CN110894225A - 一种μ-芋螺肽的规模化制备纯化方法以及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种μ‑芋螺肽的规模化制备纯化方法以及应用。本发明所述μ‑芋螺肽的规模化制备纯化方法包括线性肽氨基树脂的制备、裂解、线性肽折叠、粗肽纯化,采用替代度0.6‑0.8的氨基树脂,有利于提高合成效率;通过固相合成依次偶联氨基酸合成保护的二十二肽氨基树脂,裂解浓缩;通过空气氧化一步折叠形成三对二硫键,折叠过程不用额外加入氧化剂,操作简单,成本低,适于工业化大生产;粗肽通过HPLC制备纯化,得到纯度大于97%的μ‑芋螺肽。本发明还提供了所述μ‑芋螺肽在制备祛皱化妆品中的应用,通过简单涂抹即可达到注射肉毒杆菌毒素的效果,可避免注射肉毒杆菌毒素所带来的疼痛、面瘫等副作用。
Description
技术领域
本发明属于多肽药物领域,涉及一种μ-芋螺肽的规模化制备纯化方法以及应用。
背景技术
芋螺毒素(conotoxin)是由海洋腹足纲软体动物芋螺(Conus)的毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌的混合毒素,由许多单一毒肽组成,主要成分是一些对不同离子通道及神经受体高专一性的活性多肽化合物。与其他天然肽类毒素相比,芋螺毒素具有相对分子质量小、结构稳定、高活性、高选择性及易于合成等突出优点。根据其保守的信号肽序列及二硫键骨架,芋螺毒素可分为A,M,O,P,S,T,I,V,Y,J,D,C和L等20多个超家族,再根据其药理学作用靶点,进一步可分为α、μ、ω、κ、δ、ψ、σ、ρ、γ、加压素、惊厥剂和睡眠肽等药理家族。其中,μ-芋螺毒素主要来自M超家族,由17~22个氨基酸残基组成,是从海洋锥形蜗牛Conusconsors的毒液中分离出的芋螺肽。
μ-芋螺毒素通过骨骼肌Nav1.4通道的特异性阻断表现出肌肉降低作用,也阻断α3β2烟碱型乙酰胆碱受体。μ-芋螺毒素能够完全抑制离体小鼠半膈肌的抽搐张力(IC50=150nM)。μ-芋螺毒素能特异性地作用于乙酰胆碱受体及其他神经递质的各种受体亚型,以及钙、钠、钾等多种离子通道,不仅可用于功能性化妆品当中发挥抗皱活性,亦可直接作为药物,对新药研发具有重要意义。
获取芋螺毒素的方法主要有3种:从野生芋螺毒管中直接分离获得;通过转基因生物法合成;采用固相多肽合成法合成。其中,天然产物提取产量受限,从芋螺体内直接分离提取芋螺毒素的工艺复杂,提取困难,成本高,而生物法合成工艺并不成熟,均难以实现芋螺毒素的产业化,并不能满足市场的需求。因此,通过固相多肽合成法大量合成,降低成本,以此满足科研用途及日益增长的市场需求势在必行。
通过模拟天然的μ-芋螺毒素,人工合成μ-芋螺肽,该多肽由22个氨基酸构成,含有3个二硫键,序列为pGlu-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Lys-Ser-Trp-Cys-Arg-Asp-His-Ala-Arg-Cys-Cys-NH2。二硫键位于Cys3-Cys15、Cys4-Cys21和Cys10-Cys22位置。
μ-芋螺肽结构通过高度折叠,穿透能力强。当动作信号传达到运动神经末梢后,经过一系列生理活动,突触前膜释放乙酰胆碱,乙酰胆碱与突触后膜的肌肉型烟碱型乙酰胆碱受体(muscle-nicotinic acetylcholine receptor,m-nAchR)结合,钠离子内流,从而产生动作电位,肌肉发生收缩。过度的肌肉紧张和收缩,是形成皱纹的主要原因之一。芋螺肽可以结合m-nAchR,阻断乙酰胆碱与m-nAchR结合,还可以特异性地阻断电压门控钠离子通道,使钠离子内流受阻,导致肌肉动作电位不能形成,表情肌得以放松,从而有效地预防和减少皱纹,可作为抗皱产品中的活性成分。被誉为可以涂抹的类肉毒杆菌毒素,通过涂抹即可达到注射肉毒杆菌毒素的作用,有望替代注射等侵入式祛皱方法,从而更安全有效地祛皱,避免侵入式产品对人体造成感染、面瘫等潜在危害。
