CN110835364B - 一种基于氨基酸特异性识别实现蛋白质分离纯化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于实现蛋白质分离纯化的肽链标签，其带有特定氨基酸。本发明还提供了一种水溶性高分子聚合物，其分子中具有谷氨酰胺单元结构。本发明还提供了一种基于氨基酸特异性识别实现蛋白质分离纯化方法，其以大肠杆菌为宿主细胞表达带有上述特定氨基酸肽链标签的蛋白；利用谷氨酰胺转氨酶对赖氨酸的伯胺基团和谷氨酰胺的酰胺基团有特异性识别交联的功能，实现带有肽链标签的蛋白与水溶性高分子聚合物的特异性识别交联形成缀合物；利用凝血酶对特定序列的识别与切割，实现对缀合物的切割，完成蛋白质的分离纯化。本发明利用谷氨酰胺转氨酶和凝血酶对氨基酸特异性识别的方法，将为蛋白质纯化分离等方面提供基础，具有广泛的应用前景。

Description

一种基于氨基酸特异性识别实现蛋白质分离纯化的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，一种基于氨基酸特异性识别实现蛋白质纯化分离的方法。
背景技术
目前蛋白质纯化分离的方法有膜分离、盐溶盐析、等电点沉淀法、凝胶过滤、选择性吸附分离、亲和层析。目前用的较多的方法是镍柱亲和层析。镍柱亲和层析的原理是镍离子可以与带有组氨酸标签的蛋白质结合，而无组氨酸标签的蛋白质不会与镍离子结合，从而会从柱子底端流出。通过梯度洗脱，咪唑竞争性结合到镍离子上，使得目的蛋白被洗脱。在采用镍柱纯化的过程中，可能由于样品或者洗脱的问题，使得纯化后的蛋白溶液中仍然带有部分杂蛋白。
因此，目前存在的问题是要研究开发一种在不影响蛋白质活性的情况下对蛋白质进行分离纯化的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种用于实现蛋白质分离纯化的肽链标签，以及一种水溶性高分子聚合物，所述肽链标签带有特定氨基酸，将该肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列插入蛋白基因经表达后所获得的带有该肽链标签的蛋白能够利用谷氨酰胺转氨酶实现蛋白质与所述水溶性高分子聚合物交联，同时使得凝血酶能识别聚合物-蛋白质缀合物，并将蛋白质从缀合物中切割下来。
本发明还提供了一种上述肽链标签进行蛋白质纯化分离的方法，该方法将上述带有特定氨基酸的肽链标签的基因插入蛋白基因进行表达培养，所获得的带有该肽链标签的蛋白利用谷氨酰胺转氨酶实现蛋白质与上述水溶性高分子聚合物的交联形成聚合物-蛋白质缀合物，再利用凝血酶特异性地将蛋白质从缀合物中切割下来，实现蛋白质的纯化分离，同时能保证蛋白质的活性无明显损失。
为此，本发明第一方面提供了一种用于分离纯化蛋白质的肽链标签，其肽链长度为11个氨基酸，肽链中带有一个赖氨酸，其氨基酸序列如Sequence No.1所示。
根据本发明，在所述肽链中，赖氨酸的位点靠近N端。
在本发明的一些实施例中，所述肽链的脱氧核糖核苷酸序列如Sequence No.2所示。
本发明第二方面提供了一种用于实现蛋白质分离纯化的水溶性高分子聚合物，其分子中带有与谷氨酰胺相似的结构，并且其能够通过本发明第一方面所述的肽链标签与蛋白质形成缀合结构。
在本发明的一些具体实施例中，所述水溶性高分子聚合物的分子中带有谷氨酰胺单元结构。
本发明第三方面提供了一种如第一方面所述的肽链标签进行蛋白质分离纯化的方法，其包括：
步骤K，将肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列插入蛋白质基因片段5’端，获得带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段；
步骤L，表达带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段，获得带有肽链标签的蛋白质；
步骤M，在谷氨酰胺转氨酶(TGase)存在条件下对带有肽链标签的蛋白质与水溶性高分子聚合物进行交联形成水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物，并通过超滤除去杂蛋白；
步骤N，在凝血酶存在条件下对水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物进行切割，获得纯蛋白质；
其中，所述水溶性高分子聚合物为本发明第二方面所述的水溶性高分子聚合物。
根据本发明的一些实施方式，在步骤M中，在谷氨酰胺转氨酶(TGase)存在条件下对带有肽链标签的蛋白质与水溶性高分子聚合物进行交联形成水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物，并通过超滤除去杂蛋白，获得除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液。
在本发明的一些实施例中，以底物溶液的体积计谷氨酰胺转氨酶的使用量为1wt％-3wt％。
本发明中，所述底物溶液由带有肽链标签的粗蛋白质溶液和水溶性高分子聚合物或其水溶液混合后形成。
在本发明的一些实施例中，以底物溶液体积计含带有肽链标签的蛋白质的含量为5-10mg/mL，水溶性高分子聚合物的含量为3-5mg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述交联的温度为20-30℃。
