CN111548410A - 具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，包括至少一个可以和细胞整合素受体结合的RGD结构域、至少一段可作用于钠离子通道的钠离子通道结合肽段，所述RGD结构域与所述钠离子通道结合肽段之间用包含0‑300个氨基酸残基的多肽连接片段进行连接，同时具有结合钠离子通道以及整合素受体的能力，促进皮肤修复、代谢更新、增强淡斑减少皱纹效果，涉及其制备方法，采用高密度发酵、超耐受金属亲和层析纯化、特异性蛋白酶切除标签、离子柱精制纯化方法，得到的重组纤连蛋白rFN不含纯化标签、纯度高、比活力高，制备过程简单高效、低成本、适用大规模生产，还涉及其在体外贴壁细胞培养、皮肤损伤修复、除皱、淡斑的应用。

Description

具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白、及其制备方法和应用。

背景技术

芋螺肽(Conopeptides)是海洋腹足纲软体动物芋螺的毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌，芋螺肽的主要成分是一些对不同离子通道及神经受体高专一性的活性多肽化合物。芋螺肽能特异性地作用于乙酰胆碱受体及其他神经递质的各种受体亚型，还可以作用于钙、钠、钾等多种离子通道。芋螺肽有镇痛以及舒缓神经紧张的作用，同时不具有成瘾性，因此是一种药物领域的研究热点。近年已经开始运用于美容领域，主要作用为减弱皱纹。

由于芋螺肽分子量较小、表达较困难，目前国内外主要通过化学合成方法来制备，但这种化学合成的方法操作复杂、成本高、不适合规模化生产，且化学合成得到的芋螺肽结构与天然芋螺肽的结构有区别。

纤连蛋白是一种细胞外基质蛋白，调控了细胞的迁移、粘附、生长、增殖、组织的再生、伤口的修复，在医疗以及美容等方面有重要用途，现有的纤连蛋白虽然可以应用于美容方面，但是其在松弛皱纹、淡斑方面的效果比较有限。

单分子的纤连蛋白上存在多种结构域，分别具有不同的功能，如包括12个纤连蛋白I型重复位点FnI结构域、2个纤连蛋白II型重复位点FnII结构域、15-17个纤连蛋白III型重复位点FnIII结构域。近年来，由于对纤连蛋白功能结构域的研究深入以及重组表达技术的突破，纤连蛋白已经解决了重组表达的问题，主要是分离纤连蛋白具有不同功能的结构域，进行重新组合，获得具有不同功能的小分子化类人纤连蛋白。

重组纤连蛋白的制备涉及到较为复杂的纯化问题，目前重组纤连蛋白的单位体积培养基表达量还在较低的2g/L的水平，远远落后于胶原蛋白，纯化工艺效率低、成本高，影响重组类人纤连蛋白的应用范围。

目前重组蛋白多采用亲和填料层析进行纯化，使用较多的是金属亲和(IMAC)纯化填料，其中镍金属亲和填料已经发展到第三代，分别以三配位亚胺二乙酸(IDA-NI)、四配位胺三乙酸(NTA-NI)以及五配位(SMART-NI)为配基。

使用金属亲和填料纯化，通常需要在目的蛋白上引入6个组氨酸标签，即His-tag标签，这一标签最小只有6个氨基酸残基，水溶性好，通常不影响蛋白的结构与功能，在制药或者其它His6-tag具有不利影响的用途方面，需要移除His-tag标签，但是移除His-tag是一个巨大困难，常规的解决办法是在His6-tag与目的蛋白之间引入一个蛋白酶的酶切位点，粗纯化后的融合蛋白经过特定蛋白酶的加工，可以切除标签，通常使用凝血酶(Thrombin)、活化凝血十因子(FactorXa)、烟草花叶病毒蛋白酶TEV等进行切割，但这些酶往往存在特异性不够，会在目的蛋白序列内切开甚至切割以后会留下冗余氨基酸残基；近年来有人发现真核生物的类泛素蛋白SUMO可以特异性的被一种空间识别特异性的蛋白酶ULP1加工，这一过程具有最高底物特异性以及切割效率，如果将SUMO连接到目的蛋白的N端，ULP1蛋白酶切割以后，可以完美的解决切割效率、切割特异性以及冗余残基的问题。

目前还未见使用芋螺肽与纤连蛋白的FN功能片段融合表达的策略，进行芋螺肽的表达、提高纤连蛋白在松弛皱纹、淡斑方面的效果、并进行规模制造重组纤连蛋白的报道。

且尚未见到使用第三代超耐受镍柱纯化重组纤连蛋白，达到简化纯化工序、提高纯化效率的策略，也未见到使用SUMO/ULP1体系构建融合重组纤连蛋白进而制备重组纤连蛋白的策略。

发明内容

针对上述情况，本发明的第一个目的是提供具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，旨在采用生物技术进行芋螺肽的表达，提高纤连蛋白在松弛皱纹、淡斑、促进皮肤修复方面的效果，并进行规模制造重组纤连蛋白rFN。

其技术方案为：具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，所述重组纤连蛋白序列包括至少一个可以和细胞整合素受体结合的RGD结构域、至少一段可作用于钠离子通道的钠离子通道结合肽段，所述RGD结构域与所述钠离子通道结合肽段之间用包含0-300个氨基酸残基的多肽连接片段进行连接。

优选地，所述钠离子通道结合肽段来自于天然芋螺肽的Mu-CnIIIC片段，所述Mu-CnIIIC片段的氨基酸序列为QGCCXXXXXCSSXXCBDHZRCCGRR，所述Mu-CnIIIC片段的氨基酸序列中的X为氨基酸残基的任一种，B为碱性残基Lys、Arg中的任一种，Z为小侧链残基Gly、Ala、Ser中的任一种。

优选地，所述Mu-CnIIIC片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选地，所述RGD结构域为天然纤连蛋白的FnIII-10结构域，所述FnIII-10结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码核酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.1氨基酸序列内含有Arg-Gly-Asp的三个连续氨基酸残基序列，用于与细胞特定类型的整合素受体结合，所述多肽连接片段为天然纤连蛋白的FnIII-8、FnIII-9结构域。

优选地，所述重组纤连蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明的第二个目的是提供上述的具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白的制备方法，使用第三代超耐受镍柱纯化重组纤连蛋白rFN，采用SUMO/ULP1体系构建融合重组纤连蛋白rFN，达到简化纯化工序、提高纯化效率的策略。

