CN113480636A - 重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法,包括：利用大肠杆菌密码子的偏好性对重组人纤连蛋白进行密码子优化，构建重组表达载体。利用基因工程方法进行表达纯化，通过AKTA纯化仪使用PMB柱除细菌内毒素。经通过本发明的技术方案，重组人纤连蛋白纯化时间短，表达量高，纯度可达94%‑96%，细菌内毒素含量低，更具安全性，同时稳定性较好，也具有促进细胞增殖活性。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，特别涉及一种重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法。
背景技术
纤连蛋白（fibronectin，英文缩写FN）是一种在血液、间质外基质和细胞周基质中发现的关键黏附蛋白，是一种大分子糖蛋白，其分子量大约是440KD，由几乎两个相同的单体通过C末端二硫键相连。主要包括三种类型：I型、II型、III型。其中I型和II型含有链内二硫键，III型不含二硫键，使其在外力作用下可以部分展开。纤维连接蛋白（FN），其主要功能是增强细胞间粘连及细胞与基质的粘连，在调节细胞粘附、迁移、增殖等过程中发挥重要作用。
现有的FN大多数是动物的血液或组织中提取的天然的纤连蛋白，其产量有限、成本昂贵，限制了纤连蛋白的生产和在医疗、美容方面的应用。由于FN分子量太大（由2000多个氨基酸组成），难以被皮肤吸收。利用基因工程技术构建出与天然纤连蛋白在功能上相似的小分子重组纤连蛋白，有效解决了天然纤连蛋白分子过大难以生产的缺点，同时还保留了纤连蛋白活性，降低生产成本。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：1.一种重组人纤连蛋白（rhFN），其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
一种重组人纤连蛋白的制备方法,其特征在于,所述制备方法具体包括以下步骤：
S1:表达；将重组质粒rhFN-pET28a(+)转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得阳性基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-rhFN；经卡那霉素抗性LB平板筛选的阳性转化子，接种至10mL卡那霉素抗性LB培养基中过夜培养；
S2：诱导；次日进行转接，培养至对数生长期加入诱导剂IPTG进行诱导发酵，20℃诱导16小时，离心收集菌体；
S3:鉴定；S2的诱导过程中对未诱导菌液、诱导完成的菌液分别取样1.5mL，4℃、12000×g、5min离心收集菌体，1.5mLPBS复溶菌体，将菌体进行低温超声破碎，超声完成后，4℃、12000×g、5min离心分离上清及沉淀，用1.5mLPBS复溶沉淀；取未诱导菌液、诱导菌液、破碎离心上清、破碎离心沉淀样品各32μL，加入5×蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE鉴定蛋白的表达情况；
S4：纯化；使用AKTA纯化仪，连接Ni-NTA柱，采用分步洗脱的方法进行纯化，低温破碎菌体，离心收集上清，经亲和层析纯化得到重组人纤连蛋白；
S5：去除毒素；使用AKTA纯化仪，连接PMB柱除细菌内毒素。
作为优选方案，步骤S2中的具体步骤如下：次日按照终OD为0.04转接到700mLLB/瓶培养基中培养至OD600达到0.6~0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导发酵，IPTG为诱导剂，20℃诱导16小时，4℃、大于等于3000×g、40min离心收集菌体，得到菌泥，菌泥获得量为3g/L。
作为优选方案，步骤S4中的具体步骤如下：
S41：菌泥进行重悬，重悬后使用超声破碎仪或高压均质仪破碎菌悬液；
S42：破碎后的悬液加入到离心管中，平衡重量后，4℃、大于等于25000×g、30min，离心收集上清；
S43：离心后的菌液上清使用抽滤装置进行过滤，经过0.22μm滤膜过滤后作为蛋白原液进行后续试验；
S44：连接好AKTA和Ni-NTA柱，使用5-10倍柱体积的超纯水冲洗柱子，流速为柱料能承受最大流速的50%-80%；
S45:待流穿液电导值接近0且紫外吸收值无明显变化后，使用5-8倍柱体积的A液平衡柱子，直至流穿液电导值和紫外吸收值均达到稳定不变为止，流速为柱料能承受的最大流速的30%-50%；
S46:平衡好柱子后开始上样，流速为柱料能承受的最大流速的10%-30%，若蛋白原液体积较小而浓度较高，应适当减少流速或增加重复上样次数，当流穿液的紫外吸收值开始变化时，收集上样流穿液并取样进行SDS-PAGE电泳；
S47：上样完毕后，继续使用A液进行平衡，直至流穿液电导值和紫外吸收值接近上样前数值且稳定后，停止平衡；平衡流速为柱料能承受最大流速的30%-50%；