在本发明的一些实施例中，交联时间为4-12小时。
根据本发明的一些进一步的实施方式，在步骤N中，向除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液中加入凝血酶，并在凝血酶存在条件下对水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物进行切割，获得纯蛋白质。
根据本发明，以除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液的体积计，凝血酶的使用量为20-30U/mL。
在本发明的一些实施例中，所述切割的温度为20-37℃。
在本发明的一些实施例中，切割的时间为3-12小时，优选为3-9小时。
根据本发明，所述步骤L包括：
步骤B，将带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质的基因片段连接到载体上构建重组表达载体；
步骤C，重组表达载体转入宿主细胞，获得表达菌株；
步骤D，将表达菌株进行发酵培养，并以诱导剂进行诱导表达，然后将菌体破胞后重新悬浮，离心，收集上清液，获得带有肽链标签的粗蛋白质溶液。
本发明中，所述宿主细胞为大肠杆菌，优选所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明中，所述载体为pET32b(+)载体。
本发明中，所述诱导剂为IPTG。
在本发明的一些实施例中，所述诱导剂的加入量为发酵液体积的0.05wt％。
根据本发明，在步骤D中，将表达菌株接入发酵培养基中进行发酵培养，然后加入诱导剂进行诱导表达培养。
根据本发明的优选的实施方式，将表达菌株接入发酵培养基中进行发酵培养，当OD600达到0.8-1.0时，加入诱导剂进行诱导表达培养。
本发明中，所述发酵培养基为LB培养基。
在本发明的一些实施例中，发酵培养的温度为37℃。
在本发明的一些实施例中，诱导表达培养的温度为15-25℃。
在本发明的一些具体优选的实施方式中，在摇床中进行发酵培养。
在本发明的一些具体优选的实施例中，在本发明的所述摇床转速为180rpm。
在本发明的一些具体优选的实施方式中，在摇床中进行诱导表达培养。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述摇床转速为180rpm。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述诱导表达培养的时间为12-20小时。
本发明是利用基因工程技术，通过大肠杆菌表达带有肽链标签的蛋白质，再利用谷氨酰胺转氨酶(TGase)对肽链中氨基酸的特异性识别来实现蛋白质与高分子聚合物的交联形成缀合物，再利用凝血酶特异性对缀合物切割分离蛋白。该方法具有以下优点：
(1)在基因层面实现蛋白质的肽链修饰，不需要对蛋白质再进行体外修饰；
(2)采用生物催化剂—谷氨酰胺转氨酶(TGase)交联带有肽链标签的蛋白质，凝血酶从缀合物切割蛋白质，该方法具有特异性识别的功能；
(3)谷氨酰胺转氨酶(TGase)和凝血酶不会成为产物的一部分，可以实现重复利用；
(4)将蛋白分子在基因层面改造，使得其自带肽链，将肽链交联，不会影响蛋白质分子本身的结构和性能。
附图说明
下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：
图1示出谷氨酰胺的结构式。
图2为由N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺(Z-QG)制备合成水溶性高分子聚合物的单体(Z-QG-EMA)的反应示意图。
图3为单体Z-QG-EMA和丙烯酰胺聚合生成水溶性高分子聚合物的反应示意图。
图4为利用本发明中所述的肽链标签和水溶性高分子聚合物进行蛋白质分离纯化的机理示意图。
图2至图4中的附图标记说明：11N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺(Z-QG)；12合成水溶性高分子聚合物的单体(Z-QG-EMA)(n＝1)；13甲基丙烯酸-2-羟乙酯(HEMA)；4丙烯酰胺；20蛋白质纯品；21带有肽链标签的蛋白质；30谷氨酰胺转氨酶(TGase)；40凝血酶；100水溶性高分子聚合物(n＝1，P＝88，q＝44)；121水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物。
图5为谷氨酰胺转氨酶交联带有GKT肽标签的增强型绿色荧光蛋白的电泳图，其中，泳道1为TG酶(TGase)，泳道2为反应0小时，泳道3为反应6小时，泳道4为反应12小时。
图6为凝血酶切割带有GKT肽标签的增强型绿色荧光蛋白的电泳图，其中，泳道1为起始时刻样品，泳道2为反应3小时，泳道3为反应6小时，泳道4为反应9小时。
图7为谷氨酰胺转氨酶交联带有GKT肽标签的碳酸酐酶的电泳图，其中，泳道1为TG酶，泳道2为反应0小时，泳道3为反应6小时，泳道4为反应12小时。
图8为凝血酶切割带有GKT肽标签的碳酸酐酶的电泳图，其中，泳道1为起始时刻样品，泳道2为反应2小时，泳道3为反应4小时，泳道4为反应6小时。
图9示出碳酸酐酶纯化前后的酶活力。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将结合附图详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