其技术方案为：具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)载体构建：截取天然纤连蛋白的所述RGD结构域与多肽连接片段，以所述多肽连接片段连接所述RGD结构域与所述钠离子通道结合肽段，获得重组纤连蛋白rFN的编码DNA，将所述重组纤连蛋白rFN的编码DNA接入pSmart-I载体中，获得融合蛋白His-SUMO-rFN的重组表达载体pSmart-I-rFN质粒。

(2)摇瓶表达：将所述重组表达载体pSmart-I-rFN质粒转入大肠杆菌表达菌株，摇瓶鉴定，获得阳性工程菌。

(3)规模发酵：将所述阳性工程菌接种至培养基中培养，得到种子液，将所述种子液接种到发酵培养基中发酵、加入诱导剂诱导表达，离心得到发酵菌泥。

(4)超耐镍亲和纯化：将步骤(3)中得到的发酵菌泥均质破碎，离心过滤处理，上柱进行第三代超耐镍亲和纯化，得到洗脱后的融合蛋白His-SUMO-rFN。

(5)酶切回挂除去标签、离子柱精制纯化：取步骤(4)获得的洗脱后的融合蛋白His-SUMO-rFN，加入ULP1蛋白酶用于切除纯化标签His-SUMO，得到酶切后的重组纤连蛋白rFN缓冲液，稀释缓冲液后回挂超耐受镍柱，合并穿出液与冲洗液，采用低盐PB缓冲液进行离子交换填料精纯、洗脱。

优选地，所述纯化标签His-SUMO的SUMO部分的N端包含一段用于纯化的组氨酸标签，所述组氨酸标签含有大于或等于6个His氨基酸残基，所述纯化标签His-SUMO的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码核酸序列如SEQ ID NO.6所示。

优选地，所述ULP1蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码核酸序列如SEQ IDNO.8所示，选自酿酒酵母。

本发明的第三个目的是具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白的应用，其技术方案为：具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白的应用，用于体外贴壁细胞培养以及皮肤美容中的损伤修复、抗皱、淡斑。

本发明的有益效果是：

(1)本申请将芋螺肽的功能区域和天然纤连蛋白的功能区融合表达，表达的重组纤连蛋白rFN同时具有结合钠离子通道以及整合素受体的能力，芋螺肽中的钠离子通道调节功能区域具有调控神经肌肉连接的能力，可以舒缓肌肉紧张，起到松弛皱纹的能力，而天然纤连蛋白的FnIII-10结构域具有调控细胞贴壁、迁移、增殖、促进胞外其它基质蛋白的表达，对皱纹区域有良好的填充作用，两者相结合，在促进皮肤修复、代谢更新的同时，延缓衰老并减少皱纹产生，增强淡斑、抗皱的效果。

(2)采用超耐受金属亲和纯化填料进行高效亲和纯化、采用SUMO/ULP1体系构建融合重组纤连蛋白rFN；

超耐受镍亲和填料对于带有His-tag标签蛋白的超过90％的回收率、His-SUMO标签增加了重组纤连蛋白rFN的可溶性以及提高表达量，简化了小分子化重组类人纤连蛋白的粗纯化工艺；

ULP1特异性蛋白酶可将标签全部切除，得到的重组纤连蛋白rFN不含有纯化标签、纯度高、比活力高；

且采用高密度发酵，His-SUMO-rFN规模发酵过程中诱导后，菌体密度提高2-3倍，最终发酵产物OD600超过100，单位体积发酵液的表达量可以达到10g/L以上，制备过程简单高效，实现低成本、高效率、大规模生产高质量重组纤连蛋白的目的，拓展其商业化应用的领域。

(3)通过本申请制备方法获得的重组纤连蛋白rFN，具有良好的pH值稳定范围、优异的温度稳定范围(在70℃保温3小时，蛋白损失量小于20％)、较宽的盐离子浓度耐受范围(在盐浓度为100mM-400mM的范围内较稳定)。

(4)本发明得到的重组纤连蛋白rFN具有促进细胞贴壁展开和增殖的效果，具有促进细胞生长、代谢更新的效果，促进皮肤修复，且具有显著的减少皱纹、减弱色斑的效果。

附图说明

图1A为本发明pSmart-I载体框架图谱。

图1B为重组表达载体pSmart-I-rFN质粒的框架图谱。

图2A为重组纤连蛋白质rFN制备方法流程图。

图2B为重组纤连蛋白rFN的纯化工艺流程图。

图3为融合蛋白His-SUMO-rFN规模发酵表达量的时序电泳图。

图4为融合蛋白His-SUMO-rFN酶切效率电泳图。

图5为融合蛋白His-SUMO-rFN金属亲和填料(Smart Ni)纯化电泳图。

图6为重组纤连蛋白rFN阳离子交换填料(CM)纯化电泳图。

图7A为重组纤连蛋白rFN温度稳定性测试的电泳图。

图7B为重组纤连蛋白rFN pH稳定性测试的电泳图。

图7C为重组纤连蛋白rFN盐浓度稳定性测试的电泳图。

图8A为重组纤连蛋白rFN促进人二倍体细胞贴壁与增殖能力测试结果图。

图8B为重组纤连蛋白rFN促进仓鼠CHO细胞贴壁与增殖能力测试结果图。

图9为重组纤连蛋白rFN用于美容去皱淡斑使用效果图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员在不偏离本发明的精神和范围下对本发明技术方案的细节和形式进行的任何修改和替换，均落入本发明的保护范围内。下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例一：具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白

本发明涉及一种具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，该重组纤连蛋白序列包括至少一个可以和细胞整合素受体结合的RGD结构域、至少一段可作用于钠离子通道的钠离子通道结合肽段，所述RGD结构域与所述钠离子通道结合肽段之间用包含0-300个氨基酸残基的多肽连接片段进行连接。

基于天然芋螺肽的功能，选定其Mu-CnIIIC片段为所述钠离子通道结合肽段，所述Mu-CnIIIC片段的氨基酸序列QGCCXXXXXCSSXXCBDHZRCCGRR，所述Mu-CnIIIC片段的氨基酸序列中的X为20种氨基酸残基的任一种，即是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸中的任意一种，B为碱性残基赖氨酸Lys、精氨酸Arg残基中的任意一种，Z为小侧链残基甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、丝氨酸Ser中的任意一种。

所述Mu-CnIIIC片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码核酸序列如SEQ IDNO.4所示。