S48：柱子达到平衡后，采用分步洗脱的方式进行洗脱；第一步使用2%B和98%A进行洗脱，目的是洗脱杂蛋白。洗脱时流速为柱料能承受最大流速的30%-50%；在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS-PAGE电泳；
S49：当步骤S48中第一步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用5%B和95%A进行第二步洗脱，目的是洗脱杂蛋白。洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%-50%。在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS-PAGE电泳。
S410：当步骤S49中第二步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用30%B和70%A进行第三步洗脱，目的是洗脱目的蛋白。洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%-50%。在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS-PAGE电泳；如图4所示。
S411：当步骤S410中第三步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用100%B进行柱冲洗，洗去仍未洗下的蛋白；洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%-50%；
S412：使用ClinXImageAnalysis对SDS-PAGE电泳结果进行灰度分析，计算蛋白纯度；蛋白条带分析见图5，蛋白纯度分析见图6。
S413：纯化后蛋白使用紫外分光光度计进行浓度测定；
S414：纯化后的蛋白使用PALL30KD超滤管进行浓缩换液。离心程序为4℃，3800×g，4min，更换缓冲液为PBS，pH7.4；浓缩后蛋白再次使用紫外分光光度计进行浓度测定；
S415：浓缩后的蛋白取一部分进行稳定性试验，均分为两份，一份添加2%~5%终浓度的海藻糖和甘露醇，一份不添加任何保护剂，0.22μm滤器过滤除菌后放置于4℃冰箱过夜保存，第二天进行浓度测定。
作为优选方案，步骤S5中的具体步骤如下：
S51：将PMB除细菌内毒素纯化柱连接至AKTA上，使用5倍柱体积的缓冲液C冲洗柱子，流速为柱料能承受最大流速的30%-50%；
S52：使用20倍柱体积的超纯水冲洗柱子，流速为柱料能承受最大流速的50%-80%；
S53：待电导接近0且紫外吸收值不再变化时，使用3倍柱体积的PBS平衡柱子，流速为柱料能承受最大流速的30%-50%；
S54：平衡好柱子后开始上样，过夜循环上样蛋白以除去蛋白中的细菌内毒素，流速为柱料能承受的最大流速的10%-30%；
S55：使用PBS将柱中残留的蛋白冲出，直至电导和紫外吸收值均不再变化，流速为柱料能承受最大流速的30%-50%；
S56：除细菌内毒素后蛋白使用紫外分光光度计进行浓度测定，计算回收率，添加终浓度2%~5%的海藻糖和甘露醇后，进行分装冻干。
作为优选方案，缓冲液A为20mMTris，50mMNaCl，pH8.0；缓冲液B为20mMTris，50mMNaCl，500mM咪唑pH8.0；缓冲液C为20mMPB，1%脱氧胆酸钠，pH7.0。
一种重组人纤连蛋白的促细胞增殖活性测定方法,具体包括以下步骤：
M1：BALB/c3T3细胞以5000个细胞/孔，接种于96孔细胞培养板中（完全培养基），37℃，5％CO2细胞培养箱培养24小时；
M2：更换维持培养基继续培养24小时；
M3：分别加入不同浓度的重组人纤连蛋白以及PBS（阴性对照组），继续培养24小时；
M4:每孔加入10μLCCK-8试剂，37℃，5％CO2细胞培养箱孵育1小时后取出；
M5:用酶标仪读取96孔板在450nm的吸光值，记录测定结果。
一种重组人纤连蛋白的稳定性实验方法,具体包括以下步骤：
P1：纯化完成的蛋白溶液中加入海藻糖和甘露醇做为保护剂，使蛋白浓度为1mg/mL，4℃放置0天、1天、3天、5天、7天后检测其蛋白浓度并记录结果；
P2：纯化完成的蛋白溶液中加入海藻糖和甘露醇做为保护剂，当天冻干，将冻干后的蛋白进行复溶，使蛋白浓度为1mg/mL，分别在25℃及37℃放置0天、1天、3天、5天、7天后检测其蛋白浓度并记录结果；
P3：纯化完成的蛋白溶液中加入海藻糖、甘露醇及20%甘油作为保护剂，使蛋白浓度为1mg/mL，分别在25℃及37℃放置0天、1天、3天、5天、7天后检测其蛋白浓度并记录结果。
本发明由于采用了以上技术方案，与现有技术相比使其具有以下有益效果：本发明提供的重组纤连蛋白，采用大肠杆菌表达系统，为可溶性表达，制备方便、纯化过程简单、成本较低，生产周期较短。
1.本发明提供的纯化方法采用了超滤换液的方式，能够有效缩短纯化所需时间，大大缩短了生产周期。
2.rhFN纯化后的蛋白浓度可达到1mg/ml以上，使用ClinxImageAnalysis进行灰度分析纯度均在94%-96%之间。