人工合成芋螺肽的工艺路线包括线性肽合成、裂解、氧化折叠、粗肽纯化。线性肽的氧化折叠是芋螺肽合成中的重要步骤,只有通过折叠形成正确的二硫键连接,μ-芋螺肽才具有祛皱活性。开发一种工艺简单,稳定可控,能实现正确折叠,适于工业化大生产的芋螺肽制备纯化方法,将得到的芋螺肽原料应用于祛皱产品,满足市场需求,是本领域急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种μ-芋螺肽的规模化制备纯化方法以及应用。
本发明提供的一种μ-芋螺肽的规模化制备纯化方法,包括以下步骤:
(1)线性肽氨基树脂的制备
根据多肽序列羧基端的氨基酸结构,选择Fmoc氨基树脂作为固相合成的载体,树脂替代度控制在0.6-0.8,以提高固相合成的效率。
投入树脂溶胀,在Fmoc脱保护剂下反应脱去Fmoc保护基,溶剂洗涤树脂,投入活化的氨基酸,在偶联体系作用下于偶联溶剂中从羧基端到氨基端依次按照肽序连接氨基酸,进行树脂洗涤,得到二十二肽氨基树脂。具体地,根据芋螺肽的序列,依次投入Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-Pyr-OH反应,直至所有氨基酸连接完成,用甲醇收缩树脂,晾干,得到线性二十二肽氨基树脂。
(2)裂解
配制裂解液,加入上述二十二肽氨基树脂,进行裂解反应,反应后裂解液进行浓缩处理。
用砂芯过滤漏斗抽真空过滤裂解液树脂,用TFA洗涤树脂,抽干。过滤后的肽裂解液缓慢加入异丙醚中,沉降多肽,离心分离固体。再用乙醚洗涤固体沉淀,离心分离固体,用氮气吹干固体沉淀,真空干燥即得到线性肽粗品。
(3)氧化折叠
二硫键形成的本质是两个游离的巯基经氧化后形成的连接。μ-芋螺肽天然产物为热力学稳定产物,因此本发明采用空气氧化法来合成三对二硫键。
配制0.1mol/L Tris缓冲液,调节pH值为8.0-10.0,加入线性肽粗品中,进行氧化折叠反应,得到经氧化折叠形成三对二硫键的μ-芋螺肽粗品缓冲液。
(4)纯化
采用反相高效液相技术,流动相A为制备纯乙腈,流动相B为0.1%冰乙酸的纯水溶液,色谱柱为汉邦DAC-100,进行梯度制备,多次纯化,收集纯度≥97%的组分。纯品液采用旋转蒸发仪浓缩,冻干处理,即得μ-芋螺肽纯品。
本发明还提供了所述μ-芋螺肽在制备祛皱化妆品中的应用。
本发明相对于现有技术所取得的有益效果包括:本发明提供一种μ-芋螺肽的规模化制备纯化方法,采用替代度0.6-0.8的氨基树脂,有利于提高固相合成的效率;通过空气氧化一步折叠形成三对二硫键,折叠过程不用额外加入氧化剂,操作简单,成本低,适于工业化大生产。本发明还提供了所述μ-芋螺肽在制备祛皱化妆品中的应用,通过简单涂抹即可达到注射肉毒杆菌毒素的效果,可避免注射肉毒杆菌毒素所带来的疼痛、面瘫等副作用。
附图说明
图1目标化合物μ-芋螺肽(分子式C92H139N35O28S6)质谱图,[M+H]+m/z 1188.1825为化合物双电荷分子离子峰
具体实施方式
为了更好的理解本发明,下面结合实施例和附图对发明作详细的说明,但并不只限于以下的实施例。
下面实施例中使用的材料与试剂代表的意义为:
Rink AM树脂:一种多肽合成用的起始树脂
DMF:N,N-二甲基甲酰胺
DCM:二氯甲烷
DIC:二异丙基碳二亚胺
piperidine:哌啶
HOBt:1-羟基苯并三氮唑
TFA:三氟乙酸
Tris:三(羟甲基)氨基甲烷
Cys:半胱氨酸
Arg:精氨酸
Ala:丙氨酸
His:组氨酸
Asp:天冬氨酸
Trp:色氨酸
Ser:丝氨酸
Lys:赖氨酸
Gly:甘氨酸
Pro:脯氨酸
Asn:天冬酰胺
Pyr、pGlu:焦谷氨酸
Fmoc:芴甲氧羰基
Boc:叔丁氧基羰基
Trt:三苯甲基
Pbf:2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
tBu:叔丁基
OtBu:叔丁氧基
实施例1Boc-pGlu-Gly-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Gly-Pro-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Ser
