JPH0257183A - 新規ヘパラン硫酸分解酵素並びにそれを生産する微生物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、新規なヘパラン硫酸系グリコサミノグリカン
（ヘパラン硫酸及びヘパリン）分解酵素並びにそれを生
産する微生物及び方法に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）従来ヘ
パリン（以下Ｈｅｐと略す）及びヘパラン硫酸（以下Ｈ
３と略す）を分解する酵素（以下Ｈ３ａｓｅと略す）は
フラボバクテリウム・ヘパリナム菌に所在することが知
られており、すでに３種類の酵素について精製の報告が
ある。

しかし、この菌種に由来する酵素以外に微生物の産生ず
るＨ３ａｓｅについての精製の報告はまだない。

これらＨ５ａｓｅは、近年抗血栓剤として開発が進めら
れている低分子ヘパリンの調製時の低分子化剤として、
あるいは細胞表面や基底膜に広く分布し細胞の挙動や機
能の発現に関与しているヘパラン硫酸の構造解析のため
の試薬としてその有用性が注目されている。

これらの用途に役立つ酵素の性質として特に特異性が異
なりより安定な酵素が必要であり、これらの性質を有す
る酵素を産生ずる微生物が求められている。

本発明者等はかかる性質を有するＨ３ａｓｅ産生菌を広
く自然界に検索した結果、山梨県下の土壌より分離した
フラボバクテリウム属に属するＨｐ２０６株がかかる性
質を有する新規な酵素を産生ずる能力をもつことを見出
した。

この酵素を分画・精製した結果、理化学的性質及び特異
性の異なる３種の新しいＨ３ａｓｅが単離された。これ
らの酵素は従来のフラボバクテリウム・ヘパリナム由来
の３酵素（Ｈ３ａｓｅＩ。

ＩＩ、ＩＩ＋）に較べ、Ｈ３ａｓｅＩと理化学的性質で
は異なるが特異性の類似している酵素（Ｈ３ａｓｅＩ）
、両性質のいずれに於ても異なる二つの酵素（Ｈ３ａｓ
ｅＴ、Ｈ３ａｓｅＶ）の３種の新酵素であった。また、
この酵素は比較的安定性も良好であり初期目標に適する
性格を有することを確認し本発明を完成するに至った。

［発明の構成コ （課題を解決するための手段及び作用）本発明は、新規
ヘパラン硫酸分解酵素へパリチナーゼ■、ヘパリチナー
ゼＴ、ヘパリチナーゼＶ並びにそれを生産する微生物及
び方法に関するものである。

本発明の微生物は、フラボバクテリウム属に属するヘパ
リチナーゼＩ、ヘパリチナーゼＩｖ及びヘパリチナーゼ
Ｖ生産能を有する細菌であり、次のような菌学的性質を
有する。

Ａ、形態 （１）肉汁寒天培地に生育し、菌の形態は短い桿状であ
り、０．５〜０．７Ｘ０．８〜１．０μの大きさで、通
常２連であるが、まれに単独ないし数連をなす。

（２）細胞の多形性はない （３）運動性なし く４）胞子形成なし く５）ダラム染色性は陰性 Ｂ、生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 半透明、クリーム色（ＪＩＳ　　Ｚ８１０２゛色名”準
拠、工業用色名帳による判定）で光沢を有する円形の丘
状ないしは半球状の均質なコロニーを生ずる。表面は平
滑かつ湿潤で、周縁は金縁。拡散性色素を生成しない。

