JP2919496B2 - 新規コンドロイチン硫酸分解酵素、それらを産生する微生物並びにそれらの製法 - Google Patents
新規コンドロイチン硫酸分解酵素、それらを産生する微生物並びにそれらの製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、新規なコドロイチン硫酸分解酵素、コンド
ロイチナーゼAC III、コンドロイチナーゼＣ及びコンド
ロイチナーゼB II、それらを産生する微生物並びにそれ
らの製法に関する。
ロイチナーゼAC III、コンドロイチナーゼＣ及びコンド
ロイチナーゼB II、それらを産生する微生物並びにそれ
らの製法に関する。
（従来の技術及び発明が解決しようとする課題） コンドロイチン硫酸系グリコサミノグリカンは、細胞
外マトリックスを構成する成分として広く動物組織中に
分布しており、加齢や疾病に伴ってその含量や糖鎖構造
に変化の生じることが知られている。これらの成分の組
織内分布を知るためには、酵素消化前後における組織染
色像の変化を調べることが有力な手法として用いられて
いる。また、グリコサミノグリカンを組織から抽出し、
その糖鎖構造を調べる際、構造のちがいを識別して分解
できる特異性の高い酵素が非常に重要な役割を果たして
いる。
外マトリックスを構成する成分として広く動物組織中に
分布しており、加齢や疾病に伴ってその含量や糖鎖構造
に変化の生じることが知られている。これらの成分の組
織内分布を知るためには、酵素消化前後における組織染
色像の変化を調べることが有力な手法として用いられて
いる。また、グリコサミノグリカンを組織から抽出し、
その糖鎖構造を調べる際、構造のちがいを識別して分解
できる特異性の高い酵素が非常に重要な役割を果たして
いる。
従来、このような役割を果たす酵素としては、コンド
ロイチナーゼ（以下、Chaseと略す）ABC（Proteus vulg
aris）,Chase AC（Flavobacterium heparinum）,Chase
ACII（Arthrobacter aurescens），及びChase B（Flavo
bacterium heparinum）などがある。これらの酵素はそ
れぞれ異なる作用様式を示すが、コンドロイチン硫酸糖
鎖の作用部位についてはほとんど共通している。
ロイチナーゼ（以下、Chaseと略す）ABC（Proteus vulg
aris）,Chase AC（Flavobacterium heparinum）,Chase
ACII（Arthrobacter aurescens），及びChase B（Flavo
bacterium heparinum）などがある。これらの酵素はそ
れぞれ異なる作用様式を示すが、コンドロイチン硫酸糖
鎖の作用部位についてはほとんど共通している。
即ち、Chase ABC,Chase AC及びChase ACIIをコンドロ
イチン硫酸に作用させると、いずれの酵素も類似の分解
作用を示し、不飽和２糖（Δdi）のΔDi−OS〔２−アセ
トアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（β−Ｄ−グルコ−
４−エネピラノシルウロニックアシド）−Ｄ−ガラクト
ース〕、ΔDi−6S〔２−アセトアミド−２−デオキシ−
３−Ｏ−（β−Ｄ−グルコ−４−エネピラノシルウロニ
ックアシド−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラストース〕、Di
−4S〔２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（β
−Ｄ−グルコ−４−エネピラノシルウロニックアシド）
−４−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラストース〕、ΔDi−DiS
D〔２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（２−
Ｏ−スルホ−β−Ｄ−グルコ−４−エネピラノシルウロ
ニックアシド）−４−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラストース〕
（Chase ACを除く）及びΔDi−diSE〔２−アセトアミド
−２−デオキシ３−Ｏ−（β−Ｄ−グルコ−４−エネピ
ラノシルウロニックアシド）−4,6−ビス−Ｏ−スルホ
−Ｄ−ガラクトース〕を生成するため、これらの酵素類
を組み合わせて用いても得られる糖鎖骨格の情報は限ら
れている。
イチン硫酸に作用させると、いずれの酵素も類似の分解
作用を示し、不飽和２糖（Δdi）のΔDi−OS〔２−アセ
トアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（β−Ｄ−グルコ−
４−エネピラノシルウロニックアシド）−Ｄ−ガラクト
ース〕、ΔDi−6S〔２−アセトアミド−２−デオキシ−
３−Ｏ−（β−Ｄ−グルコ−４−エネピラノシルウロニ
ックアシド−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラストース〕、Di
