CN117886922A - 一种重组人源纤连蛋白及其表达体系 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明提供了一种重组人源纤连蛋白及其表达体系，属于生物医药技术领域。本发明提供的重组人源纤连蛋白具有良好的促细胞增殖、促细胞黏附、促细胞迁移、促炎症因子和胶原表达效果，来源于人天然蛋白质，应用于人体不会产生免疫反应，是安全有效的生物医学材料，解决了现有技术中的重组人源纤连蛋白性能不足以及无法实现异源宿主中的高效表达的问题。本发明提供的重组人源纤连蛋白表达量可观，易于纯化、且在存储过程中是稳定的，具有较高的产业化潜能。通过本发明提供的表达体系能够实现人源纤连蛋白于大肠杆菌中的高效可溶性表达，并且可实现规模化发酵纯化生产，有利于本发明重组人源纤连蛋白的商业推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种重组人源纤连蛋白及其表达体系。
背景技术
纤连蛋白（fibronectin，FN）广泛存在于动物界，是一种纤维状糖蛋白，含糖量4.5%~9.5%，其亚单位分子质量为220~250kDa，约由2500个氨基酸残基构成。不同组织来源的FN亚单位结构不尽相同，但很相似。其肽链的共同特点是由一些重复的氨基酸序列构成若干球形结构域，每个球形结构域可分别与不同的大分子或细胞表面特异性受体结合，从而使之成为多功能分子。纤连蛋白存在于多种动物细胞表面的大分子细胞外膜蛋白，是细胞外基质和基底膜中的主要非胶原性糖蛋白。在细胞黏附中起中心作用，可调节细胞极性、分化和生长。经局限性蛋白酶解可切割为几个结构域，可与血纤蛋白、肝素、胶原、DNA以及细胞表面受体等结合。
在皮肤创面修复和愈合中，纤连蛋白可以缩短创面愈合时间并且减轻伤口瘢痕，因而在再生医学中被广泛应用。而在护肤方面，纤连蛋白的修复作用表现为促进皮肤正常生理代谢，能抚平细纹、延缓衰老，同时防止黑色素细胞分泌异常，即能美白、淡斑。与胶原蛋白一样，天然的纤连蛋白从各种动物身上提取。传统的纤连蛋白主要通过从动物血浆中逐级分离纯化的方式获得，耗时长、步骤复杂且最终产率极低，在大规模生产过程中极易受到酶解，很难得到完整长度的纤连蛋白，且存在安全性问题。
专利CN116589560A公开了一种重组人源纤连蛋白的生物合成方法，提供了一段多肽，通过保守氨基酸取代，得到同一性不同的变体，得到的多肽具有皮肤抗皱、淡斑和/或美白功能。
现有技术中的重组人源纤连蛋白在促伤口愈合、促修复或抗衰方面的功效有待进一步提升，并且不能实现异源宿主中的高效表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人源纤连蛋白及其表达体系，所述纤连蛋白具有促细胞增殖、促细胞迁移活性、细胞黏附活性、促进组织再生和促进伤口愈合能力，能够实现菌株中的高效可溶性表达。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种重组人源纤连蛋白，所述重组人源纤连蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了编码上述重组人源纤连蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括初始载体和上述编码重组人源纤连蛋白的基因。
优选的，所述初始载体为pGEX系列载体、pET系列载体或pMAL系列载体。
优选的，所述初始载体为pET-21a载体。
本发明还提供了一种表达上述重组人源纤连蛋白的重组菌，其特征在于，所述重组菌中转化有上述重组表达载体。
优选的，所述重组菌株通过IPTG进行诱导表达。
优选的，所述IPTG的浓度为0.05~1mM。
优选的，所述诱导表达的温度为8~24℃；
所述诱导表达的时间为12~72h。
本发明还提供了上述重组人源纤连蛋白、重组载体、重组菌株在制备促伤口愈合产品、促修复产品或抗衰产品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的重组人源纤连蛋白具有良好的促细胞增殖、促细胞黏附、促细胞迁移、促炎症因子和胶原表达效果，来源于人天然蛋白质，应用于人体不会产生免疫反应，是安全有效的生物医学材料。并且该蛋白表达量可观，易于纯化、且在存储过程中是稳定的，具有较高的产业化潜能。