（２）肉汁寒天斜面培養 生育は良好で拡布状に生育する。生育部分はクリーム色
を呈し、半透明である。

（３）肉汁液体培養 生育はやや良好で表面に膜を形成することなく培地は半
透明の状態である。

（４）肉汁ゼラチン平板培養 生育は良好でクリーム色を呈する。ゼラチンを液化しな
い。

（５）リドマス・ミルク リドマスの色が桃色に変化する（酸の生成）。

Ｃ６生理学的性質及びその他の性質 （１）硝酸塩の還元：陰性 （２）脱窒反応：陰性 （３）ＭＲテスト；陰性 （４）ＶＰテスト：陽性 （５）インドールの生成：陰性 （６）硫化水素の生成：陰性 （７）デンプンの加水分解：陰性 （８）クエン酸の利用：陰性 （９）無機窒素源の利用：アンモニウム塩：陽性、硝酸
塩；陰性 （１０）色素の生成 キングＡ培地、キングＢ培地で非水溶性のクリーム色の
色素を生成する （１１）ウレアーゼ：陰性 （１２）オキシダーゼ：陽性 （１３）カタラーゼ：陽性 （１４）酸素に対する態度：好気性 （１５）生育ｐＨ：５〜９．５、特に７〜８が最適（１
６）生育温度＝４〜３７℃、特に２５〜３０℃が最適 （１７）Ｏ−Ｆテスト；グルコースを酸化的に利用する （１８）炭素源の利用： 無機塩培地を用いて糖類などの炭素源の利用をしらべた
。いずれの炭素源からもガスを発生せず、酸の生成は次
の通りである。

（＋：陽性、−：陰性） Ｌ−アラビノース　＋　セロビオース　　　＋Ｌ−ラム
ノース　　＋　ラフィノース　　　＋Ｄ−キシロース　
　＋　Ｄ−ソルビトール　＋Ｄ−グルコース　　＋　Ｄ
−マンニトールＤ−マンノース　　＋　イノシトール Ｄ−フラクトース　＋　ズルシトール ローガラクトース　＋　アドニトール 麦芽糖　　　　　　＋　グリセリン　　　　＋ショ糖　
　　　　　＋　サリシン 乳糖　　　　　　　＋　エタノール トレハロース　　　＋ （１９）カゼインの分解：陰性 （２０）エスクリンの分解：陽性 （２１）　Ｂ−ガラクトシダーゼ産生：陽性（２２）マ
ロン酸の利用：陰性 （２３）アルギニンの分解：陰性 （２４）　ＩＪリジン脱炭酸反応：陰性（２５）オルニ
チンの脱炭酸反応：陰性（２６）デオキシリボヌクレア
ーゼ産生：陰性（２７）ペニシリン感受性：陰性 （Ｚ８）黄色色素産生：陽性 （２９）蛍光色素産生：陰性 （３０）ＧＣ含量：３９．７％ 上記の菌学的性質を有する本菌の分類学上の位置をバー
ジエイのマニュアル・オプ・システマティック・バクテ
リオロジー、第１版、第１巻（１９８４年）を参照して
検討すると、本菌はダラム陰性のグルコース非発酵性の
好気性短桿菌で、運動性を示さず、カタラーゼ、オキシ
ダーゼを産生じ、ペニシリン感受性が陰性でＧＣ含量が
３１％から４２％の範囲にあることから、フラボバクテ
リウム属に属すると判定される。更に炭素源利用性の大
部分及び、カゼイン分解能、エスタリン分解能、インド
ール産生能、亜硝酸塩還元能、デンプン分解能、β−ガ
ラクトシダーゼ産生能の性質がフラボバクテリウム・マ
ルチイボラム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌ
ｔｉｖｏｒｕｒａ）に類似しているが、サリシン利用性
、ウレアーゼ産生能の性質がフラボバクテリウム・マル
チイボラムと異なるので、本菌はフラボバクテリウム属
に属する新菌種と同定される。

なお、本菌株Ｈｐ２０６は工業技術院微生物工業技術研
究所に微生物受託番号第１０２０７号（以下微工研菌寄
第１０２０７号と略記する）として寄託されている。

本発明の新規ヘパラン硫酸分解酵素ヘパリチナーゼ■、
ヘパリチナーゼＩ、ヘパリチナーゼＶは、フラボバクテ
リウム属に属する上記Ｈｐ２０６菌あるいはフラボバク
テリウム属に属する該酵素産生菌を通常、微生物の培養
に用いられる栄養培地、好ましくは酵素産生能を高める
ためにヘパリンやヘパラン硫酸或はこれらを含む物質を
添加した培地で培養することにより培地中あるいは菌体
中に生産蓄積されるので、公知の方法で抽出、精製する
ことによって精製酵素を得ることができる。