3.本发明提供的纯化方法能够有效除去蛋白中的细菌内毒素，除细菌内毒素后的蛋白回收率超过90%，细菌内毒素含量低于1EU/μg，可有效减少对皮肤的刺激。
4.rhFN纯化后稳定性较好，在不添加任何保护剂的PBS中4℃放置一夜，蛋白的回收率可达到97%以上，在添加有海藻糖和甘露醇的保护剂中4℃放置一夜，回收率可达到99.5%。
5.本发明提供的重组纤连蛋白，可以有效的促进细胞增殖、分化。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述部分中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为构建的重组质粒rhFN-pET28a(+)图谱；
图2为重组人纤连蛋白时相表达分析结果图；
图3为重组人纤连蛋白可溶性表达分析结果图；
图4为重组人纤连蛋白纯化结果图；
图5为rhFN纯化后蛋白条带分析图；
图6为rhFN纯化后蛋白纯度分析图；
图7为重组人纤连蛋白促细胞增殖结果图；
图8为重组人纤连蛋白稳定性实验结果图，图中1：纯化完成蛋白4℃放置；2：冻干复溶蛋白25℃放置；3：冻干复溶蛋白37℃放置；4：甘油保存蛋白25℃放置；5：甘油保存蛋白37℃放置。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
下面结合图1至图8对本发明的实施例的重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法进行具体说明。
实施例1
重组人纤连蛋白的表达及鉴定
表达：将重组质粒rhFN-pET28a(+)转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得阳性基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-rhFN，经卡那霉素抗性LB平板筛选的阳性转化子，接种至10mL卡那霉素抗性LB培养基中过夜培养，次日按照终OD为0.04转接到700mLLB/瓶培养基中培养至OD600达到0.6~0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导发酵，IPTG为诱导剂，20℃诱导16小时，4℃、大于等于3000×g、40min离心收集菌体，得到菌泥，菌泥获得量为3g/L。表达时相如图2所示，随诱导时间的增加，目的蛋白的表达量增加。
鉴定：诱导过程中对未诱导菌液、诱导完成的菌液分别取样1.5mL，4℃、12000×g、5min离心收集菌体，1.5mLPBS复溶菌体，将菌体进行低温超声破碎，超声完成后，4℃、12000×g、5min离心分离上清及沉淀，用1.5mLPBS复溶沉淀。取未诱导菌液、诱导菌液、破碎离心上清、破碎离心沉淀样品各32μL，加入5×蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE鉴定蛋白的表达情况，图3所示，目的蛋白主要为可溶性表达。
实施例2
重组人纤连蛋白的纯化
溶液配制
缓冲液A：20mMTris，50mMNaCl，pH8.0
缓冲液B：20mMTris，50mMNaCl，500mM咪唑pH8.0
缓冲液C：20mMPB，1%脱氧胆酸钠，pH7.0
纯化时使用AKTA纯化仪，连接Ni-NTA柱，采用分步洗脱的方法进行纯化。
（1）菌泥进行重悬，重悬后使用超声破碎仪或高压均质仪破碎菌悬液。
（2）破碎后的悬液加入到离心管中，平衡重量后，4℃、大于等于25000×g、30min，离心收集上清。
（3）离心后的菌液上清使用抽滤装置进行过滤，经过0.22μm滤膜过滤后作为蛋白原液进行后续试验。
（4）连接好AKTA和Ni-NTA柱，使用5-10倍柱体积的超纯水冲洗柱子。流速为柱料能承受最大流速的50%-80%。
（5）待流穿液电导值接近0且紫外吸收值无明显变化后，使用5-8倍柱体积的A液平衡柱子，直至流穿液电导值和紫外吸收值均达到稳定不变为止。流速为柱料能承受的最大流速的30%-50%。
（6）平衡好柱子后开始上样，流速为柱料能承受的最大流速的10%-30%。若蛋白原液体积较小而浓度较高，应适当减少流速或增加重复上样次数。当流穿液的紫外吸收值开始变化时，收集上样流穿液并取样进行SDS-PAGE电泳。
（7）上样完毕后，继续使用A液进行平衡，直至流穿液电导值和紫外吸收值接近上样前数值且稳定后，停止平衡。平衡流速为柱料能承受最大流速的30%-50%。
（8）柱子达到平衡后，采用分步洗脱的方式进行洗脱。第一步使用2%B和98%A进行洗脱，目的是洗脱杂蛋白。洗脱时流速为柱料能承受最大流速的30%-50%。在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS-PAGE电泳。
（9）当第一步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用5%B和95%A进行第二步洗脱，目的是洗脱杂蛋白。洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%-50%。在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS-PAGE电泳。