Ⅰ.术语
所述谷氨酰胺的结构式如图1所示，所述与谷氨酰胺相似的结构是指单体分子中具有谷氨酰胺的结构式中1-5位的单元结构，或者聚合物分子的重复单元中具有谷氨酰胺的结构式中1-5位的单元结构。
本发明中所述用语“重复单元”聚合物大分子中以共价键相互连接的、重复出现的、小而简单的结构单位。
本发明所述用语“单元结构”是指单体分子或聚合物大分子的重复单元中所含的具有特定原子组成结构的单元的结构。
本发明中所述“水”一词，在没有特别说明或限定的情况下是指去离子水、蒸馏水或超纯水。
Ⅱ.实施方案
如前所述，可能由于样品或者洗脱的问题，使得纯化后的蛋白溶液中仍然带有部分杂蛋白。鉴于此，本发明人对于蛋白质的分离纯化技术进行了大量的研究。
本发明人研究发现，采用带有特定氨基酸的肽链标签，将该肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列插入蛋白基因片段经表达后所获得的带有该肽链标签的蛋白能够利用谷氨酰胺转氨酶实现蛋白质与分子中带有与谷氨酰胺相似的结构的水溶性高分子聚合物交联形成缀合物，再利用凝血酶对肽链标签的特异性识别，将蛋白质从缀合物中分离下来，同时能保证蛋白质的活性无明显损失。本发明正是基于上述发现做出的。
为此，本发明第一方面所涉及的用于实现蛋白质分离纯化的肽链标签的肽链长度为11个氨基酸，肽链中带有一个赖氨酸，其氨基酸序列如表1(Sequence No.1)所示，本发明中也称为GKT肽；从表1可以看出，在肽链中，赖氨酸的位点靠近N端。
表1
序列号 肽链标签 肽链标签氨基酸序列
1 GKT肽 N-GKGGGLVPRGS-C
本发明人研究发现，在蛋白质基因片段中插入上述肽链的脱氧核糖核苷酸序列，并使得赖氨酸位点靠近N端，由此获得带有肽链标签的蛋白质；以大肠杆菌为宿主细胞，表达带有肽链标签的蛋白质，使得蛋白质N端具有肽链标签。
由于谷氨酰胺转氨酶(TGase)可催化蛋白质或多肽的谷氨酰胺残基和伯胺基团之间发生酰基转移反应，利用谷氨酰胺转氨酶(TGase)对赖氨酸的伯胺基团和谷氨酰胺的酰胺基团有特异性识别交联的功能，实现带有肽链标签的蛋白质的特异性识别交联。因此，可以认为上述肽链标签是实现蛋白质能被TGase交联的基础，而“在所述肽链中，赖氨酸位点靠近N端。”则可以认为是使得蛋白质能被TGase交联的必要条件。
相应于本发明上述第一方面，本发明第二方面所涉及的用于实现蛋白质分离纯化的水溶性高分子聚合物，可以理解为用于通过与蛋白质交联而实现蛋白质分离纯化的水溶性高分子聚合物，其分子中带有与谷氨酰胺相似的结构则可以认为是使得水溶性高分子能被TGase交联的必要条件，所述水溶性高分子聚合物能够通过本发明第一方面所述的肽链标签与蛋白质形成缀合结构。
所述谷氨酰胺的结构式如图1所示，所述与谷氨酰胺相似的结构是指聚合物分子的重复单元中具有谷氨酰胺的结构式中1-5位的单元结构。
在本发明的一些具体实施例中，所述水溶性高分子聚合物的分子中带有谷氨酰胺结构。
根据本发明一些具体的实施方式，本发明上述水溶性高分子聚合物的合成方法包括：
步骤F，在15毫升的N,N-二甲基甲酰胺中加入0.51g的N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺(Z-QG)、0.39g的甲基丙烯酸-2-羟乙酯、0.37g的二环己基碳二亚胺、0.29g的羟基苯并三唑一水合物、73mg的4-二甲氨基吡啶。试剂加入和混合的过程控制温度为0℃。然后缓慢升温至40℃，反应20小时。
步骤G，反应结束后，减压蒸馏除去有机溶剂，向蜡质残余物中加入二甲基亚砜，然后用乙酸乙酯稀释，用10％柠檬酸，5％碳酸氢钠，盐水的水溶液洗涤有机层，用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得到白色固体粉末，即为单体(Z-QG-EMA)。
步骤H，在1mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入0.0157g的单体(Z-QG-EMA)和0.0682g的丙烯酰胺，再加入0.0016g的偶氮二异丁腈。在60℃的条件下反应56小时。
步骤I，反应结束后，加入少量水，冷丙酮，充分沉淀后从混合物中回收白色固体，并真空干燥，即获得本发明上述水溶性高分子聚合物。
上述步骤F中由起始原料N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺(Z-QG)制备合成水溶性高分子聚合物的单体(Z-QG-EMA)的反应示意图如图2所示。
在上述步骤F中，用于制备合成水溶性高分子聚合物的单体的起始原料N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺(Z-QG)为市售产品，从图2可以看出，N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺(Z-QG)分子中具有谷氨酰胺的结构式中1-5位的单元结构，其与甲基丙烯酸-2-羟乙酯(HEMA)反应生成的用于合成水溶性高分子聚合物的单体(Z-QG-EMA)则会提供单体的双键，为后一步聚合提供双键位置，并且其分子中也具有谷氨酰胺的结构式中1-5位的单元结构。
在上述步骤H中，单体Z-QG-EMA和丙烯酰胺聚合，生成水溶性高分子聚合物，其反应示意图如图3所示。