更に具体的に説明するとフラボバクテリウム属に属する
該酵素産生菌を適当な栄養培地、例えば適当な炭素源、
窒素源、無機塩類と酵素生産能を高めるためにヘパリン
やヘパラン硫酸或はこれらを含む物質などの誘導物質を
含む培地で菌を培養し、該酵素を培地中あるいは菌体中
に生産蓄積せしめるのであるが、炭素源としてはグルコ
ース、ガラクトース、マンノース、フラクトース、キシ
ロース、ラムノース、シュクロース、ラクトース、マル
トース、セロビオース、ラフィノース、澱粉及びその加
水分解物、糖蜜、グリセリンなどが利用できる。窒素源
としては、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキ
ス、大豆粉、脱脂大豆粉、コーンステイープリカー、尿
素、アンモニウム塩など有機、無機の窒素化合物又はこ
れを含有するものが用いられる。無機塩としては、各種
リン酸塩、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、カル
シウムなどの塩類が使用される。そして更に必要に応じ
て菌の生育あるいは酵素生産に必要な各種の無機物や有
機物、例えばシリコーン油、ゴマ油、各種界面活性剤な
どの消泡剤やビタミン類を培地に添加することができる
。

本発明においては、好ましくは、酵素の誘導物質として
ヘパリンやヘパラン硫酸又はそれらを含有する物質を添
加すれば大量の該酵素を生成せしめることができる。こ
れらの添加物の添加は培養当初からでも、培養途中に行
なってもよい。添加量としてはヘパリンやヘパラン硫酸
として通常０．２％〜２％添加すれば良い結果が得られ
る。

培養の形態は液体培養でも固体培養でもよいが、通常は
液体培養が好適であり、工業的には深部通気撹拌培養を
行なうのが有利である。

本発明における培養条件は使用する菌株、培地組成等に
より多少異なるが、該酵素の生産に最も有利な条件を適
当に選択、調節して行なう。培養温度は４〜３７℃の範
囲内で適宜変更することができるが、特に好ましいのは
２５〜３０℃である。培養時間は条件によって異なるが
、１〜２日程度であって該酵素が最高蓄積量に適する時
期に培養を終了すればよい。培地のｐＨは培地調製時に
中性付近にあればよく、通常の場合、特に調節の必要は
ない。

このようにして培養した培養液及び菌体内抽出液双方か
ら三種の酵素を得ることができる。

菌体外液については硫酸アンモニウムを加え、０．８５
飽和として析出した沈殿物を透析した後、ハイドロキシ
アパタイト、イオン交換樹脂、ゲルろ過、吸着クロマト
剤を用いて酵素を分画精製する。また菌体内酵素につい
ては、菌体を適当な緩衝液に懸濁し超音波又は機械的磨
砕法によって菌体を破壊して酵素を抽出した後、その遠
心上清を菌体外液に用いたのと同様の手法により酵素を
精製することができる。しかしこれら精製の手法により
本発明は何ら制約を受けるものではない。

これら酵素の力価は酵素がいずれもヘキソサミニド結合
に作用するリアーゼであり、切断部の断端のウロン酸の
４位と５位の炭素に二重結合が作られ紫外吸収を持つこ
とを利用し、その増大を測定することにより求められる
。

酵素の基質にはへパリチナーゼ■とへパリチナーゼＶに
ついてはウシ腎臓由来のヘパラン硫酸を、ヘパリチナー
ゼＩＶについてはブタ腸粘膜由来のヘパリンを用いる。

即ち、上記基質１０ｍｇ／ｍｌ水溶液２５μｌに対し、
酵素液１０μｍ、２００＋ｎＭ酢酸緩衝液ｐＨ７，０，
２５ｕｌ、２０ｍＭ塩化カルシウム２５μｌ及び水１５
μｌを加え、３７℃で１０分間反応させる。この液に対
し、０．０６Ｎ塩酸溶液５００ｕｌを加え、反応を停止
させ、２３２ｎｍにおける紫外吸収Ａを測る。対照液と
して同混液のゼロ時間における紫外吸収ＡＯを測定する
。