−4S〔２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（β
−Ｄ−グルコ−４−エネピラノシルウロニックアシド）
−４−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラストース〕、ΔDi−DiS
D〔２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（２−
Ｏ−スルホ−β−Ｄ−グルコ−４−エネピラノシルウロ
ニックアシド）−４−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラストース〕
（Chase ACを除く）及びΔDi−diSE〔２−アセトアミド
−２−デオキシ３−Ｏ−（β−Ｄ−グルコ−４−エネピ
ラノシルウロニックアシド）−4,6−ビス−Ｏ−スルホ
−Ｄ−ガラクトース〕を生成するため、これらの酵素類
を組み合わせて用いても得られる糖鎖骨格の情報は限ら
れている。
近年、これらグリコサミノグリカンの構造と活性の関
係が重視されるようになり、糖鎖をより特異的に切断す
る酵素の必要性が高まってきている。
係が重視されるようになり、糖鎖をより特異的に切断す
る酵素の必要性が高まってきている。
［発明の構成］ （課題を解決するための手段） 本発明者らは、かかる目的に役立つ酵素を得るため、
Chase産生菌を広く自然界より検索した結果、山梨県下
の土壌より分離したフラボバクテリウム属に属するHp10
2株が、かかる性質を有する新規な酵素を産生する能力
をもつことを見いだした。
Chase産生菌を広く自然界より検索した結果、山梨県下
の土壌より分離したフラボバクテリウム属に属するHp10
2株が、かかる性質を有する新規な酵素を産生する能力
をもつことを見いだした。
この菌株をコンドロイチン硫酸を用いて誘導培養し、
培地及び菌体内に生成蓄積された酵素を分離採取した結
果、従来のChaseとは特異性のことなるコンドロイチン
硫酸分解酵素、Chase AC III、Chase C及びChase B II
を採取した。これらの酵素は従来のChaseに比べ、コン
ドロイチン硫酸糖鎖に対する作用がより限定されてお
り、Chase AC IIIはΔDi−diSを生成しないこと、Chase
CはΔDi−6S,ΔDi−diSDを生成し、ΔDi−OSはわずか
しか生成しないこと、Chase B IIはコドロイチン硫酸Ｂ
（デルマタン硫酸と同じ）に作用し、ΔDi−4S及びΔDi
−diSEを生成することなどが確認され、目的に適する性
質を有することが分かり、本発明を完成するに至った。
培地及び菌体内に生成蓄積された酵素を分離採取した結
果、従来のChaseとは特異性のことなるコンドロイチン
硫酸分解酵素、Chase AC III、Chase C及びChase B II
を採取した。これらの酵素は従来のChaseに比べ、コン
ドロイチン硫酸糖鎖に対する作用がより限定されてお
り、Chase AC IIIはΔDi−diSを生成しないこと、Chase
CはΔDi−6S,ΔDi−diSDを生成し、ΔDi−OSはわずか
しか生成しないこと、Chase B IIはコドロイチン硫酸Ｂ
（デルマタン硫酸と同じ）に作用し、ΔDi−4S及びΔDi
−diSEを生成することなどが確認され、目的に適する性
質を有することが分かり、本発明を完成するに至った。
本発明のChase AC III、Chase C及びChase B IIは、
次のような理化学的性質を有する。
次のような理化学的性質を有する。
作 用 いずれの酵素もコンドロイチン硫酸の糖鎖のヘキソサ
ミニド結合に作用するリアーゼであり、切断部の断端の
ウロン酸の４位と５位の炭素の間に２重結合を形成す
る。
ミニド結合に作用するリアーゼであり、切断部の断端の
ウロン酸の４位と５位の炭素の間に２重結合を形成す
る。
基質特異性（図１） Chase AC III:ヒアルロン酸に作用して不飽和２糖及
び不飽和オリゴ糖を生成する。コンドロイチン硫酸に作
用してΔDi−OS,ΔDi−6S及びΔDi−4Sを生成するが、
ΔDi−diSを生成しない。
び不飽和オリゴ糖を生成する。コンドロイチン硫酸に作
用してΔDi−OS,ΔDi−6S及びΔDi−4Sを生成するが、
ΔDi−diSを生成しない。
Chase C:ヒアルロン酸に作用せず、コンドロイチン硫
酸に作用してΔDi−6S及びΔDi−diSDを生成する。ガラ
クトサミンの４位が硫酸化されている不飽和２糖を生成
しない。
酸に作用してΔDi−6S及びΔDi−diSDを生成する。ガラ
クトサミンの４位が硫酸化されている不飽和２糖を生成
しない。
Chase B II:コンドロイチン硫酸Ｂに作用してΔDi−4
S及びΔDi−diSEを生成する。
S及びΔDi−diSEを生成する。
至適pH（50mMトリスー酢酸、トリスー塩酸及びグリシ
ン緩衝液、37℃反応）（図２） Chase AC III:6.0−7.0 Chase C :8.0−9.0 Chase B II :8.0−9.0 安定pH範囲（100mMトリスー酢酸、トリスー塩酸及び
