JPH08501924A

JPH08501924A - ポリサッカリド結合性融合タンパク質と抱合体

Info

Publication number: JPH08501924A
Application number: JP5517877A
Authority: JP
Inventors: ロデリックギルクス，ネイル; ジョージキルバーン，ダグラス; カーミージュニアミラー，ロバート; アントニージョンウォーレン，リチャード
Original assignee: ユニバーシティオブブリティッシュコロンビア
Priority date: 1992-04-08
Filing date: 1993-04-06
Publication date: 1996-03-05
Also published as: US6124117A; US5928917A; WO1993021331A2; CA2117887A1; US5340731A; WO1993021331A3; EP0635059A1; US5962289A

Abstract

(57)【要約】新規ポリペプチド組成物よそれの使用方法が、異種タンパク質が融合されまたは化学的一部が接合されたポリサッカリダーゼの、ポリサッカリド結合域またはそれの機能的部分である融合タンパク質を備えることにより提供された。該組成物は合成または組換えＤＮＡ技法によって調製することができる。該組成物は除去可能標識として有効性が見出された。

Description

【発明の詳細な説明】ポリサッカリド結合性融合タンパク質と抱合体緒言技術分野この発明は、キメラポリペプチドとポリペプチド抱合体−ポリサッカリドマトリックスに結合することができる化学的部分抱合体を含む新規除去可能標識と、その調製および使用のための方法に関するものである。背景微生物システムでの発現による外来タンパク質の生産は、高価値で、医学的に重要なタンパク質の生産の重要源となり得る。組換えタンパク質の精製と再生は、発酵プロセスのデザインにおいて主として考慮すべき点である。タンパク質の精製の従来の方法は、生産物を分離するために用いることができるが、改良方法は融合タンパク質の使用を含む。融合タンパク質は、アフィニティクロマトグラフィーにより精製されることができ、その融合タンパク質の所望成分は、アフニティマトリックスに結合するポリペプチドへの共有結合の結果として精製される。例えば、β-ガラクトシダーゼに融合した所望のポリペプチドを含む融合タンパク質は、ｐ-アミノ-フェニルーβ-Ｄ-チオガラクトシドーセファロースカラムを用いて精製することができる。このような方法は、ウイルス抗原のような免疫原性のポリペプチドの精製のために用いられてきた。スタヒロコッカスのプロテインＡはまた、免疫グロブリンのＦｃ部分への特異的結合により、融合タンパク質のアフィニティ精製のために用いることができる。精製に加えて、融合体からのオリジナル成分の再生は、しばしば望まれることである。化学的方法、生理学的方法の両方が、融合タンパク質をその成分のポリペプチドまたはセグメント（segments）に分けるために考案されてきた。融合タンパク質の２つのセグメントの間に、酸性で不安定なアスパチル−プロリン結合を導入すると、低いｐＨでの分離を促進する。このシステムの主な要件は、所望のセグメントは酸性で不安定でないことである。インシュリンやソマスタチンなどのホルモンを含む融合タンパク質は、所望のホルモンを分離するためにメチオニン残基のカルボキシル側に特異的な臭化シアンで、分けられていた。この方法は、所望のタンパク質がメチオニン残基を含む場合には適当でなかった。部位特異的なタンパク質分解による融合タンパク質の分裂も調べられた。チキンpro α-２コラーゲン・リンカーが挿入された融合タンパク質は、融合タンパク質の成分を放出するために精製された微生物のコラゲナーゼにより特異的に分解されることができた。所望の組換えタンパク質の精製と再生のためのその他の方法には、タンパク質のカルボキシ末端のポリアルギニン尾部の構築が含まれる。アルギニン残基は、イオン交換クロマトグラフィーによる所望のタンパク質の精製を促進するタンパク質の全体の塩基性を増加させる。続いて，カルボキシペプチダーゼＢによるポリアルギニン尾部の除去は、所望のタンパク質を再生し、所望のタンパク質のｐＩの減少のために塩基性の汚染物質から精製することができる。所望タンパク質の精製または固定化のための迅速で安価な方法を開発することは関心がもたれる。セルロースのような炭水化物ポリマーは豊富で安価である。さらに種々の酵素が炭水化物ポリマーやポリサッカリドに特異的に結合する。したがって炭水化物ポリマー固相を用いて、融合タンパク質を固定化および／または精製するための方法として、そのような酵素の炭水化物ポリマー結合部分を少なくとも含む融合タンパク質を調製することは関心がもたれる。ポリサッカリド表面に結合する能力との組合せで、融合タンパク質にさらなる性質を付与することができる融合タンパク質へ種々の薬剤を結合することもまた興味がもたれる。同様に炭水化物ポリマーへこれらの薬剤を結合することを促進するために、部分自身に結合する炭水化物ポリマーへ種々の薬剤を結合することは興味がもたれる。関連文献セルロースへのセルラーゼの親和性は、その精製のために用いられてきた（Bo yerら、Biotechnol.Bioeng．（1987）29:176-179;Halliwellら，Bio-chem，Chem J．（1978）169:713-735；Mart'yanovら，Biokhi-miya（1984）19:45-104；Num miら，A nal Biochem．（1981）116:137-141；van Tilbeurghら，FEBS Letters（1986）2 04 ：223-227）。Cellulomonas fimi由来のいくつかのセルラーゼ遺伝子はEscher ichia coliの中にクローン化されている（whittleら，Gene（1982）17:139-145; Gilkesら，J．Gen． Microbiol．（1984）130:1377-1384）。アビセル（微晶質セルロース）への結合は固有（Gilkesら，J．Biol．Chem．（1984）259:10455-1 0459）と組換え体（Owolabiら，Appl．Environ．Microbiol．（1988）54:518-52 3）の酵素の両方の精製に用いられてきた。マルトースに結合する２機能ハイブリッドタンパク質はBedouelleら，Eur．J．Biochem．（1988）171:541-549に記載されている。２つのC. fimiセルラーゼ、エキソグルカナーゼ（Cex）とエンドグルカナーゼ（CenA）は性質が調べられ、それらの遺伝子、CexとCenAは配列が決定された（W ongら，Gene（1986）44 315-324；O'Neillら，Gene（1986）44:325-330）。予想されるアミノ酸配列はこれらの酵素の領域構造の証拠を示す（Warren，PROTEINS ：Structure，Function，and Genetics （1986）1:335-341）。領域構造はまた他のセルラーゼでも観察され（Teeriら，Publications（1987）38：Technical Res earch Centre of Finland；Teeriら，Gene（1987）51:43-52）、タンパク質分解分裂による領域の分離は領域機能に関する洞察を与えた（Langsfordら，FEBS Le tters （1987）225:163-167；Tommeら，Eur．J．Bio-chem．（1988）170:575-581 ;van Tilbeurghら，FEBS Letters（1986）204:223-227）。 C. fimi培養上清で発見されたセリンプロテアーゼ（Langsfordら，J．Gem．Mi crobiol．（1984）130:1367-1376）は、セルロースに対する親和性を著しく減少して触媒活性フラグメントを放出して、基質結合組換えCenAとCexを分裂させることが示された（Langsfordら，FEBS Letters（1987）225:163-137）。両酵素の低電荷密度の不規則領域に対応する残りのフラグメントは、酵素のセルロース結合領域を構成すると考えられている。セルラーゼと結合する布のための洗剤の構成は米国特許4,822,516号（1987年1 2月2日出願）に記載されている。細菌のセルラーゼの結合領域によるセルロース繊維の既知の加水分解分裂は、Dinら，Bio/Technology（1991）9:1096-1099に記載されている。高ｐＨ、そしてｐＨを低下させアルカリンセルラーゼを添加することを含む廃棄紙リサイクルの脱色プロセスはW091/14819（1991年10月3日発行）に記載されている。発明の要旨ポリサッカリドに結合可能な除去可能標識を含む組成物が、その調製と使用のための方法と併せて、提供されている。その除去可能標識は、ポリサッカリドに結合でき、かつ異種のタンパク質または化学的一部（chemical moiety）に接合されたポリサッカリドから取得されることで特徴づけられるアミノ酸配列を含む。化学的薬剤はポリペプチドに結合するように選択することができる。標識は低イオン強度、高ｐＨを有しまたはカオトロビズム（chaotrophic）薬剤を含む除去溶液を基質と接触させることによりポリサッカリド基質から除去することができる。ポリサッカリド基質との結合の後に、標識の酵素的除去のために非特異的プロテアーゼを選択して用いることができる。この発明は、アッセイのための除去可能インクおよび除去可能タグのような、生成する除去可能マーカーの使用法を見いだした。図面の簡単な説明図１はセルロース結合領域のコンセンサス配列を示すものである。C. fimiセルラーゼ（CenAとCex）［16，17］のセルロース結合領域のアミノ酸配列とMbCel A（Microbispora bispora由来のエンドグルカナーゼ）の予想結合領域［19］、C lfX（Cellulomonas flavigena遺伝子フラグメントのオープンリーディングフレームの部分）［18］、Pfegl（Pseudomonas fluorescens var．cellulosa由来のエンドグルカナーゼ）［22］、PfxynA（P． fluorescens var．cellulosa由来のキシラナーゼ）およびBfeglI（Buryivibria fibrisolvens由来のエンドグルカナーゼ）［25］。アミノ酸残基は１文字コードで示されている。太い大文字はCenA 配列との相同性を示している。普通の大文字は他の６つの配列の中でのみおこる相同性を示している。小文字は相同性がないことを示している。*は成熟酵素のアミノ末端を示している。***は対応するＤＮＡ配列の停止コドンの発生から推定されるカルボキシル末端を示している。−は配列を改良するために残されたギャップを示している。数字は各々のラインの初めと終わりの残基を表している。 Ce nA，Cex，およびPfxynA残基は成熟タンパク質の最初から数字が付されている。M b CelA，Pfend，およびBfend1は、プロセスするリーダーペプチドが同定されていないので非プロセスポリペプチドの最初から数字が付されている。ClfXはC. f lavigena 遺伝子フラグメントオープンリーディングフレームの最初から数字が付されている。図２は、Cex発現プラスミドpEC-1.1、およびpUC12-1.1cexの構築を示している。β−ラクタマーゼ（Ａ^R）、Cex（網目四角）、およびlacプロモーターをコード刷る遺伝子の機能的方向は矢印で示されている。制限部位：Ｂ＝BamHI；Ｅ＝EcoRI；Ｈ３＝HindIII；Ｓ＝SalI 図３は、リボゾーム結合部位（RBS）の領域の、プラスミドpUC12-1.1cex，pUC 12-1.1（737），およびpUC12-1.1（PTIS）の配列を示している。PTISリボゾーム結合部位の影響は生産された酵素活性から明白である。図４はpUCEC2の構築を示している。図５はpE01の構築を示している。pUC12-1.1cex（PTIS）は、ScaIとNdeIで完全消化され、cex CBDをコードする配列を含む1.1kbpフラグメントが分離された。 pABG5（Wakarchukら（1986）は初めにNdeIで完全消化され、ついでNcoIで部分消化された。ベクター全体の配列プラスAbgの最後の６アミノ酸を除く全てをコードする配列を含む3.8kbpフラグメントが分離された。1.1kbpと3.8kbpフラグメントはAbgの最後の６アミノ酸をコードするアダプターを用いて連結されpE01を得た。図６はpUC12-1.1cex（PTIS）におけるエキソグルカナーゼCexのコーディング領域を示している。