通过本发明提供的表达体系能够实现人源纤连蛋白于大肠杆菌中的高效可溶性表达，并且可实现规模化发酵纯化生产，有利于本发明重组人源纤连蛋白的商业推广应用。
附图说明
图1为重组人纤连蛋白诱导表达的SDS-PAGE结果图；
图2为重组人纤连蛋白使用His标签进行的Wsetern Blot检测结果图；
图3为重组人纤连蛋白摇瓶样品重力柱Ni柱纯化结果图；
图4为重组人纤连蛋白在5L发酵罐中表达的SDS-PAGE结果图；
图5为重组人纤连蛋白小试纯化结果图；
图6为重组人纤连蛋白HPLC检测图谱；
图7为重组人纤连蛋白细胞增殖活力结果图；
图8为重组人纤连蛋白细胞粘附结果图；
图9为重组人纤连蛋白细胞迁移结果图；
图10为重组人纤连蛋白QPCR-促炎症因子表达细胞活性检测结果图；
图11为重组人纤连蛋白QPCR-促胶原表达细胞活性检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1 重组人源纤连蛋白的设计与重组表达
本实施例提供了重组人源纤连蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID NO.1所示：
MHHHHHHFYSCTTEGRQDGHLWCSTTSNYEQDQKYSFCTDHTVLVQTRGGNSNGALCHFPFLYNNHNYTDCTSEGRRDNMKWCGTTQNYDADQKFGFCPMAAHEEICTTNEGVMYRIGDQWDKQHDMGHMMRCTCVGNGRGEWTCIAYSQLRDQCIVDDITYNVNDTFHKRHEEGHMLNCTCFGQGRGRWKCDPVDQCQRQKTGLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRQKTGLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINY*
以及经密码子优化后的DNA序列，如SEQ ID NO.2所示：
ATGCACCACCACCATCATCACTTCTATAGCTGCACCACCGAAGGCCGTCAGGATGGCCATCTGTGGTGCAGCACCACCTCAAACTATGAACAGGATCAGAAATACAGCTTTTGCACGGATCATACGGTGCTGGTGCAGACCCGTGGAGGCAATTCGAACGGCGCGCTGTGCCATTTTCCGTTTCTGTATAACAATCACAATTATACTGATTGCACCAGCGAAGGCCGTCGTGACAACATGAAATGGTGTGGTACCACCCAGAATTATGATGCCGATCAGAAATTTGGTTTTTGTCCGATGGCCGCCCATGAAGAAATTTGCACCACAAACGAAGGCGTTATGTATCGTATTGGCGACCAGTGGGATAAACAGCATGATATGGGTCACATGATGCGCTGCACCTGCGTGGGCAACGGTCGCGGTGAATGGACCTGCATTGCCTATTCACAGCTGCGCGATCAGTGTATTGTCGACGATATTACCTACAACGTGAACGATACCTTCCATAAACGCCATGAAGAAGGCCACATGCTGAACTGCACCTGCTTTGGCCAGGGCCGCGGTCGTTGGAAATGCGATCCGGTGGATCAGTGCCAGCGCCAGAAAACCGGCCTGGATAGCCCGACCGGCATTGATTTCAGCGATATTACCGCGAATAGCTTTACGGTTCATTGGATTGCCCCGCGTGCAACCATTACCGGCTATCGCATCCGCCATCATCCGGAACATTTTAGCGGCCGTCCGCGTGAAGATCGCGTTCCGCATAGCCGCAATAGCATTACCCTTACCAATCTGACCCCGGGCACCGAATACGTGGTAAGCATTGTTGCCCTGAATGGTCGCGAAGAAAGCCCGCTGCTGATTGGCCAGCAAAGCACCGTGTCGGATGTCCCGCGCGATCTGGAAGTGGTAGCGGCGACCCCGACCTCGCTGCTGATTAGCTGGGATGCGCCGGCGGTGACTGTTCGTTATTATCGCATTACCTATGGCGAAACCGGTGGCAATTCACCGGTCCAGGAATTTACCGTGCCGGGCAGCAAAAGCACCGCCACCATTTCTGGTCTGAAACCGGGCGTCGATTACACCATTACCGTATACGCCGTGACCGGTCGTGGCGACAGCCCGGCCAGCAGCAAGCCGATTTCGATTAATTATCGTCAGAAAACCGGTCTGGACAGCCCGACCGGCATTGATTTTAGCGATATCACCGCCAACTCGTTCACCGTGCATTGGATTGCGCCGCGCGCCACCATTACCGGCTATCGTATTCGCCATCATCCGGAACATTTTTCAGGCCGTCCGCGCGAAGATCGCGTGCCGCATTCTCGCAATAGCATTACCCTGACCAATCTGACCCCGGGCACCGAATATGTTGTGAGCATCGTAGCGCTGAATGGCCGCGAAGAAAGCCCGCTGCTGATCGGCCAGCAGAGCACCGTGAGCGATGTGCCGCGCGATCTGGAGGTAGTGGCGGCCACCCCGACCAGCCTGCTGATTAGCTGGGATGCGCCGGCCGTGACCGTTCGCTATTACCGCATTACCTATGGTGAAACCGGCGGCAATAGCCCGGTTCAGGAATTCACCGTGCCGGGCTCAAAATCAACCGCGACCATCAGCGGCCTGAAACCGGGTGTGGATTATACCATTACCGTGTATGCCGTGACCGGCCGTGGCGACAGCCCGGCCTCCAGCAAACCGATTAGCATTAATTATTAA
表达重组人源纤连蛋白大肠杆菌基因工程菌的构建
合成上述重组人源纤连蛋白的编码基因（SEQ ID NO.2），经目的片段和载体双酶切、纯化后克隆到pET-21a（+）载体上，测序验证正确后提取质粒。转化至Bl21（DE3）感受态中，经0.1mg/ml氨苄霉素筛选后获得阳性重组子。
重组人源纤连蛋白在大肠杆菌基因工程菌中的表达与鉴定
（1）摇瓶诱导表达SDS-PAGE鉴定。
纤连蛋白-BL21(DE3) 转化平板挑取1个单克隆，接种于1个含有5ml LB培养基的培养管中，37℃，250rpm震荡培养过夜。培养液各取1ml分别接种于4个含有250ml LB培养基的培养瓶中，37℃，250rpm震荡培养约4h，诱导条件：分别为37 ℃，1 mM IPTG, 5h； 16℃，1mM IPTG, 24h；16℃，0.5 mM IPTG, 24h；16℃，0.1mM IPTG, 24h。pET21a-BL21(DE3) 转化平板挑取1个单克隆，接种于1个含有5ml LB培养基的培养管中，37℃、250rpm震荡培养过夜，倒出大部分培养液，仅留取约200μL于试管中，补充新鲜的LB培养基至终体积约为5ml，37℃、250rpm震荡培养约4h后，加入终浓度为1 mM 的IPTG，37℃诱导5h，作为空白对照。诱导结束后，从每个培养瓶中或培养管中吸取1ml菌液，8000rpm离心10min,丢弃上清，菌体沉淀加入200μL超纯水重悬，吸取30μL加入到含有10ul 4xloading buffer的EP管中进行SDS-PAGE电泳。如图1所示，可见目的条带，重组人纤连蛋白实现可溶性表达（其表观分子量为63.4kDa），最优的摇瓶诱导表达条件为16℃，0.1mM IPTG, 24h。
（2）His标签Wsetern Blot检测。
用NC膜200mA、转40min（顺序：负极-滤膜-胶-NC膜-滤膜-正极），转完后胶进行染色。膜用牛奶（TBST+5%脱脂奶粉）封闭20min，加入一抗（MαHis）敷浴1h，牛奶：一抗=3000：1。用TBST洗三次，每次5min，然后敷二抗（GαM）1h，牛奶：二抗=3000：1。用TBST洗三次，每次5min，加显色剂曝光观察结果。如图2所示，可见目的条带，重组人纤连蛋白顺利表达（其表观分子量为63.4kDa）。
摇瓶蛋白重力柱Ni柱纯化：取35ml Lysis buffer重悬菌体并加入PMSF，冰浴下100W、超声5s暂停5s循环10min，重复3次。破碎后10000rpm、离心30min，留上清并取样（S）。