グリシン緩衝液、37℃、30分処理）（図３） Chase AC III:6.0− 9.5 Chase C :5.5− 8.0 Chase B II :6.5−11.0 作用至適温度（50mMトリスー酢酸緩衝液、pH7.0）
（図４） Chase AC III:40℃ Chase C :50℃ Chase B II :50℃ 安定温度範囲（50mMトリスー酢酸緩衝液、pH7.0、60
分処理）（図５） Chase AC III:30℃以下 Chase C :40℃以下 Chase B II :45℃以下 pH、温度などによる失活の条件 100mM酢酸、トリスー酢酸、トリスー塩酸及びグリシ
ン緩衝液中で37℃で30分間放置することにより、次のpH
で急激に失活する（図３）。
ン緩衝液、37℃反応）（図２） Chase AC III:6.0−7.0 Chase C :8.0−9.0 Chase B II :8.0−9.0 安定pH範囲（100mMトリスー酢酸、トリスー塩酸及び
グリシン緩衝液、37℃、30分処理）（図３） Chase AC III:6.0− 9.5 Chase C :5.5− 8.0 Chase B II :6.5−11.0 作用至適温度（50mMトリスー酢酸緩衝液、pH7.0）
（図４） Chase AC III:40℃ Chase C :50℃ Chase B II :50℃ 安定温度範囲（50mMトリスー酢酸緩衝液、pH7.0、60
分処理）（図５） Chase AC III:30℃以下 Chase C :40℃以下 Chase B II :45℃以下 pH、温度などによる失活の条件 100mM酢酸、トリスー酢酸、トリスー塩酸及びグリシ
ン緩衝液中で37℃で30分間放置することにより、次のpH
で急激に失活する（図３）。
Chase AC III:pH5.5以下、pH10.0以上 Chase C :pH5.0以下、pH8.5以上 Chase B II :pH6.0以下 50mMトリスー酢酸緩衝液、pH7.0中で各温度下に60分
間放置したとき、次の温度で急激に失活する（図５）。
間放置したとき、次の温度で急激に失活する（図５）。
Chase AC III:35℃以上 Chase C :45℃以上 Chase B II :50℃以上 阻害及び活性化 本酵素類の活性は、表１に示すように各種イオンによ
り賦活又は阻害される。
り賦活又は阻害される。
Chase AC IIIはBa2+,Ca2+で賦活され、Co2+,Zn2+で阻
害される。
害される。
Chase CはBa2+で賦活され、Co2+,Mn2+,Zn2+で阻害さ
れる。
れる。
Chase B IIはK+,Na+,Ca2+,SO4 2-,PO4 3-で賦活され、B
a2+,Co2+,Mg2+,Mn2+,Zn2+,EDTAで阻害される。
a2+,Co2+,Mg2+,Mn2+,Zn2+,EDTAで阻害される。
本発明のChase AC III、Chase C及びChase B IIは、
フラボバクテリウム属に属するChase AC III、Chase C
及びChase B II産生能を有する菌を培養し、その培養液
又は菌体内にChase AC III、Chase C及びChase B IIを
生成蓄積させ、これを採取することにより得られる。
フラボバクテリウム属に属するChase AC III、Chase C
及びChase B II産生能を有する菌を培養し、その培養液
又は菌体内にChase AC III、Chase C及びChase B IIを
生成蓄積させ、これを採取することにより得られる。
Chase AC III、Chase C及びChase B IIの生産能を有
する菌としては、新規なフラボバクテリウムsp Hp102株
があげられ、次のような菌学的性質を示す。
する菌としては、新規なフラボバクテリウムsp Hp102株
があげられ、次のような菌学的性質を示す。
A.形態 （１）肉汁寒天培地に生育し、菌の形態は短い桿状であ
り、0.4〜0.5×0.6〜0.8μの大きさで、通常２連である
が、まれに単独となる。
り、0.4〜0.5×0.6〜0.8μの大きさで、通常２連である
が、まれに単独となる。
（２）細胞の多形成はない （３）運動性なし （４）胞子形成なし （５）グラム染色性は陰性 B.生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 半透明、ネープルスイエロー色（JISZ8102″色名″準
拠、工業用色名帳による判定）で光沢を有する円形の丘
状の均質なコロニーを生ずる。表面は平滑かつ湿潤で、
周縁は全縁。拡散性色素を生成しない。
拠、工業用色名帳による判定）で光沢を有する円形の丘
状の均質なコロニーを生ずる。表面は平滑かつ湿潤で、
周縁は全縁。拡散性色素を生成しない。
（２）肉汁寒天斜面培養 生育は良好で拡布状に生育する。生育部分はネープル
スイエロー色を呈し、半透明である。
スイエロー色を呈し、半透明である。
（３）肉汁液体培養 生育は良好で表面に膜を形成することなく、培地は濁
る。
る。
（４）肉汁ゼラチン平板培養 生育は良好で黄土色を呈し半透明である。ゼラチンを