〜8KDaセルロース結合領域における欠失変異体の生成に用いられた制限部位は、ヌクレオチド番号で示され、実施例４の本文で定義されている。図７はスキーム図である。図８はpTZE07（PTIS）の構築を示している。pUC12-1.1cexc（PTIS）は、ScaIm 、BamHI、およびPstIで完全消化され、PTIS配列を含む1.7kbpフラグメントが分離された。pTZE07は、ScaI、BamHI、およびPstIで完全消化され、1kbpと0.85kbp のフラグメントが分離された。1.7、1、0.85kbpのフラグメントは連結され、pTZ E07（PTIS）を得た。図９はCBD.PT_CenA、p30、およびCenAのSDS-PAGE解析を示している。精製されたCBD.PT_cenA（レーン１）、p30（レーン２）、およびCenA（レーン３）は12.5% のアクリルアミドを含むゲル上で解析された。各々のレーンには１０ｇのタンパク質をのせた。右の矢頭は、レーン４の分子量標準の位置を示している（図の上から212,130,116,97.4,68,53,45,41,36,29,20,および12.4kDa）。図１０は発現ベクターpUC18-CBD.PTの構築と、CBD.PT遺伝子の構造を示している。３つのフラグメント連結による発現べクターの構築はパネルＡに示されている。フラグメント（i）は、EcoRIとKpnIの消化によるpUC18により得られた。cen Aを含む1.6キロベースSstI-SstIフラグメントはpUC18 1.6cenAから切開されM13m p18の１本鎖ＤＮＡの調製に用いられた。cenAの472-495ヌクレオチドに相補する２４塩基プライマー（５’ＣＧＴＣＧＧＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＣＧＧ３’）は１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズし、延長される。１本鎖張り出し部分は緑豆（mung bean）ヌクレアーゼで除去され、２本鎖ＤＮＡはE co RIで切断されてフラグメント（ii）を得た。CBDをコードする領域は縞で示されP.Tボックス（ブラントエンド（blunt end））とリーダーペプチドをコードする領域は黒で示されている。フラグメント（iii）は内部EcoRI部位を含む合成ブラントエンド−KpnIリンカーであった。フラグメント（i）、（ii）、および（i ii）の連結によりプラスミドpUC18 CBD.PT（パネルＢ）を得た。β−ラクタマーゼ（Amp ^r）とlacZ’遺伝子の機能的方向は矢印で示されている。CBD.PT遺伝子の構造はパネルＣに示されている。この遺伝子はCBDプラスＣ末端のアミノ酸残基を（Thr 165）を欠失しているPTボックスをコードしている。コードアミノ酸配列は１文字コードで示され、リーダーペプチドのMetlから番号が付されている。リーダーペプチドのプロセシングはAla28とAla29の間およびAla31とAla32の間で起こる。図１１はCBD.PT_cenAの陰イオン交換クロマトグラフィーを示している。部分精製されたCBD.PT（10ml、2μM NH₄OH、pH9.4中に10mg）を０分に陰イオン交換カラムにのせ2mM NH₄OH、pH9.4で平衡化されたモノＱカラムを用いてクロマトグラフィーにかけ、流速は１．０ｍｌ／分とした。部分精製タンパク質は１０ｍｇ量クロマトグラフィーにかけた。CBD.PT_cenAはカラムでフロースルー（flow-thr ough）により再生した。カラムに結合している汚染タンパク質は塩濃度勾配で除去した（1.1-1.5M酢酸ナトリウム、pH9.8）。図１２はCenAとその分離されたフラグメントの細菌微晶質セルロース（ＢＭＣＣ）への吸収を示している。メインパネルは平衡吸収等温線を示している（［Ｂ］vs．［Ｆ］，CenA（黒三角），CBD．PTcenA（黒四角），p30，触媒領域（黒菱形））。吸収アッセイは、実験手順で述べたように３０℃で行った。初期タンパク質濃度範囲は、CenAが1.1-27.3μM、CBD．PT_cenAが1.1-32.2μM、p30が2.3-12 .2μMであった。各々のデータ点は６回の反復の平均である。２次元標準誤差は垂直および水平バーで示されている。挿入は３.４μＭ（黒三角）または１８.３ μＭ（白三角）のCenA，3.4μＭ（黒四角）または18.3μＭ（白四角）のCBD.PT_c _enA ，18.3μＭのｐ３０（白菱形）の吸収反応速度を示している。図１３はCenAとCBD．PT_CenAのＢＭＣＣへの吸収の解析を示している。挿入は図４からのCenA（白菱形）とCBD.PT_cenA（黒四角）の吸収データを片対数プロット（［Ｂ］vs.log［Ｆ］）で表している。メインパネルは同じデータをScatchar dプロット（［Ｂ］／［Ｆ］vs．［Ｂ］）で示している。曲線は最小二乗回帰解析によりCenA（連続線）とCBD．PT_CenA（ボーダーライン）のデータ点に合わせた。両方のタイプのプロットにおいて、２次元標準誤差は垂直および水平バーで示されている。図１４はCenA、CBD．PT_CenA、Cexの吸収データの両逆数プロットを示している。図４からのCenAとCBD．PT_CenAの吸収データはパネルＡとＢで各々示されている。CexのデータはパネルＣに示されている。データは垂直および水平バーで示された２次元標準偏差とともに両逆数形式（１／［Ｂ］vs．１／［Ｆ］）でプロットされている。表２で挙げられたＫ_rとａ／［Ｎ_o］値は実施例３，Ｃで概要を示した式（６）と（７）にしたがって、各々、これらのプロットの制限勾配（直線）と１／［Ｂ］軸上切片から概算された。各々のケースで、勾配は［Ｂ］の５つの最低値のデータ点を通る線から得られた。図１５はセルロースとαキチンへのCEB_cexの吸着を示したものである。アビセル^TM（５ｍｇ）、ＢＭＣＣ（１ｍｇ）、キチン（１ｍｇ）または再生セルロース（１ｍｇ）は種々の初期濃度のCBD_cex（アビセル^TMには［Po］＝0.9-180μM、BM CC、キチン、および再生セルロースには［Po］＝1.8-300μM）と混合された。図１６はセルロースとαキチンに対する結合CEB_cexの比親和性を示している。図１７はセルロースに対するCBD_cexの結合への洗剤の影響を示している。使用されたゲル濃度は１６％Ｔであった。レーンあたりのせられたタンパク質は約１．８ｎモルであった。洗剤はセルロースヘCBD_cexが結合した後（Ａ）白抜きライン）、あるいはセルロースへCBD_cexが結合する間存在するように（Ｂ、網目ライン）添加した。Ｃ，タンパク質バンドのデンシトメトリースキャン。レーン１− ５、Triton X-1000（各々0.002%，0.02%．0.2%，2%）で処理したCBD_cex。レーン６−１０、ＳＤＳ（各々0.002%，0.02%．0.2%，2%）で処理したCBD_cex。図１８は２つの除去可能標識の組成と酵素的にセルロース基質から除去可能標識の結合をはずす方法を示しており、矢印は化学部分を、白抜きボックスは特異的プロテアーゼのプロテアーゼ分裂部位を、網目ボックスはセルロース結合領域を示している。発明の詳細な説明異種のタンパク質に融合された、あるいは化学的一部に接合されたポリサッカリダーゼのポリサッカリド結合領域（ＰＢＤ）から得られるアミノ酸配列を有する除去可能標識を提供する。そのアミノ酸配列は、一般的に、ポリサッカリドの加水分解的酵素活性を本質的に欠くが、基質結合活性を保持しているものである。ポリサッカリド結合領域の調製方法も提供しており、ここでポリサッカリド結合タンパク質はポリサッカリダーゼのポリサッカリド結合領域であってもよいし、ポリサッカリド結合タンパク質の結合領域、またはポリサッカリドに結合するようにデザインされ設計されたタンパク質であってもよい。ポリサッカリド基質に結合した後、基質から標識を溶出することができる除去溶液と基質を接触させることにより除去可能標識は基質から除去されることができるし、あるいは、標識とポリサッカリド結合領域の間に、プロテアーゼ認識部位または化学的開裂部位、各々の酵素で特異的に分裂されるコラゲナーゼ、トロンビン、または因子Ｘａの部位を含むことにより、酵素的に標識を除去することができる。例えば、低ｐＨや臭化シアンに感受性である化学的開裂部位を用いることもできる。ポリサッカリド結合タンパク質全体が、例えばプロテアーゼＫのような相対的に非特異的、一般的なプロテアーゼに曝すことにより分解されるように選択することもできる。これらの方法のいずれも、結合標識の除去に有効であり得る。本発明は、いくつかの長所を有する。除去可能標識はポリペプチドまたは化学的一部が、溶解性、非溶解性に関わらず、いかなるポリサッカリダーゼの基質にも結合するための方法を提供する。さらに抱合体は、ポリサッカリド表面またはマトリックスに、所望の新しい物理的性質を付与するために使用されることが可能である。さらにキメラ成分のポリサッカリド結合領域が選択的に結合することと、それがポリサッカリド表面から容易に離脱する性質を有することは、結合している基質から、容易に除去可能な標識、染色剤、コーティングあるいはタグ（ tags）を調製するために、特に適している。例えば、セルラーゼから得られるセルロース結合領域（ＣＢＤ）と接合した染色剤あるいは色素剤を含む、除去可能なインクを作製することができる。現在の炭化水素をベースにしたインクは、除去するのが困難である。一般的な脱色処理は水酸化ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、過酸化水素およびpH10-11の洗剤の添加と、例えば40-50℃に結合されている基質を温度上昇させることを含む。これに対して、ＣＢＤをベースにした材料は特異的にかつ強固に紙に結合するが、周囲を生理学的な温度、通常40℃以下で通常20℃の範囲において、水あるいは高ｐＨで溶出することにより容易に除去されることができる。ＣＢＤ−色素は30℃、ｐＨ7.0で例えばプロテアーゼＫのような一般的なプロテアーゼを用いた加水分解により除去するように選択することができる。このようにＣＢＤは、紙や綿のようなセルロース含有材料に結合し、この染色剤や色素剤が後で除去できる方法を提供する。望まれているように、標識は、加水分解の活性を有するタンパク質を含む全セルラーゼ酵素まで含むことができ、あるいは基質結合領域だけを含む配列だけが使用され、加水分解活性が本質的に欠けていてもよい。基質の無傷な状態が保持されるので後者の方が望ましい。前者は、後に基質を同時に破壊すること、例えばリサイクル紙でインクを除去することが望まれるときに使用されるかもしれない。新規ポリペプチド組成物は以下の式を有するものを含むことができる：ＰＢＲ−ＭＲ−Ｘ（１）ここで：ＰＢＤは、当該ポリペプチドのＮ末端、またはＣ末端、あるいはその両方であってもよく、ポリサッカリダーゼの基質に結合する高親和性を提供するために、ポリサッカリドの基質結合領域からの充分な量の連続したアミノ酸配列を有することで特徴づけられる。ＭＲは中間領域で、２から３０の炭素原子からなる短い連結基であってもよく、あるいは約２から約２０のアミノ酸を有していてもよい。その領域は、通常Ig A1プロテアーゼまたは因子Ｘａのような高特異性タンパク質分解酵素によって認識される配列に対応する配列である、融合タンパク質の特異的開裂を提供するアミノ酸配列を含むことができる。およびＸはＮ末端あるいはＣ末端領域であってよく、いかなる所望のペプチドあるいは化学的一部であってもよい。Ｘは所望のポリペプチドの全配列まで含むことによって特徴づけられ、酵素、ホルモン、免疫グロブリン、タンパク質染色剤等であってもよい。新規のポリペプチド抱合体組成物は、以下の式を有するものを含む：ＰＢＤ−Ｚあるいは（２）ＰＢＤ−ＭＲ−Ｚ（３）ここで：ポリサッカリド結合領域（ＰＢＤ）はポリサッカリダーゼのポリサッカリダーゼ結合領域から得られる（１）と；ポリサッカリドに結合することができる（２）により特徴づけられ、任意で用いられる（３）は本質的にポリサッカリダーゼ活性を欠いている。ＰＢＤは少なくともポリサッカリドに結合するために必要な配列の最小数のアミノ酸の大きさである。ＰＢＤ−ＭＲは上記のごとく定義される。そしてＺはポリサッカリド結合領域に結合する化学的一部である。Ｚは一部（moiety）のみを示し、その部分の化学量（stoichiometry）を示していない。化字量は変化し得る。種々のポリサッカリド基質が興味の対象である。これらにはセルロース、β− １，４−配糖体結合で連結されたＤ−グルコビラノース・ユニットで構成されたポリサッカリドとそのエステル；例えば酢酸セルロース；反復骨格ユニットがβ− １，４−Ｄ−キシロピラノースであるキシラン；β−１，４−連結Ｎ−アセチル、２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース・ユニットから構成されていて、セルロースに類似しているキチン；から構成されるポリサッカリドが含まれる。