从上述图2和3可以看出，本发明中用于合成制备水溶性聚合物的单体(Z-QG-EMA)的起始原料N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺、制备水溶性聚合物的单体(Z-QG-EMA)，以及水溶性聚合物分子的重复单元中均具有与谷氨酰胺相似的结构；具体地，用于合成制备水溶性聚合物的单体(Z-QG-EMA)的起始原料N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺、制备水溶性聚合物的单体(Z-QG-EMA)，以及水溶性聚合物分子的重复单元中均具有谷氨酰胺单元结构。
本领域技术人员应该了解的是，当提供双键的物质由HEMA改为其他物质时(例如把HEMA换成甲基丙烯酸2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙酯(TEGMA)，则会使得图2和图3中的n的值为2，即链更长)，则会产生不同的单体，从而合成一系列聚合物。
本发明中利用如第一方面所述的肽链标签、第二方面所述水溶性高分子聚合物进行蛋白质分离纯化的机理示意图如图4所示。从图4可以看出，本发明是利用基因工程技术，通过大肠杆菌表达带有肽链标签的蛋白质，再利用谷氨酰胺转氨酶(TGase)对肽链中氨基酸的特异性识别来实现蛋白质与高分子聚合物的交联形成缀合物，再利用凝血酶特异性对缀合物切割分离蛋白。
凝血酶是一种广泛用于切割标签的蛋白酶，凝血酶一些经常使用的识别位点是L-V-P-R-G-S,L-V-P-R-G-F,和M-Y-P-R-G-N。
凝血酶能识别并切割的常用序列有一种为“L-V-P-R-G-S”，因此在肽链标签中插入该序列则是则可以认为是使得蛋白质能被TGase交联的必要条件。相应地，所述肽链的脱氧核糖核苷酸序列如表2(Sequence No.2)所示。
表2
序列号 肽链标签 肽链标签脱氧核糖核苷酸序列
2 GKT肽 GGT AAA GGT GGT GGT CTG GTT CCT CGC GGT TCT
根据本发明的一些实施方式，本发明第三方面所涉及利用如第一方面所述的肽链标签进行蛋白质分离纯化的方法，可以理解一种基于氨基酸特异性识别实现蛋白质分离纯化的方法，其包括：
步骤K，将肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列插入蛋白质基因片段5’端，获得带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段；
步骤L，表达带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段，获得带有肽链标签的蛋白质；
步骤M，在谷氨酰胺转氨酶(TGase)存在条件下对带有肽链标签的蛋白质与水溶性高分子聚合物进行交联形成水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物，并通过超滤除去杂蛋白；
步骤N，在凝血酶存在条件下对水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物进行切割，获得纯蛋白质；
其中，所述水溶性高分子聚合物为本发明第二方面所述的水溶性高分子聚合物。
上述蛋白质的分离纯化过程如图4所示。
本发明人通过SDS-PAGE表征所获得的蛋白，结果显示蛋白质的分子量变大，证明蛋白质形成共价键，即属于TGase交联蛋白质形成异肽键的结果，由此证明该步骤中在谷氨酰胺转氨酶(TGase)存在条件下对带有肽链标签的蛋白质进行交联获得了交联蛋白质；
根据本发明的一些实施方式，在步骤M中，在谷氨酰胺转氨酶(TGase)存在条件下对带有肽链标签的蛋白质与水溶性高分子聚合物进行交联形成水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物，并通过超滤除去杂蛋白，获得除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液。
本发明人通过试验研究发现，酶的用量影响蛋白的交联速度，酶量过少，则交联速度过慢，但是酶量过多，则成本过高，优选地，以底物溶液的体积计谷氨酰胺转氨酶的使用量为1wt％-3wt％。
在本发明的一些实施例中，所述交联的温度为20-30℃，交联时间为4-12小时。
本发明中，所述底物溶液由带有肽链标签的粗蛋白质溶液和水溶性高分子聚合物或其水溶液混合后形成。这可以理解为，将水溶性高分子聚合物或将其预先溶于水后形成的水溶液加入带有肽链标签的粗蛋白质溶液混合后制成底物溶液。
在本发明的一些实施例中，以底物溶液体积计含带有肽链标签的蛋白质的含量为5-10mg/mL，水溶性高分子聚合物的含量为3-5mg/mL。
根据本发明的一些进一步的实施方式，在步骤N中，向除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液中加入凝血酶，并在凝血酶存在条件下对水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物进行切割，获得纯蛋白质。
根据本发明，以除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液的体积计，凝血酶的使用量为20-30U/mL。
