CN115975002B - 一种重组人碱性成纤维细胞生长因子及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提一种重组人碱性成纤维细胞生长因子及其制备方法与应用。该重组人碱性成纤维细胞生长因子的氨基酸序列如SEQ ID:1所示。本发明提供的重组人碱性成纤维细胞生长因子是通过基因工程制备得到的，与天然人碱性成纤维细胞生长因子相比，本发明提供的重组人碱性成纤维细胞生长因子具有较高的热稳定性，在较高温度下更加不易变性，其生物学效应更持久，在实际应用过程中降解速度更慢，在科研和细胞培养领域具有极其重要的意义。

Description

一种重组人碱性成纤维细胞生长因子及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组人碱性成纤维细胞生长因子及其制备方法与应用。

背景技术

70年代中期，Gospodarowiz从脑垂体和脑组织中分离纯化出一种细胞生长因子，因其能促进成纤维细胞增殖，故命名为成纤维细胞生长因子(fibrobast growth factor，FGF)。按照等电点不同，成纤维细胞生长因子可分为碱性成纤维细胞生长因子(basicfibrobast growth factor，bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(acid fibrobast growthfactor，aFGF)。bFGF的等电点为9.6，aFGF的等电点为5.6，均为不含糖的肽类，有约56％相同氨基酸排列顺序。

与酸性成纤维细胞生长因子相比，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在生物进化上具有很强的保守性，各种动物的bFGF都有很高的同源性。人和牛bFGF的氨基酸序列同源性达到98.7％。bFGF蛋白多肽链氨基酸末端的少许加长或缩短并不影响活性，分子量为17～20KD。bFGF分子结构中有4个半胱氨酸，以此形成分子的三维空间结构。

其次，bFGF作为细胞分裂原，体外作用十分强烈，成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、血管内皮细胞、肾上腺皮质和髓质细胞、神经元和神经胶质细胞等具有很强的促细胞分裂增殖活性。此外，bFGF是重要的促有丝分裂因子，也是形态发生和分化的诱导因子。bFGF在体外细胞培养中能在低浓度下发挥作用。

在科研和细胞大规模培养领域，bFGF目前是细胞培养基的重要成分之一。但是，天然的bFGF在组织中含量甚微，从组织中提取则成本过高、产量低，并且具有不稳定性，在细胞培养过程中降解速度快。

发明内容

本发明提供一种重组人碱性成纤维细胞生长因子及其制备方法与应用，该重组人碱性成纤维细胞生长因子是通过基因工程制备得到的，与天然的人碱性成纤维细胞生长因子相比，本发明提供的重组人碱性成纤维细胞生长因子具有较高的热稳定性，在实际应用过程中降解速度更慢，在科研和细胞培养领域具有极其重要的意义。

根据本发明的第一个方面，提供一种重组人碱性成纤维细胞生长因子，该重组人碱性成纤维细胞生长因子的氨基酸序列如SEQ ID:1所示。

本发明提供的重组人碱性成纤维细胞生长因子(重组bFGF)的氨基酸序列与天然的人碱性成纤维细胞生长因子(天然bFGF)的氨基酸序列不同，与天然bFGF相比，本发明提供的重组bFGF具有良好的热稳定性，比天然bFGF更加稳定，在实际应用过程中降解更慢，在科研和细胞培养领域均具有极其重要的意义。

优选地，上述重组人碱性成纤维细胞生长因子由以下步骤制备得到：

(1)合成目的基因；

(2)将目的基因连接到质粒上，构建得到表达载体；

(3)将表达载体导入宿主细胞中；

(4)对宿主细胞进行诱导，表达得到重组人碱性成纤维细胞生长因子。

本方案涉及的重组人碱性成纤维细胞生长因子是通过因工程制备得到的，与从组织中提取天然bFGF相比，通过基因工程获得重组bFGF的成本相对较低，产量高，并且制备得到的重组bFGF的热稳定性高，更加不易发生降解。

根据本发明的第二个方面，提供一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码上述重组人碱性成纤维细胞生长因子。

优选地，上述核苷酸序列如SEQ ID:2所示。

根据本发明的第三个方面，提供一种基因表达盒，该基因表达盒含有上述核苷酸序列。

根据本发明的第四个方面，提供一种表达载体，该表达载体含有上述核苷酸序列。

根据本发明的第五个方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述表达载体。

根据本发明的第六个方面，提供上述重组人碱性成纤维细胞生长因子在细胞培养基中的应用。

本方案将本发明提供的重组人碱性成纤维细胞生长因子应用于细胞培养基中用于对细胞进行培养，在细胞培养过程中，bFGF通常会发生降解，因此需要补充bFGF，否则细胞容易发生凋亡，天然bFGF需要2～3天补充一次，而本发明提供的重组bFGF具有更好的热稳定性，在较高温度下更加不易变性，其生物学效应更持久，降解速度更慢，则可一周才补充一次，在节省培养成本的同时能够避免在细胞培养过程中由于补加bFGF的操作可能对细胞的生长和增殖造成的机械损伤。由此可见，本发明提供的重组人碱性细胞生长因子由于具有较高的稳定性，在细胞培养中具有重要的意义。