以上挙げられたようなポリサッカリドに結合できる酵素は、当該発明においてこのような基質に結合することができるアミノ酸配列源として興味の対象である。数種類のタイプの酵素がセルロース及びキシランの微生物変換に含まれており、エンドグルカナーゼ（１−４−β−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．４）；セロビオヒドロラーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．９１）；β−グルコシダーゼ；キシラナーゼ（１，４−β−Ｄ−キシラノヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．８）及びβ−キシロシダーゼ（１，４−β−Ｄ−キシランキシロヒドロラーゼＥＣ３．２．１．３７）を含む。その組成物は、宿主細胞中に、ポリサッカリダーゼの多糖類結合領域または多糖類結合タンパク質の少なくとも機能部分をコードするＤＮＡからなるＤＮＡ構造を形質転換することにより調整することができる。異型のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ＰＢＤのＤＮＡ配列にリゲート（ligate）することができる。融合遺伝子またはＰＢＤのＤＮＡ配列単独は、真核または原核細胞の宿主細胞中で発現することができる。発現した及び単離した融合タンパク質及びＰＢＤは、化学的一部（chemical moiety）に抱合されることができる。セルラーゼのようなポリサッカリダーゼ遺伝子及び多糖類結合タンパク質の単離に使用される技術は、この分野ではよく知られており、合成、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、またはそれらの組み合わせを含む。遺伝子の取扱いの種々の技術が知られており、制限、消化、分泌、リケーション、インビトロ突然変異誘発、プライマー修復、リンカー及びアダプターの採用などを含む（ Maniatisら、分子クローニング、コールド・スプリング・ハーバー研究所、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８２参照）。一般に、その方法は、設計された特徴を有するポリサッカリダーゼまたは多糖類結合タンパク質を発現する生物からのゲノムライブラリの調製からなる。多糖類と相互作用するタンパク質は、レクチン、ミチナーゼ、及びアミラーゼと同様にキシラナーゼ及びベータ−１，４グリカナーゼを含む。多糖類と結合する酵素の多くは、直接触媒及び結合領域（binding domain）からなる。しかし、本発明は、そのような酵素からの結合領域の使用に限られず、結合及び触媒領域がひとつであり同一であるようなものも使用できる。本発明で使用される酵素の例は、Cellulomonas fini、Trichoderma reesei及びm. bispora等の種に属する菌株から得られるセルラーゼである。その例は、P. fluorescens subsp．celluloses allulose及びC．thermocellumからのキシリナーゼを含む。ドナー微生物のゲノムは、単離され、BamHIのような適当な制限酵素によって開裂される。得られたフラグメントは、制限酵素によって予め開裂されたベクター分子に結合される。好適なベクターの例は、制限エンドヌクレアーゼBamHIによって開裂されたプラスミドpBR322である。ポリサッカリダーゼのアミノ酸配列は、ポリサッカリダーゼのドナー細胞として注目される細胞からのｍＲＮＡまたはＤＮＡから調製されるｃＤＮＡまたはゲノムライブラリをスクリーン（screen）するためのプローブの設計にも使用される。ポリサッカリダーゼｃＤＮＡまたはそのフラグメントを交雑プローブとして使用することにより、構造的に関連した遺伝子を他の微生物中に容易にクローンすることができる。特に考慮されたのは、ポリサッカリダーゼの触媒及び結合領域が分離された生物から得られる遺伝子のヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを用いたポリサッカリダーゼ活性を発現する生物からの遺伝子の単離である。ボリサッカリダーゼの結合領域の共通配列を用いて発生したプローブは特に興味深い。結合領域の共通配列の例は、図１に示したセルロース結合領域の共通領域である。そのプローブは全配列よりかなり短くできるが、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１４のヌクレオチド長である。長いオリゴヌクレオチドも有用であり、遺伝子の全長までの、好ましくは５００より短く、さらに好ましくは２５０より短いヌクレオチド長である。ＲＮＡまたはＤＮＡプローブも使用できる。使用において、プローブは、典型的には、例えば³²Ｐ、³Ｈ、ビオチンまたはアビジンといった検出可能な方法で標識され、遺伝子が求められている生物からの１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと培養される。交雑は、１本鎖または２本鎖（交雑した）ＤＮＡ（またはＤＮＡ／ＲＮＡ）が、（典型的にはニトロセルロース紙を用いて）分離された後、その標識によって検出される。オリゴヌクレオチドに使用するのに好適な交雑技術は当業者によく知られている。プローブは通常、同定を容易にする検出可能な標識とともに使用されるが、標識されていないオリゴヌクレオチドもまた、標識されたプローブの前駆体として、及び２本鎖ＤＮＡ（またはＤＮＡ／ＲＮＡ）の直接検出を提供する方法のために有用である。従って、 ”オリゴヌクレオチドプローブ”という用語は標識及び非標識の両方の形態を意味する。ポリサッカリダーゼまたは多糖類結合タンパク質の多糖類−結合領域を単離するために、いくつかの遺伝子的手法が使用できる。ひとつの方法は遺伝子の部分を取り出し、端を切り取ったタンパク質をコードする突然変異した遺伝子を得るためにフレームに残された遺伝子−ベクターフラグメントを融合するために制限酵素を使用する。他の方法は、ＤＮＡの５’及び３’末端から外的に、または遺伝子の制限された間隙から内的にヌクレオチドを組織的に欠失するために、Bal3 1のようなエキソヌクレアーゼの使用を含む。これらの遺伝子欠失法は、基質または多糖類結合能力を評価される短縮されたタンパク質分子をコード化する突然変異した遺伝子をもたらす。評価及び結合活性に適した基質は、アビセル(Avice l)、綿繊維、濾紙、クラフト紙または木材パルプ等である。多糖類結合領域をコード化するヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡとして同定されれば、それは除去可能標識を調製する種々の方法で取り扱うことができるが、その除去可能標識は、上記式（１）で示したような構造を有し、ヌクレオチド配列は注目するポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列に融合される。多糖類結合領域をコード化するフラグメント及び注目するポリペプチドをコード化するＤＮＡはリケートされる。その結果リケートされたＤＮＡは、発現を供するための種々の方法で取り扱われる。例えば、E. coliのような細菌、Sac caromyces cerevisiaeのような真核生物、または哺乳類細胞を含む単細胞宿主が採用される。式（１）の融合タンパク質の調整及び単離は以下の通りである。転写調節領域及びプロモーターは、細菌に対しては、ｌａｃプロモータ、ラムダ左及び右プロモータ、ｔｒｐ及びｌａｃプロモータ、ｔａｃプロモータ等を含む。さらに、転写調節領域は、例えば、栄養素、あるいは成長媒体、温度、等における発現生成物の存在または不在といった、融合した遺伝子の発現時間を調節する調節配列を含んでもよい。例えば、融合遺伝子の発現は、バクテリオファージラムダＰＬプロモータ、バクテリオファージラムダＯＬプロモータ及び温度感応性リプレッサからなる制限配列を用いて温度によって制限することができる。プロモータの制限はリプレッサとオペレータとの相互作用を通して達成される。発現カセットは、適当な細胞宿主におけるエピソーム維持の複製系に含まれることができ、さもなくば複製系なしで提供されることができ、宿主ゲノムに組み込まれる。ＤＮＡは、リン酸カルシウム−沈降ＤＮＡを用いた形質転換、細胞をウイルスに接触させることによる移入、細胞中へのＤＮＡの微少注入等のような公知の技術で宿主に導入することができる。融合遺伝子が適当な宿主に導入されれば、宿主は成長して融合遺伝子を発現することができる。いくつかの例では、融合遺伝子の分泌のために提供される構造遺伝子より上流側でそのリーダフレームにある信号配列（分泌リーダ）にとって望ましい。分泌リーダは、ペニシリナーゼの分泌リーダ、免疫グロブリン、Ｔ− 細胞レセプター、外膜タンパタ質、等を含んでいる。プロパーリーディングフレームにおける融合によって、キメラポリペプチドは媒体中に分泌される。生成物が宿主細胞中に保持されたところで、細胞が培養され、溶菌され、多糖類基質に結合することにより生成物単離及び精製がなされる。生成物が分泌されたところで、栄養媒体が収拾され、多糖類マトリックスへの結合により生成物が単離される。活性タンパク質を調整するために、そのタンパク質を再生させる必要がある。再配列生成物は、野生種または他のグリコシル化を有するグリコシル化または非グリコシル化されたものであることができる。グリコシル化の程度は、それが生成される生物と同様に、特別な配列に一部依存している。従って、E. coli細胞での生成物の発現は、非グリコシル化生成物をもたらし、昆虫細胞での生成物の発現は、哺乳類細胞での生成物の発現より小さな発現をもたらす。酵母での発現は過グリコシル化をもたらす。融合遺伝子からの融合タンパク質の生成に加えて、融合タンパク質は化学的にも合成できる。基質結合領域またはその多発性物は、それ自身の上に生成され、精製された後、当業者に知られた技術を用いて注目するポリペプチドに化学的に結合される。タンパク質抱合は、グルタルアルデヒドを用いてキャリアタンパク質にペプチドを結合することを含む（Reichlin Methods of Enzymology（1980） 70：159-165）。多糖類結合領域及び化学的一部（上記式（２）及び（３））の抱合体からなる除去可能標識は、以下のように調製される。ポリサッカリダーゼの基質に結合することのできるアミノ酸配列は、上記のように、または、当業者に知られた他の方法によって得られる。化学的一部は、多糖類結合領域からのアミノ酸配列に、共有結合修飾、イオン結合、疎水性結合、水素結合、タンパク質翻訳、タンパク質発現、またはそれらの組み合わせを含む種々の化学的手法によって結合可能である。触媒領域が結合領域に結合しているところでは、触媒活性の特異的な阻害剤が結合には影響を与えずに触媒部位の不活性化に使用されてもよい。共有結合修飾反応は、末端アミン、スルフィドリル基、アジド基及び他の通常用いられる生化学的共有結合試薬を含むことができる。非共有結合修飾反応は、アニオン結合、親水性結合、水素結合及び他の通常用いられる非共有結合試薬を含むことができる。もし多糖類結合領域が特定の共有またはイオン性試薬であるときは、多糖類結合領域を構成する実質的な残基は、修飾反応中にその領域に結合することのできるリガンドでその領域を培養することによって保護することができる。この技術は、多糖類結合領域を、その領域の他の部分を修飾するために用いた化学的試薬と反応することから保護する。化学的一部の融合タンパク質への抱合は、インビボでもインビトロでも起こりうる。典型的には、反応はインビトロで起こるが、インビボ抱合の場合は、グリコシル化等の形態で起こる。インビトロ抱合の場合、多糖類結合領域を修飾する反応は、その領域が多糖類結合マトリックスに結合したまたは多糖類マトリックスから離れているときに行われる。例は、プロテインＡのような注目するタンパク質の、セルロース結合領域のようなポリサッカリダーゼ結合領域への結合の前の、Reichlin(1980)により記述されているようなグルタルアルデヒド抱合を含む。多糖類結合領域がマトリックスに結合されたとき、他の残基が化学的一部との反応にさらされるのに対し、実際にマトリックスに結合する部位を保護するという利点が提供される。化学的一部の多糖類結合領域への結合が、多糖類基質に結合する能力の減退をもたらすならば、多糖類マトリックスの存在を必要とする反応方法は、領域の結合性を維持するために好ましい。交雑反応は、融合タンパク質抱合体のヘテロ− ２感応性を得るために設計されたとき、融合タンパク質とともに行われる。例えば、融合タンパク質は、アルカリ性ホスファターゼ、β−グルコシダーゼまたはトリプシンのような酵素、及びクーマシーブルーまたはアミノブラックのような染料からなることができる。