わずかに液化する。
わずかに液化する。
（５）リトマス・ミルク リトマスの色が桃色に変化する（酸の生成）。
C.生理学的性質及びその他の性質 １）硝酸塩の還元：陰性 （２）脱窒反応：陰性 （３）MRテスト：陰性 （４）VPテスト：陽性 （５）インドールの生成：陰性 （６）硫化水素の生成：陰性 （７）デンプンの加水分解：陽性 （８）クエン酸の利用：陰性 （９）無機窒素源の利用：アンモニウム塩：陽性、硝酸
塩：陰性 （10）色素の生成 キンブＡ培地、キングＢ培地での排水溶性のネープル
スイエロー色の色素を生成する （11）ウレアーゼ：陽性 （12）オキシダーゼ：陽性 （13）カタラーゼ：陽性 （14）酸素に対する態度：好気性 （15）生育pH:5〜9.5,特に７〜８が最適 （16）生育温度:7〜40℃、特に30〜37℃が最適 （17）０−Ｆテスト：グルコースを酸化的に利用する （18）炭素源の利用： 無機塩培地を用いて糖類などの炭素源の利用を調べ
た。いずれの炭素源からもガスを発生せず酸の生成は以
下の通りである。
塩：陰性 （10）色素の生成 キンブＡ培地、キングＢ培地での排水溶性のネープル
スイエロー色の色素を生成する （11）ウレアーゼ：陽性 （12）オキシダーゼ：陽性 （13）カタラーゼ：陽性 （14）酸素に対する態度：好気性 （15）生育pH:5〜9.5,特に７〜８が最適 （16）生育温度:7〜40℃、特に30〜37℃が最適 （17）０−Ｆテスト：グルコースを酸化的に利用する （18）炭素源の利用： 無機塩培地を用いて糖類などの炭素源の利用を調べ
た。いずれの炭素源からもガスを発生せず酸の生成は以
下の通りである。
（＋：陽性、−：陰性） Ｌ−アラビノース＋セロビオース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ラフィノース ＋ Ｄ−キシロース ＋Ｄ−ソルビトール＋ Ｄ−グルコース ＋Ｄ−マンニトール＋ Ｄ−マンノース ＋イノシトール ＋ Ｄ−フラクトース＋ズルシトール − Ｄ−ガラクトース＋アドニトール ＋ 麦芽糖 ＋グリセリン ＋ ショ糖 ＋サリシン ＋ 乳糖 ＋エタノール − トレハロース ＋ （19）ガセインの分解：陰性 （20）エスクリンの分解：陽性 （21）β−ガラクトシダーゼ産生：陽性 （22）マロン酸の利用：陰性 （23）アルギニンの分解：陰性 （24）リジンの脱炭酸反応：陰性 （25）オルニチンの脱炭酸反応：陰性 （26）デオキシリボヌクレアーゼ産生：陰性 （27）ペニシリン感受性：陰性 （28）黄色色素産生：陽性 （29）蛍光色素産生：陰性 （30）GC含量:37.7％ 上記の菌学的性質を有する本菌の分類学上の位置をバ
ージェイのマニュアル・オブ・システマティック・バク
テリオロジー、第１版、第１巻（1984年）を参照して検
討すると、本菌はグラム陰性のグルコース非発酵性の好
気性短桿菌で、運動性を示さず、カタラーゼ、オキシダ
ーゼを産生し、ペニシリン感受性が陰性でGC含量が31％
から42％の範囲にあることから、フラボバクテリウム属
に属すると判定される。更に炭素源利用性の大部分及
び、カゼイン分解能、エスクリン分解能、インドール産
生能、亜硝酸塩還元能、デンプン分解能、ウレアーゼ産
生能、β−ガラクトシダーゼ産生能の性質が比較のため
入手したフラボバクテリウム・マルティボラム（Flavob
acterium multivorum）ATCC33613株に類似していたが、
マンニトール、アドニトール、イノシトール、ソルビト
ールの利用性がフラボバクテリウム・マルティボラムと
異なるので、本菌はフラボバクテリウム属に属する新菌
種と同定される。
ージェイのマニュアル・オブ・システマティック・バク
テリオロジー、第１版、第１巻（1984年）を参照して検
討すると、本菌はグラム陰性のグルコース非発酵性の好
気性短桿菌で、運動性を示さず、カタラーゼ、オキシダ
ーゼを産生し、ペニシリン感受性が陰性でGC含量が31％
から42％の範囲にあることから、フラボバクテリウム属
に属すると判定される。更に炭素源利用性の大部分及
び、カゼイン分解能、エスクリン分解能、インドール産
生能、亜硝酸塩還元能、デンプン分解能、ウレアーゼ産
生能、β−ガラクトシダーゼ産生能の性質が比較のため
入手したフラボバクテリウム・マルティボラム（Flavob
acterium multivorum）ATCC33613株に類似していたが、
マンニトール、アドニトール、イノシトール、ソルビト
ールの利用性がフラボバクテリウム・マルティボラムと
異なるので、本菌はフラボバクテリウム属に属する新菌
種と同定される。
なお、本菌株Hp102は工業技術院微生物工業技術研究
所に微生物受託番号第10206号（以下、微工研菌寄第102
06号の略記する）として寄託されている。
所に微生物受託番号第10206号（以下、微工研菌寄第102
06号の略記する）として寄託されている。
本発明の新規フラボバクテリウムsp Hp102菌株を培養
して、Chase AC III、ChaseC、Chase B IIを培地又は菌
体内に生成蓄積させるには、通常、微生物の培養に用い
