JP2863338B2 - Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼの製造方法 - Google Patents
Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼの製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＬ−フコースデヒドロゲ
ナーゼの製造方法に関する。更に詳しくは細菌を培養し
て、その培養物よりＬ−フコースデヒドロゲナーゼを製
造する方法に関する。
ナーゼの製造方法に関する。更に詳しくは細菌を培養し
て、その培養物よりＬ−フコースデヒドロゲナーゼを製
造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−フコースは生体内の複合糖鎖の非還
元末端に存在してその物質の抗原性や情報伝達に関与す
るなどの機能を持つほか、胃、腸、粘液や海藻フコイダ
ンの構成糖としても存在する。また、悪性疾患患者の血
清中の結合型Ｌ−フコースが増加するという報告〔キャ
ンサー リサーチ（ Cancer Research )、第３７巻、第
４１０１〜４１０３頁（１９７７）〕や、肝硬変、悪性
疾患患者において尿中遊離型Ｌ−フコースが増加すると
いう報告〔クリニカル ケミストリー( ClinicalChemis
try ）、第３６巻、第３号、第４７４〜４７６頁（１９
９０）〕もある。つまり、尿、血清、粘液など様々な試
料中のＬ−フコースを測定することにより、病態や生体
内でのＬ−フコースの代謝変化などの情報が得られる。
Ｌ−フコースの測定方法は化学法やＨＰＬＣによる方
法、酵素法等があるが、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ
を用いた酵素法が最も迅速簡便である。Ｌ−フコースデ
ヒドロゲナーゼとしてはシュードモナド（ Pseudomonad
)由来〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー ( Journal of BiologicalChemistry ) 、第２４０
巻、第１１号、第４４９３〜４４９７頁（１９６
５）〕、ブタ肝臓由来〔ジャーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー、第２４４巻、第４７８５〜４７９
２頁（１９６９）〕、シュードモナス（ Pseudomonas )
由来〔アグリカルチュラル アンドバイオロジカル ケ
ミストリー ( Agricultural and Biological Chemistry
)、第３９巻、第１１号、第２２２７〜２２３４頁（１
９７５）〕、羊肝臓由来〔アーカイブズ オブ バイオ
ケミストリーアンド バイオフィジクス ( Archieves o
f Biochemistry and Biophysics ) 、第１３９巻、第８
３〜８６頁（１９７０）〕、ウサギ肝臓由来〔ジャーナ
ル オブ バイオケミストリー、第８６巻、第１５５９
〜１５６５頁（１９７９）〕、プルラリア ( Pullulari
a ）由来〔カナディアン ジャーナル オブ ミクロバ
イオロジー ( Canadian Journal of Microbiology ) 、
第３０巻、第７５３〜７５７頁（１９８４）〕、コリネ
バクテリウム ( Corynebacterium )由来（特開昭６２−
１５５０８５号）、シュードモナス由来〔アグリカルチ
ュラル アンドバイオロジカル ケミストリー、第５３
巻、第６号、第１４９３〜１５０１頁（１９８９）〕の
ものが知られており、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼは
Ｌ−フコースの定量に広く用いられている非常に有用な
酵素である〔アグリカルチュラルアンド バイオロジカ
ル ケミストリー、第３９巻、第１１号、第２２２７〜
２２３４頁（１９７５）、ジャーナル オブ バイオケ
ミストリー、第８６巻、第１５５９〜１５６５頁（１９
７９）〕。
元末端に存在してその物質の抗原性や情報伝達に関与す
るなどの機能を持つほか、胃、腸、粘液や海藻フコイダ
ンの構成糖としても存在する。また、悪性疾患患者の血
清中の結合型Ｌ−フコースが増加するという報告〔キャ
ンサー リサーチ（ Cancer Research )、第３７巻、第
４１０１〜４１０３頁（１９７７）〕や、肝硬変、悪性
疾患患者において尿中遊離型Ｌ−フコースが増加すると
いう報告〔クリニカル ケミストリー( ClinicalChemis
try ）、第３６巻、第３号、第４７４〜４７６頁（１９
９０）〕もある。つまり、尿、血清、粘液など様々な試
料中のＬ−フコースを測定することにより、病態や生体
内でのＬ−フコースの代謝変化などの情報が得られる。
Ｌ−フコースの測定方法は化学法やＨＰＬＣによる方
法、酵素法等があるが、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ
を用いた酵素法が最も迅速簡便である。Ｌ−フコースデ
ヒドロゲナーゼとしてはシュードモナド（ Pseudomonad
)由来〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー ( Journal of BiologicalChemistry ) 、第２４０
巻、第１１号、第４４９３〜４４９７頁（１９６
５）〕、ブタ肝臓由来〔ジャーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー、第２４４巻、第４７８５〜４７９
２頁（１９６９）〕、シュードモナス（ Pseudomonas )
由来〔アグリカルチュラル アンドバイオロジカル ケ
ミストリー ( Agricultural and Biological Chemistry
)、第３９巻、第１１号、第２２２７〜２２３４頁（１
９７５）〕、羊肝臓由来〔アーカイブズ オブ バイオ
ケミストリーアンド バイオフィジクス ( Archieves o
f Biochemistry and Biophysics ) 、第１３９巻、第８
３〜８６頁（１９７０）〕、ウサギ肝臓由来〔ジャーナ
ル オブ バイオケミストリー、第８６巻、第１５５９
〜１５６５頁（１９７９）〕、プルラリア ( Pullulari
a ）由来〔カナディアン ジャーナル オブ ミクロバ
イオロジー ( Canadian Journal of Microbiology ) 、
第３０巻、第７５３〜７５７頁（１９８４）〕、コリネ
バクテリウム ( Corynebacterium )由来（特開昭６２−
１５５０８５号）、シュードモナス由来〔アグリカルチ
ュラル アンドバイオロジカル ケミストリー、第５３
巻、第６号、第１４９３〜１５０１頁（１９８９）〕の
ものが知られており、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼは
Ｌ−フコースの定量に広く用いられている非常に有用な
酵素である〔アグリカルチュラルアンド バイオロジカ
ル ケミストリー、第３９巻、第１１号、第２２２７〜
２２３４頁（１９７５）、ジャーナル オブ バイオケ
ミストリー、第８６巻、第１５５９〜１５６５頁（１９
７９）〕。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｌ−
フコースデヒドロゲナーゼを工業的に安価に製造する新
しい方法を提供することにある。
フコースデヒドロゲナーゼを工業的に安価に製造する新