上清过两遍重力柱，流穿液取样（FT）；先用40ml Lysis buffer冲洗，然后用20mlWash buffer洗杂并取样（W）；最后用10ml Elution buffer洗脱并用2ml EP管收集（E1）~（E5）。如图3所示，结果说明目的蛋白顺利结合Ni柱。
实施例2 重组人源纤连蛋白的小试发酵和纯化
（1）小试发酵。
对构建的表达重组人纤连蛋白基因工程菌进行5L发酵罐发酵，获取含有重组人纤连蛋白的发酵菌泥，实现重组人源纤连蛋白的规模化生产。
一级种子液：取工作细胞库细胞1支，按1%比例接种于含100μg/mL AMP的20ml LB培养液中，37 ℃培养12 h，作为一级种子。
二级种子液：以1%的接种量接种于2-3个装有150 ml LB培养液（含100μg/ml AMP，150μL）的1L摇瓶中，30 ℃，200rpm，培养12h左右，作为二级种子。
二级种子培养基配方如下表1所示：
表1 二级种子培养基配方信息表
使用5L迪必尔发酵罐，配制2.37L的发酵培养基（2.22L底料+150ml二级种子液OD600为6.696）。在培养期间，溶氧维持在30%以上，转速为400-1000r/min，通过调节通气量和搅拌转数提高溶氧，并通过加入氨水维持pH值至7.0-7.1，泡沫通过加入少量的消泡剂消除；37 ℃培养5h左右开始补料，培养11个小时左右（OD600为80）开始诱导，接入千分之四的IPTG，23℃诱导13个小时左右放罐，共计培养24h，放罐OD600为159.2，湿重为0.2g/ml。
发酵过程中的底料和补料配方如下表2所示：
表2 发酵过程中的底料和补料配方信息表
放罐收获2.5L菌液，4℃，8000rpm，离心40分钟，共计收获湿菌445.70g，取样制样跑胶验证，如图4所示，可见明显目的蛋白表达。
（2）小试纯化。
使用到的缓冲液如下：
缓冲液A：20mM PB (pH7.4)+500mM NaCl
缓冲液B：20mM PB (pH7.4) +500mM NaCl +500mM 咪唑
缓冲液C：20mM PB (pH7.4)
缓冲液D：20mM PB (pH7.4) +1M NaCl
样品前处理：取菌体（存-20℃）230g，按照约1：20的破碎比加入4600ml 缓冲液充分重悬后，等待破碎。500ml纯化水冲洗干净破碎机物料杯中的75%乙醇，2次。提前开始制冷机，点击循环，制冷选项。待温度降至4-10℃即可破碎样品。
倒入样品至物料杯中，在不加压的情况下，40L/h进行流通。将流通之后的样品再次倒入物料杯中，待管路中样品充满不存在空气后，慢慢至900bar，破碎3次，用纯化水冲洗物料杯及管路，最终封存于75%乙醇（500ml）中。调节样品ph至8.0离心8000r，30min，4℃，收集破碎上清进行纯化。
NI柱亲和+SP阳离子纯化蛋白：以缓冲液A平衡亲和层析Ni柱-255ml（层析填料为苏州纳微产 UniGel-80Ni, 装载于江苏汉邦科技产全自动层析系统）至A280 吸光值和电导率值都保持不变，设置上样流速为10ml/min，检测紫外A280吸光值，当其上升时，开始接样，待上样结束后，关闭接样，再以缓冲液A平衡Ni亲和层析介质，当A280吸光值下降时，打开接样，直至紫外和电导降至最低且不再变化，停止接样。分别用100mM和250mM的咪唑（10%和20%缓冲液B）洗脱，收集洗脱液，取样制样跑胶验证；将上述洗脱样品用纯水稀释至低电导（同缓冲液C），以缓冲液C平衡阳离子柱-170ml（层析填料为苏州纳微产 UniGel-80sp,装载于江苏汉邦科技产全自动层析系统）纯化过程同上，分别用5%、10%、20%、40%、100%缓冲液D洗脱，收集洗脱液，取样制样跑胶验证，如图5所示，顺利纯化得到目的蛋白。
纯化后获得的蛋白经浓缩、透析（缓冲液为PBS）、冷冻干燥后保存。 C18柱HPLC检测目的蛋白纯度在96%以上，实验结果如图6所示。
实施例3 重组人纤连蛋白细胞增殖活力检测