根据本发明的第七个方面，提供一种细胞培养基，该细胞培养基含有上述重组人碱性成纤维细胞生长因子。

优选地，重组人碱性成纤维细胞生长因子在所述细胞培养基中的体积分数为0.05～0.3％。

优选地，上述细胞培养基还含有1vt％青霉素-链霉素-新霉素混合物，5～20vt％血小板裂解液，0.05～0.3vt％表皮生长因子溶液，0.1％～1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺添加剂。

优选地，在上述细胞培养基中，重组人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为50～150ng/mL。

优选地，在上述细胞培养基中，重组人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为100ng/mL。

附图说明

图1为本发明实施例1中构建得到的表达载体的示意图；

图2为本发明实施例2利用Western Blot实验对重组bFGF进行验证的实验结果图；

图3为本发明对比例1提供的天然bFGF的熔解曲线图；

图4为本发明实施例1提供的重组bFGF的熔解曲线图；

图5为利用本发明对比例2提供的牙髓间充质干细胞培养基对牙髓间充质干细胞进行培养至第4天的细胞生长状态图；

图6为利用本发明实施例3提供的牙髓间充质干细胞培养基对牙髓间充质干细胞进行培养至第4天的细胞生长状态图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明提供的技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1重组人碱性成纤维细胞生长因子的制备

一种重组人碱性成纤维细胞生长因子(重组bFGF)，其氨基酸序列如SEQ ID:1所示；

本实施例提供的重组bFGF由以下步骤制备得到：

(1)目的基因的合成

该步骤涉及的目的基因的核苷酸序列如SEQ ID:3所示；

(2)表达载体的构建

利用限制性核酸内切酶双酶切步骤(1)的目的基因以得到目的片段，用同样的酶酶切线性化pET-28a质粒以得到载体，连接目的片段和载体构建得到如图1所示的表达载体；

(3)质粒的转染

①从-70℃冰箱中取出装有200μL大肠杆菌感受态细胞悬液的离心管，室温下使其解冻，解冻后立即置于冰上；

②向装有感受态细胞悬液的离心管中加入含量不超过50ng、体积不超过10μL的质粒DNA溶液(即表达载体)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟，；

③将离心管置于42℃水浴中热击45秒或90秒，热击后迅速置于冰上冷却1～10分钟；

④向离心管中加入1mL LB液体培养基(不含卡那霉素)，混匀后于37℃下震荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；

其中，LB液体培养基(不含卡那霉素)的配制方法如下：称取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，加纯水至1000mL，用5mol/L的NaOH调节pH至6～8，置于高温高压灭菌锅中121℃灭菌30分钟，得到不含卡那霉素的LB液体培养基；

⑤将离心管中的菌液摇匀后取100μL涂布于LB琼脂培养基(含卡那霉素)上，正面向上放置半小时，带菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，于37℃下培养10～48小时；

其中，LB琼脂糖培养基(含卡那霉素)的配置方法如下：称取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂糖15g，加纯水至1000mL，用5mol/L的NaOH调节pH至6～8，置于高温高压灭菌锅中121℃灭菌30分钟，在使用前加入卡那霉素(用灭菌水溶解，并经过0.22μm滤膜过滤)至浓度为50μg/mL，摇匀，得到含卡那霉素的LB琼脂糖培养基；

(4)扩增

分装LB液体培养基(含卡那霉素)，每管10mL，挑取步骤(3)中的单菌落，加入到分装好LB液体培养基中，于37℃、220rpm下震荡过夜；

(5)测序

①当菌液的OD₆₀₀值＞0.8时，将菌液混匀，取1mL菌液测序；

②再取1mL菌液进行扩增(即去1mL菌液加入到40mL含卡那霉素的LB液体培养基中)，于37℃、200rpm下振摇，同样操作扩增两管；

③将剩余菌液进行分装，用浓度为25wt％的甘油保存并于-80℃下冻存；

④取其中一管经过扩增后的菌液，提取质粒，送样测序；

上述①和④的测序结果均说明表达载体成功导入到宿主细胞中，并且能够正常进行扩增；

(6)诱导蛋白产生

取步骤(5)中经过扩增的另一管菌液，加入到LB液体培养基中，同时加入0.6mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于25℃、220rpm下培养过夜；