基于天然纤连蛋白结构域的功能，选定天然纤连蛋白的FnIII-10结构域作为所述RGD结构域，所述FnIII-10结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码核酸序列如SEQID NO.2所示，所述SEQ ID NO.1氨基酸序列内含有Arg-Gly-Asp的三个连续氨基酸残基序列，用于与细胞特定类型的整合素受体结合。

选定来自天然纤连蛋白的结构域FnIII-8、FnIII-9为多肽连接片段，连接FnIII-10结构域与Mu-CnIIIC片段，获得重组纤连蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

实施例二：具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白的制备方法

一、具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白的制备方法

包括以下步骤：

(1)载体构建

如图2A中的箭头1所指，截取天然纤连蛋白的FnIII-8、FnIII-9、FnIII-10结构域，截取天然芋螺肽的Mu-CnIIIC片段，通过FnIII-8、FnIII-9结构域将FnIII-10结构域与Mu-CnIIIC片段连接，采用全基因优化并合成将FnIII-8、FnIII-9、FnIII-10结构域及Mu-CnIIIC片段无缝拼接，获得重组纤连蛋白rFN的编码DNA。

如图2A中的箭头2所指，将所述重组纤连蛋白rFN的编码DNA接入pSmart-I载体的合适读码框位置，pSmart-I载体购自常州天地人和生物科技有限公司，获得融合蛋白His-SUMO-rFN的重组表达载体pSmart-I-rFN质粒。

pSmart-I载体框架图谱、重组表达载体pSmart-I-rFN质粒的框架图谱分别见图1A和图1B，其中原始的pSmart-I载体中含有His-SUMO的编码框，重组纤连蛋白rFN的编码DNA序列插入到His-SUMO编码框内，就获得了编码一个融合了His-SUMO和重组纤连蛋白rFN的表达质粒pSmart-I-rFN。

融合蛋白His-SUMO-rFN的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，pSmart-I载体的核酸序列如SEQ ID NO.12所示，重组表达载体pSmart-I-rFN质粒的核酸序列如SEQ ID NO.13所示。

(2)摇瓶表达

如图2A的箭头3所指，将所述重组表达载体pSmart-I-rFN质粒转入大肠杆菌表达菌株，摇瓶鉴定，获得阳性基因工程菌BL21(DE3)/pSmart-I-rFN。

具体为：将重组表达载体pSmart-I-rFN质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得阳性基因工程菌BL21(DE3)/pSmart-I-rFN，挑取阳转化子接种至600ml LB培养基中培养至OD600达到0.6，加入终浓度为1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导发酵，IPTG为诱导剂，分别于37℃诱导4小时、或22℃诱导6小时，4℃7000r/min离心10min收集菌体，加入30mLTBS(Tris-HCl 25mM,NaCl 150mM,pH7.4)重悬菌体，超声破碎菌体悬液至溶液清亮，12000r/min离心10min，所收集全细胞裂解液及上清液均采用SDS-PAGE分析检测融合蛋白His-SUMO-rFN的表达。

其中，重组表达载体pSmart-I-rFN本身带有卡那霉素抗性，带有T7启动子，转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株之后，菌株内带有的T7 RNA聚合酶可以启动融合蛋白基因转录，在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导条件下，可以利用大肠杆菌本身的蛋白质翻译系统，可以表达融合蛋白His-SUMO-rFN，该融合蛋白His-SUMO-rFN带有His-tag标签，可用于金属亲和纯化；带有一个SUMO标签蛋白，用于蛋白酶的特异性切割，以及带一个来自于天然纤连蛋白的功能片段rFN，经过筛选，摇瓶小量表达可以达到40mg/ml，融合蛋白His-SUMO-rFN可溶部分达到90％以上，经过镍柱亲和纯化，使用ULP1蛋白酶切，可以将His-SUMO标签与rFN片段高效切开。

(3)规模发酵

将步骤(2)中得到的阳性基因工程菌BL21(DE3)/pSmart-I-rFN接种至600mlLB培养基中37℃培养过夜作为种子液，将600ml种子液接种到50L发酵培养基中，在37℃温度下恒温培养进行发酵，发酵培养4h后，开始以800ml/h的速度加入发酵补料，第8小时发酵液OD600达到30以上，此时向发酵液中加入15g诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，加入诱导剂后，再以1000ml/h的速度继续向发酵液中加入发酵补料，第14小时(诱导后6小时)发酵液OD600达到50以上，结束发酵，离心得到发酵菌泥。

且加入诱导剂IPTG进行诱导后，需每小时取样采用SDS-PAGE分析检测融合蛋白His-SUMO-rFN的表达，结果见图3所示。

其中发酵培养基的配方为：2.5g/L硫酸铵、6.25g/L磷酸二氢钾、5g/L酵母浸粉以及10g/L蛋白胨，发酵补料的配方为：400g/L甘油，200g/L蛋白胨。

(4)超耐镍亲和纯化

如图2A中的箭头4所指的重组纤连蛋白rFN的纯化工艺流程图，如图2B中的4.1箭头所指，将步骤(3)中得到的发酵菌泥均质破碎，离心过滤处理，上层析柱进行第三代超耐镍亲和纯化，得到洗脱后的融合蛋白His-SUMO-rFN。

具体为：将发酵菌泥6000g进行离心力离心收菌，弃去上清液，剩余菌泥用冰水预冷的TBS缓冲液悬浮分散，60MPa压力高压均质破菌，再于低温4、℃10000g离心力高速离心除去菌体碎片，0.22um膜过滤进一步处理上柱前的裂菌样本的上清液；

上清液上层析柱进行超耐镍亲和纯化，镍柱的填料类型为Smart-Ni 6FF，填料购自常州天地人和，上样径向流速为200cm/小时，最后用下述三种洗脱液按照咪唑浓度由低到高的顺序洗脱，得到洗脱后的融合蛋白His-SUMO-rFN，并进行洗脱样品His-SUMO-rFN的SDS-PAGE电泳测试，测试结果见图5所示。合并纯度达标的洗脱组分，用于下一步精制纯化。