除去可能標識の使用に依存して、化学的一部は、染料、発色団、同位体化学物質、タンパク質、脂肪、液体、炭化水素、色素、等を含む種々の化合物から選ぶことができる。非水性及び水性環境の両方で安定な化学的一部を使用するのが望ましい。従って、好ましいのは、多糖類マトリックス上で乾燥した染料、マーカー、及びタグ(tag)である。非−特異的な、背景をなす結合の減少が重要であるとき、反応混合物から容易に取り出せる試薬を使用するべきである。例えば、それら自身が多糖類マトリックスに結合しない試薬が、非−特異的で背景をなす結合を減少させるために使用できる。例えば、除去可能標識は多糖類マトリックスを通り抜け、反応しない試薬は洗い落とされるが、多糖類結合領域抱合体からなる除去可能標識はマトリックスに結合したままである。逆に、抱合された多糖類結合領域は、上澄みがその試薬を含むことができ、ＰＢＤ−抱合体が多糖類マトリックスベッド(bead)に沿って沈降するような多糖類マトリックスベッドを使用した遠心分離技術によって反応していない試薬から取り出すことができる。特別な実験計画及び試薬の目的に応じて、ポリペプチドまたはＰＢＤ単独は、抱合体にタグできるし、タグしないこともできる。直接または間接の検出可能な信号を提供する非常に多くのタグが使用されている。これらのタグは、放射性核種、酵素、フルオレスカー(fluor escor)、粒子、化学発光体、酵素基質または補因子、酵素阻害剤、磁性粒子、染料等を含む。タグをポリペプチドまたはＰＢＤに結合する多くの方法が存在し、当業者にはよく知られている。例えば、ポリペプチドＮ−末端アミノ基は、ピロレゾン(pyrulezone)の形に誘導されるが、他の自由アミノ基は保護され、ピロレゾンは多くの検出可能な信号発生部位と結合する試薬に接触できる。逆に、標識は、スルフィドリルまたはアジド基のようなタンパク質修飾試薬を使用することにより多糖類結合領域に結合される。一般に、多糖類結合領域−抱合体（除去可能標識）は、中性ｐＨの、約１０^-3 Ｍから約１Ｍの中イオン強度緩衝液中で多糖類マトリックスに結合できる。結合は、抱合体に応じて、４℃から少なくとも７０℃の温度で実施される。結合は、実質的に瞬時に起こり、温度は臨界的ではない。ＰＢＤ−抱合体がマトリックスに結合するれば、マトリックスは乾燥させてもよいし、或いは水性環境においてもよい。多糖類マトリックスのタイプは、かなり変化させてもよい。例は、綿、木材、紙製品、キチン及び多糖類マトリックスの生物及び非生物源を含むが、それらに限られるものではない。マトリックスは、２次元または３次元の幾何学構造を有する表面と定義され、フィルター円盤、クロマトグラフ樹脂等を含むことができる。そのような抱合体は、種々の表面で多糖類の位置を示す選択タグとして、及び、綿、レイヨン、木材、セロハンまたは紙のような合成及び非合成源の両方からの多糖類表面の除去可能染料及び染色剤として使用できる。抱合体は、抗生物質、フンギシジン、殺虫剤、テキスチャライジング(texturizing)試薬のような化学的試薬を、そのような多糖類表面に結合させるのに使用できる。マトリックスからＰＢＤ抱合体を切り放すために、低イオン強度緩衝液または水、あるいはアルカリ性ｐＨまたは過塩素酸塩緩衝液が必要とされる。脱着の温度は臨界的ではなく、ほぼ１０℃〜４０℃の範囲であるが、環境温度はほぼ２０ ℃が好ましい。結合したＰＢＤ抱合体は、水で繰り返し洗浄されるか、または、連続的な水流で希釈される。一般に、ｐＨ９．５の炭酸塩緩衝液または６Ｍグアニジン塩酸が、この脱着工程に使用可能である。希薄水酸化ナトリウム（約０．１Ｍ）が、いくつかの場合の処理に好適である。ＰＢＤの性質は修飾することができ、その接着特性が水によって脱着されるよう、あるいは望むならば、脱着されないようにすることができる。マトリックスへの脱着媒体の適用は、融合タンパク質の多糖類結合領域に、マトリックスからＰＢＤ−抱合体を離れさせる。例えばＷＯ９１／１４８１９に記載された方法とは対照的に、ＰＢＤ抱合体を用いたこの場合は、デインキング(deinking)に先立つ多糖類表面の酵素的処理が不要である。例えば、ＷＯ９１／１４８１９に記載されたようなアルカリ性セルラーゼによる多糖類の表面層の部分的加水分解は繊維構造を弱くするが、一方、多糖類の、上記の脱着溶液による処理は、多糖類の表面構造を変化させない。さらに、マトリックスからＰＢＤを脱着させるための非−特異的プロテアーゼの使用を含む方法は、抱合体に直接作用し、多糖類表面を修飾しない。基質から離れた後のＰＢＤ−抱合体の分離には、種々の技術が使用される。例えば、多糖類表面は、上記の脱着溶液でＰＢＤ−抱合体を洗い落とすことができる。ＰＢＤ−抱合体は、例えばそのｐＨのイオン強度を変え、ＰＢＤ−抱合体をイオン交換体または多糖類マトリックスに再吸着させることにより脱着溶液から分離できる。注目するタンパク質または化学的一部は、多糖類結合領域と、注目するタンパク質または化学的一部との間に存在する配列に特異的なプロテアーゼを使用することにより、多糖類結合領域から容易に切り放すことができる。注目する再配列タンパク質からの結合領域の切り放し（分割）は、溶液中でできるが、融合タンパク質は多糖類マトリックスに固定される。後者の場合、注目する再配列タンパク質または化学的一部は、多糖類結合領域の汚染なしに、多糖類マトリックスから切り放すことができる。逆に、非−特異的プロテアーゼは、ＰＢＤ複合体のＰＢＴ部分の完全な分解のために使用され、よって、例えば、約５０μｇ／ｍｌの濃度で約２０分間、３７℃で、プロテアーゼＫで処理することにより、それを多糖類から切り放す。融合タンパク質とＰＢＤ抱合体の使用融合タンパク質及びＰＢＤ抱合体は、注目するタンパク質の精製、注目するタンパク質の固定化、及びＰＢＤ抱合体の固相ダイアグノスチクス(diagnostics) 、精製、及び被膜、タグ及び取り出し可能な染料の調製を含む非常に多くの適用を供する。他の適用は、注目する化合物の多糖類マトリックスへの結合を含む。除去可能標識は、特に生化学的化合物の、化合物の精製手段として使用され得る。この方法で精製される生化学化合物の例は、インターロイキン２、因子Ｆ、リグニナーゼ、及びＴＰＡを含む。この方法で精製されるＰＢＤ抱合体の例は、クーマシーブルー、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）で標識されたＰＢＤを含む。主題の化合物は、融合タンパク質の多糖類支持体上経の固定化の手段としても使用される。なぜなら、その多糖類結合領域の基質に対する吸着は強力で特異的だからである。固定化系は、以下のような用途を見いだした。例えば、診断検定のための固体試薬の調製、酵素、抗体フラグメント、ペプチドホルモン等の試薬；セルロースが、例えばカルボキシメチルセルロースのような可溶性、あるいは微晶質セルロース（アビセル）のような固体支持体のどちらかであり、薬剤がインターロイキン２のようなポリペプチドであるデクリース・クリアランス・レート(decrease clearance rate)に結合した薬剤；ドラッグ・デリバリー、例えばカルボキシセルロースに結合し、例えば輸送される薬剤の免疫特異性を高めるために同じセルロース支持体に対するアジュバントの結合をともなう抱合に使用できる；染料結合、例えば色素または染料の、例えばセルロース表面といった多糖類に対する結合；例えば紙及び布（綿）への印刷；加水分解または相乗作用の提供、例えば、木材片の処理のためのリグニナーゼのような酵素の標的化(targeti ng)、ポルフィリンの標的化、例えば木材パルプの漂白；植物表面への、例えばＢｔトキシンまたは他の抗菌剤といった殺虫剤の結合；窒素固定；フンギシジンの持続放出；それらは、海洋環境のような高い塩の条件下でも、海水にさらされた表面の汚染防除のために使用され、新鮮な水の輸送が融合タンパク質を取り除く。以下の実施例が説明のために提供されるが、これらに限られるものではない。実験略語ｐＮＰＣ＝ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドＨＰＡ＝ハイド・パワー・アキュア(hide power axure) ｇＣｅｎＡ及びｇＣｅｘ＝C. fimiからのＣｅｎＡ及びＣｅｘのグリコシル化形態ｎｇＣｅｎＡ及びｎｇＣｅｘ＝組換えE. coliからのＣｅｎＡ及びＣｅｘの非グリコシル化形態。ＲＰＣ＝逆相クロマトグラフィーＳＤＳ−ＰＡＧＥ＝硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 α−Ｐｒｏ／Ｔｈｒ＝合成ＣｅｘＰｒｏ／Ｔｈｒ箱に対するウサギ抗血清ＰＭＳＦ＝フェニル−メチルスルフォニルフルオライド生物学的培養の寄託以下の寄託がアメリカンタイプ培養コレクション(American Type Culture Col lection)（ＡＴＣＣ）でなされた。１２３０１パークローンドライブ(Park Lawn Drive)、ロックビル（Rockville)、メリーランド、２０８５２。（１）大隅菌(Escherichaia coli)中のプラスミドｐｃＥＣ−２上でクローンした遺伝子ＣｅｎＡの誘導体は、１９８６年４月２３日に寄託された（ＡＴＣＣ、許可番号６７１０１）；（２）プラスミドｐＥＣ−１上でクローンされた遺伝子Ｃｅｘの誘導体は、１９８６年５月２７日に寄託された（ＡＴＣＣ許可番号６７１２０）；（３）大腸菌ＪＭ８３、ｐＵＣ１２−１．ｌｃｅｘは、１９８６年４月２３日に寄託された（ＡＴＣＣ許可番号６７１０２）。実施例１Ｃｅｘを発現するプラスミドの作製Ａ．細菌株およびプラスミド宿主株Ｃ６００（thr-1 leu-6 thi-1 supE44 1acvY1 tonA21）、およびプラスミドpcI857とpCP3は、Erik Remautから入手し、Gene(1983)22：103-113に記載されている。Ｂ．組換えＤＮＡ技術ＤＮＡの調製および酵素反応は、ＮＹのコールドスプリングハーバーのコールドスプリングハーバー研究所のManiatisらによる，Molecular Clonin：A Labora tory Manual の記載に従って行った。制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー酵素）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、および移動可能な翻訳開始部位（ＰＴＩＳ）は、Pharmacia社から購入した。バクテリオファージラムダのレフトワード(Leftward)プロモーター（ＰＬ）を有するプラスミドの、ファージラムダのｃＩ８５７遺伝子を有する株への細菌の形質転換は、以下の修正を除いて、Maniatisらによる.,supra,の方法で行った。その細菌の細胞は、３４℃で２分間熱ショックを与え、ＬＢ培地で１時間インキュベートし、選択的な培地にまいた。Ｃ．細菌の生育および誘導細菌は、オートクレーブ後に０．４％グルコース、１ｍｌ当り５０μｇのカナマイシン、および１ｍｌ当り７５μｇのアンピシリンが添加されたＬＢ培地(Man iatis,supra)で培養した。３０℃、６００ｎｍにおける吸光度が０．３となるまで生育した後、培養物を分割し、平行した試料は３０℃（誘導なし）および４１ ℃（誘導された）で培養した。Ｄ． cex遺伝子の単離 C. fimiから得たcex遺伝子は、１９８６年５月２日に出願された米国特許出願第８５９，０４２号に記載されているようにして単離し、その事実は参照によってここに取り入れられている。Ｅ．プラスミドの作製１．pUC12-1.lcex cex遺伝子は、C. fimiのBamHI断片６．６キロベースペア(kbp)がpBR322のBamH Iにつながれた、pEC-1でクローンした（図２参照）。cex遺伝子は、欠失解析によって、２．５６kbpのBamHI-SalIＤＮＡ断片に局在され、pEC-1.1を産した（図２）。プラスミドpUC12-1.1cex（図２）は、プラスミドpUC12(Gene(1982)19:259 -268)にE.coliラクトースオペロンのプロモーター-オペレーター領域(lacZp/o) から下流域に反対の配向に配置されたpEC-1.1から得た２．５６kbpを含んでいる。プラスミドpEc-1、Whittleら.,Gene(1982)17:139-145、およびGilkesら.,J.Ge n.Microbiol. (1984)130:1377-1384、によって記載されており、その事実は参照によってここに取り入れられている。２．PUC12-1.1(737) pUC12-1.1(737)の作製のために、５’非翻訳配列、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、およびcex遺伝子の開始コドンとを最初に取り除き、E. coli lacオペロンからのプロモーター−オペレーター領域、ＲＢＳ、および（Ｇａｌ）のアミノ末端、そしてさらにＰＴＩＳのＲＢＳ−ＡＴＧ配列で置き換えた。