しい方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明はＬ−フコースデヒドロゲナーゼの製造方法に関す
るものであって、アルスロバクター属に属し、Ｌ−フコ
ースデヒドロゲナーゼ生産能を有する微生物を培養し、
培養物からＬ−フコースデヒドロゲナーゼを採取するこ
とからなる。
発明はＬ−フコースデヒドロゲナーゼの製造方法に関す
るものであって、アルスロバクター属に属し、Ｌ−フコ
ースデヒドロゲナーゼ生産能を有する微生物を培養し、
培養物からＬ−フコースデヒドロゲナーゼを採取するこ
とからなる。
【０００５】本発明で用いられるアルスロバクター ( A
rthrobacter ) 属に属する細菌はＬ−フコースデヒドロ
ゲナーゼを培養物中に著量生産することが可能で、また
後述するごとく非常に精製が容易であり、かつ優れた性
質を有している。
rthrobacter ) 属に属する細菌はＬ−フコースデヒドロ
ゲナーゼを培養物中に著量生産することが可能で、また
後述するごとく非常に精製が容易であり、かつ優れた性
質を有している。
【０００６】まず、本発明に使用される菌株としては、
アルスロバクター属に属するＬ−フコースデヒドロゲナ
ーゼ生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよ
く、またこれらの菌株の変異株でも良い。そして、アル
スロバクター属に属しＬ−フコースデヒドロゲナーゼ生
産能を有する菌株の具体例としては、例えばアルスロバ
クター オキシダンス ( Arthrobacter oxidans ) Ｆ１
が挙げられる。本菌は、土壌中より本発明者らが新たに
検索して得た菌株で、その菌学的性質は次のとおりであ
る。
アルスロバクター属に属するＬ−フコースデヒドロゲナ
ーゼ生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよ
く、またこれらの菌株の変異株でも良い。そして、アル
スロバクター属に属しＬ−フコースデヒドロゲナーゼ生
産能を有する菌株の具体例としては、例えばアルスロバ
クター オキシダンス ( Arthrobacter oxidans ) Ｆ１
が挙げられる。本菌は、土壌中より本発明者らが新たに
検索して得た菌株で、その菌学的性質は次のとおりであ
る。
【０００７】ａ）形態的性質 顕微鏡的観察（肉汁寒天培地上で３０℃で培養） （１）細胞の形及び大きさ 通常細胞の大きさは０．３〜０．５×３〜５μｍ、直線
状あるいは若干湾曲した桿菌であり片端あるいは両端が
クラブ状に曲がったものもあり多形成である。 （２）運動性の有無：なし （３）周鞭毛の有無：なし （４）グラム染色性：陽性 （５）胞子の有無 ：なし （６）抗酸性 ：陰性
状あるいは若干湾曲した桿菌であり片端あるいは両端が
クラブ状に曲がったものもあり多形成である。 （２）運動性の有無：なし （３）周鞭毛の有無：なし （４）グラム染色性：陽性 （５）胞子の有無 ：なし （６）抗酸性 ：陰性
【０００８】ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養：３０℃の培養で直径２〜４mm
の凸円形コロニーを形成する。表面及び周縁は滑らかで
ある。コロニーの色は、白黄色不透明で光沢がある。 （２）肉汁寒天斜面培養：３０℃培養で拡幅によく生育
する。 （３）肉汁ゼラチン穿刺培養：２０℃静置培養で表面及
び穿刺線に沿って生育し、ゆっくりとゼラチンを液化す
る。
の凸円形コロニーを形成する。表面及び周縁は滑らかで
ある。コロニーの色は、白黄色不透明で光沢がある。 （２）肉汁寒天斜面培養：３０℃培養で拡幅によく生育
する。 （３）肉汁ゼラチン穿刺培養：２０℃静置培養で表面及
び穿刺線に沿って生育し、ゆっくりとゼラチンを液化す
る。
【０００９】ｃ）生理学的性質 （１）カタラーゼ ：陽性 （２）デンプンの加水分解：陽性 （３）最適生育条件 ：２２℃〜３７℃、 pH ６．
０〜８．５ （４）酸素に対する態度 ：好気性 （５）ＤＮＡのＧＣ含量 ：６０％（Ｔｍ法による） （６）ペプチドグリカンタイプ：Ａ３α、Ｌｙｓ−Ｓｅ
ｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ
０〜８．５ （４）酸素に対する態度 ：好気性 （５）ＤＮＡのＧＣ含量 ：６０％（Ｔｍ法による） （６）ペプチドグリカンタイプ：Ａ３α、Ｌｙｓ−Ｓｅ
ｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ
【００１０】上記したごとく本菌はその性状より、バー
ジーズ マニュアル オブ システマティック バクテ
リオロジー( Bergey′s Manual of Systematic Bacter
iology )、第２巻（１９８６）と対比すると、アルスロ
バクター オキシダンスと認められる。
ジーズ マニュアル オブ システマティック バクテ
リオロジー( Bergey′s Manual of Systematic Bacter
iology )、第２巻（１９８６）と対比すると、アルスロ
バクター オキシダンスと認められる。
【００１１】なお本菌株はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ
ｏｘｉｄａｎｓ Ｆ１と表示され工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条寄第３６７４号（ＦＥＲＭ ＢＰ
−３６７４）として寄託されている。
ｏｘｉｄａｎｓ Ｆ１と表示され工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条寄第３６７４号（ＦＥＲＭ ＢＰ
−３６７４）として寄託されている。
【００１２】本発明において培地に加える栄養源は、使
用する菌株が利用し、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼを
生産するものであればよく、炭素源としては、例えばＬ
−フコース、Ｄ−アラビノース、グリセロール、Ｄ−グ
ルコース、シュクロース、マルトース、ラクトース、ク
エン酸、酢酸などが利用でき、窒素源としてはペプト
ン、酵母エキス、コーンスティープリカー、肉エキス、
硫安、塩化アンモニウムなどが適当である。そのほかに
リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム
塩、鉄塩などの無機質及び金属塩類を加えても良い。な
お、本発明のＬ−フコースデヒドロゲナーゼは誘導酵素
である故Ｌ−フコースを培地に添加すれば著しく酵素生
産量が増大する。例えばＬ−フコース０．１％添加によ
り無添加に比べて約１００倍のＬ−フコースデヒドロゲ
ナーゼが生産される。
用する菌株が利用し、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼを
生産するものであればよく、炭素源としては、例えばＬ
−フコース、Ｄ−アラビノース、グリセロール、Ｄ−グ
ルコース、シュクロース、マルトース、ラクトース、ク
エン酸、酢酸などが利用でき、窒素源としてはペプト
ン、酵母エキス、コーンスティープリカー、肉エキス、
硫安、塩化アンモニウムなどが適当である。そのほかに
リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム
塩、鉄塩などの無機質及び金属塩類を加えても良い。な
お、本発明のＬ−フコースデヒドロゲナーゼは誘導酵素
である故Ｌ−フコースを培地に添加すれば著しく酵素生
産量が増大する。例えばＬ−フコース０．１％添加によ
り無添加に比べて約１００倍のＬ−フコースデヒドロゲ