其中：平衡液为TBS缓冲液(Tris-HCl 25mM,NaCl 150mM,pH7.4)；

洗杂液：含有5mM咪唑的TBS缓冲液(Tris-HCl 25mM,NaCl 150mM,咪唑5mMpH7.4)；

洗脱液：含有不同浓度咪唑的TBS缓冲液

第一种洗脱液：含咪唑浓度为20mM的TBS缓冲液(Tris-HCl 25mM、NaCl 150mM、咪唑20mM，pH 7.4)；

第二种洗脱液：含咪唑浓度为50mM的TBS缓冲液(Tris-HCl 25mM、NaCl 150mM、咪唑50mM，pH 7.4)；

第三种洗脱液：含咪唑浓度为250mM的TBS缓冲液(Tris-HCl 25mM、NaCl 150mM、咪唑250mM，pH 7.4)。

(5)酶切回挂除去标签、离子柱精制纯化

酶切回挂除去标签：如图2B中的箭头4.2所指，取步骤(4)中得到的经镍柱洗脱后的融合蛋白His-SUMO-rFN，加入ULP1蛋白酶切除His-SUMO标签，酶切效率电泳图见图4，融合蛋白His-SUMO-rFN与ULP1蛋白酶的摩尔比为1000:1，ULP1蛋白酶购自镇江瑞华生物科技有限公司，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码核酸序列如SEQ ID NO.8所示，4℃酶切2小时，得到酶切后的重组纤连蛋白rFN缓冲液。

将重组纤连蛋白rFN缓冲液用不含有咪唑的TBS缓冲液稀释，回挂超耐受镍柱，对部分滞留层析柱的重组纤连蛋白rFN用10倍柱体积的TBS缓冲液冲洗收集，合并穿出液与冲洗液。

离子柱精制纯化：如图2B中的箭头4.3所指，将上述合并的穿出液与冲洗液在中空纤维体系中切换低盐磷酸盐缓冲液(PB)缓冲液进行离子交换填料精纯，填料类型为阳离子交换填料CM 6FF Beads，即羧甲基高流速琼脂糖购自常州天地人和，最后使用含有100mM/200mM/500mM NaCl的盐梯度洗脱液进行洗脱，所有洗脱样品均进行SDS-PAGE电泳检测，测试结果见图6所示。

PB缓冲液：磷酸二氢钠(NaH₂PQ₄)25mM，pH 6.5；

洗脱液为含有不同浓度氯化钠的PBS缓冲液；

第一种洗脱液：含氯化钠100mM的PBS缓冲液(25mM NaH₂PQ₄、100mM NaCl，pH 6.5)；

第二种洗脱液：含氯化钠200mM的PBS缓冲液(25mM NaH₂PQ₄、200mM NaCl，pH 6.5)；

第三种洗脱液：含氯化钠500mM的PBS缓冲液(25mM NaH₂PQ₄、500mM NaCl，pH 6.5)。

本申请中纯化标签His-SUMO的SUMO部分的N端包含一段用于纯化的组氨酸标签，所述组氨酸标签含有大于或等于6个His氨基酸残基，纯化标签His-SUMO的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码核酸序列如SEQ ID NO.6所示。

二、结果

1、His-SUMO-rFN规模发酵表达量时序电泳测试

如图3为融合蛋白His-SUMO-rFN规模发酵表达量的时序电泳图，其中，第1孔为诱导前样品，第2、3、4、5、6孔分别为诱导时长为2h、3h、4h、5h、6h的样品，M为预染分子量蛋白Marker。

根据图3所示，在规模发酵过程中，诱导前的本底表达被控制在很低水平，诱导前样品未见明显的融合蛋白His-SUMO-rFN条带，分子量约为54kDa，从诱导剂IPTG加入后2小时，融合蛋白His-SUMO-rFN占菌体总蛋白的含量比例上升，5小时后达到平台期，分子量约为54kDa，诱导6h后可以放罐，收获发酵液。

根据上样量(每孔1ul发酵液上样量)以及染色条带灰度计算，诱导后6小时，单位体积发酵液的表达量可以达到8g/L以上，若使用纯氧通气发酵，菌体浓度可以继续上升，提高菌体密度2-3倍，最终的发酵产物OD600超过100，与之对应地，单位体积发酵液的表达量超过10g/L。

2、His-SUMO-rFN酶切效率电泳测试

如图4中His-SUMO-rFN酶切效率电泳图所示，第1孔为酶切前的融合蛋白His-SUMO-rFN，第2孔为酶切时长1h的样品，第3孔为酶切时长2h的样品，M为预染分子量蛋白Marker。

结果显示：ULP1蛋白酶可以高效的切开His-SUMO-rFN融合蛋白(分子量约为54kDa)，1小时酶切效率大于95％，2小时酶切效率大于99％。酶切后的两个片段His-SUMO片段(表观分子量约为20kDa)、rFN片段(表观分子量约为34kDa)大小正确。

3、His-SUMO-rFN金属亲和填料(Smart Ni)纯化测试

图5为融合蛋白His-SUMO-rFN进行金属亲和填料纯化过程中各阶段样品的电泳测试图，第1孔为含有融合蛋白的上柱前的裂菌上清液，第2孔为穿出液，第3、4、5孔分别为用第一种洗脱液(含咪唑浓度为20mM的TBS缓冲液)、第二种洗脱液含咪唑浓度(含咪唑浓度为50mM的TBS缓冲液)、第三种洗脱液(含咪唑浓度为20mM的TBS缓冲液)洗脱得到的洗脱组分，第6孔为填料上残留的融合蛋白His-SUMO-rFN，M为预染分子量蛋白Marker。

电泳结果显示：融合蛋白His-SUMO-rFN可以被填料Smart-Ni 6FF高效捕获，一步亲和层析回收率可以达到90％以上，融合蛋白His-SUMO-rFN主要位于含50mM和250mM咪唑的洗脱液中。SDS-PAGE电泳图使用灰度扫描分析软件分析，收获的融合蛋白His-SUMO-rFN的纯度大于95％。

4、重组纤连蛋白rFN阳离子交换填料(CM)纯化测试

图6为重组纤连蛋白rFN进行阳离子交换填料(CM)，即纯化过程中各阶段样品的电泳测试图，图中第1孔为经过Smart Ni回挂去除标签之后的重组纤连蛋白rFN，第2孔为穿出液，第3、4、5孔分别为采用第一种洗脱液(含氯化钠100mM的PBS缓冲液)、第二种洗脱液(含氯化钠200mM的PBS缓冲液)、第三种洗脱液(含氯化钠500mM的PBS缓冲液)洗脱得到的洗脱组分，第6孔为填料上残留的重组纤连蛋白rFN，M为预染分子量蛋白Marker。