(7)蛋白的提取纯化

①取适量大肠杆菌培养液，于4℃、5000～15000g下离心10分钟，弃去上清，得到大肠杆菌沉淀，同时进行称重；

②将大肠杆菌沉淀于-80℃下放置过夜；

③根据大肠杆菌质量，加入B-PERⅡ溶液(每克大肠杆菌加入B-PERⅡ试剂2mL，每毫升B-PERⅡ试剂加入Halt protease inhibitors 10μL)进行裂解，室温震荡15分钟，得到大肠杆菌裂解液；

④装30mL的镍柱，平衡镍柱；

⑤将步骤③中的大肠杆菌裂解液于4℃、5000～15000g下离心5分钟，取上清，加入等体积的10mM咪唑，混匀；

⑥将步骤⑤中的溶液加入到平衡好的镍柱中，于4℃下旋转振摇2小时，使蛋白充分挂到镍柱上，垂直放置镍柱，将镍柱中的溶液自然滴落并舍弃；

⑦在镍柱中加入30mL的25mM咪唑，垂直放置镍柱，将镍柱中的溶液自然滴落并舍弃；

⑧在镍柱中加入30mL的250mM咪唑，于4℃下旋转振摇1小时，垂直放置镍柱，将镍柱中的溶液自然滴落并收集；

⑨将步骤⑧收集得到的滤液用超滤管进行超滤除盐，得到表达纯化的蛋白，即本发明提供的重组人碱性成纤维细胞生长因子(重组bFGF)。

实施例2重组人碱性成纤维细胞生长因子的验证

本实施例的目的旨在利用Western Blot实验对实施例1制备得到重组人碱性成纤维细胞生长因子(重组bFGF)进行验证，以证明经过表达纯化得到的蛋白为重组bFGF，具体步骤如下：

(1)SDS-PAGE胶的制备

①分别利用自来水和纯水将用于配制蛋白胶的玻璃板冲洗干净，然后自然晾干；

②将玻璃板卡紧卡齐后，置于制胶架上；

③取一根15mL的离心管，加入分离胶和分离缓冲液各2.5mL，同时加入过硫酸铵44μL，摇匀，并立即用1mL移液枪将其沿玻璃板一侧缓慢注入，达到玻璃板的三分之二处(约4.5mL)；

④灌胶后立即往玻璃板中加入无水乙醇(沿玻璃板边水平缓慢加入)，将分离胶压成一条直线，30分钟后倒去无水乙醇，并用吸水纸擦去玻璃板上残留的无水乙醇；

⑤另取一根15mL的离心管，加入浓缩胶和浓缩胶缓冲液各1mL，同时加入过硫酸铵18μL，混匀，并立即用1mL移液枪将其沿玻璃板一侧缓慢注入，加到玻璃板的顶部，迅速插入梳子，室温水平静置60分钟；

(2)样品制备

取样品(即实施例1得到表达纯化的蛋白)5μL、上样缓冲液5μL、纯化水15μL，混匀，并置于100℃金属浴10分钟以使蛋白变性，取出冷却至室温；

(3)电泳

①将玻璃板放入电泳槽，往电泳槽中加入电泳液，拔出梳子，点样，其中，Marker和样品各5μL；

②恒压80V，当染料跑完浓缩胶被压成一条直线时，将电压调高到120V，继续跑至距底板五分之一处，停止电泳；

(4)转膜

①裁剪大小合适的PVDF膜，标记出正反面，放入甲醇中活化5分钟，然后放入电转液中；

②切掉浓缩胶和无用部分；

③盘子中加入电转液，夹板黑色面朝下，依次放入一层海绵、两层滤纸、胶、PVDF膜、两层滤纸、一层海绵，合上夹板，注意胶和膜之间不能存在起泡，将夹板泡在电转液中；

④将夹板放入电转槽中，黑色面朝黑色面，透明面朝红色面；

⑤向电泳槽中倒入电转液，电泳盒中加入冰块，将电泳盒置于四周方面冰块的泡沫箱中；

⑥恒流250mA，转膜90分钟；

(5)封闭

①电转完毕后取出PVDF膜，用TBST缓冲液洗涤3次，每次5分钟(放摇床摇)；

②将经过洗涤的PVDF膜置于5vt％脱脂奶粉封闭液中，于摇床中室温封闭1小时；

③将经过封闭的PVDF膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟；

(6)一抗孵育

①将一抗加入到50mL的离心管中，向其中加入TBST缓冲液将一抗稀释到说明书中适宜浓度(稀释比例1:2000)，总体积约5mL；

②将PVDF膜含蛋白的一面朝里，不含蛋白的一面贴管壁，将旋转摇床放4℃冰箱，孵育过夜；

③用TBST缓冲液将PVDF膜洗涤3次，每次10分钟；

(7)显影

将显影液A液、B液、纯化水按照体积比1:1:2配制成发光液，总体积约2mL，将PVDF膜含蛋白的面朝下，与发光液充分接触约1分钟；

(8)发光图片成像分析

将上述PVDF膜置于化学发光成像系统中进行成像分析，结果如图2所示。由图2可知，实施例1最终得到表达纯化的蛋白的分子量为15kDa，这说明实施例1经过表达和纯化得到的蛋白确实是重组人碱性成纤维细胞生长因子(重组bFGF)。