られる栄養培地、好ましくは酵素産生能を高めるために
コンドロイチン硫酸、コドロイチンポリ硫酸、ヘパリ
ン、ヘパラン硫酸或はこれらを含む物質を添加した培地
で培養することにより、培地中或は菌体中に生成蓄積さ
れるので、公知の方法で抽出、精製することによって精
製酵素を得ることができる。
して、Chase AC III、ChaseC、Chase B IIを培地又は菌
体内に生成蓄積させるには、通常、微生物の培養に用い
られる栄養培地、好ましくは酵素産生能を高めるために
コンドロイチン硫酸、コドロイチンポリ硫酸、ヘパリ
ン、ヘパラン硫酸或はこれらを含む物質を添加した培地
で培養することにより、培地中或は菌体中に生成蓄積さ
れるので、公知の方法で抽出、精製することによって精
製酵素を得ることができる。
更に具体的に説明するとフラボバクテリウムsp Hp102
菌株を適当な栄養培地、例えば適当な炭素源、窒素源、
無機塩類と酵素産生能を高めるために、コンドロイチン
硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫
酸或はこれらを含む物質などの誘導物質を含む培地で菌
を培養し、該酵素を培地中或は菌体中に生成蓄積させる
のであるが、炭素源としてはグルコース、ガラクトー
ス、マンノース、フラクトース、キシロース、ラムノー
ス、アラビノース、シュクロース、ラクトース、マルト
ース、トレハロース、セロビオース、ラフィノース、ソ
ルビトース、マンニトール、イノシトール、アドニトー
ル、澱粉及びその加水分解物、糖蜜、グリセリンなどが
利用できる。窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキ
ス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、脱脂大豆粉、コーン
スティープリカー、尿素、アンモニウム塩など有機、無
機の窒素化合物又はこれを含有するものが用いられる。
無機塩としては、各種リン酸塩、マグネシウム、カリウ
ム、ナトリウム、カルシウムなどの塩類が使用される。
そして更に必要に応じて菌の生育或は酵素産生に必要な
各種の無機物や有機物、例えばシリコーン油、ゴマ油、
各種界面活性剤などの消泡剤やビタミン類を培地に添加
することができる。
菌株を適当な栄養培地、例えば適当な炭素源、窒素源、
無機塩類と酵素産生能を高めるために、コンドロイチン
硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫
酸或はこれらを含む物質などの誘導物質を含む培地で菌
を培養し、該酵素を培地中或は菌体中に生成蓄積させる
のであるが、炭素源としてはグルコース、ガラクトー
ス、マンノース、フラクトース、キシロース、ラムノー
ス、アラビノース、シュクロース、ラクトース、マルト
ース、トレハロース、セロビオース、ラフィノース、ソ
ルビトース、マンニトール、イノシトール、アドニトー
ル、澱粉及びその加水分解物、糖蜜、グリセリンなどが
利用できる。窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキ
ス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、脱脂大豆粉、コーン
スティープリカー、尿素、アンモニウム塩など有機、無
機の窒素化合物又はこれを含有するものが用いられる。
無機塩としては、各種リン酸塩、マグネシウム、カリウ
ム、ナトリウム、カルシウムなどの塩類が使用される。
そして更に必要に応じて菌の生育或は酵素産生に必要な
各種の無機物や有機物、例えばシリコーン油、ゴマ油、
各種界面活性剤などの消泡剤やビタミン類を培地に添加
することができる。
本発明においては、好ましくは、酵素の誘導物質とし
てコンドロイチン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパ
リンやペパラン硫酸又はこれらを含有する物質を培地に
添加すれば大量の該酵素を生成させることができる。こ
れらの添加物の添加は培養当初からでも、培養途中に行
なってもよい。添加量としては上記誘導物質を通常0.2
％〜２％添加すれば良い結果が得られる。
てコンドロイチン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパ
リンやペパラン硫酸又はこれらを含有する物質を培地に
添加すれば大量の該酵素を生成させることができる。こ
れらの添加物の添加は培養当初からでも、培養途中に行
なってもよい。添加量としては上記誘導物質を通常0.2
％〜２％添加すれば良い結果が得られる。
培養の形態は液体培養でも固体培養でもよいが、通常
は液体培養が好適であり、工業的には深部通気撹拌培養
を行なうのが有利である。
は液体培養が好適であり、工業的には深部通気撹拌培養
を行なうのが有利である。
本発明における培養条件は、使用する菌壁、培地組成
等により多少異なるが、該酵素の生産に最も有利な条件
を適当に選択、調節して行なう。培養温度は７〜40℃の