最初の段階でpU C12-1.1cexは、StyIとBamHIを用いて切断し、その付着末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー酵素）で補修し、プラスミドＤＮＡを希釈状態で接続し、pUC12- 1.1(737)を得た。この操作によって、(i)Cexのリーダー配列の第２コドンとpUC1 2によってコードされているＢＧａｌのアルフア断片の第１１コドンとの間のイン-フレーム融合；(ii)StyI切断部位の再生；および(iii) BamHI切断部位を用いたcex開始コドンの置き換えが、結果的になされた。pUC12-1.1(737)のβ−Ｇａｌ−cex融合領域のヌクレオチドの配列および推測されるアミノ酸配列を図３に示す。３．pUC12-1.1(PTIS) pUC12-1.1(PTIS)を得るために、pUC12-1.1(737)はEcoRIとBamHIとで切断され、EcoRIとBamHIの付着末端を有する１７bpのＰＴＩＳを導入した。この手法は、結果として、ＰＴＩＳの開始ＡＴＧにcexのリーダー配列の第２コドンのイン-フレーム融合を引き起こした。（下記および図３参照）：ＰＴＩＳ pUC12-1.1cexは、融合していないcex遺伝子産物をコードする。pUC12-1.1cex における自然のcex遺伝子産物のコドンの番号付けは、リーダー配列の開始ＡＴＧを−４１として、成熟したcexの最初のコドンを＋１として始まる。β-Ｇａｌ -Ｅｘｇ融合における最初のcexコドンは、そのもとの番号をとどめている。推測されたアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列の上に一文字表記で示されている。β-Ｇａｌからもたらされたヌクレオチドおよびアミノ酸には、下線が付されている。小文字活字のアミノ酸は、ｌａｃを起源とするものではなく、pUC12のリンカー領域からもたらされたものである。cex遺伝子のアミノ末端におけるStyI、AvaIIおよびEcoRII制限部位は、cex遺伝子の、pUC12におけるＢＧａｌのアミノ末端への融合のために使用された。Cexの活性は、全細胞タンパク質のミリグラムに対する解離したｐ-ニトロフェニルのナノモルとして表示している。実施例２ CenA発現プラスミドの作製Ａ．細菌および培地 E. coli JM101を全てのcenAの実験に使用した。全ての培養物はＬＢ培地で培養し、必要に応じて１．５％(w/v)の寒天で固化した。アンピシリンは、終濃度が100μ/mlとなるように添加した。CenAの活性は、1.0%(w/v)の寒天と1.0%(w/v) のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）とを含むＬＢ上でコロニーを成育した後に、コンゴレッド(Congo red)を用いた染色によって決定した。液体の培養物は、５０または２５０ｍｌのエレンメイヤー(Erlenmeyer)フラスコに１０または５０ｍｌ採取し、New Brunswick Gyrotory浴槽に200r.p.m.で培養した。Ｂ．ＤＮＡ技法プラスミドは、アルカリ溶菌によってE. coliから放出せしめ、CsCl-エチジウムブロマイド(ethidium bromide)濃度勾配で平衡に遠心によって精製した。制限エンドヌクレアーゼを用いた分解、断片の接続、およびE. coliの形質転換は、記載された通りに行った。Ｃ．他の方法抽出物はフレンチプレスを用いた細胞の破壊によって調製した。酵素はペリプラズムから浸透ショックにより放出された。培養物の上層は遠心分離によって得た。全ての酵素は、３０℃で活性測定した。E. coli JM101/pUC18-1.6 cenAから得られたエンドグルカナーゼは、免疫吸着クロマトグラフィーによって精製し、さらに２０ｍＭピペラジン(piperazine)、ｐ９．８において０−１．０ＭＮａＣｌの濃度勾配をかけて、モノＱ樹脂の陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。アミノ酸配列は、Applied Biosystems社、470A gasphase sequenatorを使用してエドマン分解装置によって決定した。Ｄ．CenA遺伝子の単離 C. fimiからのCenA遺伝子は、１９８６年８月７日に出願され現在は放棄された米国特許出願第８９４，３２６の継続出願で、１９９０年１２月１８日に出願されたＵＳＮＮ特許第６３０，３９６号に記載された通りに単離した。Ｅ．プラスミドの作製 pcEC2のC. fimi ＤＮＡの６．０kbの挿入配列から１．６kbのSstI断片を精製、し、pUC18のSｓtI部位にサブクローンし、pUCEC2を得、その図式的な説明を図４に示す。線はBR322ＤＮＡを示し；箱状部はC. fimi ＤＮＡ；斜線部はcenAをコードする配列；矢印は転写の向き；ＳはSstI；Ａ）pcEC2；（Ｂ）pUCEC2におけるlacZとcenAの融合点のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列である。実施例３ cex ＳＢＤ遺伝子断片とアグロバクテリウム(Agrobacterium)β−ガラクトシダーゼ遺伝子(abg)との融合体を有する発現ベクターの作成と融合タンパク質の特性の決定Ａ．ベクターの作製プラスミドpUC12-1.1cex(PTIS)は、ScaIおよびNdeIを用いて完成体を切断した。cex ＣＢＤをコードする配列を含む1.1kbp断片が単離された。pABG5(Wakarchu kら，1986)は、NdeIとともに最初の消化された完全体であり部分的なNcoIを伴う。全てのベクターの配列、およびAbgの最後の６つのアミノ酸を除く全てをコードする配列とを含む3.8kbp断片が単離された。1.1kbpと3.8kbpフラグメントとは、Abgの最後の６つのアミノ酸を保証するアダプターを用いて連結され(ligated) 、pE01を作製した。プラスミドpE01は、2700bpのベクターと、2254bpのcex ＣＢＤ-abg挿入配列とに相当する。作製されたプラスミドは、E. coli JM109に形質転換される。Ｂ．融合タンパク質の酵素的およびＰＡＧＥ特性決定 pE01によってコードされる融合タンパク質は、本来のAbgと比較したその触媒活性と、本来のCexと比較したアビセルに対するその結合能力について特性決定をした。触媒活性の特性決定は、その速度論的特徴（e.q.,ｋ_mおよびＶmax）および融合酵素の基質特異性との決定を含む。酵素活性は、標準的な測定時間、温度、ｐＨ、イオン強度および緩衝液のもとで、セロビオースの凝固濃縮物から生成したグルコースの量によって決定される。グルコースの濃度は、グルコースアナライザー(Beckman社)を用いて測定される。この解析法は、酸素電極によって決定されるようにグルコースからグルコン酸への変化において酸素消費の初期速度に基づいている；酸素消費の速度は、既知の標準グルコース溶液に比較して、グルコースの存在量に直接的に比例する。融合タンパク質は、相対的な分子量を決定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥによっても解析した。精製された融合タンパク質は、二つ以上の他のタンパク質断片を生じるC. fimi由来のプロテアーゼを用いて分割され得る。このことは、融合タンパク質の分割されたタンパク質の混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うこと、および、蛍光糖デリバティブ(derivative)、ＭＵＧ（４-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-グルコシドまたはＸ-ｇｌｕ（５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-ξ-Ｄ-グルコヒラノシド）を使用したザイモグラムを行うことにより確信される。このことはまた、活性を有する他のより小さな断片が形成されたかどうか、および、それらの相対的な大きさを決定する。Ｃ．融合タンパク質の吸着能力の特徴決定セルラーゼのセルロースに対する吸着は、不溶性のセルロース性基質の加水分解において必要とされる最初の段階であると予想される。酵素濃度、酵素、組合せおよび割合、温度、緩衝液のｐＨおよびイオン強度のような、どのような要因が、セルラーゼの吸着速度およびセルロースの分解速度に影響するのかを判明させるために、セルロースに結合する酵素は、いくつかの微生物に対して調査されている(Ghose & Bisaria，1979；Moloney & Coughlan，1983；Ooshimaら，1983 ； Ryuら，1984；Andreaseら，1987；Williamson & Stutzenberge，1987)。リガンドの吸着（ＣｅｎＡ、ＣＢＤ．ＰＴ_CenA、Ｃｅｘ、またはＣＢＤ_Cex）は、平衡反応であると仮定され、その反応では、単一リガンドが、結晶のセルロースの表面上のセロビオースの繰り返し格子単位の一つ以上と反応する。平衡状態では、吸着反応は、以下の式によって表現される［Ｂ］は結合リガンド(mol.gセルロース^-1)、［Ｆ］は結合していないリガンドの濃度（モル）、［Ｎ］は結合することができる結合部位の濃度(mol.gセルロース^-1)、およびＫａは平衡結合定数(1.mol^-1)である。単一のリガンドが、たった一つの格子単位と接合し、正のまたは負の協同的な作用がないという仮定をする。［Ｎ］＝［Ｎ_O］＝［Ｂ］（２）［Ｎ_O］は、リガンドがない状態における結合部位の濃度である。等式（１）に等式（２）を代入および変形によって、ラングミュアの等式が与えられる：しかしながら、ＣＢＤの大きさは、繰り返しセロビオース格子単位の量をかなり超えている；それゆえ、リガンドいつくかの格子単位を占める必要がある。もし、結合部位が、ひとつの格子単位より大きいとすると、その表面は、潜在能力のある結合部位が重なりあって並んだものと見なされなければならない。これらの状態では、［Ｎ］は、［Ｂ］のみではなく、セルロース表面の結合リガンドの配列による確率関数によって示される（考察参照）。この混乱を避けるため、どの二つの最も近接したリガンドが第３のリガンドの結合を排除しないようにリガンドが位置する、［Ｂ］の値が非常に低い条件に限って吸着を考えることが適切である。このような条件では、等式（２）は以下のように書き換えられる［Ｎ］＝［Ｎ_O］−α［Ｂ］（４） αは単一のリガンド分子によって占められる格子単位の数である。等式（１）に等式（４）を代入し、変形すると以下の式を得る。低いリガンド濃度で得られたデータは、この等式に当てはまる。等式（５）の二つの逆数に変形した式を用いて吸着データを図示すると便利である：それは、より低い濃度範囲のデータを強調する。１／［Ｂ］に対する１／［Ｆ］の図示における傾き（１／Ｋａ［Ｎ_O］）および切片（α／Ｎ_O）は、［Ｂ］の低い値でのデータの点を通過する直線を当てることによって概算される。相対的な平衡結合定数、Ｋγ(l.gセルロース^-1)以外は、Ｋａ、［Ｎ］、またはαに対する固有の解答は、この解析法からは得ることができない、そこでは、Ｋγ＝［Ｎ_O］Ｋａ（７）セルロースの与えられた試料に対する様々に関連付けされたリガンドの親和性を比較するために使用される（すなわち［Ｎ_O］が一定である場合）。１／［Ｂ］と１／［Ｆ］との両方の量に誤差が発生するために、二重最小自乗法(a doubly weighted least squares analysis)が使用された。この方法では、残余は、当てはめられた直線とデータの点との間の自乗された誤差の合計を最小にする、両方の軸線に沿って重が加えられる。Ｋγとしての値は、それが基質に対する酵素の吸着親和性、および吸着物の単位表面あたりの吸着部位の数のそれそれを意味するという点で重要である。Ｋγ の値は、セルロースに融合酵素の吸着における異なる物理的および化学的な要素の影響の意味のある比較がされ得るために特に必要とされる。アビセルに結合する酵素の能力は、系のなかに導入された酵素の、上清に存在する結合していない酵素の、および蒸留水で基質から流出された結合酵素の、既知の活性濃度に比較した結合酵素という割合として表される。様々な酵素濃度におけるセルロース基質への酵素の吸着機構の速度論的研究は、異なるｐＨ、温度、および緩衝液のイオン強度でのＫγ決定を含んでいる。固定された融合タンパク質の安定性（作用および貯蔵）は、バッチまたはカラムにおけるアビセルへの酵素の結合、および酵素反応が時間の関数として起こると考えることによって決定される。回収されたグルコース量、融合タンパク質の活性濃度、および時間に対する流出したタンパク質の量は、固定反応の安定性を示している。