将皮肤原代成纤维细胞接种到改良杜氏伊格尔培养基(Dulbecco's ModifiedEagle Medium ，DMEM)中，37℃培养至对数生长期，再接种到96孔细胞培养板中(5000个细胞/孔，100微升培养基/孔)。用磷酸缓冲液(137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸二氢钠，2mM磷酸二氢钾，10EU凝血酶，1mM氯化钙以及0.5mM氯化镁， pH=7.2)稀释蛋白冻干粉至1mg/mL，然后按比例加入到96孔细胞培养板，使重组人纤连蛋白的终浓度依次至5ppm、10ppm、50ppm、100ppm，以加入磷酸缓冲液的样品为空白对照组。每种浓度处理各3个重复孔。在37℃培养48小时后，加入终浓度为5毫克/毫升的噻唑兰溶液(MTT，10微升/孔)，37℃继续培养4小时。弃去培养基，每孔加入150μL的二甲基亚砍(DMSO)，然后置于摇床上缓慢振荡10分钟。最后，利用酶标仪测定各孔的吸光度(测定波长为490nm结果见图7。
结果显示，加入重组人纤连蛋白的实验组中，成纤维细胞活力相比于对照组都在95%以上，在低浓度5ppm的条件下细胞活力能达到110%，有明显细胞增殖，此结果表明本发明提供的重组人纤连蛋白无细胞毒性，并且具有促进细胞增殖的效果及促进伤口愈合的能力，是安全有效的生物医学材料。
实施例4 重组人纤连蛋白细胞粘附活性检测
96孔板每孔加入100μl 样品包被液。用PBS或1%BSA稀释得到的终浓度为5ppm、10ppm、50ppm、100ppm的检测样品为样品包被液。将培养板置2-8℃过夜（或者37℃2h）。移除包被液。用PBS或者1%BSA洗涤1-3次，每次洗涤需用力甩干样品板。取对数生长期的HaCAT（人类永生化表皮细胞）Hacat细胞，用胰酶消化，PBS洗涤，然后用DMEM完全培养基重悬，制成细胞悬液。按5×10^4个cells/孔接种96孔板，建议设3-5个复孔，同时设立对照组即未包被样品组。放37℃培养箱孵育30分钟-1小时。取出培养板，吸弃培养基。然后用相应的培养基洗涤2-3次，每次洗涤需用力甩干样品板。粘附率检测：按照每孔100 μL基础培养基+10μLCCK8的比例稀释CCK8（避光），然后向每孔缓缓加入110μL稀释后的溶液，避免形成气泡以影响酶标仪读数。 CO2培养箱继续孵育1.5h后（OD为0.8-1.0最佳），读取 450 nm 波长下的吸光值。使用统计软件（excel、graphpad、spss等）计算每个包被浓度下复孔的平均值与标准误差，根据公式CVR=（A-A0）/A0×100%来计算不同包被浓度下的细胞活力（CVR，%，cellviability ratio；A：处理组吸光值；A0：空白组吸光值）。CRV为正值即可认定样本具有活性能够粘附实验所用细胞，CRV越大细胞活性越好，CRV为零或者负值即可认定样本不具有细胞活性，结果见图8。
结果显示，加入重组人纤连蛋白的实验组中，细胞粘附率都高于对照组，都在100%以上，在50ppm的条件下细胞粘附率为107.16%，此结果表明本发明提供的重组人纤连蛋白具有促进细胞粘附效果，具有创面修复的能力，是有效的生物医学材料。
实施例5 重组人纤连蛋白细胞迁移活性检测
将皮肤原代成纤维细胞接种到改良杜氏伊格尔培养基(Dulbecco's ModifiedEagle Medium ，DMEM)中，37℃培养至对数生长期，再接种到6孔细胞培养板中(200000个细胞/孔，lmL培养基/孔)。将细胞培养至铺满培养孔表面(覆盖度为100%)后，用细胞刮刀进行轻轻划痕，划痕宽度约为8mm。用磷酸缓冲液(137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸二氢钠，2mM磷酸二氢钾，10EU凝血酶，1mM氯化钙以及0.5mM氯化镁， pH=7.2)稀释蛋白冻干粉至1mg/mL，然后按比例加入到细胞铺满培养孔表面的细胞培养板，使蛋白的终浓度分别为5ppm、10ppm、50ppm、100ppm，以加入磷酸缓冲液的样品为空白对照组，每组进行三个重复。分别于37℃培养6和24小时后，利用倒置显微镜进行观察并记录细胞迁移的距离，结果见图9。
结果显示，在给药重组人纤连蛋白6h后，不同浓度给药条件下，细胞迁移率均高于对照组，其中5ppm条件下细胞迁移率为38%，促进细胞迁移效果显著；在给药重组人纤维连接蛋白24h后，不同浓度给药条件下，细胞迁移率均高于对照组，其中10ppm条件下细胞迁移率为73%，与对照组相比，促进细胞迁移效果显著。该结果表明本发明制备的重组人纤连蛋白具有优良的促细胞迁移效果，具有抗衰修复的能力，是有效的生物医学材料。
实施例6 重组人纤连蛋白QPCR-促炎症因子表达细胞活性检测