在本发明的一些实施例中，所述切割的温度为20-37℃，切割的时间为3-12小时，优选为3-9小时。
本发明中对于表达带有肽链标签脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段的方法没有特别的限制，可以采用本领域常规的方法来表达带有肽链标签的蛋白质基因片段。例如，在一些实施例中：所述步骤L包括：
步骤B，将带有肽链标签脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质的基因片段连接到pET32b(+)载体上构建重组表达载体；
步骤C，重组表达载体转入作为宿主细胞的大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达菌株；
步骤D，将表达菌株接入LB培养基中进行发酵培养，当OD600达到0.8-1.0时，加入诱导剂IPTG进行诱导表达培养，然后将菌体破胞后重新悬浮，离心，收集上清液，获得带有肽链标签的粗蛋白质溶液，其中所述诱导剂的加入量为发酵液体积的0.05wt％。
在上述步骤D中，在摇床中进行发酵培养，所述摇床转速为180rpm；所述发酵培养的温度为37℃。
在上述步骤D中，在摇床中进行诱导表达培养，所述摇床转速为180rpm；所述诱导表达培养的温度为15-25℃，所述诱导表达培养的时间为12-20小时。
在上述步骤D中，将菌体破胞后加入缓冲溶液重新悬浮，离心，收集上清液，获得带有肽链标签的粗蛋白质溶液。
在本发明的一些实施例中，所述缓冲溶液为0.05mol/L的Tris-HCl溶液。
本发明中SDS-PAGE(蛋白电泳)采用DYCZ-24K电泳槽(北京六一生物科技有限公司)进行，根据蛋白质亚基分子量的不同实现分开蛋白质的目的，具体方法包括：
(1)分离胶的选择：根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，本章实验采用12％浓度的预制胶。
(2)设备检漏：将凝胶板和电泳玻璃板按顺序装好并固定，在电泳玻璃板和凝胶板间注满电泳缓冲液，静置15-20min，观察液面是否下降，是否有液体漏出，若无则进行下一步操作，反之，则拆除重新进行安装，并重复检漏至液面不下降，证明设备密闭性良好。
(3)制样：样品和上样缓冲液比例为3:1，取经预处理后样品45μL与15μL上样缓冲液混合均匀，在沸水中煮5-10min。
(4)上样：拔出样梳，将制得的样品向每孔内加20μL，在单独的一个孔中加蛋白marker10μL。
(5)SDS-PAGE凝胶电泳：加样完成后，向电泳槽中补充适量电泳缓冲液，接通电源，设置电压120V进行电泳，电泳时间70min左右。
(6)凝胶剥离与染色脱色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶剥离凝胶板后放在培养皿内，用蒸馏水小心清洗1-3次，倒入染色液考马斯R-250，染色40-60min，染色结束后，蒸馏水清洗3-5次，倒入脱色液10％的乙酸溶液脱色，30-60min后更换一次脱色液，脱色至蛋白条带清晰即可。
本发明中N60 Touch超微量分光光度计(Sonics&Materials)测定的碳酸酐酶酶活，1U碳酸酐酶酶活定义：pH＝8.0，25℃下，1分钟内转化1μmol乙酸对硝基苯酯为对硝基苯酚所需的酶量，具体方法如下：
(1)在1毫升体系中，加入670μL 0.1mol/L pH＝7.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)；加入300μL 3mmol对硝基乙酸苯酯溶液；加入30μL的游离酶液；在348nm波长下监测8分钟，0到8分钟每隔1分钟取样测吸光度。
(2)对硝基苯酚的标准曲线：以348nm处吸光度为纵坐标，对硝基苯酚浓度为横坐标绘制标准曲线。
本发明首先提供了一种带有特定氨基酸的肽链标签，所述的肽链标签的氨基酸序列如表1所示，所述的肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列如表2所示。其次，本发明提供了一种分子中具有谷氨酰胺单元结构的水溶性高分子聚合物。再次，本发明提供了一种基于氨基酸特异性识别实现蛋白质分离纯化方法。该方法是以大肠杆菌为宿主细胞，表达带有上述特定氨基酸肽链标签的蛋白质；利用谷氨酰胺转氨酶(TGase)对赖氨酸的伯胺基团和谷氨酰胺的酰胺基团有特异性识别交联的功能，实现带有肽链标签的蛋白质与水溶性高分子聚合物的特异性识别交联形成缀合物；利用凝血酶对特定序列的识别与切割，实现对缀合物的切割，完成蛋白质的纯化分离。本发明利用谷氨酰胺转氨酶(TGase)和凝血酶对氨基酸特异性识别的方法，将为增强型绿色荧光蛋白、碳酸酐酶、甲酸脱氢酶、脂肪酶等各种蛋白质的纯化分离方面提供基础，具有广泛的应用前景。
Ⅲ、实施例
以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。
实施例1：带有GKT肽标签的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的纯化分离
1.水溶性高分子聚合物合成：
(1)在15毫升的N,N-二甲基甲酰胺中加入0.51g的N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺、0.39g的甲基丙烯酸-2-羟乙酯、0.37g的二环己基碳二亚胺、0.29g的羟基苯并三唑一水合物、73mg的4-二甲氨基吡啶。试剂加入和混合的过程控制温度为0℃。然后缓慢升温至40℃，反应20小时。