範囲内で適宜変更することができるが、特に好ましいの
は30〜37℃である。培養時間は条件によって異なるが、
１〜２日程度であって、該酵素が最高蓄積に達する時期
に培養を終了すればよい。培地のpHは培地調整時に中性
付近にあればよく、通常の場合、特に調節の必要はな
い。
等により多少異なるが、該酵素の生産に最も有利な条件
を適当に選択、調節して行なう。培養温度は７〜40℃の
範囲内で適宜変更することができるが、特に好ましいの
は30〜37℃である。培養時間は条件によって異なるが、
１〜２日程度であって、該酵素が最高蓄積に達する時期
に培養を終了すればよい。培地のpHは培地調整時に中性
付近にあればよく、通常の場合、特に調節の必要はな
い。
実施例 （力価測定法） Chase AC III、Chase C及びChase B IIの力価は、こ
れら酵素がいずれもヘキソサミニド結合に作用するリア
ーゼであり、切断部の断端のウロン酸の４位と５位の炭
素に二重結合が形成され、紫外線吸収を持つことを利用
してその増大を測定することにより求められる。
れら酵素がいずれもヘキソサミニド結合に作用するリア
ーゼであり、切断部の断端のウロン酸の４位と５位の炭
素に二重結合が形成され、紫外線吸収を持つことを利用
してその増大を測定することにより求められる。
酵素の基質には、Chase A C IIIとChase Cについては
コンドロイチン硫酸Ｃ（サメ軟骨由来）を、Chase B II
についてはコンドロイチン硫酸Ｂ（ブタ皮膚由来）を用
いる。
コンドロイチン硫酸Ｃ（サメ軟骨由来）を、Chase B II
についてはコンドロイチン硫酸Ｂ（ブタ皮膚由来）を用
いる。
即ち、上記基質10mg/ml水溶液25μに対し、酵素液1
0μ、200mM酢酸緩衝液、pH7.0、25μ、20mM塩化カ
ルシウム25μ及び水15μを加え、37℃で10分間反応
させる。この液に対して、0.06N塩酸溶液500μを加
え、反応を停止させ、232nmにおける紫外吸収Ａを測
る。対照液として同混液のゼロ時間における紫外吸収A0
を測定する。
0μ、200mM酢酸緩衝液、pH7.0、25μ、20mM塩化カ
ルシウム25μ及び水15μを加え、37℃で10分間反応
させる。この液に対して、0.06N塩酸溶液500μを加
え、反応を停止させ、232nmにおける紫外吸収Ａを測
る。対照液として同混液のゼロ時間における紫外吸収A0
を測定する。
酵素力価の表示は、上記反応で１分間に１μmolの分
解量を生じさせる力価を１単位として、次の式から算出
する： （培養法） ペプトン（極東製）0.5％、酵母エキス（極東製）0.2
％、コンドロイチン硫酸ナトリウム（生化学工業製）0.
5％、K2HPO40.1％、MgSO4・7H2O0.02％、NaCl0.1％及び
消泡剤アデカノールLG109（旭電化製）0.005％（pH7.
0）の組成からなる培地20を30容のジャーファーメ
ンターに仕込み、120℃で20分間蒸気減菌後、予め同組
成（但し、酵母エキス濃度0.5％、消泡剤は無添加）の
培地で30℃、８時間振盪培養しておいたフラボバクテリ
ウムspHp102株（微工研菌寄第10206号）400ml（２％）
を無菌的に植菌し、30℃で16時間通気撹拌（200rpm）培
養した。
解量を生じさせる力価を１単位として、次の式から算出
する： （培養法） ペプトン（極東製）0.5％、酵母エキス（極東製）0.2
％、コンドロイチン硫酸ナトリウム（生化学工業製）0.
5％、K2HPO40.1％、MgSO4・7H2O0.02％、NaCl0.1％及び
消泡剤アデカノールLG109（旭電化製）0.005％（pH7.
0）の組成からなる培地20を30容のジャーファーメ
ンターに仕込み、120℃で20分間蒸気減菌後、予め同組
成（但し、酵母エキス濃度0.5％、消泡剤は無添加）の
培地で30℃、８時間振盪培養しておいたフラボバクテリ
ウムspHp102株（微工研菌寄第10206号）400ml（２％）
を無菌的に植菌し、30℃で16時間通気撹拌（200rpm）培
養した。
培養液20を連続遠心分離機にて処理して菌体を集
め、この菌体（湿重量220g）を800mlの0.1M燐酸緩衝液
（pH6.8）中に懸濁し、超音波破砕機を用いて菌体を破
砕した。破砕後、遠心分離により不容物を除去し、得ら
れた上清液に0.5M酢酸ナトリウム溶液500mlを加えた
後、プロタミン溶液（125mg/）750mlを４℃で撹拌し
ながら滴下した。この液を30分間放置した後、遠心分離
して上清を集め、予め50mM燐酸緩衝液中で平衡化したハ
イドロキシアパタイトカラム（６×22cm）に負荷し、同
緩衝液中で食塩濃度を０→1.5Mまで直線的に上昇させる
ことにより溶出させた。コンドロイチン硫酸Ｃ及びＢを
基質として酵素活性を測定し、食塩濃度0.3−0.53Mで溶
出するChase CとChase B II画分（１）及び0.55−0.8M
に溶出するChase A C III画分（２）を分取し、それぞ
れの画分を限外過膜を用いて濃縮脱塩し、次いで50mM
トリスー酢酸緩衝液に置換した。両活性画分はそれぞれ
同緩衝液で平衡化した硫酸化セルロファインカラム（2.