（10）当第二步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用30%B和70%A进行第三步洗脱，目的是洗脱目的蛋白。洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%-50%。在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS-PAGE电泳，如图4所示，目的蛋白在150mM咪唑大量洗脱下来，且纯度达到95%以上。
（11）当第三步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用100%B进行柱冲洗，洗去仍未洗下的蛋白。洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%-50%。
（12）使用ClinXImageAnalysis对SDS-PAGE电泳结果进行灰度分析，计算蛋白纯度。蛋白条带分析见图5，软件分析结果为泳道中有4条蛋白条带，其中第3条为目的蛋白；蛋白纯度分析见图6，目的蛋白纯度结果为96%。
（13）纯化后蛋白使用紫外分光光度计进行浓度测定。
（14）纯化后的蛋白使用PALL30KD超滤管进行浓缩换液。离心程序为4℃，3800×g，4min，更换缓冲液为PBS，pH7.4。浓缩后蛋白再次使用紫外分光光度计进行浓度测定。
（15）浓缩后的蛋白取一部分进行稳定性试验，均分为两份，一份添加2%~5%终浓度的海藻糖和甘露醇，一份不添加任何保护剂，0.22μm滤器过滤除菌后放置于4℃冰箱过夜保存，第二天进行浓度测定。
实施例3
使用AKTA纯化仪，连接PMB柱除细菌内毒素。
（1）将PMB除细菌内毒素纯化柱连接至AKTA上，使用5倍柱体积的缓冲液C冲洗柱子，流速为柱料能承受最大流速的30%-50%。
（2）使用20倍柱体积的超纯水冲洗柱子，流速为柱料能承受最大流速的50%-80%。
（3）待电导接近0且紫外吸收值不再变化时，使用3倍柱体积的PBS平衡柱子，流速为柱料能承受最大流速的30%-50%。
（4）平衡好柱子后开始上样，过夜循环上样蛋白以除去蛋白中的细菌内毒素，流速为柱料能承受的最大流速的10%-30%。
（5）使用PBS将柱中残留的蛋白冲出，直至电导和紫外吸收值均不再变化，流速为柱料能承受最大流速的30%-50%。
（6）除细菌内毒素后蛋白使用紫外分光光度计进行浓度测定，计算回收率，添加终浓度2%~5%的海藻糖和甘露醇后，进行分装冻干。
高载量金属离子螯合层析填料对His-tag标签蛋白的回收率超过95%，回收纯度超过90%。His-Tag标签提高了目的蛋白的表达量和可溶性，极大地简化了人重组纤连蛋白的纯化流程。
实施例4
重组人纤连蛋白促细胞增殖活性测定
具体实施过程为：
（1）BALB/c3T3细胞以5000个细胞/孔，接种于96孔细胞培养板中（完全培养基），37℃，5％CO2细胞培养箱培养24小时。
（2）更换维持培养基继续培养24小时。
（3）分别加入不同浓度的重组人纤连蛋白以及PBS（阴性对照组），继续培养24小时。
（4）每孔加入10μLCCK-8试剂，37℃，5％CO2细胞培养箱孵育1小时后取出。
（5）用酶标仪读取96孔板在450nm的吸光值，记录测定结果。
具体试验结果如图7所示，本发明对其核苷酸序列进行优化后，经大肠杆菌可溶性表达的重组人纤连蛋白具有细胞增殖的作用，半数有效浓度EC50为0.01107ng/mL。
实施例5
重组人纤连蛋白稳定性实验
具体实施过程为：
（1）纯化完成的蛋白溶液中加入海藻糖和甘露醇做为保护剂，使蛋白浓度为1mg/mL，4℃放置0天、1天、3天、5天、7天后检测其蛋白浓度并记录结果。
（2）纯化完成的蛋白溶液中加入海藻糖和甘露醇做为保护剂，当天冻干，将冻干后的蛋白进行复溶，使蛋白浓度为1mg/mL，分别在25℃及37℃放置0天、1天、3天、5天、7天后检测其蛋白浓度并记录结果。
（3）纯化完成的蛋白溶液中加入海藻糖、甘露醇及20%甘油作为保护剂，使蛋白浓度为1mg/mL，分别在25℃及37℃放置0天、1天、3天、5天、7天后检测其蛋白浓度并记录结果。
具体结果如图8所示，本发明所述蛋白在各种条件下放置，7天内蛋白浓度维持稳定，蛋白的稳定性较好。
序列表
重组人纤连蛋白氨基酸顺序为：（SEQ ID NO.1）：
MGEIDKPSQMQVTDVQDNSISVKWLPSSSPVTGYRVTTTPKNGPGPTKTKTAGPDQTEMTIEGLQPTVEYVVSVYAQNPSGESQPLVQTAVTNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGTQSTAIPAPTDLKFTQVTPTSLSAQWTPPNVQLTGYRVRVTPKEKTGPMKEINLAPDSSSVVVSGLMVATKYEVSVYALKDTLTSRPAQGVVTT
未优化的核苷酸序列如下（SEQ ID NO.2）：