酵素力価の表示は上記反応条件で１分間に１μｍｏｌの
分解量を生じせしめる力価を１単位とじて次の式から算
出する： ＝　　ｕ／ｍｌ（使用酵素ｍ１当りの単位）本発明の新
規なＨ３ａｓｅの理化学的性質を示す。

（１）１囲　いずれの酵素もヘパリン又はヘパラン硫酸
のグルコサミニド結合に作用するリアーゼであり、切断
部のグルクロン酸又はイデュロン酸の４位と５位の炭素
の間に二重結合を形成する。

（２）　！　（図１）　　ＨＳａｓｅＩは主としてヘパ
ラン硫酸に作用し、分解産物として不飽和２糖である、
非硫酸化物（以下「ΔＤｉＨ３−Ｏ５Ｊという）、グル
コサミン−６−硫酸（以下「ΔＤｉ）ＩＳ−”６ＳＪと
いう）、グルコサミン−Ｎ−硫酸（以下「△ＤｉＨ５−
ＮＳＪという）と少量のグルコサミン−Ｎ、６−ジ硫酸
（以下「△Ｄ　ｉ　Ｈ５−ｄ　ｉ　Ｎ、　　６ＳＪとい
う）を生じる。

ＨＳ　ａ　ｓ　ｅ　ＩＶはヘパリン及びヘパラン硫酸に
作用し、分解産物として不飽和２糖である、ウロン酸−
２−硫酸−グルコサミンーＮ−硫酸（以下「ΔＤｉＨ３
−ｄｉ、Ｕ、ＮＳＪという）及びウロン酸−２−硫酸−
グルコサミンーＮ、６−ジ硫酸Ｃ以下「ΔＤ　ｉ　Ｈ３
−ｔｒ　ｉ　ＳＪという）を生じる。

Ｈ３ａｓｅＶはＨＳａｓｅＩの分解産物のうち、△Ｄｉ
Ｈ３−ｄｉＮ、６Ｓ以外の産物を生じる。

（３）至゛　Ｈび　　　Ｈ範　： 本酵素類の至適ｐＨは、ＨＳａｓｅＩ及びＨ５ａｓｅｌ
ＶはいずれもｐＨ７，５（５０ｍ＆ｌトリス酢酸緩衝液
）、Ｈ５ａｓｅＶ、ｐＨ６，５〜７．０（同緩衝液）に
ある（図２）。

本酵素類の安定ｐＨ域は、Ｈ３ａｓｅ　Ｉ及びＨＳ　ａ
　ｓ　ｅ　ＩＶはいずれも１１００Ｉｌ１トリス酢酸緩
衝液中でｐＨ６，０〜７．５、Ｈ５ａｓｅＶでは同緩衝
液でｐＨ６，０〜７．０にある（図３）。

（４）　　　”ｍＯ）　　１　　本酵素類の作用至適温
度は５０＋ｎｌＡ酢酸緩衝液ｐＨ７，０，５ｍＭ塩化カ
ルシウム存在下でＨＳａｓｅＩ、４５℃付近、ＨＳ　ａ
　ｓ　ｅ　Ｉ、Ｈ３ａｓｅＶ４０℃付近である（図４）
。

（５）　Ｈ１温　などによる　　の 本酵素類はいずれもｐＨ５，５以下、ｐＨ８，０以上で
３７℃３０分放置することにより５０％以下に失活する
（図３）。また本酵素類を５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ７，
０中で各温度に６０分間放置した時の安定性はＨＳａｓ
ｅＩとＨ３ａｓｅＩＶは３５℃以上で、Ｈ３ａｓｅＶは
４０℃以上で急激に失活する（図５）。

（６と１１薬剋Ω１１ 本酵素類の活性はいずれもＢａ”、Ｃａ”ｖ　ｇ２−等
で賦活され、Ｃｏ２″″、Ｚｎ”＋で阻害された。また
ＨＳａｓｅＩは更にＰＯ４”−、ＥＤＴＡでも阻害され
る（表参照）。