ナーゼが生産される。
【００１３】Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培
養するに当り、生産量は培養条件により大きく変動する
が、一般に培養温度は２０〜３５℃、培地の pH ５．５
〜８．５が良く１０〜３０時間の通気かくはん培養で本
発明によるＬ−フコースデヒドロゲナーゼの生産は最高
に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成などに応
じ、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼの生産量が最大にな
るように設定するのが当然である。
養するに当り、生産量は培養条件により大きく変動する
が、一般に培養温度は２０〜３５℃、培地の pH ５．５
〜８．５が良く１０〜３０時間の通気かくはん培養で本
発明によるＬ−フコースデヒドロゲナーゼの生産は最高
に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成などに応
じ、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼの生産量が最大にな
るように設定するのが当然である。
【００１４】本発明の菌によって生産されたＬ−フコー
スデヒドロゲナーゼは菌体内に存在するので、培養物を
固液分離し、得られた湿菌体から通常用いられる超音波
処理、フレンチプレス、ダイノミルなどの種々の破壊手
段を用いて菌体を破壊、あるいはリゾチームなどの細胞
壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解すると無細胞抽出
液が得られる。次に、この抽出液から通常用いられる精
製手段により精製酵素標品を得ることができる。例え
ば、塩析、除核酸、イオン交換カラムクロマト、疎水結
合カラムクロマト、ゲルろ過、アフィニティーカラムク
ロマトなどにより精製を行い、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動的に単一な精製Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ
を得ることができる。
スデヒドロゲナーゼは菌体内に存在するので、培養物を
固液分離し、得られた湿菌体から通常用いられる超音波
処理、フレンチプレス、ダイノミルなどの種々の破壊手
段を用いて菌体を破壊、あるいはリゾチームなどの細胞
壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解すると無細胞抽出
液が得られる。次に、この抽出液から通常用いられる精
製手段により精製酵素標品を得ることができる。例え
ば、塩析、除核酸、イオン交換カラムクロマト、疎水結
合カラムクロマト、ゲルろ過、アフィニティーカラムク
ロマトなどにより精製を行い、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動的に単一な精製Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ
を得ることができる。
【００１５】本発明により得られるＬ−フコースデヒド
ロゲナーゼの酵素化学的及び理化学的性質は次のとおり
である。
ロゲナーゼの酵素化学的及び理化学的性質は次のとおり
である。
【００１６】（１）作用：本酵素は下記反応式（化１）
のごとく、Ｌ−フコースを酸化して、Ｌ−フコノ−δ−
ラクトンを生成する。
のごとく、Ｌ−フコースを酸化して、Ｌ−フコノ−δ−
ラクトンを生成する。
【化１】Ｌ−フコース＋ＮＡＤ+ 又はＮＡＤＰ+ → Ｌ
−フコノ−δ−ラクトン＋ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ＋Ｈ
+
−フコノ−δ−ラクトン＋ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ＋Ｈ
+
【００１７】（２）基質特異性：３mMのリン酸を含む１
２５mM グリシン−ＮａＯＨ緩衝液中で補酵素にＮＡＤ
+ を用いて各種の糖に対する反応速度を調べると、本酵
素はＬ−フコースに最もよく作用しＬ−ガラクトースや
Ｄ−アラビノースにも作用する（表１）。
２５mM グリシン−ＮａＯＨ緩衝液中で補酵素にＮＡＤ
+ を用いて各種の糖に対する反応速度を調べると、本酵
素はＬ−フコースに最もよく作用しＬ−ガラクトースや
Ｄ−アラビノースにも作用する（表１）。
【００１８】
【表１】 表 １ ──────────────────────────────────── 基 質（１０mM） 相 対 活 性（％） ──────────────────────────────────── Ｌ−フコース １００ Ｌ−ガラクトース ８３ Ｄ−アラビノース ４９ Ｄ−リキソース ２．０ Ｌ−リボース ０．５＞ Ｌ−アロース ０．５＞ Ｌ−グルコース ０．５＞ Ｌ−キシロース ０．５＞ ──────────────────────────────────── Ｄ−フコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−アラビノース、 Ｌ−リキソース、Ｄ−リボース、Ｄ−グルコース、 Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−マンノース、 Ｌ−ラムノース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−フラクトース ０ ────────────────────────────────────
【００１９】また本酵素は補酵素としてＮＡＤ+ あるい
はＮＡＤＰ+ を使用することができる。相対活性比は上
記緩衝液中でＬ−フコース（１０mM）を基質に用いた場
合（ＮＡＤ+ ）：（ＮＡＤＰ+ ）＝１００：２２の反応
速度を示す。
はＮＡＤＰ+ を使用することができる。相対活性比は上
記緩衝液中でＬ−フコース（１０mM）を基質に用いた場
合（ＮＡＤ+ ）：（ＮＡＤＰ+ ）＝１００：２２の反応
速度を示す。
【００２０】（３）至適pH及びpH安定性：本酵素の至適
pHは基質にＬ−フコースとＮＡＤ+ を用い、５０mMのブ
リトンとロビンソンの緩衝液を用いると pH ７．２〜
７．４付近にある（図１）。また本酵素を３０℃におい
てそれぞれのpHで６０分間処理した時は pH ６．０〜１
０．５まで安定であった（図３）。なお図１及び図３に
おいて、横軸はpH、縦軸は相対活性（％）を示す。
pHは基質にＬ−フコースとＮＡＤ+ を用い、５０mMのブ
リトンとロビンソンの緩衝液を用いると pH ７．２〜
７．４付近にある（図１）。また本酵素を３０℃におい
てそれぞれのpHで６０分間処理した時は pH ６．０〜１
０．５まで安定であった（図３）。なお図１及び図３に
おいて、横軸はpH、縦軸は相対活性（％）を示す。
【００２１】（４）至適温度及び熱安定性：本酵素は４
３℃に至適温度を有している（図２）。また本酵素を p
H ８．０においてそれぞれの温度で１０分間処理したと
き４０℃まで安定であった（図４）。なお図２及び図４
において、横軸は温度（℃）、縦軸は相対活性（％）を
示す。
３℃に至適温度を有している（図２）。また本酵素を p
H ８．０においてそれぞれの温度で１０分間処理したと
き４０℃まで安定であった（図４）。なお図２及び図４
において、横軸は温度（℃）、縦軸は相対活性（％）を
示す。
【００２２】（５）分子量：本酵素の分子量をポリアク
リルアミドゲル電気泳動法により求めると、約３９６０