结果显示，重组纤连蛋白rFN可以高效地被阳离子交换填料CM吸附，穿出液中有少量的重组纤连蛋白rFN，其占比少于5％。

经高盐洗脱以后，重组纤连蛋白rFN主要位于含200mM和500mM NaCl浓度的洗脱液中，柱上残留比例少于5％，经高盐洗脱而回收的重组纤连蛋白rFN无明显可见杂带，电泳纯度大于99％。

经His-SUMO-rFN金属亲和填料纯化与重组纤连蛋白rFN阳离子交换填料纯化，得到的重组纤连蛋白rFN的总回收率大于90％，His-SUMO标签完全去除，重组纤连蛋白rFN内毒素水平小于0.001EU/ug。

实施例三：具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白的稳定性测试

1、温度稳定性测试

取纯化后的重组纤连蛋白rFN样品1ml分装至6个EP管中，分别放置于25℃、40℃、50℃、60℃和70℃水浴中孵育3小时，水浴结束后12000rpm离心，5min后取各上清液进行SDS-PAGE电泳检测。

结果如图7A所示，第1孔为25℃孵育样品，第2、3、4、5孔分别为40℃、50℃、60℃、70℃孵育样品，M为预染分子量蛋白Marker，结果显示：重组纤连蛋白rFN的耐热性较好，25℃保温3小时未见离心沉淀，40℃、50℃、60℃、70℃保温3小时会产生少量离心沉淀，但上清液中残留的重组纤连蛋白rFN的比例均大于80％，相比于40℃保温样品，70℃保温样品产生的沉淀更多、上清液中残留的重组纤连蛋白rFN较少。

2、pH稳定性测试

取纯化后的重组纤连蛋白rFN样品10ml分装至11个离心管中，分别调整离心管内溶液的pH值为9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5，12000rpm离心5min后取上清液进行SDS-PAGE电泳检测。

结果如图7B所示：第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10孔分别对应pH为9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0和4.5的样品，M为预染分子量蛋白Marker，结果显示：重组纤连蛋白rFN在pH值为7.5-9.0的环境中保持稳定，在pH值为5.5-7.0的环境中，其稳定性随pH值的下降而降低，在pH值为4.5-5.0的环境中，其稳定性随pH值下降的而上升。

3、盐浓度稳定性测试

取纯化后的重组纤连蛋白rFN样品10ml分装至离心管中，分别透析至盐浓度为0mM、100mM、200mM、300mM、400mM的TBS缓冲液中(20mM Tris，0-400mM NaCl，pH 8.0)，4℃透析48小时，每6小时换液一次，之后12000rpm离心5min后取上清液，进行SDS-PAGE电泳检测。

结果如图7C所示：第1、2、3、4、5孔分别对应处于盐浓度为0mM、100mM、200mM、300mM、400mM的TBS缓冲液中的样品，M为预染分子量蛋白Marker，结果显示：重组纤连蛋白rFN在氯化钠浓度为0mM的缓冲体系中稳定性下降，随着缓冲体系中NaCl浓度的增加，重组纤连蛋白rFN的稳定性增加。

通过该制备方法，本发明实现了在大肠杆菌中大量制备重组纤连蛋白rFN，通过超耐镍金属亲和填料(Smart Ni)、阳离子交换填料(CM)纯化方式的组合，多种填料获得了高纯度重组纤连蛋白rFN，重组纤连蛋白rFN的N端带有一段来自于芋螺肽的片段CnIIIC，且保留了天然的蛋白酶切位点，和天然纤连蛋白功能片段氨基酸残基序列完全相同，整个制备工艺融合蛋白His-SUMO-rFN的发酵产量大于8g/L培养基，精制纯化后重组纤连蛋白的收率大于50％，每升大肠杆菌发酵液可以获得4克以上纯度大于99％的重组纤连蛋白rFN。

该制备方法的优势在于：(1)His-SUMO标签增加了重组纤连蛋白rFN的可溶性以及提高表达量；(2)利用超耐受镍亲和填料对于带有His-tag标签蛋白的高效率回收(达到90％以上)；(3)利用了ULP1蛋白酶大于99％的特异性切割效率，可有效的除去His-SUMO标签；(4)利用了阳离子填料羧甲基高流速琼脂糖(CM 6FF Beads)可以很好的富集重组纤连蛋白rFN，提高重组纤连蛋白rFN纯度(纯度大于99％)的同时，去除小分子与内毒素。

且通过上述纯化工艺获得的重组纤连蛋白rFN，含有来自芋螺肽的CnIIIC功能区域，其可以结合并调节钠离子通道，还含有来自于人天然纤连蛋白FN的III结构域FnIII-8、FnIII-9、FnIII-10，可以结合细胞整合素受体，在两者之间保留了芋螺肽的天然蛋白酶加工位点，即位于C端的GRR序列，GRR序列可以特异性的被组织蛋白酶识别并切开，因此重组纤连蛋白rFN的两个片段都来自于天然蛋白，不含有任何冗余残基，在用于组织修复，特别是皮肤美容用途时，重组纤连蛋白rFN进入皮肤组织，能够被皮肤组织内的酶自动加工成CnIIIC和FnIII-8、FnIII-9、FnIII-10，CnIIIC片段结合钠离子通道，调节神经电流，具有松弛皱纹、镇痛舒缓的作用，FnIII-8、FnIII-9、FnIII-10能够诱导成纤维母细胞的迁移与分化，加快损伤修复、减少色斑沉积的效果。

且通过上述构建以及纯化方法制备的重组纤连蛋白rFN具有良好的pH值稳定范围、优异的温度稳定范围(在70℃保温3小时，蛋白损失量小于20％)、较宽的盐离子浓度耐受范围(在盐浓度为100mM-400mM的范围内较稳定)。

而化妆品配方通常选择弱酸性环境(pH5.0-pH5.5)、接近生理条件的盐离子浓度(生理盐水的离子强度以下)、生产中通常会有56度保温灭菌步骤，对于上述三点，本发明所制备的重组纤连蛋白rFN完全符合要求，因此适合用于医疗、美容等多个应用领域。