（７）ｆｌｕ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により本酵
素の分子量を求めると、Ｈ３ａｓｅＩは６４，０００±
５．０００、Ｈ３ａ　ｓ　ｅ　ＩＶは１００．０００±
５．０００、Ｈ３ａｓｅＶは７２，０００±５．０００
と算出される（図６）。図中Ａはミオシン（分子量２０
０．０００）、ＢはフォスフォリラーゼＢ（分子量９７
．４００）、Ｃは牛血清アルブミン（分子量６８．００
０）、Ｄは卵白アルブミン（分子量４３．０００）を示
す。

また、本酵素類は還元下でもいずれも同じ分子量を示し
一本鎖であると推定される。

（発明の実施例） 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。

実施例 ペプトン（極東製）０．５％、酵母エキス（極東製）０
．２％、ヘパリンナトリウム（シンテックス製）０．２
％、Ｋ、ＨＰＯ，０，１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ，ＯＯ，
０２％、ＮａＣｆｆ００１％、消泡剤アデカノールＬＧ
１０９　（加電化製）０．００５％（ｐＨ７，０）の組
成からなる培地２０Ｉ２を３０２容のジャーファーメン
タ−に仕込み、１２０℃で２０分間蒸気滅菌後、予め同
組成（但し、酵母エキス濃度０．５％、消泡剤は無添加
）の培地で３０℃、８時間振盪培養しておいたＨｐ２０
６株（微工研菌寄第１０２０７号）６００ｉ＋１（３％
）を無菌的に植菌し、３０℃で１６時間通気（ＩＶ、Ｖ
、ｍ）撹拌（２００ｒｐｍ）培養した。

培養液２０Ｉ２を連続遠心分離機にて処理して菌体な集
め、この菌体な０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６，８）にて
２５Ｃ１ｎｌに懸濁した。この懸濁液をダイノミルにか
け菌体を破砕した。破砕後、遠心分離により不溶物の除
去を行ない、得られた上清液にプロタミンを１００ｍｇ
添加した。不溶物を遠心分離により除去し、上清液に硫
酸アンモニウムを加え０．８飽和とした。沈殿物を集め
、５０＋ｎＭ燐酸緩衝液ｐＨ６，８で一夜透析し透析内
液をハイドロキシアパタイトカラム（３，４Ｘ４０ｃｍ
）に負荷し同緩衝液中で食塩濃度を０→０．７５Ｍまで
直線的に上昇させることにより溶出させた。Ｈｅｐ及び
Ｈ３を基質として活性を測定した。０．５Ｍ前後でＨＳ
　ａ　ｓ　ｅ　Ｉ、Ｈ５ａｓｅＶが溶出された。Ｈ５ａ
ｓｅ　Ｉはグラジェント終了後、２Ｍ食塩で溶出させた
。Ｈ５ａｓｅ■及びＨ３ａｓｅＶの画分を集め、５０ｍ
Ｍトリス緩衝液ｐＨ７，２に透析し、透析内液を硫酸化
セルロファインのカラム（２，５Ｘ２０ｃｍ）に負荷し
同緩衝液で洗った後、食塩濃度な０−０．６Ｍまで直線
的に上昇せしめることにより、０．２Ｍ付近でＨ３ａｓ
ｅＶを、０．３５Ｍ付近でＨ５ａｓｅＴＶを分離溶出せ
しめることができた。

Ｈ３ａｓｅＩＶについては更にデルマタン硫酸をＡＨ−
セファロースに固定化したカラム（Ｂ、　Ｂ−ＡＨ−セ
ファロース４Ｂ、２Ｘ１０ｃｍ）を用い、予め５＋ｎＭ
リン酸緩衝液ｐＨ６，８により試料及びカラムを緩衝化
した後、負荷し、食塩濃度を０→０．３Ｍまで上昇せし
めることにより混入するスルファターゼを除去精製した
。