０であった。
リルアミドゲル電気泳動法により求めると、約３９６０
０であった。
【００２３】（６）等電点：IsogelアガロースＩＥＦプ
レートpH範囲３〜７を用いて等電点電気泳動を行ったと
ころ本酵素の等電点は３．６であった。
レートpH範囲３〜７を用いて等電点電気泳動を行ったと
ころ本酵素の等電点は３．６であった。
【００２４】（７）金属塩の影響：本酵素は表２に示す
様に、ＨｇＣｌ2 、ＡｇＣｌ2 、ＣｄＣｌ2 により強く
阻害された。その他の２価の陽イオンにより少し阻害さ
れた。
様に、ＨｇＣｌ2 、ＡｇＣｌ2 、ＣｄＣｌ2 により強く
阻害された。その他の２価の陽イオンにより少し阻害さ
れた。
【００２５】
【表２】 表 ２ ──────────────────────────────── 金 属 塩（１mM） 相 対 活 性（％） ──────────────────────────────── ＨｇＣｌ2 、ＡｇＣｌ2 ０ ＣｄＣｌ2 ２．４ ＺｎＣｌ2 ５８ ＦｅＣｌ3 ６４ ＣｏＣｌ2 ７４ ＣｕＣｌ2 ７５ ＣａＣｌ2 ７７ ＮｉＣｌ2 ８２ ＭｇＣｌ2 ８４ ＭｎＣｌ2 ８７ ＮａＣｌ ９９ ＫＣｌ ９９ ───────────────────────────────
【００２６】（８）ｋｍ値：３mMのリン酸を含む１２５
mMのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液 pH ８．０を用いてライ
ンウイバ−バーク（ Lineweaver-Burk )プロットにより
本酵素のｋｍ値を求めた。Ｌ−フコースに対するｋｍ値
はＮＡＤ+ を補酵素とした場合は０．６９mM、ＮＡＤＰ
+ を補酵素とした場合は０．０３５mMであった。また、
Ｌ−フコースを基質に用いた場合ＮＡＤ+ に対するｋｍ
値は０．２７mM、ＮＡＤＰ+ に対するｋｍ値は０．００
１８mMであった。
mMのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液 pH ８．０を用いてライ
ンウイバ−バーク（ Lineweaver-Burk )プロットにより
本酵素のｋｍ値を求めた。Ｌ−フコースに対するｋｍ値
はＮＡＤ+ を補酵素とした場合は０．６９mM、ＮＡＤＰ
+ を補酵素とした場合は０．０３５mMであった。また、
Ｌ−フコースを基質に用いた場合ＮＡＤ+ に対するｋｍ
値は０．２７mM、ＮＡＤＰ+ に対するｋｍ値は０．００
１８mMであった。
【００２７】（９）酵素活性測定法：Ｌ−フコースデヒ
ドロゲナーゼの活性は次のようにして測定した。すなわ
ち３０mM Ｌ−フコース１．０ml、５mMリン酸を含む２
００mMグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ pH ８．０）１．８
ml、１５mM ＮＡＤ+ ０．１ml及び０．１〜０．３Ｕ／
mlとなる様に希釈した酵素液０．１mlを（反応液総量
３．０ml）混合し、３７℃、１０分間反応させた後、３
４０nmにおける吸光度を測定する（Ｏ．Ｄ．サンプ
ル）。別に対照として酵素溶液の代りに蒸留水０．１ml
を加え同様の操作によって吸光度を測定し（Ｏ．Ｄ．ブ
ランク）、△Ｏ．Ｄ．340 （Ｏ．Ｄ．サンプル−Ｏ．
Ｄ．ブランク）を求めた。Ｌ−フコースデヒドロゲナー
ゼ活性は下記の計算式（数１）によって求められる。
ドロゲナーゼの活性は次のようにして測定した。すなわ
ち３０mM Ｌ−フコース１．０ml、５mMリン酸を含む２
００mMグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ pH ８．０）１．８
ml、１５mM ＮＡＤ+ ０．１ml及び０．１〜０．３Ｕ／
mlとなる様に希釈した酵素液０．１mlを（反応液総量
３．０ml）混合し、３７℃、１０分間反応させた後、３
４０nmにおける吸光度を測定する（Ｏ．Ｄ．サンプ
ル）。別に対照として酵素溶液の代りに蒸留水０．１ml
を加え同様の操作によって吸光度を測定し（Ｏ．Ｄ．ブ
ランク）、△Ｏ．Ｄ．340 （Ｏ．Ｄ．サンプル−Ｏ．
Ｄ．ブランク）を求めた。Ｌ−フコースデヒドロゲナー
ゼ活性は下記の計算式（数１）によって求められる。
【００２８】
【数１】 単位／ml＝〔（△Ｏ．Ｄ．340 ×３．０＜ml＞）／（６．２２×１０＜分＞× ０．１＜ml＞×ｄ）〕×ｄｆ ６．２２：３４０nmにおけるＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数 ｄ：光路長（cm) ｄｆ：希釈率
【００２９】なお、アルスロバクター オキシダンスＦ
１はα−フコシダーゼも生産する。α−Ｌ−フコシダー
ゼはα−Ｌ−フコシド結合に作用して、Ｌ−フコースを
遊離させる酵素で、細菌、カビ、放線菌、植物、軟体動
物、ほ乳類に見出されている。一方、高等動物由来の糖
タンパク質、糖脂質等の複合糖質中の糖鎖部分には、α
−Ｌ−フコシル基が頻繁に見出されており、これらの糖
鎖の構造と機能の関係を研究するためにα−Ｌ−フコシ
ダーゼが使用されている。また、複合糖質に含まれてい
るＬ−フコースはα−Ｌ−フコシダーゼで処理すること
により、遊離型のＬ−フコースとして定量することがで
きる。最近、α−Ｌ−フコシダーゼの製造に関する報告
がいくつかあり〔アグリカルチュラル アンド バイオ
ロジカル ケミストリー、第４９巻、第３１７９頁（１
９８５）（特開昭６２−１５５０８６号）〕、これらの
酵素は糖鎖の構造解析や、糖鎖中に含まれるＬ−フコー
スの遊離、定量に利用されている。
１はα−フコシダーゼも生産する。α−Ｌ−フコシダー
ゼはα−Ｌ−フコシド結合に作用して、Ｌ−フコースを
遊離させる酵素で、細菌、カビ、放線菌、植物、軟体動
物、ほ乳類に見出されている。一方、高等動物由来の糖
タンパク質、糖脂質等の複合糖質中の糖鎖部分には、α
−Ｌ−フコシル基が頻繁に見出されており、これらの糖
鎖の構造と機能の関係を研究するためにα−Ｌ−フコシ
ダーゼが使用されている。また、複合糖質に含まれてい
るＬ−フコースはα−Ｌ−フコシダーゼで処理すること
により、遊離型のＬ−フコースとして定量することがで
きる。最近、α−Ｌ−フコシダーゼの製造に関する報告
がいくつかあり〔アグリカルチュラル アンド バイオ
ロジカル ケミストリー、第４９巻、第３１７９頁（１
９８５）（特開昭６２−１５５０８６号）〕、これらの
酵素は糖鎖の構造解析や、糖鎖中に含まれるＬ−フコー
スの遊離、定量に利用されている。
【００３０】本発明で用いられているアルスロバクター
属に属する細菌は該菌株を培養することにより、培養物
中に著量のα−Ｌ−フコシダーゼを生産することが可能
で、精製も容易である。また生産されるα−Ｌ−フコシ
ダーゼも酵素学的に優れた性質を有している。
属に属する細菌は該菌株を培養することにより、培養物
中に著量のα−Ｌ−フコシダーゼを生産することが可能
で、精製も容易である。また生産されるα−Ｌ−フコシ
ダーゼも酵素学的に優れた性質を有している。
【００３１】α−Ｌ−フコシダーゼの生産菌株として
は、アルスロバクター属に属するα−Ｌ−フコシダーゼ
生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよく、ま
たこれらの菌株の変異株でも良い。そして、アルスロバ
クター属に属しα−Ｌ−フコシダーゼ生産能を有する菌
株の具体例がアルスロバクター オキシダンスＦ１であ
る。α−Ｌ−フコシダーゼの製造において培地に加える
栄養源は、使用する菌株が利用し、α−Ｌ−フコシダー
ゼを生産するものであればよく、炭素源としては、例え
ばＬ−フコース、Ｄ−アラビノース、グリセロール、Ｄ
−グルコース、シュクロース、マルトース、ラクトー