(2)反应结束后，减压蒸馏除去有机溶剂，向蜡质残余物中加入二甲基亚砜，然后用乙酸乙酯稀释，用10％柠檬酸，5％碳酸氢钠，盐水的水溶液洗涤有机层，用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得到白色固体粉末，即为单体(Z-QG-EMA)。
(3)在1mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入0.0157g的单体(Z-QG-EMA)和0.0682g的丙烯酰胺，再加入0.0016g的偶氮二异丁腈。在60℃的条件下反应56小时。
(4)反应结束后，加入少量水，冷丙酮，充分沉淀后从混合物中回收白色固体，并真空干燥。即为一种水溶性高分子聚合物。
2.带有GKT肽标签的增强型绿色荧光蛋白的表达
(1)制备带有GKT肽标签的脱氧核糖核苷酸序列的增强型绿色荧光蛋白的基因片段
将肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列插入蛋白质基因片段5’端，获得带有GKT肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的增强型绿色荧光蛋白的基因片段；
(2)重组表达载体的构建
将带有GKT肽标签的脱氧核糖核苷酸序列的增强型绿色荧光蛋白的基因片段连接到pET32b(+)载体上构建重组表达载体；
(3)构建重组菌株
重组表达载体转入大肠杆菌，获得表达菌株；
(4)带有肽链标签蛋白质的表达
将表达菌株进行发酵培养,以IPTG为诱导剂进行诱导表达。将表达菌株于LB培养基中，37℃，180rpm摇床培养，待OD600达到0.8时，加入IPTG，温度设定为25℃，180rpm摇床培养，连续培养12小时。IPTG的加入量为发酵液体积的0.05％。
将菌体破胞后加入0.05mol/L的Tris-HCl溶液(缓冲溶液)重新悬浮，离心，收集上清液，获得带有GKT肽链标签的增强型绿色荧光蛋白的粗蛋白质溶液。
3.制备水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物
使用谷氨酰胺转氨酶对带有GKT肽标签的增强型绿色荧光蛋白与水溶性高分子聚合物交联形成水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物。将带有GKT肽链标签的增强型绿色荧光蛋白的粗蛋白质溶液和水溶性高分子聚合物水溶液混合后形成底物溶液，其中蛋白质的含量为10mg/mL，水溶性高分子聚合物的含量为5mg/mL。谷氨酰胺转氨酶相对于底物溶液的总体积的使用量为1wt％，交联温度为20℃，交联时间为12小时。交联结束后，采用100KDa的超滤膜除去低于100KDa的杂蛋白质，获得除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液。
4.切割水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物
在除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液中使用凝血酶切割聚合物-蛋白质缀合物。以除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液的体积计，凝血酶的用量为30U/mL，切割温度为37℃，切割时间为9小时。
谷氨酰胺转氨酶交联带有GKT肽标签的增强型绿色荧光蛋白的电泳结果如图5所示。图5中，泳道1为TG酶(TGase)，泳道2为反应0小时，泳道3为反应6小时，泳道4为反应12小时。经过12小时的反应，游离的GKT-EGFP明显减少，表明GKT-EGFP与聚合物结合。
凝血酶切割带有GKT肽标签的增强型绿色荧光蛋白的电泳结果如图6所示。图6中，泳道1为起始时刻样品，泳道2为反应3小时，泳道3为反应6小时，泳道4为反应9小时。经过9小时的反应，箭头所指的条带明显增多，表明EGFP从聚合物中分离出来，且分离效果明显，产生的条带单一。同时，荧光分光光度计(F-320，天津港东科技)的分析结果显示，经过该方法纯化的增强型绿色荧光蛋白仍具有绿色荧光。
实施例2：带有GKT肽标签的碳酸酐酶(CA)的纯化分离
1.水溶性高分子聚合物合成：
(1)在15毫升的N,N-二甲基甲酰胺中加入0.51g的N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺、0.39g的甲基丙烯酸-2-羟乙酯、0.37g的二环己基碳二亚胺、0.29g的羟基苯并三唑一水合物、73mg的4-二甲氨基吡啶。试剂加入和混合的过程控制温度为0℃。然后缓慢升温至40℃，反应20小时。
(2)反应结束后，减压蒸馏除去有机溶剂，向蜡质残余物中加入二甲基亚砜，然后用乙酸乙酯稀释，用10％柠檬酸，5％碳酸氢钠，盐水的水溶液洗涤有机层，用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得到白色固体粉末，即为单体(Z-QG-EMA)。
(3)在1mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入0.0157g的单体(Z-QG-EMA)和0.0682g的丙烯酰胺，再加入0.0016g的偶氮二异丁腈。在60℃的条件下反应56小时。
