）Ｈ＝
５．０）の処理で残存活性１００％、また７０℃、１時
間（ｐ　Ｈ＝５．０）の処理でも９０％の残存活性を示
すことが判る。

（５）キシラン分解度二６５℃、ρ）−１５，０で４時
間作用の後、６５％加水分解する。

キシラン粉末０．５％を含有する燐酸緩衝液を基質溶液
として、本酵素を、ｐ　Ｈ＝５．０．温度６５℃で作用
さＶ１経時的にキシラン分解度を求めた結果を下記第４
表に示す。

第４表 時間（１」ｒ）　　　分解率（％） ０、５　　　　　　　２０ １、０　　　　　　　４０ ２、０　　　　　　　５５ ３、０　　　　　　　５８ ４．０　　　　　　６５ ５、０　　　　　　　６５ 上記第４表より、本酵素はキシラン（木材）を６５℃、
ｐｆ−１５，０にて４時間作用の後６５％加水分解し得
るものであることが判る。

（６）基質分解の特異性：エンド型の作用様式を示す。

上記（５）に記載の試験において、経時的に反応液をサ
ンプリングしてＴｉｃ（シリカゲル、メルク社製）にて
展開（ブタノール：ピリジン：水＝８：１：１）し、硫
酸噴霧の後、オリゴ糖、キシロトリオース、キシロビオ
ース及び′キジローズをマーカーとして、之等各マーカ
ーのスポットと比較して各分解物の検出を行なった。結
果を下記第５表に示す。尚、表中各分解物における表示
は次のことを示ず。

＋４４・・・・・・・・・大量、　廿・・・・・・・・
・中子・・・・・・・・・小、　　−・・・・・・・・
・無第５表 分解物　　　　　　　作用時間（分） ＝□　　　　　６０分後　１２０分後 オリゴ糖　　　　　　ｍ　　　　　　＋ｎキシロ１−リ
オース　　−１＋　　　　　　ｉｎキシロビオース　　
　−　　　　　− キジローズ　　　　　−　　　　　− 上記第５表より、本酵素はエンド型の作用様式を示すこ
とが判る。

以上の各種試験結果より、本発明酵素（キシラナーゼ）
は、特に耐熱性に優れている点において特徴付けられ、
この点で従来のキシラナーゼと（Ｊ異なる新規なもので
あることが確認される。即ち、従来公知のキシラナーゼ
は、全て中湿度にて安定なものであり、その作用至適温
度の上限は、約４５〜５０℃とされているが、本発明の
キシラナーゼＫＢ−１０−Ｉの作用至適温度は、７０℃
であり、従来例を見ない高温耐性の酵素であることが判
る。従って本発明の耐熱性キシラナーゼは、殊にキシラ
ンを含む各種原料、例えば稲ワラ等の農産廃棄物の有効
利用に、即ち之等の原料からキジローズの分制収得に非
常に有用であり、該加水分解を効率よ〈実施できる利点
がある。