ス、クエン酸、酢酸などが利用でき、窒素源としてはペ
プトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、肉エキ
ス、硫安、塩化アンモニウムなどが適当である。そのほ
かにリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウ
ム塩、鉄塩など無機質及び金属塩類を加えても良い。
は、アルスロバクター属に属するα−Ｌ−フコシダーゼ
生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよく、ま
たこれらの菌株の変異株でも良い。そして、アルスロバ
クター属に属しα−Ｌ−フコシダーゼ生産能を有する菌
株の具体例がアルスロバクター オキシダンスＦ１であ
る。α−Ｌ−フコシダーゼの製造において培地に加える
栄養源は、使用する菌株が利用し、α−Ｌ−フコシダー
ゼを生産するものであればよく、炭素源としては、例え
ばＬ−フコース、Ｄ−アラビノース、グリセロール、Ｄ
−グルコース、シュクロース、マルトース、ラクトー
ス、クエン酸、酢酸などが利用でき、窒素源としてはペ
プトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、肉エキ
ス、硫安、塩化アンモニウムなどが適当である。そのほ
かにリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウ
ム塩、鉄塩など無機質及び金属塩類を加えても良い。
【００３２】またα−Ｌ−フコシダーゼもＬ−フコース
デヒドロゲナーゼと同じ誘導酵素である故、Ｌ−フコー
スを培地に添加すれば著しく酵素生産量が増大する。例
えばＬ−フコース０．１％添加により無添加に比べて約
１００倍のα−Ｌ−フコシダーゼが生産される。α−Ｌ
−フコシダーゼ生産菌を培養するに当り、生産量は培養
条件により大きく変動するが、一般に培養温度は２０〜
３５℃、培地の pH ５．５〜８．５が良く、１０〜３０
時間の通気かくはん培養でα−Ｌ−フコシダーゼの生産
は最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成な
どに応じ、α−Ｌ−フコシダーゼの生産量が最大になる
ように設定すれば良い。α−Ｌ−フコシダーゼ生産菌に
よって生産されたα−Ｌ−フコシダーゼは菌体内に存在
するので、培養物を固液分離し、得られた湿菌体から通
常用いられる超音波処理、フレンチプレス、ダイノミル
などの種々の破壊手段を用いて菌体を破壊、あるいはリ
ゾチームなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶
解すると無細胞抽出液が得られる。次に、この抽出液か
ら通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得るこ
とができる。例えば、塩析、除核酸、イオン交換カラム
クロマト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過、アフィ
ニティーカラムクロマトなどにより精製を行い、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動的に単一な精製α−Ｌ−フコ
シダーゼを得ることができる。
デヒドロゲナーゼと同じ誘導酵素である故、Ｌ−フコー
スを培地に添加すれば著しく酵素生産量が増大する。例
えばＬ−フコース０．１％添加により無添加に比べて約
１００倍のα−Ｌ−フコシダーゼが生産される。α−Ｌ
−フコシダーゼ生産菌を培養するに当り、生産量は培養
条件により大きく変動するが、一般に培養温度は２０〜
３５℃、培地の pH ５．５〜８．５が良く、１０〜３０
時間の通気かくはん培養でα−Ｌ−フコシダーゼの生産
は最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成な
どに応じ、α−Ｌ−フコシダーゼの生産量が最大になる
ように設定すれば良い。α−Ｌ−フコシダーゼ生産菌に
よって生産されたα−Ｌ−フコシダーゼは菌体内に存在
するので、培養物を固液分離し、得られた湿菌体から通
常用いられる超音波処理、フレンチプレス、ダイノミル
などの種々の破壊手段を用いて菌体を破壊、あるいはリ
ゾチームなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶
解すると無細胞抽出液が得られる。次に、この抽出液か
ら通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得るこ
とができる。例えば、塩析、除核酸、イオン交換カラム
クロマト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過、アフィ
ニティーカラムクロマトなどにより精製を行い、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動的に単一な精製α−Ｌ−フコ
シダーゼを得ることができる。
【００３３】得られるα−Ｌ−フコシダーゼの酵素化学
的及び理化学的性質は次のとおりである。 （１）作用：
的及び理化学的性質は次のとおりである。 （１）作用：
【００３４】
【化２】
【００３５】本酵素は上記反応式（化２）のごとく、α
−Ｌ−フコシドに作用して、Ｌ−フコースを遊離する。
−Ｌ−フコシドに作用して、Ｌ−フコースを遊離する。
【００３６】（２）基質特異性：合成基質ではｐ−ニト
ロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシドに作用する。他の
ｐ−ニトロフェニル糖化合物（ｐ−ニトロフェニル−β
−Ｌ−フコピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−
グルコピラノシドなど）には全く作用しない。また天然
基質では、人乳由来の２′−フコシルラクトースや、ブ
タ顎下腺ムチンの糖鎖などに作用する。
ロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシドに作用する。他の
ｐ−ニトロフェニル糖化合物（ｐ−ニトロフェニル−β
−Ｌ−フコピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−
グルコピラノシドなど）には全く作用しない。また天然
基質では、人乳由来の２′−フコシルラクトースや、ブ
タ顎下腺ムチンの糖鎖などに作用する。
【００３７】（３）至適pH及びpH安定性：本酵素の至適
pHは図５の曲線で表されるごとく pH ８．５付近であっ
た。本酵素を２５℃においてそれぞれのpHで６０分間処
理したときのpH安定性を図６に示した。図６より明らか
なように本酵素は pH ５．５〜９．５の間で安定であ
る。なお図５及び図６において、横軸はpH、縦軸は相対
活性（％）を示す。
pHは図５の曲線で表されるごとく pH ８．５付近であっ
た。本酵素を２５℃においてそれぞれのpHで６０分間処
理したときのpH安定性を図６に示した。図６より明らか
なように本酵素は pH ５．５〜９．５の間で安定であ
る。なお図５及び図６において、横軸はpH、縦軸は相対
活性（％）を示す。
【００３８】（４）至適温度及び熱安定性：本酵素の至
適温度は図７の曲線で表されるごとく３４℃に至適温度
を有している。本酵素を pH ８．０においてそれぞれの
温度で６０分間処理したときの熱安定性を図８に示し
た。本酵素は２６℃まで安定であったが５０℃でも約７
０％の残存活性を示した。なお、図７及び図８におい