(tBu)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-氨基树脂的制备
1.1树脂的溶胀
将替代度为0.7的Rink AM树脂75g加入固相柱内,加入500ml DMF完全浸没树脂后通入氮气,开启搅拌,100r/min,搅拌5min,后抽干溶剂5min。再加入500ml DMF,完全浸没树脂后通入氮气,开启搅拌,100r/min,搅拌30min,抽干溶剂。继续加入500ml DMF,完全浸没树脂后通入氮气,开启搅拌,100r/min,抽干溶剂5min溶胀结束。
1.2脱Fmoc
加入500ml 20%piperidine/DMF,通入氮气,搅拌反应5min,抽干3min。再加入500ml 20%piperidine/DMF,通入氮气,搅拌8min,抽干3min。接着加入500ml DMF,通入氮气,开启搅拌1~2min,抽干3min,重复洗涤树脂7~8次。
1.3投料反应
将称量好的氨基酸和HOBt加入到1L圆底磨口烧瓶中,加入500ml DMF,晃动2min使其溶解,放入±5℃度冰箱冷藏。10min后取出上述冰箱里的烧瓶后加入DIC,晃动10min。
将上述混合活化液加入反应柱中,通入氮气搅拌,计时反应1.5h。控制温度在30℃左右。
1.4反应完毕洗涤树脂
加入500ml DMF,通入氮气,开启搅拌,树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌1~2min,抽干3min。反复用500ml DMF洗涤树脂,抽干溶剂,直至抽滤出的溶剂澄清透明。
1.5依次偶联氨基酸
重复1.2~1.4步骤,依次偶联至第22个氨基酸。各氨基酸原料及试剂用量(按RinkAM树脂75g合成规模为25.5mmol计算)见下表1。
表1各氨基酸原料及试剂用量
1.6收缩晾干树脂
加入700ml DCM,开启搅拌,通入氮气,计时3min,抽干3min。加入700ml甲醇,开启搅拌,通入氮气,计时5min,抽干3min。再次加入700ml甲醇,开启搅拌,通入氮气,计时5min,抽干30min。将树脂倒出至托盘晾干,碾散,使树脂成流沙状,之后称重密封冷藏,得到Boc-pGlu-Gly-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Gly-Pro-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-氨基树脂。
实施例2H-pGlu-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Lys-Ser-Trp-Cys-Arg-Asp-His-Ala-Arg-Cys-
Cys-NH2的制备
2.1试剂预处理
将TFA、异丙醚、乙醚放入冰箱冷冻4h以上。苯酚60℃水浴2h。
2.2裂解操作
称取90g待裂解树脂加入1L圆底烧瓶中。
分别量取15.7ml乙二硫醇、31.5ml苯甲硫醚、15.7ml水、535.5ml TFA、31.5ml苯酚,混合均匀后倒入到装有树脂的1L圆底烧瓶中,磁力搅拌,500r/min,反应2.5h。
裂解反应2.5h后,裂解液在38℃以下浓缩1h,用砂芯过滤漏斗抽真空过滤裂解液树脂,抽干1min。加入15ml TFA洗涤树脂,抽干1min。再次加入15ml TFA洗涤树脂,抽干1min。
2.3沉降操作
将22L冷冻后的异丙醚加入到25L血清瓶中,开启搅拌。过滤后的肽裂解液缓慢加入到25L血清瓶中,搅拌5min,静止30min。
沉降液分层,颜色黄白。抽出上清液,下层沉淀倒入2个1L离心瓶离心。转速4000r/min,离心2min,倾倒上清液。
用冷冻后的乙醚洗涤沉淀,每1L离心瓶加入500ml乙醚,搅拌5min,离心2min,转速4000r/min,倾倒上清液,重复洗涤4次。