对比例1

本对比例提供一种天然的人碱性成纤维细胞生长因子(天然bFGF)，该天然bFGF的氨基酸序列如SEQ ID:4所示。

实施例3

一种牙髓间充质干细胞培养基，该培养基为添加有如下成分的DMEM培养基：1vt％PSN抗生素混合物(青霉素-链霉素-新霉素抗生物混合物)、5～20vt％血小板裂解液、0.05～0.3vt％EGF(表皮细胞生长因子)溶液、0.05～0.3vt％实施例1的重组bFGF(重组人碱性成纤维细胞生长因子)溶液和0.1～1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺添加剂；

其中，EFG溶液的浓度为100ng/mL；bFGF溶液的浓度为100ng/mL。

对比例2

本对比例提供一种牙髓间充质干细胞培养基，与实施例3的区别在于：所采用的bFGF为对比例1提供的天然人碱性成纤维细胞生长因子(天然bFGF)。

测试例1稳定性测试

利用荧光定量PCR(qPCR)技术分别对实施例1提供的重组bFGF、对比例1提供的天然bFGF的热稳定性进行检测。

SYPRO Orange荧光染料是一种自然淬灭的染料，蛋白质变性后，它能够高效地结合到暴露出来的蛋白质疏水核心上，进而发生荧光信号的增强，因此，分别向重组bFGF和天然bFGF中加入SYPRO Orange荧光染料，并置于不同的温度下进行处理，利用装配有专用于SYPRO Orange的检测通道的荧光定量PCR仪(qTOWER3,Jena)对荧光信号值进行检测，以温度为横坐标、以荧光信号值相对温度值的变化率为纵坐标，绘制熔解曲线，天然bFGF的熔解曲线如图3所示，重组bFGF的熔解曲线如图4所示，其中，熔解曲线中的dF指荧光信号值的变化量，dT指温度值的变化量。

由图3和图4可知，重组bFGF的荧光信号值相对于温度值的变化率比天然bFGF更低，且重组bFGF的熔点比天然bFGF更高，这说明与天然bFGF相比，重组bFGF的热稳定性更高，在高温下更加不容易发生变性，其生物学效应更持久。

测试例2

本测试例的参试对象为实施例3和对比例2提供的牙髓间充质干细胞培养基。利用这两种培养基分别在6孔板中培养P23代牙髓间充质干细胞，培养至第4天时对牙髓间充质干细胞的生长情况进行拍照观察(此时每孔约15～20万细胞)，其中，利用牙髓间充质干细胞培养基对牙髓干细胞进行培养时，天然bFGF的补充频率为每3天补充一次，重组bFGF的补充频率为每周补充一次。

利用对比例2提供的牙髓间充质干细胞培养基对牙髓间充质干细胞进行培养至第4天的结果如图5所示，利用实施例3提供的牙髓间充质干细胞培养基对牙髓间充质干细胞进行培养至第4天的结果如图6所示。由图5和图6可知，利用实施例3和对比例2提供的牙髓间充质干细胞培养基对牙髓间充质干细胞进行培养时，对比例2提供的培养基中的天然bFGF需要每3天补充一次，否则牙髓间充质干细胞会开始凋亡并且在培养基中出现漂浮的细胞碎片，而实施例3提供的培养基中的重组bFGF仅需要一周补充一次即可达到与天然bFGF一样的培养效果。

综上所述，本发明提供的重组人碱性成纤维细胞生长因子(重组bFGF)的氨基酸序列与天然的人碱性成纤维细胞生长因子(天然bFGF)的氨基酸序列不同，与天然bFGF相比，本发明提供的重组bFGF具有良好的热稳定性，比天然bFGF更加稳定，在较高温度下更加不易变性，其生物学效应更持久，在实际应用过程中降解更慢，在科研和细胞培养领域均具有极其重要的意义。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种重组人碱性成纤维细胞生长因子，其特征在于：所述重组人碱性成纤维细胞生长因子的氨基酸序列如SEQ ID:1所示。

2.一种基因表达盒，其特征在于：所述基因表达盒含有如SEQ ID:2所示的核苷酸序列。

3.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体含有如SEQ ID:2所示的核苷酸序列。

4.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有如权利要求3所述表达载体。

5.如权利要求1所述重组人碱性成纤维细胞生长因子在细胞培养基中的应用。

6.一种细胞培养基，其特征在于：所述细胞培养基含有如权利要求1所述重组人碱性成纤维细胞生长因子。