5×30cm）に負荷し、同緩衝液中で食塩濃度を０→0.5M
まで直線的に上昇させて、画分（１）では0.3−0.33Mに
Chase B IIを、0.4−0.45MにChase Cを溶出、分取し
た。また、画分（２）についても同条件下で溶出を行な
い、0.3−0.4M食塩濃度で溶出する活性画分を回収し
た。
め、この菌体（湿重量220g）を800mlの0.1M燐酸緩衝液
（pH6.8）中に懸濁し、超音波破砕機を用いて菌体を破
砕した。破砕後、遠心分離により不容物を除去し、得ら
れた上清液に0.5M酢酸ナトリウム溶液500mlを加えた
後、プロタミン溶液（125mg/）750mlを４℃で撹拌し
ながら滴下した。この液を30分間放置した後、遠心分離
して上清を集め、予め50mM燐酸緩衝液中で平衡化したハ
イドロキシアパタイトカラム（６×22cm）に負荷し、同
緩衝液中で食塩濃度を０→1.5Mまで直線的に上昇させる
ことにより溶出させた。コンドロイチン硫酸Ｃ及びＢを
基質として酵素活性を測定し、食塩濃度0.3−0.53Mで溶
出するChase CとChase B II画分（１）及び0.55−0.8M
に溶出するChase A C III画分（２）を分取し、それぞ
れの画分を限外過膜を用いて濃縮脱塩し、次いで50mM
トリスー酢酸緩衝液に置換した。両活性画分はそれぞれ
同緩衝液で平衡化した硫酸化セルロファインカラム（2.
5×30cm）に負荷し、同緩衝液中で食塩濃度を０→0.5M
まで直線的に上昇させて、画分（１）では0.3−0.33Mに
Chase B IIを、0.4−0.45MにChase Cを溶出、分取し
た。また、画分（２）についても同条件下で溶出を行な
い、0.3−0.4M食塩濃度で溶出する活性画分を回収し
た。
得られたそれぞれ３酵素の画分について、10mlまで限
外過膜濃縮を行なった後、それぞれをセファクリルＳ
−200カラム（3.8×100cmに負荷し、0.2M食塩を含む50m
Mトリス−酢酸緩衝液でゲル過を行ない、それぞれの
活性画分を集め、限外過膜を用いて濃縮脱塩し、目的
の酵素濃縮液を得た。
外過膜濃縮を行なった後、それぞれをセファクリルＳ
−200カラム（3.8×100cmに負荷し、0.2M食塩を含む50m
Mトリス−酢酸緩衝液でゲル過を行ない、それぞれの
活性画分を集め、限外過膜を用いて濃縮脱塩し、目的
の酵素濃縮液を得た。
各酵素の収量 Chase AC III 960U Chase C 55U Chase B II 68U ［発明の効果］ 本発明によれば、新規コンドロイチン硫酸分解酵素、
Chase AC III、Chase C及びChase B IIを提供すること
ができる。
Chase AC III、Chase C及びChase B IIを提供すること
ができる。
【図面の簡単な説明】 図１は本発明の酵素類の基質特異性を示す図である。Ａ
はChase AC IIIによるコンドロイチン硫酸Ｃ（サメ軟
骨）消化物のHPLC分析における紫外吸収図、ＢはChase
Cによるコンドロイチン硫酸Ｄ（サメヒレ）消化物のHPL
C分析における紫外吸収図、ＣはChase B IIによるコン
ドロイチン硫酸Ｂ（ブタ皮）消化物のHPLC分析における
紫外吸収図を示す。 1:ΔDi−0S,2:ΔDi−6S, 3:ΔDi−4S,4:ΔDi−diSD, 5:ΔDi−diSE,6:Δ４糖以上のオリゴ糖 図２は本発明の酵素類の至適pHを示す図であり、図３は
本発明の酵素類の安定pH範囲を示す図である。図２及び
図３のＡはChase AC III、ＢはChase C、ＣはChase B I
I 図４は本発明の作用至適温度を示す図であり、図５は本
発明の酵素類の温度による失各の条件を示す図である。
図４及び図５のＡはChase AC III、ＢはChase C、ＣはC
hase B II
はChase AC IIIによるコンドロイチン硫酸Ｃ（サメ軟
骨）消化物のHPLC分析における紫外吸収図、ＢはChase
Cによるコンドロイチン硫酸Ｄ（サメヒレ）消化物のHPL
C分析における紫外吸収図、ＣはChase B IIによるコン
ドロイチン硫酸Ｂ（ブタ皮）消化物のHPLC分析における
紫外吸収図を示す。 1:ΔDi−0S,2:ΔDi−6S, 3:ΔDi−4S,4:ΔDi−diSD, 5:ΔDi−diSE,6:Δ４糖以上のオリゴ糖 図２は本発明の酵素類の至適pHを示す図であり、図３は
本発明の酵素類の安定pH範囲を示す図である。図２及び
図３のＡはChase AC III、ＢはChase C、ＣはChase B I
I 図４は本発明の作用至適温度を示す図であり、図５は本
発明の酵素類の温度による失各の条件を示す図である。
図４及び図５のＡはChase AC III、ＢはChase C、ＣはC
hase B II
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:20） (56)参考文献 特開 昭48−91266（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−107587（ＪＰ，Ａ) 特公 昭47−13704（ＪＰ，Ｂ２) ＣＡＲＢＯＨＹＤＲ．ＲＥＳ．，88 （２）（1981），Ｐ291−303 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/88 C12N 1/20 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】下記の理化学的性質を有するコンドロイチ
ン硫酸分解酵素であるコンドロイチナーゼAC III、コン
ドロイチナーゼＣ及びコンドロイチナーゼB II。 作 用 いずれの酵素もコンドロイチン硫酸の糖鎖のヘキソサミ
ニド結合に作用するリアーゼであり、切断部の断端のウ
ロン酸の４位と５位の炭素の間に２重結合を形成する。 基質特異性 コンドロイチナーゼAC III:ヒアルロン酸に作用して不
飽和２糖及び不飽和オリゴ糖を生成する。コンドロイチ
ン硫酸に作用してΔDi−OS、ΔDi−6S及びΔDi−4Sを生
成するが、ΔDi−diSを生成しない。 コンドロイチナーゼC:ヒアルロン酸に作用せず、コンド
ロイチン硫酸に作用してΔDi−6S及びΔDi−diSDを生成
する。ガラクトサミンの４位が硫酸化されている不飽和
２糖を生成しない。 コンドロイチナーゼB II:コンドロイチン硫酸Ｂに作用
してΔDi−4S 及びΔDi−diSEを生成する。 至適pH（50mMトリスー酢酸、トリスー塩酸及びグリシ