ccatgggcgaaattgacaaaccatcccagatgcaagtgaccgatgttcaggacaacagcattagtgtcaagtggctgccttcaagttcccctgttactggttacagagtaaccaccactcccaaaaatggaccaggaccaacaaaaactaaaactgcaggtccagatcaaacagaaatgactattgaaggcttgcagcccacagtggagtatgtggttagtgtctatgctcagaatccaagcggagagagtcagcctctggttcagactgcagtaaccaacattgatcgccctaaaggactggcattcactgatgtggatgtcgattccatcaaaattgcttgggaaagcccacaggggcaagtttccaggtacagggtgacctactcgagccctgaggatggaatccatgagctattccctgcacctgatggtgaagaagacactgcagagctgcaaggcctcagaccgggttctgagtacacagtcagtgtggttgccttgcacgatgatatggagagccagcccctgattggaacccagtccacagctattcctgcaccaactgacctgaagttcactcaggtcacacccacaagcctgagcgcccagtggacaccacccaatgttcagctcactggatatcgagtgcgggtgacccccaaggagaagaccggaccaatgaaagaaatcaaccttgctcctgacagctcatccgtggttgtatcaggacttatggtggccaccaaatatgaagtgagtgtctatgctcttaaggacactttgacaagcagaccagctcagggagttgtcaccactctcgag
优化的核苷酸序列如下（SEQ ID NO.3）：
CCATGGGCGAAATTGATAAACCGAGTCAGATGCAGGTTACCGATGTGCAGGATAATAGCATTAGTGTTAAATGGCTGCCGAGCAGCAGCCCGGTGACCGGTTATCGTGTTACCACCACCCCGAAAAATGGCCCGGGTCCGACCAAAACCAAAACCGCCGGTCCGGATCAGACCGAAATGACCATTGAAGGCCTGCAGCCGACCGTGGAATATGTTGTTAGTGTGTATGCCCAGAATCCGAGCGGCGAAAGTCAGCCGCTGGTTCAGACCGCAGTTACCAATATTGATCGCCCGAAAGGTCTGGCATTCACTGATGTGGATGTTGATAGCATTAAGATTGCATGGGAAAGCCCGCAGGGTCAGGTTAGTCGCTATCGCGTGACCTATAGCAGCCCGGAAGATGGCATTCATGAACTGTTTCCGGCCCCGGATGGCGAAGAAGATACCGCCGAACTGCAGGGTCTGCGCCCGGGTAGCGAATATACCGTGAGTGTTGTGGCACTGCATGATGATATGGAAAGTCAGCCTCTGATTGGCACCCAGAGCACCGCCATTCCGGCACCGACCGATCTGAAATTCACTCAGGTTACCCCGACCAGTCTGAGCGCCCAGTGGACCCCGCCGAATGTTCAGCTGACCGGTTATCGCGTTCGCGTGACCCCGAAAGAAAAAACCGGCCCGATGAAAGAAATTAATCTGGCCCCGGATAGTAGTAGTGTTGTTGTTAGTGGTCTGATGGTTGCAACCAAATATGAAGTGAGTGTGTATGCGCTGAAAGATACCCTGACCAGTCGTCCGGCCCAGGGTGTTGTTACCACCCTCGAG
在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 烟台科瑞斯生物有限责任公司
<120> 重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 272
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Gly Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln Met Gln Val Thr Asp Val Gln
1 5 10 15
Asp Asn Ser Ile Ser Val Lys Trp Leu Pro Ser Ser Ser Pro Val Thr
20 25 30
Gly Tyr Arg Val Thr Thr Thr Pro Lys Asn Gly Pro Gly Pro Thr Lys
35 40 45
Thr Lys Thr Ala Gly Pro Asp Gln Thr Glu Met Thr Ile Glu Gly Leu
50 55 60
Gln Pro Thr Val Glu Tyr Val Val Ser Val Tyr Ala Gln Asn Pro Ser