实施例四：具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白的应用

1、在促进细胞贴壁与增殖方面的应用

(1)使用人二倍体细胞进行贴壁和增值实验：

将人二倍体细胞复苏培养，到80％长满培养皿，胰蛋白酶消化细胞后，使用无血清培养基DMEM(购自Gibco公司)洗涤三次去除胰蛋白酶残留，加入培养基DMEM/F12(购自Gibco公司)分散被消化后的细胞到12孔板里进行培养，同时分别在各个培养基中加入不同浓度的重组纤连蛋白rFN，含重组纤连蛋白rFN浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0、5.0、10ug/ml的培养基，培养培养4-24小时后观察细胞贴壁及增值情况。

结果如图8A所示：消化后的细胞在没有重组纤连蛋白rFN的情况下贴壁缓慢，培养时长为24小时时增殖很少，消化后的细胞在含重组纤连蛋白rFN浓度为0.5ug/ml、1.0ug/ml、1.5ug/ml、2.0ug/ml的培养基中，培养时长到达4h时贴壁展开、到达24h有明显增殖，且随着培养基中重组纤连蛋白rFN的浓度上升，贴壁展开与增殖速度加快，而消化后的细胞在含重组纤连蛋白rFN浓度为2.0ug/ml、5.0ug/ml、10ug/ml的培养基中，贴壁展开与增殖没有显著差异。

(2)使用仓鼠CHO细胞进行贴壁和增值实验：

将仓鼠CHO细胞复苏培养，到80％长满培养皿，胰蛋白酶消化细胞后，使用无血清培养基DMEM(购自Gibco公司)洗涤三次去除胰蛋白酶残留，加入培养基DMEM/F12(购自Gibco公司)分散被消化后的细胞到12孔板里进行培养，同时分别在各个培养基中加入不同浓度的重组纤连蛋白rFN，形成含重组纤连蛋白rFN浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0、5.0、10ug/ml的培养基，培养24小时后观察细胞贴壁及增殖情况。

结果如图8B中所示，消化后的细胞在没有重组纤连蛋白rFN的情况下贴壁缓慢，培养24小时仅有少量细胞贴壁，但未展开成梭状，增殖很少；

在含重组纤连蛋白rFN浓度为0.5ug/ml的培养基中仅有少量细胞贴壁展开，但相比于未加重组纤连蛋白rFN的对照组，培养24小时后细胞增殖明显；

在含重组纤连蛋白rFN浓度为1.0、1.5、2.0、5.0、10ug/ml的培养基中，培养24小时后均有明显的贴壁展开与细胞增殖，且随重组纤连蛋白rFN的浓度上升，贴壁展开与增殖速度加快，在含重组纤连蛋白rFN浓度为10ug/ml的培养基中，细胞贴壁展开与增殖最充分。

以上实验说明重组纤连蛋白rFN具有促进细胞贴壁展开和增殖的效果，从而反映了重组纤连蛋白rFN具有促进细胞生长、代谢更新的效果，促进皮肤修复。

2、重组纤连蛋白rFN用于皮肤抗皱、淡斑

为测试重组纤连蛋白rFN在皮肤抗皱和淡斑上的表现，我们使用生理盐水，配制重组纤连蛋白rFN浓度为10ug/ml的溶液，涂抹实验者眼角，观察眼角鱼尾纹和色斑的变化。

结果如图9所示，结果表明使用7天后眼角鱼尾纹减弱、眼角色斑的色素沉积可以被逆转修复，使用后14天，眼角皮肤光泽度改善，皱纹减少、色斑减弱效果显著。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 江苏邦特生物科技有限公司，中国科学院过程工程研究所，中科华启（北京）生物技术研究院

<120> 具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白及其制备方法与应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 94

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens.）

<400> 1

Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr

1 5 10 15

Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr

20 25 30

Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe

35 40 45

Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro

50 55 60

Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp

65 70 75 80

Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr

85 90

<210> 2

<211> 282

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gtgagcgatg tgccgcgtga tctggaagtg gtggcggcga ccccgaccag cctgctgatt 60

agctgggatg cgccggcggt gaccgtgcgt tattatcgta ttacctatgg cgaaaccggc 120

ggcaacagcc cggtgcagga atttaccgtg ccgggcagca aaagcaccgc gaccattagc 180

ggcctgaaac cgggcgtgga ttataccatt accgtgtatg cggtgaccgg ccgtggcgat 240

agcccggcga gcagcaaacc gattagcatt aactatcgta cc 282

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> 芋螺（Conus geographus）

<400> 3

Gln Gly Cys Cys Asn Gly Pro Lys Gly Cys Ser Ser Lys Trp Cys Arg

1 5 10 15

Asp His Ala Arg Cys Cys Gly Arg Arg

20 25

<210> 4

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cagggctgct gcaacggccc gaaaggctgc agcagcaaat ggtgccgtga tcatgcgcgt 60

tgctgcggcc gtcgt 75

<210> 5

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 5

Met Gly His His His His His His Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln

1 5 10 15

Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile

20 25 30

Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys

35 40 45

Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln

50 55 60

Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile

65 70 75 80

Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile

85 90 95

Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly

100 105

<210> 6

<211> 318

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

atgggtcacc atcaccatca ccatatgtcg gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca 60

gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct 120

tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc 180

gctaaaagac agggtaagga aatggactcc ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt 240

caagctgatc agacccctga agatttggac atggaggata acgatattat tgaggctcac 300

agagaacaga ttggtggc 318

<210> 7

<211> 228

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 7

Met Leu Val Pro Glu Leu Asn Glu Lys Asp Asp Asp Gln Val Gln Lys

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ser Arg Glu Asn Thr Gln Leu Met Asn Arg Asp Asn Ile