各得られた酵素画分は限外ろ過膜（ウルトラフィルター
〇に−１０）を用いて濃縮脱塩し、酵素濃液を得た。

各酵素の収量 Ｈ３ａｓｅＩ　　４０Ｕ ＨＳ　ａ　ｓ　ｅ　ＩＶ　　３８　Ｕ Ｈ３ａｓｅＶ　　　５Ｕ ［発明の効果］ 本発明によれば、新規ヘパラン硫酸分解酵素へバリチナ
ーゼＩ、ヘパリチナーゼＴ、ヘパリチナーゼＶを提供す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明の酵素類の基質特異性を示す図であり、
図２は、本発明の酵素類の至適ｐＨを示す図であり、図
３は、本発明の酵素類の安定ｐＨ範囲を示す図であり、
図４は、本発明の酵素類の作用至適温度を示す図であり
、図５は、本発明の酵素類の温度による失活の条件を示
す図であり、図６は、本発明の酵素類の分子量を示す図
である。 （・／、） １・１・ １石 （＠／、） １・（ セ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の理化学的性質を有することを特徴とする新
   規ヘパラン硫酸分解酵素ヘパリチナーゼ I 、ヘパリチ
   ナーゼIV及びヘパリチナーゼＶ。 ［１］作用：いずれの酵素もヘパリン又はヘパラン硫酸
   のグルコサミニド結合に作用するリアーゼであり、切断
   部のグルクロン酸又はイデュロン酸の４位と５位の炭素
   の間に二重結合を形成する。 ［２］基質特異性 ヘパリチナーゼ I ：主としてヘパラン硫酸に作用し、
   分解産物として不飽和２糖である、非硫酸化物、Ｎ−ア
   セチルグルコサミン−６−硫酸、グルコサミン−Ｎ−硫
   酸と少量のグルコサミン−Ｎ，６−ジ硫酸を生じる。 ヘパリチナーゼIV：ヘパリン及びヘパラン硫酸に作用し
   、分解産物として不飽和２糖である、ウロン酸−２−硫
   酸−グルコサミン−Ｎ−硫酸及びウロン酸−２−硫酸−
   グルコサミン−Ｎ，６−ジ硫酸を生じる。 ヘパリチナーゼＶ：主としてヘパラン硫酸に作用し、分
   解産物として不飽和２糖である、非硫酸化物、グルコサ
   ミン−６−硫酸及びグルコサミン−Ｎ−硫酸を生じる。 ［３」至適ｐＨ（５ＯｍＭトリス−酢酸緩衝液、３７℃
   反応） ヘパリチナーゼ I ：約７．５ ヘパリチナーゼIV：約７．５ ヘパリチナーゼＶ：約７．０ ［４］安定ｐＨ範囲（１００ｍＭトリス−酢酸緩衝液、
   ３７℃、３０分処理） ヘパリチナーゼ I ：６．０〜７．５ ヘパリチナーゼIV：６．０〜７．５ ヘパリチナーゼＶ：６．０〜７．０ ［５］至適温度（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ７．０、５
   ｍＭ塩化カルシウム） ヘパリチナーゼ I ：約４５℃ ヘパリチナーゼIV：約４０℃ ヘパリチナーゼＶ：約４０℃ ［６］安定温度範囲（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ７．０
   、６０分処理） ヘパリチナーゼ I ：３５℃以下 ヘパリチナーゼIV：３５℃以下 ヘパリチナーゼＶ：４０℃以下 ［７］分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
   動法） ヘパリチナーゼ I ：６４，０００±５，０００ヘパリ
   チナーゼIV：１００，０００±５，０００ヘパリチナー
   ゼＶ：７２，０００±５，０００（２）フラボバクテリ
   ウム属に属するヘパリチナーゼ I 、ヘパリチナーゼIV
   及びヘパリチナーゼＶ生産能を有する細菌。 （３）フラボバクテリウム属に属するヘパリチナーゼ
   I 、ヘパリチナーゼIV及びヘパリチナーゼＶ生産能を有
   する細菌を培養し、その培養液又は菌体内抽出液からヘ
   パリチナーゼ I 、ヘパリチナーゼIV又はヘパリチナー
   ゼＶを分離、採取することを特徴とするヘパリチナーゼ
   I 、ヘパリチナーゼIV又はヘパリチナーゼＶの製造法
   。