実施例４基質結合に反応性のあるＤＮＡ断片の単離基質結合に関与する特異的ＳＢＤペプチドを決定するために、いくつかの遺伝学的な試みが有効である。一つの方法は、遺伝子の一部を除去し、そしてさらに特有の遺伝子断片として切りつめられたタンパク質をコードする変異遺伝子を得るために、残りの遺伝子ーベクター断片のインフレーム融合する制限酵素を使用する。他の方法は、ＤＮＡの５’および３’末端の外側から、または、内側からは遺伝子内の制限された切れ目から整然とヌクレオチドを欠失させるために、エキソヌクレアーゼ（例えば、Bal31）の使用を伴う。これらの遺伝子欠失法は、短縮されたタンパク質分子をコードする変異遺伝子を生産するという最終な目的を有し、その短縮されたタンパク質分子の機能は、元のタンパク質分子と同じであるかもしれないし、違うかもしれない。切りつめられたタンパク質における機能の変化は、一部のペプチドフラグメントperseの除去、または、いくつかのアミノ酸を欠失の結果として修飾されたタンパク質におこる立体配置の変化から起こり得る。Ａ．ＸｍａIII制限酵素を使用した欠失 Cellulomanas fimiのエキソグルカナーゼCexをコードするpUC12-1.1cexの領域は、図６に示されており、適切な制限部位および大きさを備えている。ヌクレオチド(nt)1962とnt2580との間の遺伝子の一部が脱離したプラスミドの SalI（Ｓ）部分的切断の最初の結合の研究が、結果的に切りつめられたタンパク質がアビセルに結合しなかったことを示した。この結果は、SalI部位(nt 1962) から停止コドン(nt2189のTGA) までにコードされたペプチドが、酵素の結合にとって必須の領域であることを示すものではない。欠失の開始の少し前の領域はセルロースに結合するための重要な領域とされ得る。SalIの欠失した変異によって、セルロースに結合しないことに寄与する他の要因は、欠失したCexとベクターのｂ−ガラクトシダーゼとの間の融合タンパク質の形状である。アミノ酸が１１０の平均分子量を有すると仮定すると、SalI変異における欠失ペプチドは、大きさが約８kDである。この予想された大きさは、タンパク的に分割されたエキソグルカナーゼの試料からＦＰＬＣ(Pharmacia社)によって精製され、それに続いてアビセルにしっかりと結合することが確かめられたペプチドの大きさによく一致する。この結果は、特異的なＳＢＤペプチドが、この見かけの８kDの領域内にあることを明確に示している。ＦＰＬＣ精製された約８kDのペプチドのＮ末端は、配列決定され、どこにプロテイナーゼ分割部位があるか正確に決定された。結果は、アミノ酸分割部位は、ＰＴボックス（最後のスレオニンとセリンとの間）の終わりに起こることを示している。このアミノ酸配列の結果によれば、ＳＢＤペプチドの算定された大きさは、11.3 kDである。ＦＰＬＣ精製されたＳＢＤペプチドの大きさと、アミノ酸分割部位から推定されたように算定された大きさとの間の食い違いは、ポリアタリルアミドケルにおけるペプチドの異常な移動から引き起こされ得る。基質結合と関係する更なるアミノ酸配列を描写するため、プラスミドpUC12-1. lcexを、XmaIIIを用いて部分的に切断した。大きさが5107bpに相当する描写されたフラグメントを単離し、接続し、E. coli JM101に導入した。nt1873とnt2074 との間の遺伝子の一部が欠失され、残存する遺伝子-ベクターが互いにインフレームに再結合された。切りつめられたタンパク質が生成され、そのアビセルへの結合親和性が特徴付けされ、元のcexタンパク質と比較された。Ｂ．Ｂａｌ３１を使用した欠失 Bal31は、高度に特異的なヌクレアーゼで、内在の一本鎖を切ることなしに、ｄｓＤＮＡの３’および５’末端の両方を同時に切断する。酵素がＣａ⁺⁺を絶対的に必要とするため、酵素による切断の程度は、二価のキレート剤、ＥＧＴＡを反応液単に加えることによって監視および操作することができる(Maniatisら、1 982 )。 cex遺伝子をBaI31の切断にさらす前に、次の領域を含むループアウト(loopout )フラグメントを合成した：１）欠失が始まる制限部位（ベクター内で、かつC. fimi 遺伝子挿入物のちょうど数ヌクレオチド下流に唯一見られるXbaI）；２）ベクターにも挿入物にも見られない第二の制限部位（NcoI）；全ての３つの読み取り枠に停止コドンを含むヌクレオチドの拡張。ループアウト断片は、挿入物を含むM13ssＤＮＡの鋳型に最初にアニールした。その断片は、d(A,T,G,およびC)TPと、クレノーポリメラーゼおよびリガーゼを加えて伸長した。この断片は、E. coli JM101に形質転換し、標識されたループアウトプライマーとハイブリッド結合したプラークを選別した。ＤＮＡの複製物をE. coli形質転換体から単離した。その複製されたＤＮＡは、ＤＮＡを描写するために、最初にXbaIで切断した。その同一の描写されたＤＮＡを、さらにNcoI で切断した。NcoI部位を有する一端に位置するC. fimi ＤＮＡを含むスタッファー(stuffer)ＤＮＡ断片は、NcoIでも切断される。スタッファーＤＮＡは、NcoI 部位を再生するために、描写されたＤＮＡに接続した。この構成物は、さらに、ほぼ同じ速度で両端（スタッファーＤＮＡおよびcex遺伝子挿入物における）から切断を行なうBal31を用いて切断した。反応混合物は、反応試料の一部を除去することおよびBal31の切断を止めるためにＥＧＴＡを含むＤＮＡ緩衝液に入れることによって、周期的に停止させた。スタッファーＤＮＡは、NcoIを加えることによって、不活性化されたBal31切断ＤＮＡ混合物に移した。ＤＮＡは、さらにクレノーポリメラーゼで満たし、アガロースケルでサイズ分画し、閉環した環状の二本鎖ＤＮＡを得るためにpUC12にブラント(blunt)接続された。接続された混合物からの数μｌを、二つの制限酵素を用いて切断した。そのような方法を用いれば、Bal31による切断の結果として挿入物の長さの小さな差異が簡単に確かめられる。ＤＮＡは、有能なE. coli JM101細胞に形質転換された。見かけ上８k d ＳＢＤペプチドに対して生成されたcex抗体の３末端で切断された変異体のファミリーを選択することが、正の切断クローンを同定するために使用された。異なる切断変異体から生成される切りつめられたタンパク質は、アビセルに結合する能力および上述したような触媒活性を調べた。実施例５アビセルに固定されたβ−グルコシダーゼ融合タンパク質を用いたセロビオースからのグルコースの生成この手順は、エンドグルカナーゼ-エキソヌクレアーゼのコインキュベーション(coincubation)を使用し、続いてβ-グルコシダーゼが固定されているアビセルカラムに、得られたセロビオース混合物を送る（図７Ｂ参照）。その方法は、次の通りである。発酵容器内で、適切な割合のエンドグルカナーゼとエキソヌクレアーゼの両方を、分解するためのセルロース物質を含む媒質に添加した。酵素は、媒質に溶けるセロビオースを生成するために一定時間反応させる。酵素を伴う使用された媒質の全てが、最初にエンドグルカナーゼおよびエキソグルカナーゼの両方を固定しかつ集結させるアビセルカラムにかけた。セロビオースを含む流出物は、第二のセロビオースをグルコース単位に加水分解するβ-グルコシダーゼＣＢＤ_Cex融合タンパク質が固定されたアビセルカラムにかけた。エンドグルコシダーゼおよびエキソグルコシダーゼは、溶出によって最初のカラムから回収した。両方のカラムは、精製および酵素の転換のために何度か再使用することができる。実施例６ＣｅｎＡ-アルカリ性ホスファターゼ融合タンパク質発現カセットの準備ＴｎｐｈｏＡは大腸菌(E. coli)アルカリ性ホスファターゼ遺伝子ｐｈｏＡからその信号配列（’ｐｈｏＡ）を除いたものを含有するトランスポゾンＴｎ５の誘導体である。正しいリーディングフレーム中にある発現された遺伝子中に転位的挿入を行うことにより、ＰｈｏＡ融合タンパク質が作られる。もし標的遺伝子がタンパク質エクスポート(export)シグナルを含有しているなら、これらは融合タンパク質の分泌を律することが可能である。この分泌は、アルカリ性ホスファターゼ活性によって検知することができ、これは酵素がペリプラズム(periplasm ic)に分泌されたときにのみ存在する。Ｔｎｐｈｏ遺伝子は、複数のクローニング部位を有するプラスミド中でC. fimi ｃｅｎＡ遺伝子を用いてｐｈｏＡ遺伝子を作るために用いられる。重要なタンパク質をコードする遺伝子は、複数クローニング部位（ｍｃｓ）にクローン化され、融合タンパク質として発現される。この遺伝子生産物は、アビセル(Avicel)などのセルロースに結合し、C. fimiプロテアーゼを用いてＣｅｎＡ融合の相手から切断することによって、精製される。Ａ．遺伝子融合の準備と分析ＣｅｎＡで遺伝子融合を生じるために、Ｔｎｐｈｏでの転位的突然変異誘発が用いられる。ｃｅｎＡを含むプラスミドはｐＵＣＥ２、ｐＴＺ１８Ｕでクローン化された１．６kb ＳｓｔＩｃｅｎＡ断片、ｐＵＣ１８の多官能誘導体である（ヤニシュ-ペロン(Yanisch-Perron)他，遺伝子(Gene)（１９８５）３３：１０３-１１９）。ｐＴＺ１８Ｕはユー・エス・バイオケミカルズ社(U.S．Biochemic als)から入手可能である。ｃｅｎＡ遺伝子のカルボキシ末端基を削除し、ｐＴＺ１８Ｕの複数クローン化部位とＰｒｏ−Ｔｈｒボックス(box)とを並列するために、オリゴヌクレオチド指向の突然変異誘発(Zolerら，Nucleic Acids Res．（１９８２）１０：６４８７-６５００及びZolerら，Methods Enzymol．（１９８３）１００：４６８-５００)を用いた。スクリーニングの手順には、プローブとして突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いるドットブロット(dot blot)ハイブリッド形成と、制限分析とが含まれる。欠失領域の配列を確かめるために、鎖終結法によるＤＮＡ配列決定が行われた（ヤニシユ-ペロン，上記）。転位の発生は、トランスポゾンを含む欠陥ラムダフアージ、λＴｎｐｈｏＡ- １、による大腸菌ＣＣ１１８（ｐＵＣＥＣ２）の感染によって仲介された（Guti errezら，J．Mol．Biol．（１９８７）１９５：２８９-２９７）。ｐＵＣＥＣ２（図４）はｐｃＥＣ-２からのｃｅｎＡコード化配列を発現ベタターｐＵＣ１８に転移することによって誘導された（Guoら（１９８８）FEMS Microbiol. Lett ４９，２７９-２８３）。大腸菌ＣＣ１１８はｐｈｏＡ遺伝子中に欠失を含む。ＣｅｎＡを用いた枠中での(in-frame)ｃｅｎＡ中への転位的挿入はペリプラズムへエクスポートされるＣｅｎＡ−ＰｈｏＡ融合タンパク質を生じ、分泌はＣｅｎＡシグナルペプチドによって促進される。カナマイシン（トランスポゾン指向）及びアンビシリン抵抗性に関して選択されたコロニーを、色素形成基質リン酸５ -ブロモ-４-クロロ-３-インドリル（ＸＰ）上でのアルカリ性フォスファターゼ活性に関してスクリーニングした。ＰｈｏＡ＋コロニーからのプラスミドＤＮＡを再形質転換(retransform)し、上記の様に選択してスクリーニングした。ＰｈｏＡ＋コロニーを、コンゴレッドを用いて染色されたカルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）プレート上でのエンドグルカナーゼ活性に関してスクリーニングした（Greenwoodら，FEBS Letters（１９８４）２：２５９-２６３）。所望の表現型は、Ｐｈｏ＋、Ｅｎｇ−、及びアンピシリン及びカナマイシンへの抵抗性である。プラスミドＤＮＡをＰｈｏＡ＋、ＥｎｇＡ−コロニーから単離し、制限消化及びアガロースケル電気泳動によって分析した。スクリーニングされた５５のコロニーの内、３４は正しい配向においてｃｅｎＡでＴｎｐｈｏＡ挿入を有していた。この挿入は、ｃｅｎＡ遺伝子全体を通して起こった。これらのクローンの中には、枠外(out-of-frame)挿入、すなわち融合のタンパク質生産物を見た場合に明らかとなる可能性、を有することができるものもある。ＣｅｎＡ−ＰｈｏＡ融合タンパク質のいくつかのセルロース結合の分析により、５０mMリン酸塩緩衝剤（ｐＨ７．０）及び０．５ＭＮａＣｌを用いて厳密に洗浄しても、融合タンパク質かろ紙に結合することがわかる。セルロースに結合しＣ．ｆｉｍｉプロテアーゼ切断部位を含有する一つの融合タンパク質を、さらに調べるために選択した。鎖終結法を用いるＤＮＡ配列決定によって、ＴｎｐｈｏＡの正確な挿入位置を決定した。アビセルへの結合を容易にし、アビセルからの溶出を引き起こすような緩衝剤条件も、上記の様に決定された（実施例３参照）。Ｃ．