20 25 30

Glu Ile Thr Val Arg Asp Phe Lys Thr Leu Ala Pro Arg Arg Trp Leu

35 40 45

Asn Asp Thr Ile Ile Glu Phe Phe Met Lys Tyr Ile Glu Lys Ser Thr

50 55 60

Pro Asn Thr Val Ala Phe Asn Ser Phe Phe Tyr Thr Asn Leu Ser Glu

65 70 75 80

Arg Gly Tyr Gln Gly Val Arg Arg Trp Met Lys Arg Lys Lys Thr Gln

85 90 95

Ile Asp Lys Leu Asp Lys Ile Phe Thr Pro Ile Asn Leu Asn Gln Ser

100 105 110

His Trp Ala Leu Gly Ile Ile Asp Leu Lys Lys Lys Thr Ile Gly Tyr

115 120 125

Val Asp Ser Leu Ser Asn Gly Pro Asn Ala Met Ser Phe Ala Ile Leu

130 135 140

Thr Asp Leu Gln Lys Tyr Val Met Glu Glu Ser Lys His Thr Ile Gly

145 150 155 160

Glu Asp Phe Asp Leu Ile His Leu Asp Cys Pro Gln Gln Pro Asn Gly

165 170 175

Tyr Asp Cys Gly Ile Tyr Val Cys Met Asn Thr Leu Tyr Gly Ser Ala

180 185 190

Asp Ala Pro Leu Asp Phe Asp Tyr Lys Asp Ala Ile Arg Met Arg Arg

195 200 205

Phe Ile Ala His Leu Ile Leu Thr Asp Ala Leu Lys Leu Glu His His

210 215 220

His His His His

225

<210> 8

<211> 684

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

atgctggtgc cggaactgaa cgaaaaagat gatgatcagg tgcagaaagc gctggcgagc 60

cgtgaaaaca cccagctgat gaaccgtgat aacattgaaa ttaccgtgcg tgattttaaa 120

accctggcgc cgcgtcgttg gctgaacgat accattattg aattttttat gaaatatatt 180

gaaaaaagca ccccgaacac cgtggcgttt aacagctttt tttataccaa cctgagcgaa 240

cgtggctatc agggcgtgcg tcgttggatg aaacgtaaaa aaacccagat tgataaactg 300

gataaaattt ttaccccgat taacctgaac cagagccatt gggcgctggg cattattgat 360

ctgaaaaaaa aaaccattgg ctatgtggat agcctgagca acggcccgaa cgcgatgagc 420

tttgcgattc tgaccgatct gcagaaatat gtgatggaag aaagcaaaca taccattggc 480

gaagattttg atctgattca tctggattgc ccgcagcagc cgaacggcta tgattgcggc 540

atttatgtgt gcatgaacac cctgtatggc agcgcggatg cgccgctgga ttttgattat 600

aaagatgcga ttcgtatgcg tcgttttatt gcgcatctga ttctgaccga tgcgctgaaa 660

ctggaacatc atcatcatca tcat 684

<210> 9

<211> 297

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 9

Gln Gly Cys Cys Asn Gly Pro Lys Gly Cys Ser Ser Lys Trp Cys Arg

1 5 10 15

Asp His Ala Arg Cys Cys Gly Arg Arg Gly Ser Ile Gln Trp Asn Ala

20 25 30

Pro Gln Pro Ser His Ile Ser Lys Tyr Ile Leu Arg Trp Arg Pro Lys

35 40 45

Asn Ser Val Gly Arg Trp Lys Glu Ala Thr Ile Pro Gly His Leu Asn

50 55 60

Ser Tyr Thr Ile Lys Gly Leu Lys Pro Gly Val Val Tyr Glu Gly Gln

65 70 75 80

Leu Ile Ser Ile Gln Gln Tyr Gly His Gln Glu Val Thr Arg Phe Asp

85 90 95

Phe Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Gly Gly Ser Gly Ala Val Pro Pro

100 105 110

Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val

115 120 125

Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg

130 135 140

Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser

145 150 155 160

Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu

165 170 175

Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro

180 185 190

Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Gly Ser Gly Val Ser Asp Val Pro

195 200 205

Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser

210 215 220

Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly

225 230 235 240

Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser

245 250 255

Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr

260 265 270

Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser

275 280 285

Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr

290 295

<210> 10

<211> 891

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

cagggctgct gcaacggccc gaaaggctgc agcagcaaat ggtgccgtga tcatgcgcgt 60

tgctgcggcc gtcgtggcag cattcagtgg aacgcgccgc agccgagcca tattagcaaa 120

tatattctgc gttggcgtcc gaaaaacagc gtgggccgtt ggaaagaagc gaccattccg 180

ggccatctga acagctatac cattaaaggc ctgaaaccgg gcgtggtgta tgaaggccag 240

ctgattagca ttcagcagta tggccatcag gaagtgaccc gttttgattt taccaccacc 300

agcaccagca ccggcggcag cggcgcggtg ccgccgccga ccgatctgcg ttttaccaac 360

attggcccgg ataccatgcg tgtgacctgg gcgccgccgc cgagcattga tctgaccaac 420

tttctggtgc gttatagccc ggtgaaaaac gaagaagatg tggcggaact gagcattagc 480

ccgagcgata acgcggtggt gctgaccaac ctgctgccgg gcaccgaata tgtggtgagc 540

gtgagcagcg tgtatgaaca gcatgaaagc accccgctgc gtggccgtca gaaaaccggc 600

ggcagcggcg tgagcgatgt gccgcgtgat ctggaagtgg tggcggcgac cccgaccagc 660

ctgctgatta gctgggatgc gccggcggtg accgtgcgtt attatcgtat tacctatggc 720

gaaaccggcg gcaacagccc ggtgcaggaa tttaccgtgc cgggcagcaa aagcaccgcg 780

accattagcg gcctgaaacc gggcgtggat tataccatta ccgtgtatgc ggtgaccggc 840

cgtggcgata gcccggcgag cagcaaaccg attagcatta actatcgtac c 891

<210> 11

<211> 403

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 11

Met Gly His His His His His His Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln

1 5 10 15

Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile

20 25 30

Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys

35 40 45

Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln

50 55 60

Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile

65 70 75 80

Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile

85 90 95

Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Gln Gly Cys Cys Asn Gly

100 105 110

Pro Lys Gly Cys Ser Ser Lys Trp Cys Arg Asp His Ala Arg Cys Cys

115 120 125

Gly Arg Arg Gly Ser Ile Gln Trp Asn Ala Pro Gln Pro Ser His Ile

130 135 140

Ser Lys Tyr Ile Leu Arg Trp Arg Pro Lys Asn Ser Val Gly Arg Trp

145 150 155 160

Lys Glu Ala Thr Ile Pro Gly His Leu Asn Ser Tyr Thr Ile Lys Gly

165 170 175

Leu Lys Pro Gly Val Val Tyr Glu Gly Gln Leu Ile Ser Ile Gln Gln

180 185 190

Tyr Gly His Gln Glu Val Thr Arg Phe Asp Phe Thr Thr Thr Ser Thr

195 200 205

Ser Thr Gly Gly Ser Gly Ala Val Pro Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe

210 215 220

Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro

225 230 235 240

Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn

245 250 255

Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val

260 265 270

Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser

275 280 285

Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys

290 295 300

Thr Gly Gly Ser Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val

305 310 315 320

Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val

325 330 335

Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser

340 345 350

Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile

355 360 365

Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val

370 375 380

Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn

385 390 395 400

Tyr Arg Thr

<210> 12

<211> 5594

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggtcacc atcaccatca ccatatgtcg 5100

gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact 5160

cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc 5220

actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc gctaaaagac agggtaagga aatggactcc 5280

ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt caagctgatc agacccctga agatttggac 5340

atggaggata acgatattat tgaggctcac agagaacaga ttggtggcca aggatccgaa 5400

ttcgagctcc gtcgacaagc ttgcggccgc actcgagcac caccaccacc accactgaga 5460

tccggctgct aacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata 5520

actagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg 5580

aactatatcc ggat 5594

<210> 13

<211> 6445

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggtcacc atcaccatca ccatatgtcg 5100

gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact 5160

cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc 5220

actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc gctaaaagac agggtaagga aatggactcc 5280

ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt caagctgatc agacccctga agatttggac 5340

atggaggata acgatattat tgaggctcac agagaacaga ttggtggcca gggctgctgc 5400

aacggcccga aaggctgcag cagcaaatgg tgccgtgatc atgcgcgttg ctgcggccgt 5460

cgtggcagca ttcagtggaa cgcgccgcag ccgagccata ttagcaaata tattctgcgt 5520

tggcgtccga aaaacagcgt gggccgttgg aaagaagcga ccattccggg ccatctgaac 5580

agctatacca ttaaaggcct gaaaccgggc gtggtgtatg aaggccagct gattagcatt 5640

cagcagtatg gccatcagga agtgacccgt tttgatttta ccaccaccag caccagcacc 5700

ggcggcagcg gcgcggtgcc gccgccgacc gatctgcgtt ttaccaacat tggcccggat 5760

accatgcgtg tgacctgggc gccgccgccg agcattgatc tgaccaactt tctggtgcgt 5820

tatagcccgg tgaaaaacga agaagatgtg gcggaactga gcattagccc gagcgataac 5880

gcggtggtgc tgaccaacct gctgccgggc accgaatatg tggtgagcgt gagcagcgtg 5940

tatgaacagc atgaaagcac cccgctgcgt ggccgtcaga aaaccggcgg cagcggcgtg 6000

agcgatgtgc cgcgtgatct ggaagtggtg gcggcgaccc cgaccagcct gctgattagc 6060

tgggatgcgc cggcggtgac cgtgcgttat tatcgtatta cctatggcga aaccggcggc 6120

aacagcccgg tgcaggaatt taccgtgccg ggcagcaaaa gcaccgcgac cattagcggc 6180

ctgaaaccgg gcgtggatta taccattacc gtgtatgcgg tgaccggccg tggcgatagc 6240

ccggcgagca gcaaaccgat tagcattaac tatcgtacct aactcgagca ccaccaccac 6300

caccactgag atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc 6360

gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg 6420

ctgaaaggag gaactatatc cggat 6445

Claims (9)

1.具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，其特征在于，所述重组纤连蛋白序列包括至少一个可以和细胞整合素受体结合的RGD结构域、至少一段可作用于钠离子通道的钠离子通道结合肽段，所述RGD结构域与所述钠离子通道结合肽段之间用包含0-300个氨基酸残基的多肽连接片段进行连接。

2.如权利要求1所述的具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，其特征在于：所述钠离子通道结合肽段来自于天然芋螺肽的Mu-CnIIIC片段，所述Mu-CnIIIC片段的氨基酸序列为QGCCXXXXXCSSXXCBDHZRCCGRR，所述Mu-CnIIIC片段的氨基酸序列中的X为氨基酸残基的任一种，B为碱性残基Lys、Arg中的任一种，Z为小侧链残基Gly、Ala、Ser中的任一种。

3.如权利要求2所述的具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，其特征在于：所述Mu-CnIIIC片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求1-3任一所述的具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，其特征在于：所述RGD结构域为天然纤连蛋白的FnIII-10结构域，所述FnIII-10结构域的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，编码核酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.1氨基酸序列内含有Arg-Gly-Asp的三个连续氨基酸残基序列，用于与细胞特定类型的整合素受体结合，所述多肽连接片段为天然纤连蛋白的FnIII-8、FnIII-9结构域。

5.如权利要求4所述的具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，其特征在于：所述重组纤连蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

6.如权利要求1所述的具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)载体构建：截取天然纤连蛋白的所述RGD结构域与多肽连接片段，以所述多肽连接片段连接所述RGD结构域与所述钠离子通道结合肽段，获得重组纤连蛋白rFN的编码DNA，将所述重组纤连蛋白rFN的编码DNA接入pSmart-I载体中，获得融合蛋白His-SUMO-rFN的重组表达载体pSmart-I-rFN质粒。

(2)摇瓶表达：将所述重组表达载体pSmart-I-rFN质粒转入大肠杆菌表达菌株，摇瓶鉴定，获得阳性工程菌。

(3)规模发酵：将所述阳性工程菌接种至培养基中培养，得到种子液，将所述种子液接种到发酵培养基中发酵、加入诱导剂诱导表达，离心得到发酵菌泥。

(4)超耐镍亲和纯化：将步骤(3)中得到的发酵菌泥均质破碎，离心过滤处理，上柱进行第三代超耐镍亲和纯化，得到洗脱后的融合蛋白His-SUMO-rFN。

(5)酶切回挂除去标签、离子柱精制纯化：取步骤(4)获得的洗脱后的融合蛋白His-SUMO-rFN，加入ULP1蛋白酶用于切除纯化标签His-SUMO，得到酶切后的重组纤连蛋白rFN缓冲液，稀释缓冲液后回挂超耐受镍柱，合并穿出液与冲洗液，采用低盐PB缓冲液进行离子交换填料精纯、洗脱。

7.如权利要求6所述的具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白的制备方法，其特征在于：所述纯化标签His-SUMO的SUMO部分的N端包含一段用于纯化的组氨酸标签，所述组氨酸标签含有大于或等于6个His氨基酸残基，所述纯化标签His-SUMO的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码核酸序列如SEQ ID NO.6所示。

8.如权利要求6所述的具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白的制备方法，其特征在于：所述ULP1蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码核酸序列如SEQ ID NO.8所示，选自酿酒酵母。

9.如权利要求1所述的具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白的应用，其特征在于：用于体外贴壁细胞培养以及皮肤美容中的损伤修复、抗皱、淡斑。

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