65 70 75 80
Gly Glu Ser Gln Pro Leu Val Gln Thr Ala Val Thr Asn Ile Asp Arg
85 90 95
Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile Lys Ile
100 105 110
Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr Arg Val Thr Tyr
115 120 125
Ser Ser Pro Glu Asp Gly Ile His Glu Leu Phe Pro Ala Pro Asp Gly
130 135 140
Glu Glu Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Gly Ser Glu Tyr
145 150 155 160
Thr Val Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met Glu Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ile Gly Thr Gln Ser Thr Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe
180 185 190
Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn
195 200 205
Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr
210 215 220
Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val
225 230 235 240
Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala
245 250 255
Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr
260 265 270
<210> 2
<211> 824
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ccatgggcga aattgacaaa ccatcccaga tgcaagtgac cgatgttcag gacaacagca 60
ttagtgtcaa gtggctgcct tcaagttccc ctgttactgg ttacagagta accaccactc 120
ccaaaaatgg accaggacca acaaaaacta aaactgcagg tccagatcaa acagaaatga 180
ctattgaagg cttgcagccc acagtggagt atgtggttag tgtctatgct cagaatccaa 240
gcggagagag tcagcctctg gttcagactg cagtaaccaa cattgatcgc cctaaaggac 300
tggcattcac tgatgtggat gtcgattcca tcaaaattgc ttgggaaagc ccacaggggc 360
aagtttccag gtacagggtg acctactcga gccctgagga tggaatccat gagctattcc 420
ctgcacctga tggtgaagaa gacactgcag agctgcaagg cctcagaccg ggttctgagt 480
acacagtcag tgtggttgcc ttgcacgatg atatggagag ccagcccctg attggaaccc 540
agtccacagc tattcctgca ccaactgacc tgaagttcac tcaggtcaca cccacaagcc 600
tgagcgccca gtggacacca cccaatgttc agctcactgg atatcgagtg cgggtgaccc 660
ccaaggagaa gaccggacca atgaaagaaa tcaaccttgc tcctgacagc tcatccgtgg 720
ttgtatcagg acttatggtg gccaccaaat atgaagtgag tgtctatgct cttaaggaca 780
ctttgacaag cagaccagct cagggagttg tcaccactct cgag 824
<210> 3
<211> 824
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ccatgggcga aattgataaa ccgagtcaga tgcaggttac cgatgtgcag gataatagca 60
ttagtgttaa atggctgccg agcagcagcc cggtgaccgg ttatcgtgtt accaccaccc 120