て、横軸は温度（℃）、縦軸は相対活性（％）を示す。
適温度は図７の曲線で表されるごとく３４℃に至適温度
を有している。本酵素を pH ８．０においてそれぞれの
温度で６０分間処理したときの熱安定性を図８に示し
た。本酵素は２６℃まで安定であったが５０℃でも約７
０％の残存活性を示した。なお、図７及び図８におい
て、横軸は温度（℃）、縦軸は相対活性（％）を示す。
【００３９】（５）分子量：本酵素の分子量はセファク
リルＳ−２００（ファルマシア社製）を用いたゲルろ過
法により求めると約４３０００であった。
リルＳ−２００（ファルマシア社製）を用いたゲルろ過
法により求めると約４３０００であった。
【００４０】（６）等電点：ファルマライト（ pH ３〜
１０、ファルマシア社製）を用いた等電点電気泳動法に
より求めた本酵素の等電点は約３．８であった。
１０、ファルマシア社製）を用いた等電点電気泳動法に
より求めた本酵素の等電点は約３．８であった。
【００４１】（７）金属イオンの影響：本酵素は表３に
示すように、Ａｇ+ 、Ｈｇ2+、及びＣｕ2+などにより強
力に阻害された。
示すように、Ａｇ+ 、Ｈｇ2+、及びＣｕ2+などにより強
力に阻害された。
【００４２】
【表３】 表 ３ 金属イオン（１mM） 相対活性（％） ───────────────────────────── 無添加 １００ Ａｇ+ ０ Ｈｇ2+ ０ Ｃｕ2+ ０ Ｚｎ2+ ９０ Ｎｉ2+ ９４ Ｍｎ2+、Ｍｇ2+、Ｎａ+ 、Ｃａ2+ １００
【００４３】（８）ｋｍ値：ラインウイバー−バーク
プロットにより本酵素のｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−
フコピラノシドに対するｋｍ値を求めたところ０．０４
７mMであった。
プロットにより本酵素のｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−
フコピラノシドに対するｋｍ値を求めたところ０．０４
７mMであった。
【００４４】（９）酵素活性測定法：α−Ｌ−フコシダ
ーゼ活性の測定は次のようにして求めた。すなわち１０
mMｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド０．１
ml、１００mMリン酸緩衝液（ pH ８．５）１．３ml及び
適当に希釈した酵素液０．１ml、反応液量１．５mlで３
７℃、１０分間反応させた後、０．２５Ｍ Ｎａ2 ＣＯ
3の１．５mlを添加して反応を停止させ、４０５nmの吸
光度を測定する（Ｏ．Ｄ．サンプル）。別に対照として
酵素溶液の代りに蒸留水０．１mlを加え同様の操作によ
って吸光度を測定し（Ｏ．Ｄ．ブランク）、△Ｏ．Ｄ．
405 （Ｏ．Ｄ．サンプル−Ｏ．Ｄ．ブランク）を求め
た。α−Ｌ−フコシダーゼ活性は下記の計算式（数２）
によって求められる。
ーゼ活性の測定は次のようにして求めた。すなわち１０
mMｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド０．１
ml、１００mMリン酸緩衝液（ pH ８．５）１．３ml及び
適当に希釈した酵素液０．１ml、反応液量１．５mlで３
７℃、１０分間反応させた後、０．２５Ｍ Ｎａ2 ＣＯ
3の１．５mlを添加して反応を停止させ、４０５nmの吸
光度を測定する（Ｏ．Ｄ．サンプル）。別に対照として
酵素溶液の代りに蒸留水０．１mlを加え同様の操作によ
って吸光度を測定し（Ｏ．Ｄ．ブランク）、△Ｏ．Ｄ．
405 （Ｏ．Ｄ．サンプル−Ｏ．Ｄ．ブランク）を求め
た。α−Ｌ−フコシダーゼ活性は下記の計算式（数２）
によって求められる。
【００４５】
【数２】 単位／ml＝〔（△Ｏ．Ｄ．＜Ｏ．Ｄ．サンプル−Ｏ．Ｄ．ブランク＞×３．０ ＜ml＞）／（１７．８×１０＜分＞×０．１＜ml＞×ｄ）〕×ｄｆ １７．８：ｐ−ニトロフェノールのミリモル分子吸光係数
【００４６】
【実施例】以下に本発明によるＬ−フコースデヒドロゲ
ナーゼの製造方法を実施例をもって示すが、本発明が以
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。なお
％は他に特記せぬ限りｗ／ｖ％である。
ナーゼの製造方法を実施例をもって示すが、本発明が以
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。なお
％は他に特記せぬ限りｗ／ｖ％である。
【００４７】実施例１ Ｌ−フコース０．１％、ペプトン０．５％、ＫＨ２ＰＯ
４の０．３％及びＭｇＳＯ４，・７Ｈ２Ｏの０．０５
％、ｐＨ７．０からなる培地１００ｍｌを分注して殺菌
（１２０℃、２０分間）した５００ｍｌの三角フラスコ
にアルスロバクター オキシダンスＦ１〔微工研条寄第
３６７４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６７４）〕を接種し３
０℃で３０時間培養したところ、この培養物中のＬ−フ
コースデヒドロゲナーゼ活性は１．１単位／１ｍｌであ
った。
４の０．３％及びＭｇＳＯ４，・７Ｈ２Ｏの０．０５
％、ｐＨ７．０からなる培地１００ｍｌを分注して殺菌
（１２０℃、２０分間）した５００ｍｌの三角フラスコ
にアルスロバクター オキシダンスＦ１〔微工研条寄第
３６７４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６７４）〕を接種し３
０℃で３０時間培養したところ、この培養物中のＬ−フ
コースデヒドロゲナーゼ活性は１．１単位／１ｍｌであ
った。
【００４８】実施例２ アルスロバクター オキシダンスＦ１〔微工研条寄第３
６７４号（ＦＥＲＭＢＰ−３６７４）〕を酵母エキス
０．５％、ペプトン１．０％、ＫＨ２ＰＯ４の０．３％
及びＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏの０．１％、ｐＨ７．０から
なる培地６００ｍｌを分注して殺菌（１２０℃、２０分
間）した２リットルの三角フラスコに接種し、３０℃で
２４時間培養して種培養液とした。ペプトン０．５％、
ＫＨ２ＰＯ４の０．３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏの０．
１％、及び消泡剤（日本油脂社製ＣＢ−４４２）０．０
１％、ｐＨ７．０からなる培地１４リットルを３０リッ
トル容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃で２０
分間殺菌した。冷却後、別殺菌（１２０℃、２０分間）
した３％Ｌ−フコース５００ｍｌ及び上記の種培養液６
００ｍｌを接種し、３０℃で２４時間、毎分１０リット
ルの通気量と毎分３００回転のかくはん速度の条件で培
養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集
め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、以下の全操作
はｐＨ８で行った）５００ｍｌに懸濁した後、超音波処
理で菌体を破砕し、この破砕液を遠心分離して上澄液５
４０ｍｌを得た。この上澄液のＬ−フコースデヒドロゲ
ナーゼ活性は、３８．０単位／ｍｌであった。この上澄
液にポリエチレンイミン（２％、ｐＨ７．５）２５ｍｌ
を徐々に添加し、遠心分離をして上澄液を得た。この上
澄液をあらかじめ５０ｍＭリン酸緩衝液で緩衝化したＤ
ＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）
のカラム（直径５．０ｃｍ×長さ１０ｃｍ）に吸着さ
せ、吸着物を０ｍＭから８００ｍＭの塩化ナトリウムで