取对数生长期的细胞以每孔6x10^5个皮肤原代成纤维细胞细胞接种于6孔板中，在37℃、5% CO2和 95%湿度的恒温培养箱中培养24h后（汇合度在80%-90%），弃掉培养基，用PBS洗2次，洗去残留的培养基，每孔加入2mL用（可含1%双抗）无血清培养基稀释得到的终浓度为检定浓度的检测样品，以无血清（可含1%双抗）培养基为对照组。放入37℃、 5% CO2培养箱，在给药后24h取样。每个实验样品孔先用PBS洗2-3遍，吸弃干净液体后每个孔加0.5mlTrizol，反复吹吸，充分吹下贴壁细胞，将样品全部转入无RNA酶的1.5ml离心管中。用试剂盒提取RNA，详细步骤参考试剂盒说明书。反转录cDNA ，详细步骤参考反转录说明书。三步法qPCR （TAKARA TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus），详细步骤参考qPCR试剂说明书。使用统计分析软件（excel、graphpad、spss等）先计算每个检测样品Ct的均值（mean）；再计算检测样品的ΔCt，即某检测因子某检测样品的Ct-内参基因某检测样品的Ct；然后再计算检测样品的ΔΔCt，即某检测因子实验组的ΔCt-某检测因子空白组的ΔCt；最后计算检测样品2^(-ΔΔCt)值，即相对表达量，以及每个检测样品孔的标准误差（SD），得到数据表，结果如图10。
结果显示，加入重组人纤连蛋白的实验组中，排除实验误差，不同浓度给药条件下不同基因的相对表达量均明显高于对照组，其中，TNF-α在50ppm条件下相对表达量最高，IL-1α在50ppm条件下相对表达量最高，IL-6在5ppm条件下相对表达量最高，IL-8在50ppm条件下相对表达量最高，IL-10在100ppm条件下相对表达量最高。
以上结果表明本发明制备的重组人纤连蛋白具有较好的促进炎症因子分泌的能力，并且最佳给药量50-100ppm，具备促进伤口愈合和创面修复的潜力，是有效的生物医学材料。
实施例7 重组人纤连蛋白QPCR-促胶原表达细胞活性检测
QPCR方法步骤同实施例6，经统计分析，实验结果如图11。
结果显示，加入重组人纤连蛋白的实验组中，不同浓度给药条件下不同基因的相对表达量均明显高于对照组，其中，COL17、COL1、COL4、COL7均在100ppm条件下相对表达量最高。
结果表明本发明制备的重组人纤连蛋白具有较优的促胶原分泌表达的能力，并且最佳给药量为100ppm，具备良好的抗衰修复能力，是有效的生物医学材料。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种重组人源纤连蛋白，其特征在于，所述重组人源纤连蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述重组人源纤连蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括初始载体和权利要求2所述的编码重组人源纤连蛋白的基因。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述初始载体为pGEX系列载体、pET系列载体或pMAL系列载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述初始载体为pET-21a载体。
6.一种表达权利要求1所述重组人源纤连蛋白的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株中转化有权利要求3~5任一项所述的重组表达载体。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株通过IPTG进行诱导表达。
8.根据权利要求7所述的重组菌株，其特征在于，所述IPTG的浓度为0.05~1mM。
9.根据权利要求7所述的重组菌株，其特征在于，所述诱导表达的温度为8~24℃；
所述诱导表达的时间为12~72h。
10.权利要求1所述的重组人源纤连蛋白、权利要求3~5任一项所述的重组载体、权利要求6~9任一项所述的重组菌株在制备促伤口愈合产品、促修复产品或抗衰产品中的应用。
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