(4)反应结束后，加入少量水，冷丙酮，充分沉淀后从混合物中回收白色固体，并真空干燥。即为一种水溶性高分子聚合物。
2.带有GKT肽标签的碳酸酐酶的表达
(1)制备带有GKT肽标签的脱氧核糖核苷酸序列的碳酸酐酶的基因片段
将肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列插入碳酸酐酶基因片段5’端，获得带有GKT肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的碳酸酐酶的基因片段；
(2)重组表达载体的构建
将带有GKT肽标签的脱氧核糖核苷酸序列的碳酸酐酶的基因片段连接到pET32b(+)载体上构建重组表达载体；
(3)构建重组菌株
重组表达载体转入大肠杆菌，获得表达菌株；
(4)带有肽链标签蛋白质的表达
将表达菌株进行发酵培养,以IPTG为诱导剂进行诱导表达。将表达菌株于LB培养基中，37℃，180rpm摇床培养，待OD600达到0.8时，加入IPTG，温度设定为25℃，180rpm摇床培养，连续培养12小时。IPTG的加入量为发酵液体积的0.05％。
将菌体破胞后加入0.05mol/L的Tris-HCl溶液(缓冲溶液)重新悬浮，离心，收集上清液，获得带有GKT肽链标签的碳酸酐酶的粗蛋白质溶液。
3.制备水溶性高分子聚合物-蛋白质(碳酸酐酶)缀合物
使用谷氨酰胺转氨酶对带有GKT肽标签的碳酸酐酶与水溶性高分子聚合物交联形成水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物。将带有GKT肽链标签的碳酸酐酶的粗蛋白质溶液和水溶性高分子聚合物水溶液混合后形成底物溶液，其中带有GKT肽链标签的碳酸酐酶的含量为10mg/mL，水溶性高分子聚合物的含量为5mg/mL；谷氨酰胺转氨酶相对于底物溶液的总体积的使用量为1wt％，交联温度为20℃，交联时间为12小时。交联结束后，采用100KDa的超滤膜除去低于100KDa的杂蛋白质，获得除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质(碳酸酐酶)缀合物溶液。
4.切割水溶性高分子聚合物-蛋白质(碳酸酐酶)缀合物
在除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液中使用凝血酶切割聚合物-蛋白质缀合物。以除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液的体积计，凝血酶的用量为30U/mL，切割温度为25℃，切割时间为6小时。
谷氨酰胺转氨酶交联带有GKT肽标签的碳酸酐酶的电泳结果如图7所示。图7中，泳道1为TG酶(TGase)，泳道2为反应0小时，泳道3为反应6小时，泳道4为反应12小时。经过12小时的反应，游离的碳酸酐酶明显减少，表明GKT-CA聚合物结合。
凝血酶切割带有GKT肽标签的碳酸酐酶的电泳结果如图8所示。图8中，泳道1为起始时刻样品，泳道2为反应2小时，泳道3为反应4小时，泳道4为反应6小时。经过6小时的反应，箭头所指的条带明显增多，表明碳酸酐酶从聚合物中分离出来，且分离效果明显，产生的条带单一。
碳酸酐酶纯化前后的酶活力如图9所示。图9显示，采用该方法纯化得到的碳酸酐酶酶活无太大损失。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
<110> 北京化工大学
<120> 一种基于氨基酸特异性识别实现蛋白质分离纯化的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> （GKT肽）
<400> 1
Gly Lys Gly Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> （GKT肽）
<400> 2
ggtaaaggtg gtggtctggt tcctcgcggt tct 33

Claims (19)

1.一种利用用于实现蛋白质分离纯化的肽链标签和水溶性高分子聚合物进行蛋白质分离纯化的方法，其包括：
步骤K，将肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列插入蛋白质基因片段5’端，获得带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段；
步骤L，表达带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段，获得带有肽链标签的蛋白质；
步骤M，在谷氨酰胺转氨酶(TGase)存在条件下对带有肽链标签的蛋白质与水溶性高分子聚合物进行交联形成水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物，并通过超滤除去杂蛋白；
步骤N，在凝血酶存在条件下对水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物进行切割，获得纯蛋白质；