グラジエント溶出して活性画分を集めた。次にこの活性
画分に、塩化ナトリウムを添加し４Ｍ濃度とした。これ
をあらかじめ４Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩
衝液で緩衝化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ（フ
ァルマシア社製）のカラム（直径２．５ｃｍ×長さ２０
ｃｍ）に吸着させ、吸着物を３Ｍ塩化ナトリウム含有２
０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウム含有
２０ｍＭリン酸緩衝液で溶出し、活性画分を集めた。こ
の活性画分を限外ろ過により濃縮し、濃縮液をあらかじ
め１００ｍＭリン酸緩衝液で緩衝化したセファクリルＳ
−２００（ファルマシア社製）のカラム（直径２．５ｃ
ｍ×長さ１３０ｃｍ）でゲルろ過を行い活性画分を集め
た。この酵素溶液の比活性は２８０（単位／ｍｇ．タン
パク質）であり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に
ほぼ均一であった。以上の精製工程を表４及び表５に示
す。
６７４号（ＦＥＲＭＢＰ−３６７４）〕を酵母エキス
０．５％、ペプトン１．０％、ＫＨ２ＰＯ４の０．３％
及びＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏの０．１％、ｐＨ７．０から
なる培地６００ｍｌを分注して殺菌（１２０℃、２０分
間）した２リットルの三角フラスコに接種し、３０℃で
２４時間培養して種培養液とした。ペプトン０．５％、
ＫＨ２ＰＯ４の０．３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏの０．
１％、及び消泡剤（日本油脂社製ＣＢ−４４２）０．０
１％、ｐＨ７．０からなる培地１４リットルを３０リッ
トル容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃で２０
分間殺菌した。冷却後、別殺菌（１２０℃、２０分間）
した３％Ｌ−フコース５００ｍｌ及び上記の種培養液６
００ｍｌを接種し、３０℃で２４時間、毎分１０リット
ルの通気量と毎分３００回転のかくはん速度の条件で培
養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集
め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、以下の全操作
はｐＨ８で行った）５００ｍｌに懸濁した後、超音波処
理で菌体を破砕し、この破砕液を遠心分離して上澄液５
４０ｍｌを得た。この上澄液のＬ−フコースデヒドロゲ
ナーゼ活性は、３８．０単位／ｍｌであった。この上澄
液にポリエチレンイミン（２％、ｐＨ７．５）２５ｍｌ
を徐々に添加し、遠心分離をして上澄液を得た。この上
澄液をあらかじめ５０ｍＭリン酸緩衝液で緩衝化したＤ
ＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）
のカラム（直径５．０ｃｍ×長さ１０ｃｍ）に吸着さ
せ、吸着物を０ｍＭから８００ｍＭの塩化ナトリウムで
グラジエント溶出して活性画分を集めた。次にこの活性
画分に、塩化ナトリウムを添加し４Ｍ濃度とした。これ
をあらかじめ４Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩
衝液で緩衝化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ（フ
ァルマシア社製）のカラム（直径２．５ｃｍ×長さ２０
ｃｍ）に吸着させ、吸着物を３Ｍ塩化ナトリウム含有２
０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウム含有
２０ｍＭリン酸緩衝液で溶出し、活性画分を集めた。こ
の活性画分を限外ろ過により濃縮し、濃縮液をあらかじ
め１００ｍＭリン酸緩衝液で緩衝化したセファクリルＳ
−２００（ファルマシア社製）のカラム（直径２．５ｃ
ｍ×長さ１３０ｃｍ）でゲルろ過を行い活性画分を集め
た。この酵素溶液の比活性は２８０（単位／ｍｇ．タン
パク質）であり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に
ほぼ均一であった。以上の精製工程を表４及び表５に示
す。
【００４９】
【表４】 表 ４ ──────────────────────────────────── 工 程 総タンパク量(mg) 総活性（単位） ──────────────────────────────────── （１）菌体抽出液 ３８６００ ２０５００ （２）ポリエチレンイミン処理 ２７０００ １９７００ （３）ＤＥＡＥ−セファロース ＣＬ−６Ｂ ３２４ １６９００ （４）フェニル−セファロース ＣＬ−４Ｂ ６７．２ １２３００ （５）限外ろ過 ６０．２ １２１００ （６）セファクリルＳ−２００ ３６．４ １０２００ ────────────────────────────────────
【表５】 表 ５ ────────────────────────── 比活性（単位／mg） 収 率（％） ────────────────────────── （１） ０．５３１ １００ （２） ０．７３０ ９６．０ （３） ５２．１ ８２．５ （４） １８３ ６０．１ （５） ２０１ ５９．２ （６） ２８０ ４９．８ ──────────────────────────
【００５０】参考例１ 実施例２に記載と同じ方法で同じ菌株を用い培養を行
い、同様の操作により菌体の超音波処理後の上澄液５５
０mlを調製した。この上澄液のα−Ｌ−フコシダーゼ活
性は９０単位／mlであった。この上澄液に２％のポリエ
チレンイミン（ pH ７．５）を２７ml加え生じた沈殿を
遠心分離により除去し上澄液を得た。この上澄液をあら
かじめ５０mMリン酸緩衝液（ pH ８．０）で緩衝化した
ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社
製）のカラム（直径４．０cm×長さ１０cm）に吸着さ
せ、吸着物を１５０mMリン酸緩衝液（ pH ８．０）で洗
浄後、３００mMリン酸緩衝液（ pH ８．０）で溶出して
活性画分を集めた。次にこの活性画分を限外ろ過で脱塩
後、５０mMリン酸緩衝液（ pH ８．０）で緩衝化したＤ
ＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂのカラム（直径２cm×
長さ９cm）に再び吸着させ、上記と同様な方法で溶出し
て得た活性画分に塩化ナトリウムを添加し、４Ｍ濃度と
した。これをあらかじめ４Ｍ塩化ナトリウム含有２０mM
リン酸緩衝液（ pH ８．０）で緩衝化したフェニルセフ
ァロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）のカラム（直
径２．５cm×長さ１０cm）に吸着させ、吸着物を４Ｍ塩
化ナトリウム含有２０mMリン酸緩衝液（ pH ８．０）で
洗浄後、３Ｍ塩化ナトリウム含有２０mMリン酸緩衝液
（ pH ８．０）で溶出し活性画分を集めた。この活性画
分をコロジオン膜で濃縮後、あらかじめ１００mMリン酸
緩衝液（pH ８．０）で緩衝化したセファクリルＳ−２
００（ファルマシア社製）のカラム（直径３cm×１２０
cm）でゲルろ過を行い、得た活性画分にＥＤＴＡを１mM
濃度になるように加えて凍結乾燥し、精製酵素粉末を得
た。この粉末の比活性は６０．３単位／mgであった。こ