ｆｉｍｉプロテアーゼ部位を含むこれらの融合、例えばＣＢＤ-ＰＴ-ＰｈｏＡ、に関して、アビセル結合融合タンパク質をC. fimiプロテアーゼと共にインキュベートし、限外ろ過によって濃縮されたタンパク質分解性断片を放出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＰｈｏＡ活性サイモグラム又はウエスタンイムノブロット (Western immunoblot)により、又はゲルろ過クロマトグラフィーにより分析した。基質結合断片をＳＤＳに溶解し、Ｐｒｏ-Ｔｈｒボックスへの抗血清を用いてプローブしてＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びウエスタンイムノブロットによって分析した（ラングスフオード(Langsford)他，FEBS Letters（１９８７）２２５：１６３- １６７）。Ｂ．融合タンパク質の精製融合タンパク質を含有する、清澄化された大腸菌細胞抽出物を、この融合タンパク質のアビセルマトリックス（例えば、５０mMリン酸塩，ｐＨ７．０）への結合を促進する緩衝剤中で、アビセルカラムにかけた。非特異的に結合したタンパク質を除去するために緩衝剤でカラムを完全に洗浄したのちに、Ｃ．ｆｉｍｉプロテアーゼをカラムにかけ、緩衝剤を通過させて洗浄した。集めた画分をアルカリ性フォスファターゼ活性、及びイオン交感又はゲルろ過クロマトグラフィーによってさらに精製された酵素ヒークに関して検定した。プロテアーゼ濃度及び流量などの精製条件は、アルカリ性フォスファターゼ活性の回収を最適化するように変えた。実施例７薬輸送のためのCellulomonas fimiセルロース結合領域の使用Ａ．インターロイキン２の溶解性／持続性ＣｅｎＡセルロース結合領域をコードするＤＮＡ配列とＩＬ-２又はその機能的部分をコードしてそれを大腸菌などの発現宿主中に形質転換する遺伝子とを有してなる融合遺伝子を調製することにより、C. fimiセルラーゼのセルロース結合領域に結合したインターロイキン２（ＩＬ２）を有してなる融合タンパク質を上記の様に調製した。このＣｅｎＡＣＢＤ-ＩＬ２融合タンパク質をセルロース（アビセル又は綿）上のアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。次に、この融合タンパク質を６Ｍのグアニジル塩酸塩で溶出し、次に可溶の（カルボキシメチル）又は不溶の（アビセル）セルロースに結合した。抱合体をマウスに注射し（腹腔内(i.p.)）、腹腔液からＩＬ-２クリアランスの速度論を決定する。この可溶の抱合体を静脈内に(i.v.)注射し、血液からのＩＬ-２活性のタリアランスの速度論を決定する。これら抱合体は、循環からのＩＬ-２のタリアランス速度を減少する効用があることがわかる。Ｂ．抗原性／アジュバント活性上記の様に調製された、C. fimiセルラーゼのセルロース結合領域にそれぞれ結合したＩＬ-２とアルカリ性ホスファターゼとを有してなる二つのタンパク質を、各融合タンパク質上のセルロース結合領域（ＣＢＤ）を介して同じセルロース調製物に結合する。可溶（例えば、カルボキシメチル）及び不溶（例えば、アビセル）のセルロースマトリックスを共に用いる。この組み合わされたマトリックスＩＬ-２-ＣＢＤセルラーゼ-ＣＢＤ-アルカリ性フォスファターゼをマウスに注射し、１週間及び２週間後に免疫応答（細胞増殖及び抗アルカリ性フォスファターゼ抗体濃度）を決定する。これらの応答を同量のアルカリ性フォスファターゼ-ＣＢＤを注射して生ずる応答と比較する。続く実験において、ＨＩＶｇｐ１２０-ＣＢＲ及びPseudomonasポーリン-ＣＢＲを、アルカリ性フォスファターゼを変えた類似の系において試験した。ＩＬ-２の抗原との極めて接近した組み合わせは、与えられた抗原に体する免疫応答を増強するのに有効であることがわかる。実施例８ＣＢＤ-クーマシーブルー及びＣＢＤ-フルオレセイン又はローダミンイソチオシアナート（ＣＢＤ-ＦＩＴＣ又はＣＢＤ-ＴＲＩＴＣ）の生産クーマシーブルーＲ２５０（商標）又はＦＩＴＣのいずれかを、発現して単離したＣＢＤ群に付着することにより、ＣＢＤ-抱合体を作った。 C. fimiセルラーゼ（ＣＢＤｃｅｘ）から１１０のアミノ酸をコードして、断片からのインサートを含有するＰＴＺＥ０７（ＰＴＩＳ）ベクター（図８参照）からＣＢＤＣｅｘを発現した。このＣＢＤｃｅｘＤＮＡインサートは、上記実施例３で論じられたＣｅｘＣＢＤ遺伝子フラグメントに対応する。このフラグメントの発現生産物、ＰＡＧＥによって決定された８kDのタンパク質、を下の表１に示されたようなアビセル（微晶質セルロース）カラム上で単離した。この単離されたＣＢＤを、下記の様に染料又は蛍光標識に付着させるまで保管した。ｐＨ７の５０mM ＫＰＯ４緩衝剤中の２％のターマシーブルーを用いて２０℃ で数分間ＣＤＢｃｅｘをインキュベートすることにより、バイオラド(BioRad)（商標）からのクーマシーブルーＲ２５０をＣＢＤｃｅｘに付着し、ＣＢＤｃｅｘ- クーマシーを生産した。次の様に、ＦＩＴＣ又はＴＲＩＴＣをＣＢＤｃｅｘに付着した。フルオレセイン及びローダミンイソチオシアナート誘導体の両方がカップリング(coupling)反応に用いられる。遭遇する主な問題は、オーバー又はアンダーカップリング(over- or undercoupling)のいずれかであるが、抱合の水準は単純な吸収の読みによって決定することができる。（下記参照）。表１培養上澄みからのＣＢＤ_Cexの精製１．培養体積：ＬＢ中６０Ｌ＋アンピシリン（１００μg.ML¹）＋ＩＰＴＧ（０．１mM）２．セルロース：アビセルPH-101（乾燥粉末）１．０８kg ３．結合条件：一晩；室温；周期的手動(periodic manual) ４．アビセル洗浄：ｐＨ７の５０mMリン酸塩緩衝剤中（３０Ｌあたり）４×ＩＬ１ＭＮａＣｌ５．脱着(Desorption) ２抽出：ｐＨ７の５０mMリン酸塩緩衝剤中（３０Ｌあたり）２× １Ｌ８MGdmCl ６．ＹＭ-２膜（アミコン(Amicon)）を通す限外ろ過、及び水との交換。７．結果：回収されたＣＢＤ_Cexの総量：３２０mg（１回目抽出）９５０mg（２回目抽出）合計約１２００mg 吸着負荷：１．１１μg ＣＢＤ_Cex.mgアビセル^-1 収率：２０mg ＣＢＤ_Cex.Ｌ培養上澄み^-1 生産性：１mg ＣＢＤＢＤ_Cex.Ｌ培養上澄み^-1.ｈカップリングの前に、反応の完結後の遊離蛍光色素からの標識付けされたＣＢＤを分離するためのゲルろ過カラムを用意する。球状タンパク質に関して１０，０００の排除限界を有するゲルマトリックスを用いる（例えば、セファデクス(S ephadex)Ｇ２５）。微細サイズのビーズ（直径約５０μm）が好ましい。必要なカラムは、反応物の全体積に２０を乗じることにより決定される。製造者の指示（膨潤等）に従ってこのサイズのカラムを用意すれば、カラムはＰＢＳ中で平衡化する。０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐｈ９．０）中に少なくとも１mg/mlのＣＢＤ溶液を調製する。フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）又はテトラメチル -ローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）をジメチルスルホキシド（水を含まない、最上級のものが利用できる）中に１mg/mlで溶解する。この溶液は、各標識付け反応毎に新鮮なものを調製する。１mlのタンパク質溶液毎に、５０μ gの染料溶液を加える。この染料は５mlの分割量で非常にゆっくりと加えなければならず、タンパク質溶液は添加のあいだ穏やかにしかし連続的に撹拌しなければならない。次にこの反応物は４℃で８時間暗所に置かれる。次に５０mMまでＮＨ₄Ｃｌを加え、この混合物を４℃で２時間インキュベートする。次にキシレンシラノール(cylanol)を０．１％まで、グリセロールを５％まで加えた。結合しない染料をゲルろ過によって抱合体から分離し、カップリング反応物をカラムの頂部に注意深く層にする。次にこの抱合されたＣＢＤをＰＢＳで溶出する。これは、通常室内光下で見ることができる。この抱合体を光を通さない容器中のカラム緩衝剤中で４℃で保管する。適当であれば、０．０２％までアジ化ナトリウムを加える。低濃度のＣＢＤ（すなわち、＜１mg/ml）を用いる場合は、通常ＢＳＡを１％の最終濃度まで加えると有利である。フロオレセインカップリングに関しては、タンパク質に対するフルオレセインの割合は４９５nm及び２８０nmの吸収を計測することにより概算できる。ローダミンに関しては、５７５nm及び２８０nmで計測される。ローダミンに関しては、５７５nm及び２８０nmで計測される。フルオレセインの吸収の割合（４９５-２８０nm）は０．３と０．７との間である。これらより下の割合では低い信号を生じ、一方、高い割合は高いバックグラウンドを示す。この割合が低すぎると、より低い水準のＣＢＤとより高い水準の染料とを用いて抱合が繰り返される。もしより高い水準が見受けられるならば、この標識付けは適当な変更をして繰り返され、標識付けされたＣＢＤはＦＰＬＣカラムクロマトグラフィーによってさらに精製される。実施例９除去可能なインクとしてのＣＢＤ-クーマシー及びＣＢＤ-フルオレセインイソチオシアナートの使用Ａ．紙用染料がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に付着したとき、ＰＢＤcexに付着したとき、あるいは溶液中で遊離しているときに、紙に選択的に結合した染料の量を比較することにより、紙からのＣＢＤcex-クーマシーブルーの選択的結合及び除去を試験した。２種類の紙、ワットマン(Whatman)の＃３及びニトロセルロース、を用いた。ＣＢＤcexクーマシーブルーを円形にいずれかの紙の上におき、２分間乾燥し、２００mlのＫ₂ＰＯ₄緩衝剤ｐＨ７で１５分間、５００mlのＫ₂ＰＯ₄ 緩衝剤ｐＨ７で５時間、そして２００mlのＫ₂ＰＯ₄緩衝剤ｐＨ７で１時間洗浄した。一晩から２４時間、１０％メタノール中の５％酢酸中で脱染色(destaining) することによって、非特異的に結合した染料を除去した。次にこの紙を５０℃で１５分間オーブン乾燥した。洗浄工程に続いて、遊離の染料は結合せずＢＳＡに結合した染料は弱く結合するが、一方でＣＢＤcex-クーマシーブルーは紙に結合したままである。低イオン強度（例えば、蒸留水）又は高ｐＨ（例えば、炭酸ナトリウム緩衝剤，ｐＨ９、又は０．１ＭＮａＯＨ）の溶液を用いて、ＣＤＢcex-クーマシーブルーを紙から除去した。また、プロテアーゼＫを用いた処理（５０mg/ml，３７ ℃，２０分）によっても、ＣＤＢcex-クーマシーブルーを紙から除去した。Ｂ．透明包装材料用再生セロフアン包装材料に関して、ＣＢＤcex-クーマシーの選択的結合及び除去を試験した。Ｃ．生存植物組織用生存植物組織（例えば、トウヒ葉）に関して、ＣＢＤcex-ＦＩＴＣの選択的結合及び除去を実証した。Ｄ．綿繊維用綿繊維に関して、ＣＢＤcex-ＦＩＴＣの選択的結合及び除去を試験した。ＣＢＤcexを１０分間緩衝剤中で繊維に結合した。この繊維を５０mMリン酸塩緩衝剤，ｐＨ７．０，で５回洗浄した。最初の２回の洗浄工程の後では、繊維からＣＢＤcex-ＦＩＴＣは除去されなかった。しかし、プロテアーゼＫの存在下（５０mg /ml，３７℃，２０分）では、ＣＢＤcex-ＦＩＴＣは完全に除去された。実施例１０ＣｅｎＡ．ｐ３０及びＣＢＤ．ＰＴ_CenAの精製。大腸菌中で組換え型C. fimi ＤＮＡから合成される（図９，レーン３）、ＣｅｎＡの非グリコシル化された形態の精製は、Gilkesら（１９８８）J．Biol．Che m. ,２６３：１０４０１-１０４０７に記載されている。この酵素は、Ｔｈｒ１６５とＶａｌ１６６の間（すなわちＰ．Ｔ．ボックスのカルボキシル末端）でC. f imi プロテアーゼによって２つの断片に切断される。この安定な２９．７kDa、カルボキシルメチル末端断片（ｐ３０）はＣｅｎＡ触媒領域を有してなる；これはサイズ排除クロマトグラフフィーによる消化から精製される（図９，レーン２）。対応するアミノ末端断片は、Ｐ．Ｔ．ボックスを加えたＣＢＤを有してなるが、非化学量論的な比率で生産される。このことは多分、それがさらにタンパク質分解を受けやすいためである、上記Gilkesら。従って、このポリペプチドの生産のための代わりの方法が採用された。ｃｅｎＡ遺伝子は、触媒領域をコードする領域を除去するためにインビトロで取り扱われた（図１０Ａ）。結果として得られる遺伝子断片を、大腸菌を形質転換するために用いられた組換え型プラスミドｐＵＣ１８-ＣＢＤ．ＰＴを与えるために、ｐＵＣ１８中に結合した（図１０Ｂ）。このプラスミド上のｃｅｎＡ遺伝子断片は、図１０Ｃに示すように、タンパク質ＣＢＤ．ＰＴ_CenA（すなわち、ＰＴｈｒ１６５を欠いた.Ｔ.ボックスを加えた全ＣＢＤ）をコードする。ＣＢＤ．