其中，所述肽链标签，其肽链长度为11个氨基酸，肽链中带有一个赖氨酸，其氨基酸序列如Sequence No.1所示，且在所述肽链中，赖氨酸的位点靠近N端；所述水溶性高分子聚合物的分子中带有与谷氨酰胺相似的结构，并且其能够通过用于实现蛋白质分离纯化的肽链标签与蛋白质形成缀合结构。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水溶性高分子聚合物的分子中带有谷氨酰胺单元结构。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽链的脱氧核糖核苷酸序列如Sequence No.2所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤M中，将谷氨酰胺转氨酶加入到带有肽链标签的蛋白质和水溶性高分子聚合物的底物溶液中进行交联形成水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物，并通过超滤除去杂蛋白，获得除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液；以底物溶液的体积计谷氨酰胺转氨酶的使用量为1wt％-3wt％；和/或，所述底物溶液由带有肽链标签的粗蛋白质溶液和水溶性高分子聚合物或其水溶液混合后形成；以底物溶液体积计含带有肽链标签的蛋白质的含量为5-10mg/mL，水溶性高分子聚合物的含量为3-5mg/mL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述交联的温度为20-30℃；和/或，交联时间为4-12小时。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤N中，向除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液中加入凝血酶，并在凝血酶存在条件下对水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物进行切割，获得纯蛋白质；以除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液的体积计，凝血酶的使用量为20-30U/mL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述切割的温度为20-37℃；和/或，切割的时间为3-12小时。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，切割的时间为3-9小时。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤L包括：
步骤B，将带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质的基因片段连接到载体上构建重组表达载体；
步骤C，重组表达载体转入宿主细胞，获得表达菌株；
步骤D，将表达菌株进行发酵培养，并以诱导剂进行诱导表达，然后将菌体破胞后重新悬浮，离心，收集上清液，获得带有肽链标签的粗蛋白质溶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌；和/或，所述载体为pET32b(+)载体；和/或，所述诱导剂为IPTG，所述IPTG的加入量为发酵液体积的0.05％。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤D中，将表达菌株接入发酵培养基中进行发酵培养，然后加入诱导剂进行诱导表达培养；和/或，所述发酵培养基为LB培养基；和/或，发酵培养的温度为37℃；和/或，诱导表达培养的温度为15-25℃。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，将表达菌株接入发酵培养基中进行发酵培养，当OD600达到0.8-1.0时，加入诱导剂进行诱导表达培养。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，在摇床中进行发酵培养；所述摇床转速为180rpm。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，在摇床中进行诱导表达培养；所述摇床转速为180rpm；和/或，所述诱导表达培养的时间为12-20小时。
16.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，在步骤D中，将表达菌株接入发酵培养基中进行发酵培养，然后加入诱导剂进行诱导表达培养；和/或，所述发酵培养基为LB培养基；和/或，发酵培养的温度为37℃；和/或，诱导表达培养的温度为15-25℃。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，将表达菌株接入发酵培养基中进行发酵培养，当OD600达到0.8-1.0时，加入诱导剂进行诱导表达培养。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，在摇床中进行发酵培养；所述摇床转速为180rpm。
19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，在摇床中进行诱导表达培养；所述摇床转速为180rpm；和/或，所述诱导表达培养的时间为12-20小时。
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