本発明のキシラナーゼＫＢ−’１０＝Ｉは、本発明者ら
が新たに見出しｌｃクロストリディウム属に属し、下記
菌学的性質を有する新規微生物の培養により得られる。

Ａ　形態学的特徴 （ａ）細胞の形及び大きさ；桿菌で、大きさは０．４〜
０．６μｍＸ４．０〜５．０μｒｎである。

（ｂ）細胞の多形性：無し。

（Ｃ）運動性；有り。

（ｄ）胞子形成能：有り。胞子の形状は楕円乃至球状で
末端に位置し、径は０．８〜１．Ｏｔｔｍである。

（ｅ）ダラム染色性；陰性。

（ｆ）抗酸性：無し。

Ｂ　次の培地におｔ′ｊる生育状態（嫌気性条件下）（
ａ）すし・マスミルク：酸性、凝固。

Ｃ生理学的性質 （ａ）ＶＰテスト：　　　　陰↑４゜ （ｂ）ゼラチン液化能：　陰性。

（Ｃ）硫化水素の生成：　陰性。

（ｄ）澱粉の加水分解：　陽性。

（ｅ）カゼイン分解能：　陰性。

（ｆ）無機窒素源の利用：陰性。

（９）色素の生成：　　　陰性。

（ｈ）カタラーげ生成：　陰性。

（１）生育の範囲：　１）Ｈ４〜８、部面３５〜６５℃
である。

（、ｊ）酸素に対する態度：嫌気性（偏性）。

（ｋ）Ｏ−Ｆテスト：好気的にはブドウ糖より酸を生成
せず。

（Ｑ）下記の糖類がら酸及びガスの生成の有無糖　類　
　　　　酸生成　ガス生成 Ｌ−アラビノース　　　千　　　十 り−キシロース　　　　＋　　　＋ Ｄ−グルコース　　　　＋　　　４− Ｄ−マンノース　　　　＋　　　十 〇−フラクトース　　　＋　　　＋ Ｄ−ガラクトース　　　＋　　　十 麦芽糖　　　　　　　　＋　　　＋ ショ糖　　　　　　　＋　　　十 乳糖　　　　　　　　　＋　　　十 トレハロース　　　　　＋　　　十 り−ソルビット　　　　−　　　− Ｄ−マンニット　　　　＋　　　十 イノジット　　　　　　−− グリセリン　　　　　　−− 澱粉　　　　　　　　　→−１ 上記形態学的特徴、生育状態及び生理学的性質を有する
微生物は、バーシイのマニアル・オフ・デターミネイテ
ィブ・バクテリオロジー第８版による検索によれば、ク
ロストリディウム属に属することが判明した。しかしな
がら本微生物が該当する種は見当たらなかった。最も近
似したものとしてはクロストリディウム・リーーモザツ
力ロリデイカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　　ｔｈｅｒ
ｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　＞が挙げられる
が、該株を始め従来公知のクロストリディウム属菌につ
いては、ギシラン分解能は知られていない。唯一キシラ
ン分解能について記載されているクロストリディウム菌
としては、クロストリゾイウム・ザーモセラム（Ｃ。

ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ２７４０５
があるが、この菌もこれがセルビオースの存在下ではじ
めてキシラナーゼを生産すること及び強力なセルラーゼ
生産菌であること等の点で本菌株とは本質的に異なって
いる。本菌株と上記バーシイのマニュアル第８版第５７
２頁に記載されたクロストリディウム・サーモセラム（
Ｖ　１ｌｊｏｅｎ、　Ｆｒｅｄ　ａｎｄｐｅｔｅｒｓｏ
ｎ　、　１９２６．　７　）との同族を対比して示せば
下記第６表の通りである。

第　　６　　表 上記第６表に示す通り、本菌株は、色素生成が陰性であ
る点、醋酸生成を行なう点等においてクロストリディウ
ム・ザーモセラムとは明確に区別される。

またクロストリディウム属には、上記した通り本菌株に
該当する種は存在しないことから、本発明者らは、本菌
株をクロス１−リゾイウム属に属す゛る新種と認め、こ
れをクロストリディウム　エスピー、　ＫＢ−１０（Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　　３１）、　ＫＢ　−１０）と
命名した。本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に
受託番号　微■研菌寄第８３１７号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−
８３１７）として寄託されている。

本発明の新規なキシラナーゼＫＢ−１０−Ｉの生産能を
有する微生物には、上記ＫＢ−１０株の通常の変異株、
即ち該株を常法に従い例えば紫外線又はＸ線照射、変異
誘発剤処理等により変異させた変異株も包含される。

１７一 本発明の新規なキシラナーゼＫＢ−１０−１は、上記微
生物の培養により、主として菌体外に生産される。

上記微生物からの本発明キシラナーゼの収得は、該微生
物を通常のこの種嫌気性菌の培養と同様にして培養する
ことにより実施できる。上記培養に用いられる培地は、
上記微生物が利用する栄養源を含有づる培地であればよ
く、これはクロストリジウム属その他の通常の嫌気性菌
の培養に用いられる培地と同様の各種炭素源、窒素源、
無機金属塩等を適宜含有させたものでよい。特に好まし
い培地としては、例えば以下の各種栄養源その他を含有
するＰＹ−Ｘ培地を例示することができる。

〔ＰＹ−Ｘ培地〕

キシラン　　　　　　　　　０．５ａ ポリペプトン　　　　　　　１．０ｇ イーストエキストラクト　　１．０（＋無機塩類溶液Ｘ
Ｉ　　　　　　４．Ｑ計Ｑヘミン水溶液ｘ２　　　　　
　１．Ｑ制システィン塩酸塩　　　　　０．０５（１イ
オン交換水　　　　　　１００ｍ１ ｐｌ−１７，０ 上記無機塩類溶液８１は、以下の組成を有する。

Ｃａ　Ｃ（１２０，０２％ Ｍｇ８０４　・７Ｈ２００，０４８％ に２　ＨＰＯＡ　　　　　　　Ｏ，１％ＫＨ２ＰＯ４０
，１％ Ｎａ　ＨＣＯ３０，１％ またヘミン水溶液８２におけるヘミンは、培地中に０．
５ｍｏ／１００ｍ２の割合で含有される。