ン緩衝液、37℃反応） コンドロイチナーゼAC III:6.0−7.0 コンドロイチナーゼ C :8.0−9.0 コンドロイチナーゼB II :8.0−9.0 安定pH範囲（100mMトリスー酢酸、トリスー塩酸及び
グリシン緩衝液、37℃、30分処理） コンドロイチナーゼAC III:6.0− 9.5 コンドロイチナーゼ C :5.5− 8.0 コンドロイチナーゼB II :6.5−11.0 作用至適温度（50mMトリスー酢酸緩衝液、pH7.0） コンドロイチナーゼAC III:40℃ コンドロイチナーゼ C :50℃ コンドロイチナーゼB II :50℃ 安定温度範囲（50mMトリスー酢酸緩衝液、pH7.0、60
分処理） コンドロイチナーゼAC III:30℃以下 コンドロイチナーゼ C :40℃以下 コンドロイチナーゼB II :45℃以下 阻害及び活性化 コンドロイチナーゼAC III:Ba2+,Ca2+で賦活され、C
o2+,Zn2+で阻害される。 コンドロイチナーゼC:Ba2+で賦活され、Co2+,Mn2+,Zn2+
で阻害される。 コンドロイチナーゼB II:K+,Na+,Ca2+,SO4 2-,PO4 3-で賦
活され、Ba2+,Co2+,Mg2+,Mn2+,Zn2+,EDTAで阻害され
る。 - 【請求項２】請求項（１）記載のコンドロイチナーゼAC
III、コンドロイチナーゼＣ及びコンドロイチナーゼB
II産生能を有するフラボバクテリウムsp Hp102株。 - 【請求項３】フラボバクテリウム属に属するコンドロイ
チナーゼAC III、コンドロイチナーゼＣ及びコンドロイ
チナーゼB II産生菌を培養し、その培養液又は菌体内に
コンドロイチナーゼAC III、コンドロイチナーゼＣ及び
／又はコンドロイチナーゼB IIを生成蓄積させ、これを
採取することを特徴とする請求項（１）記載のコンドロ
イチナーゼAC III、コンドロイチナーゼＣ及び／又はコ
ンドロイチナーゼB IIの製造法。 - 【請求項４】コンドロイチナーゼAC III、コンドロイチ
ナーゼＣ及びコンドロイチナーゼB II産生菌がフラボバ
クテリウムsp Hp102株であることを特徴とする請求項
（３）に記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21601789A JP2919496B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | 新規コンドロイチン硫酸分解酵素、それらを産生する微生物並びにそれらの製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21601789A JP2919496B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | 新規コンドロイチン硫酸分解酵素、それらを産生する微生物並びにそれらの製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0380079A JPH0380079A (ja) | 1991-04-04 |
| JP2919496B2 true JP2919496B2 (ja) | 1999-07-12 |
Family
ID=16681998
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21601789A Expired - Fee Related JP2919496B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | 新規コンドロイチン硫酸分解酵素、それらを産生する微生物並びにそれらの製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2919496B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6001630A (en) * | 1992-06-26 | 1999-12-14 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Pharmaceutical compositions of chondroitinase ABC isolated from Proteus vulgaris ATCC 6896 |
| US5773277A (en) * | 1992-06-26 | 1998-06-30 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Crystalline chondroitinase isolated from Proteus vulgaris ATCC 6896 |
| US5496718A (en) * | 1992-06-26 | 1996-03-05 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Chondroitinase ABC isolated from proteus vulgaris ATCC 6896 |
| US6596303B1 (en) | 1999-03-22 | 2003-07-22 | Mars Incorporated | Pet food for maintenance of joint health and alleviation of arthritic symptoms in companion animals |
-
1989
- 1989-08-24 JP JP21601789A patent/JP2919496B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＣＡＲＢＯＨＹＤＲ．ＲＥＳ．，８８（２）（１９８１），Ｐ２９１−３０３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0380079A (ja) | 1991-04-04 |
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Legal Events
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
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