ＰＴ_CenAは上記Gilkesらに示されたセルロースアフィニティークロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーによって、大腸菌ＪＭ１０１（ｐＵＣ１８-ＣＢＤ．ＰＴ）細胞抽出物から精製された（図１１）。ＣＢＤ．ＰＴ_CenAはｐＨ９．４（すなわち理論的ｐＩより３．２ｐＨ単位だけ上）で陰イオン交換カラムに非常に弱く結合したが、たぶんその低い電荷密度による（Warrenら（１９８６）タンパク質(Proteins)，１：３３５-３４１）。しかし、汚染するタンパク質はより強く結合したので、クロマトグラフィーの段階では効果的だった。この精製されたＣＢＤ．ＰＴ_CenA調製物は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって判断したところ、均質であった（図９，レーン１）。標準タンパク質に関して、その見かけの分子質量（２０．０kDa）は初期の構造から予想される分子質量（１４．１kDa）より大きかった。このＰＴボックスは異常な電気泳動の移動を生じることが前に示された（Gilkesら（１９８９）J．Biol ．Chem. ,２６４：１７８０２-１７８０８）。見かけ上均質になるまでｐ３０も精製した（図９，レーン２）；少量（≦合計１％）の３０kDa汚染物は、精製されたＣｅｎ調製物中で顕著であった（図９，レーン３）。実施例１１ＣｅｎＡ．ＣＢＤ．ＰＴ_CenA及びｐ３０のＢＭＣＣへの吸着の分析３０℃でのＣｅｎＡ及びＣＢＤ．ＰＴ_CenAの細菌性の微晶質セルロース（ＢＭＣＣ）への吸着の速度論を図２（挿入図）に示す。吸着等温線を計測するために用いた濃度範囲に関して、高低の合計タンパク質濃度を試験した。両方の濃度で、最も短い実験的に実施可能なインキュベーション時間（０．２分）内で、平衡を完了した。続く１６．７時間のあいだ、いずれのタンパク質の正味の脱着はなかった。ｐ３０の検知可能な吸着はなかった。１８．３μMのＣｅｎＡでの１８時間のインキュベーションの後のＢＭＣＣの加水分解は、可溶の還元糖の放出によって決定したところ、全セルロースの２．７％に達した；１８．３μMのｐ３０を用いて０．８％の加水分解を得た。同じモル濃度でのＣＢＤ．ＰＴ_CenAを用いた場合には、加水分解は検知されなかった。ＣＢＤ．ＰＴ_CenAおよびｐ３０（１．１- ３２．２μMの合計タンパク質）に関する平衡吸着等温線は図１２（主要なパネル）に示されている。速度論的実験で見られたｐ３０の吸着が存在しないことが確かめられた。ＣｅｎＡ及びＣＢＤ．ＰＴ_CenAによるＢＭＣＣの飽和を試みたが、用いられた最高の合計タンパク質濃度では達成されなかった。このように飽和に至らなかったことは、図１３（挿入図）に示されるように、同じデータを半対数の形態（log Ｆに対してＢ）でプロットすると強調された。ＣｅｎＡ及びＣＢＤ．ＰＴ_CenAに関するデータのスカッチャードプロット（図１３、主要なパネル）は非線形（上方に凹）であり、ＢＭＣＣを有するこれらのタンパク質の複雑な相互作用を示した。ＣｅｎＡ、ＣＢＤ．ＰＴ_CenA及びＣｅｘのＢＭＣＣへの結合に関する吸収パラメータを次の表に示す。これらのパラメータ（±積算された標準誤差）は、実施例３、Ｃ、で述べられたように、二重逆数形態（図１４）でプロットされた吸着データから計算された。Ｋ_a及びａに関する値は、実施例３、Ｃ、に詳述されているように、［Ｎ_O］＝１０１μmol格子残基.gセルロース^-1を用いて計算した。アビセル、ＢＭＣＣ及び再発生(regenerated)セルロース（ＲＣ）を含むセルロースに対するＣＢＤｃｅ_x の吸着及び相対的親和性と、キチンのものとを図１５及び１６に示す。図１７は、ポリサッカリダーゼの少なくとも多糖結合領域がタンパク質あるいは化学的一部、例えば染料や色素、等の重要な配位子に連接している、混成のタンパク質を有してなる本発明の組成物に、ＣＥＢ_Cexの結合上の洗浄剤を添加することの影響を示している。セルロースからの２つの異なった除去可能な標識の再組成物(recomposition)を酵素的にでデバインドする(debinding)例が実施例１８に示されている。この組成物は、キチンやセルロースなどの多糖マトリックスへの、又は可溶か不可溶のこれらの化字的誘導体の一つへの、様々な配位子の結合のための用途があることがわかる。これらの組成物は、例えば薬輸送系として、マトリックスに結合して、あるいはバイオリアクター及び固定化酵素リアクター中で用いることができ、あるいは、配位子を単離又は精製して、次に配位子を回収して、続いて特異的なプロテアーゼを用いて切断するための手段として用いることができる。これらはまた、インク又はフルオレセインあるいはローダミンなどの蛍光化合物などの、染料を、紙や綿などの多糖マトリックスに可逆的に結合する効用があることがわかる。本明細書に述べられた全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する技術において通常の知識を有する者の知識の水準を示している。全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物及び特許出願が特定的にそして個々に援用して示されているのと同じ程度に、本書において援用される。これで本発明は全て述べられたが、当該技術において通常の知識を有するものに明らかなように、添付の請求項の意図又は範囲から離れることなく、これに多くの変更及び修正を加えることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＧ０１Ｎ 33/573 8310−2Ｊ // Ｄ０６Ｐ 3/60 Ｚ 9356−4Ｈ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者キルバーン，ダグラスジョージカナダ国Ｖ６Ｓ１Ｔ４ブリティッシュコロンビアバンクーバーウェスト 29スアベニュ 3728 (72)発明者ミラー，ロバートカーミージュニアカナダ国Ｖ７Ｒ４Ｎ９ブリティッシュコロンビアノースバンクーバーハックルベリーレーン 5535 (72)発明者ウォーレン，リチャードアントニージョンカナダ国Ｖ５Ｚ１Ｚ１ブリティッシュコロンビアバンクーバーウェスト 21ストアベニュ 942

Claims

【特許請求の範囲】１．融合タンパク質を含むポリサッカリドを得るための方法であって、ポリサッカリダーゼの基質結合領域と所望のペプチドとを備える融合タンパク質を調製すること、上記融合タンパク質と基質を含むポリサッカリドマトリックスとを上記ポリサッカリダーゼのための条件下で接触させ、それによって上記基質結合領域を上記ポリサッカリドマトリックスに結合させること、を備えていることを特徴とする方法。２．上記の調製は、転写の５’-３’方向中に、転写開始調節領域、翻訳開始領域、上記融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、及び翻訳と転写終止領域とを含み、上記融合タンパク質の発現が上記開始及び終止領域により調節されるＤＮＡ構造を包含する宿主細胞を培養すること、及び上記融合タンパク質を分離すること、を備えていることを特徴とする請求の範囲第１項の方法。３．上記の分離が、上記融合タンパク質と上記ポリサッカリダーゼの基質を備えるマトリッスとを接触させることを含むことを特徴とする請求の範囲第２項の方法。４．上記ポリサッカリダーゼがセルラーゼであることを特徴とする請求の範囲第１項の方法。５．上記セルラーゼがセルロモナス・フィミ（Cellulomonas fimi）から得られたものであることを特徴とする請求の範囲第４項の方法。６．上記セルラーゼがエンドグルカナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）またはセロビオヒドロラーセ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）であることを特徴とする請求の範囲第４項の方法。７．上記ポリサッカリドマトリックスが不溶性セルロースであることを特徴とする請求の範囲第４項の方法。８．上記不溶性セルロースが微晶質セルロース、リグノセルロース性材料または綿であることを特徴とする請求の範囲第７項の方法。９．上記リグノセルロース性材料が、木材、木材パルプ、または植物組織を含むことを特徴とする請求の範囲第７項の方法。１０．上記ポリサッカリドマトリックスが可溶性ポリサッカリドであることを特徴とする請求の範囲第４項の方法。１１．上記可溶性ポリサッカリドがカルボキシメチルセルロースであることを特徴とする請求の範囲第１０項の方法。１２．構成材料として、（１）（ａ）化学的一部が接合され、（ｂ）ポリサッカリダーゼの、基質結合領域を含むアミノ酸配列、またはそれの機能的部分、を備える抱合体、及び（２）上記ポリサッカリダーゼのポリサッカリド基質を含むポリサッカリドマトリックス、とを備え、上記構成材料（１）は、上記（ｂ）を介して構成材料（２）に結合されていることを特徴とする組成物。１３．上記ポリサッカリダーゼが、β−１，４−グリカナーゼであり、かつ上記ポリサッカリド基質がβ−１，４−グリカンを含むことを特徴とする請求の範囲第１２項の組成物。１４．上記β−１，４−グリカンはセルロースまたはキチンを含むことを特徴とする請求の範囲第１３項の組成物。１５．上記セルロースが、紙、微晶質セルロース、綿及びカルボキシメチルセルロースよりなる群から選択されたものであることを特徴とする請求の範囲第１４項の組成物。１６．上記ポリサッカリダーゼの上記基質結合領域に上記ポリサッカリダーゼのための基質を接触させる条件下で、上記基質結合領域に上記マトリックス中のポリサッカリド基質を結合させる方法によって得られたことを特徴とする請求の範囲第１２項の組成物。１７．上記化学的一部がポリペプチドに融合されることを特徴とする請求の範囲第１２項の組成物。１８．上記化学的一部が、（ａ）放射性核種、（ｂ）発色団、染料、色素、酵素及びフルオレセインよりなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第１７項の組成物。１９．上記染料がクマシーブルーを含むことを特徴とする請求の範囲第１８項の組成物。２０．上記発色団が、（ａ）フルオレセインイソチオシアナート、及び（ｂ）テトラメチルローダミンイソチオシアナート、よりなる群から選択されたものであることを特徴とする請求の範囲第１８項の組成物。２１．上記ポリサッカリドマトリックスが不溶性セルロースであることを特徴とする請求の範囲第１２項の組成物。２２．上記不溶性セルロースが微晶質セルロース、紙、綿、木材、パルプまたは植物組織であることを特徴とする請求の範囲第２１項の組成物。２３．上記ポリサッカリドマトリックスが可溶性ポリサッカリドであることを特徴とする請求の範囲第１２項の組成物。２４．上記可溶性ポリサッカリドがカルボキシメチルセルロースであることを特徴とする請求の範囲第２３項の組成物。２５．（ａ）化学的一部が接合され、（ｂ）ポリサッカリダーゼから調製し得る、基質結合領域を含むアミノ酸配列、またはそれの機能的部分、を備える除去可能標識。２６．請求の範囲第２５項の除去可能標識を備え、そこでポリサッカリドが上記ポリサッカリダーゼのための基質であり、かつ上記除去可能標識が上記ポリサッカリドから上記アミノ酸配列を通して結合されたことを特徴とするポリサッカリド。２７．上記アミノ酸配列がプロテアーゼ認識配列を含むことを特徴とする請求の範囲第２６項のポリサッカリド。２８．上記プロテアーゼ認識配列がポリサッカリダーゼに固有のものであることを特徴とする請求の範囲第２７項のポリサッカリド。２９．上記プロテアーゼ認識配列がポリサッカリダーゼと異種であることを特徴とする請求の範囲第２７項のポリサッカリド。３０．上記プロテアーゼ認識配列が、ポリサッカリドと（ａ）低イオン強度及び（ｂ）高ｐＨよりなる群から選択される特徴をもった除去溶液と接触させること、を含む方法によって除去され得るものであることを特徴とする請求の範囲第２６項のポリサッカリド。３１．上記プロテアーゼ認識配列が、ポリサッカリドと、上記プロテアーゼ認識配列で上記アミノ酸配列を分割し得るプロテアーゼを備える除去溶液とを接触させること、を含む方法によって除去され得るものであることを特徴とする請求の範囲第２６項のポリサッカリド。３２．上記プロテアーゼが非特異性プロテアーゼであることを特徴とする請求の範囲第３１項のポリサッカリド。３３．上記除去可能標識が、上記化学的一部と上記アミノ酸配列との間の特異的プロテアーゼ分割部位を更に含んだことを特徴とする請求の範囲第２６項のポリサッカリド。３４．上記特異的プロテアーゼ分割部位が、（ａ）因子Ｘａ、（ｂ）トロンビン、及び（ｃ）トリプシン、よりなる群から選択されるプロテアーゼのためのものであることを特徴とする請求の範囲第３３項のポリサッカリド。