cgaaaaatgg cccgggtccg accaaaacca aaaccgccgg tccggatcag accgaaatga 180
ccattgaagg cctgcagccg accgtggaat atgttgttag tgtgtatgcc cagaatccga 240
gcggcgaaag tcagccgctg gttcagaccg cagttaccaa tattgatcgc ccgaaaggtc 300
tggcattcac tgatgtggat gttgatagca ttaagattgc atgggaaagc ccgcagggtc 360
aggttagtcg ctatcgcgtg acctatagca gcccggaaga tggcattcat gaactgtttc 420
cggccccgga tggcgaagaa gataccgccg aactgcaggg tctgcgcccg ggtagcgaat 480
ataccgtgag tgttgtggca ctgcatgatg atatggaaag tcagcctctg attggcaccc 540
agagcaccgc cattccggca ccgaccgatc tgaaattcac tcaggttacc ccgaccagtc 600
tgagcgccca gtggaccccg ccgaatgttc agctgaccgg ttatcgcgtt cgcgtgaccc 660
cgaaagaaaa aaccggcccg atgaaagaaa ttaatctggc cccggatagt agtagtgttg 720
ttgttagtgg tctgatggtt gcaaccaaat atgaagtgag tgtgtatgcg ctgaaagata 780
ccctgaccag tcgtccggcc cagggtgttg ttaccaccct cgag 824
Claims (8)
1.一种重组人纤连蛋白（rhFN），其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.如权利要求1所述的一种重组人纤连蛋白的制备方法,其特征在于,所述制备方法具体包括以下步骤：
S1:表达；将重组质粒rhFN-pET28a(+)转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得阳性基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-rhFN；经卡那霉素抗性LB平板筛选的阳性转化子，接种至10mL卡那霉素抗性LB培养基中过夜培养；
S2：诱导；次日进行转接，培养至对数生长期加入诱导剂IPTG进行诱导发酵，20℃诱导16小时，离心收集菌体；
S3:鉴定；S2的诱导过程中对未诱导菌液、诱导完成的菌液分别取样1.5mL，4℃、12000×g、5min离心收集菌体，1.5mLPBS复溶菌体，将菌体进行低温超声破碎，超声完成后，4℃、12000×g、5min离心分离上清及沉淀，用1.5mLPBS复溶沉淀；取未诱导菌液、诱导菌液、破碎离心上清、破碎离心沉淀样品各32μL，加入5×蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE鉴定蛋白的表达情况；
S4：纯化；使用AKTA纯化仪，连接Ni-NTA柱，采用分步洗脱的方法进行纯化，低温破碎菌体，离心收集上清，经亲和层析纯化得到重组人纤连蛋白；
S5：去除毒素；使用AKTA纯化仪，连接PMB柱除细菌内毒素。
3.根据权利要求2所述的一种重组人纤连蛋白的制备方法,其特征在于,所述步骤S2中的具体步骤如下：次日按照终OD为0.04转接到700mLLB/瓶培养基中培养至OD600达到0.6~0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导发酵，IPTG为诱导剂，20℃诱导16小时，4℃、大于等于3000×g、40min离心收集菌体，得到菌泥，菌泥获得量为3g/L。
4.根据权利要求2所述的一种重组人纤连蛋白的制备方法,其特征在于,所述步骤S4中的具体步骤如下：
S41：菌泥进行重悬，重悬后使用超声破碎仪或高压均质仪破碎菌悬液；
S42：破碎后的悬液加入到离心管中，平衡重量后，4℃、大于等于25000×g、30min，离心收集上清；
S43：离心后的菌液上清使用抽滤装置进行过滤，经过0.22μm滤膜过滤后作为蛋白原液进行后续试验；
S44：连接好AKTA和Ni-NTA柱，使用5-10倍柱体积的超纯水冲洗柱子，流速为柱料能承受最大流速的50%-80%；
S45:待流穿液电导值接近0且紫外吸收值无明显变化后，使用5-8倍柱体积的A液平衡柱子，直至流穿液电导值和紫外吸收值均达到稳定不变为止，流速为柱料能承受的最大流速的30%-50%；
S46:平衡好柱子后开始上样，流速为柱料能承受的最大流速的10%-30%，若蛋白原液体积较小而浓度较高，应适当减少流速或增加重复上样次数，当流穿液的紫外吸收值开始变化时，收集上样流穿液并取样进行SDS-PAGE电泳；