上記培地ＰＹ−Ｘに示したように、微生物ＫＢ−１０株
の培養用培地には、特にキシランを添加配合するのが好
ましくこれにより目的酵素の生産車を増加させることが
できる。また培地にはヘミン及びシスディンを添加配合
するのも好ましい。

上記培地を利用した微生物の培養条件は、特に制限はな
いが、通常利用する微生物の至適温度及び至適ｐＨ条件
を採用するのが好ましい。また培養は、通常の各種培養
方法によることができるが、特に静画培養及び液体培養
によるのがよく、培養に当っては嫌気性雰囲気、例えば
窒素雰囲気、炭酸ガス雰囲気等を維持するのが好ましい
。

上記培養により目的とするキシラナーゼがＩｇＨ物中に
産生される。その培養物からの採取は、ｊ８養物中に目
的酵素が著量蓄積される頃、通常培養開始２４時時間和
行なうのがよく、約１５〜７２詩間後でも採取可能であ
る。上記酵素の採取は、常法に従うことができる。即ち
、例えば培養物、特に好ましくは培養液を遠心分離して
得られる上清を透析等の方法により精製して粗酵素液と
づ−ることができる。

上記のごとくして得られる各粗酵素液は、そのままで酵
素液として用いることもでき、また通常の精製手段によ
り更に精製して酵素標品とすることもできる。該精製手
段としては、例えば樹脂吸着法、塩析法、抽出法、カラ
ムクロマトグラフィー等を例示できる。

実　　　施　　　例 以下、本発明を更に詳細に説明するため実施例を挙げる
。

実施例１ クロストリディウム　エスピー、ＫＢ−１０（微工研菌
奇第８３１７号）を、ｐｙ−ｘ培地（１）Ｈ７，０）１
００ｍ０中に１×１０５〜１×１０６個／−となる温度
で播種し、これを小型バイアル瓶（ゴムキャップ付）に
入れ、その気相の空気を窒素ガス９０％、炭酸ガス５％
及び水素ガス５％の気体と置換した後、５５℃で２４時
間、４８時間及び７２時間各々静置培養を行なった。

上記培養の後、遠心分離（８０００ｒｐｍ　、１０分間
）により上清と菌体とを分離した。

上記上清を、燐酸緩衝液（０，０２Ｍ、ｐ　Ｈ７，０）
に２−メルカプトエタノールを０．５ｍ２／３Ｑの割合
で添加した溶液５０１＋１１２に対して一昼夜透析して
、透析内液として粗酵素液を得た。

得られた粗酵素液とその培養時間との関係を調べた結果
を下記第７表に示す。

第７表 培養時間（Ｈｒ　）　　キシラナーゼＫＢ−１０−Ｉ酵
素活性（単位／　ｍＱ　） ２４　　　　　　　　０．１２ ４８　　　　　　　　０．１２ ７２　　　　　　　　０．１２ 〈以　上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］下記特性を有するキシラナーゼＫＢ−１０− I
   。 （１）基質特異性：キシランをよく分解する。 セルロースは分解しない。 （２）至適ｐＨ：約４．５付近。 （３）至適温度：約７０℃付近。 （４）温度安定性：５５℃、１時間（ｐＨ＝５．０）の
   処理で残存活性１００％、 ７０℃、１時間（ｐＨ＝５．０）の処理 で残存活性９０％を示す。 （５）キシラン分解度：６５℃、ＰＨ５．０で４時間作
   用の後、６５％加水分解する。 （６）基質分解の特異性：エンド型の作用様式を示す。 ［２］クロストリデイウム属に属するキシラナーゼＫＢ
   −１０− I 生産菌を培養して、培養物から下記特性を
   有するキシラナーゼＫＢ−１０− I を採取することを
   特徴とするキシラナーゼＫＢ−１０− I の製造法。 （１）基質特異性：キシランをよく分解する。 セルロースは分解しない。 （２）至適ｐＨ：約４．５付近。 （３）至適温度：約７０℃付近。 （４）温度安定性：５５℃、１時間（ｐＨ＝５．０）の
   処理で残存活性１００％、 ７０℃、１時間（ｐＨ＝５．０）の処理 で残存活性９０％を示す。 （５）キシラン分解度：６５℃、ｐＨ５．０で４時間作
   用の後、６５％加水分解する。 （６）基質分解の特異性：エンド型の作用様式を示す。