の酵素粉末はポリアクリルアミドゲル電気泳動的に単一
であった。この精製工程を表６及び表７に示す。以上の
ように複合糖質の構造と機能の解明に有用なα−Ｌ−フ
コシダーゼを効率よく製造することができる。
い、同様の操作により菌体の超音波処理後の上澄液５５
０mlを調製した。この上澄液のα−Ｌ−フコシダーゼ活
性は９０単位／mlであった。この上澄液に２％のポリエ
チレンイミン（ pH ７．５）を２７ml加え生じた沈殿を
遠心分離により除去し上澄液を得た。この上澄液をあら
かじめ５０mMリン酸緩衝液（ pH ８．０）で緩衝化した
ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社
製）のカラム（直径４．０cm×長さ１０cm）に吸着さ
せ、吸着物を１５０mMリン酸緩衝液（ pH ８．０）で洗
浄後、３００mMリン酸緩衝液（ pH ８．０）で溶出して
活性画分を集めた。次にこの活性画分を限外ろ過で脱塩
後、５０mMリン酸緩衝液（ pH ８．０）で緩衝化したＤ
ＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂのカラム（直径２cm×
長さ９cm）に再び吸着させ、上記と同様な方法で溶出し
て得た活性画分に塩化ナトリウムを添加し、４Ｍ濃度と
した。これをあらかじめ４Ｍ塩化ナトリウム含有２０mM
リン酸緩衝液（ pH ８．０）で緩衝化したフェニルセフ
ァロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）のカラム（直
径２．５cm×長さ１０cm）に吸着させ、吸着物を４Ｍ塩
化ナトリウム含有２０mMリン酸緩衝液（ pH ８．０）で
洗浄後、３Ｍ塩化ナトリウム含有２０mMリン酸緩衝液
（ pH ８．０）で溶出し活性画分を集めた。この活性画
分をコロジオン膜で濃縮後、あらかじめ１００mMリン酸
緩衝液（pH ８．０）で緩衝化したセファクリルＳ−２
００（ファルマシア社製）のカラム（直径３cm×１２０
cm）でゲルろ過を行い、得た活性画分にＥＤＴＡを１mM
濃度になるように加えて凍結乾燥し、精製酵素粉末を得
た。この粉末の比活性は６０．３単位／mgであった。こ
の酵素粉末はポリアクリルアミドゲル電気泳動的に単一
であった。この精製工程を表６及び表７に示す。以上の
ように複合糖質の構造と機能の解明に有用なα−Ｌ−フ
コシダーゼを効率よく製造することができる。
【００５１】
【表６】 表 ６ ─────────────────────────────────── 工 程 総タンパク量(mg) 総活性（単位） ─────────────────────────────────── （１）菌体抽出液 ３８６００ ４９５００ （２）ポリエチレンイミン処理 ２７０００ ４７６００ （３）ＤＥＡＥ−セファロース ＣＬ−６Ｂ ４４４０ ４４８００ （４）ＤＥＡＥ−セファロース ＣＬ−６Ｂ ２８００ ４３７００ （５）フェニルセファロース ＣＬ−４Ｂ ５７６ ３１２００ （６）セファクリルＳ−２００ ４３５ ２６２００ （７）凍結乾燥 ４２６ ２５７００ ───────────────────────────────────
【表７】 表 ７ ────────────────────────── 比活性（単位／mg） 収 率（％） ────────────────────────── （１） １．２８ １００ （２） １．７６ ９６．２ （３） １０．１ ９０．６ （４） １５．６ ８８．２ （５） ５４．２ ６３．０ （６） ６０．２ ５３．０ （７） ６０．３ ５２．０ ──────────────────────────
【００５２】
【発明の効果】本発明により、Ｌ−フコースの定量に有
用なＬ−フコースデヒドロゲナーゼの新たな工業的生産
に適した製造方法が提供された。
用なＬ−フコースデヒドロゲナーゼの新たな工業的生産
に適した製造方法が提供された。
【図１】本発明により得られるＬ−フコースデヒドロゲ
ナーゼのpHと活性の関係を表すグラフである。
ナーゼのpHと活性の関係を表すグラフである。
【図２】温度と活性の関係を表すグラフである。
【図３】Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼを３０℃におい
てそれぞれのpHで６０分間処理した後のpHと活性の関係
を表すグラフである。
てそれぞれのpHで６０分間処理した後のpHと活性の関係
を表すグラフである。
【図４】pH ８．０においてそれぞれの温度で１０分間
処理した後の温度と活性の関係を表すグラフである。
処理した後の温度と活性の関係を表すグラフである。
【図５】α−Ｌ−フコシダーゼのpHと活性の関係を表す
グラフである。
グラフである。
【図６】α−Ｌ−フコシダーゼを２５℃においてそれぞ
れのpHで６０分間処理した後のpHと活性の関係を表すグ
ラフである。
れのpHで６０分間処理した後のpHと活性の関係を表すグ
ラフである。
【図７】温度と活性の関係を表すグラフである。
【図８】pH ８．０においてそれぞれの温度で６０分間
処理した後の温度と活性の関係を表すグラフである。
処理した後の温度と活性の関係を表すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 日野 文嗣 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 平５−38285（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/04 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 アルスロバクター属に属するＬ−フコー
スデヒドロゲナーゼ生産菌を培養し、培養物よりＬ−フ
コースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするＬ
−フコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8912091A JP2863338B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8912091A JP2863338B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04304883A JPH04304883A (ja) | 1992-10-28 |
| JP2863338B2 true JP2863338B2 (ja) | 1999-03-03 |
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ID=13962033
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8912091A Expired - Fee Related JP2863338B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼの製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2863338B2 (ja) |
-
1991
- 1991-03-29 JP JP8912091A patent/JP2863338B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JPH04304883A (ja) | 1992-10-28 |
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