S47：上样完毕后，继续使用A液进行平衡，直至流穿液电导值和紫外吸收值接近上样前数值且稳定后，停止平衡；平衡流速为柱料能承受最大流速的30%-50%；
S48：柱子达到平衡后，采用分步洗脱的方式进行洗脱；第一步使用2%B和98%A进行洗脱，洗脱时流速为柱料能承受最大流速的30%-50%；在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS-PAGE电泳；
S49：当步骤S48中第一步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用5%B和95%A进行第二步洗脱，洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%-50%，在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS-PAGE电泳；
S410：当步骤S49中第二步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用30%B和70%A进行第三步洗脱，洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%-50%，在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS-PAGE电泳；S411：当步骤S410中第三步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用100%B进行柱冲洗，洗去仍未洗下的蛋白；洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%-50%；
S412：使用ClinXImageAnalysis对SDS-PAGE电泳结果进行灰度分析，计算蛋白纯度；
S413：纯化后蛋白使用紫外分光光度计进行浓度测定；
S414：纯化后的蛋白使用PALL30KD超滤管进行浓缩换液；离心程序为4℃，3800×g，4min，更换缓冲液为PBS，pH7.4；浓缩后蛋白再次使用紫外分光光度计进行浓度测定；
S415：浓缩后的蛋白取一部分进行稳定性试验，均分为两份，一份添加2%~5%终浓度的海藻糖和甘露醇，一份不添加任何保护剂，0.22μm滤器过滤除菌后放置于4℃冰箱过夜保存，第二天进行浓度测定。
5.根据权利要求4所述的一种重组人纤连蛋白的制备方法,其特征在于,所述步骤S5中的具体步骤如下：
S51：将PMB除细菌内毒素纯化柱连接至AKTA上，使用5倍柱体积的缓冲液C冲洗柱子，流速为柱料能承受最大流速的30%-50%；
S52：使用20倍柱体积的超纯水冲洗柱子，流速为柱料能承受最大流速的50%-80%；
S53：待电导接近0且紫外吸收值不再变化时，使用3倍柱体积的PBS平衡柱子，流速为柱料能承受最大流速的30%-50%；
S54：平衡好柱子后开始上样，过夜循环上样蛋白以除去蛋白中的细菌内毒素，流速为柱料能承受的最大流速的10%-30%；
S55：使用PBS将柱中残留的蛋白冲出，直至电导和紫外吸收值均不再变化，流速为柱料能承受最大流速的30%-50%；
S56：除细菌内毒素后蛋白使用紫外分光光度计进行浓度测定，计算回收率，添加终浓度2%~5%的海藻糖和甘露醇后，进行分装冻干。
6.根据权利要求4或5所述的一种重组人纤连蛋白的制备方法,其特征在于,所述缓冲液A为20mMTris，50mMNaCl，pH8.0；缓冲液B为20mMTris，50mMNaCl，500mM咪唑pH8.0；缓冲液C为20mMPB，1%脱氧胆酸钠，pH7.0。
7.如权利要求1-6所述的一种重组人纤连蛋白的促细胞增殖活性测定方法,其特征在于,所述重组人纤连蛋白的促细胞增殖活性测定方法，具体包括以下步骤：
M1：BALB/c3T3细胞以5000个细胞/孔，接种于96孔细胞培养板中（完全培养基），37℃，5％CO2细胞培养箱培养24小时；
M2：更换维持培养基继续培养24小时；
M3：分别加入不同浓度的重组人纤连蛋白以及PBS（阴性对照组），继续培养24小时；
M4:每孔加入10μLCCK-8试剂，37℃，5％CO2细胞培养箱孵育1小时后取出；
M5:用酶标仪读取96孔板在450nm的吸光值，记录测定结果。
8.如权利要求1-6所述的一种重组人纤连蛋白的稳定性实验方法,其特征在于,所述重组人纤连蛋白的稳定性实验方法，具体包括以下步骤：
P1：纯化完成的蛋白溶液中加入海藻糖和甘露醇做为保护剂，使蛋白浓度为1mg/mL，4℃放置0天、1天、3天、5天、7天后检测其蛋白浓度并记录结果；
P2：纯化完成的蛋白溶液中加入海藻糖和甘露醇做为保护剂，当天冻干，将冻干后的蛋白进行复溶，使蛋白浓度为1mg/mL，分别在25℃及37℃放置0天、1天、3天、5天、7天后检测其蛋白浓度并记录结果；
P3：纯化完成的蛋白溶液中加入海藻糖、甘露醇及20%甘油作为保护剂，使蛋白浓度为1mg/mL，分别在25℃及37℃放置0天、1天、3天、5天、7天后检测其蛋白浓度并记录结果。
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