离心瓶内固体用弱氮气吹干5min。密封,放入真空干燥器,抽真空2.5h。得到约30g粗品H-pGlu-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Lys-Ser-Trp-Cys-Arg-Asp-His-Ala-Arg-Cys-Cys-NH2。
实施例3
3.1 0.1mol/L缓冲液配制
称取102g Tris加入10L血清瓶,加入8.5L纯化水,搅拌,将pH调至8.2,即得0.1mol/L Tris缓冲液。
3.2氧化折叠操作
从真空干燥器中取出粗肽称量后(约30g),立即投入到10L血清瓶缓冲液中,搅拌反应16h。溶液颜色澄清亮黄。得到经氧化折叠形成三对二硫键的μ-芋螺肽粗品缓冲液。
实施例4μ-芋螺肽粗品纯化
4.1预处理
μ-芋螺肽粗品缓冲液经孔径为0.80μm水性滤膜过滤,再用孔径为0.45μm水性滤膜过滤。
4.2纯化制备
采用高效液相色谱仪进行制备纯化。
流动相A:制备纯乙腈;流动相B:0.1%冰乙酸的纯水溶液;
色谱柱:汉邦DAC-100;
制备梯度:
时间(min) | 流速(mL/min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 160 | 3 | 97 |
5 | 160 | 3 | 97 |
11 | 160 | 15 | 85 |
31 | 160 | 30 | 70 |
34 | 160 | 30 | 70 |
36 | 160 | 3 | 97 |
46 | 160 | 3 | 97 |
(1)分段收集纯度97%、纯度85%左右、纯度60%左右的组分;
(2)将步骤(1)收集的60%纯度回收再纯化,分段收集纯度85%、纯度60%左右的组分;
(3)将步骤(1)、步骤(2)收集的85%纯度回收再纯化,分段收集纯度98%、纯度85%左右、纯度60%左右的组分;
(4)将步骤(2)、步骤(3)收集的60%纯度回收再纯化,分段收集纯度85%、纯度60%左右的组分;
(5)将步骤(3)、步骤(4)收集的85%纯度回收再纯化,分段收集纯度98%、纯度85%左右、纯度60%左右的组分;
(6)将步骤(5)中85%纯度回收再纯化,收集纯度98%的组分。
4.3纯品浓缩冻干
纯品液加入到20L旋转蒸发仪中,设置温度35℃,转速60r/min,进行浓缩旋蒸,去除溶液中的有机溶剂及水分,浓缩至≤1L体积后,转入2L圆底瓶。冻干处理,获得白色粉状固体,即得μ-芋螺肽纯品。(总产率10%,纯度98%)
经质谱检测,目标化合物μ-芋螺肽被成功合成,分子量为2375。
图1目标化合物μ-芋螺肽(分子式C92H139N35O28S6)质谱图,[M+H]+m/z 1188.1825为化合物双电荷分子离子峰。
实施例5μ-芋螺肽祛皱功效测试
5.1受试者
60名35-55岁的健康女性,随机分为2组,平均每组30人。
5.2试验样品
浓度为1%的通过本发明制备纯化方法得到的μ-芋螺肽精华液,以安慰剂作为空白对照。
5.3测试仪器
C-Cube多功能皮肤成像分析系统(Pixience,法国)
5.4试验操作
给药前,先测量眼周区域的皱纹深度空白值,然后将试样均匀涂布于测试区域,30min后再次测量皱纹深度值,与给药前的空白值比较,计算30min皱纹深度变化百分比,以此评价样品的即时祛皱效果。测试期间不得使用其他化妆品,连续使用4周,分别测量记录各组样品测试区域的皱纹深度,与给药前的空白值比较,计算使用4周的皱纹深度变化百分比,以此评价样品的持久祛皱效果。同一个受试者的测试由同一个测量人员完成。
5.5测试结果
安慰剂组、芋螺肽组在给药前、给药30min、给药4周的皱纹深度变化百分比见下表2。
表2不同时间的皱纹深度变化百分比(%)
样品名称 | 0min | 30min | 4周 |
安慰剂组 | 0 | -3.29 | -3.10 |
芋螺肽组 | 0 | -63.75 | -81.42 |
由表中数据可知,相对于安慰剂组,使用芋螺肽之后,受试者的皱纹深度出现了显著的减小。使用30min后,芋螺肽组的皱纹深度减小了63.75%,表明芋螺肽具有良好的即时祛皱效果。使用4周后,芋螺肽组的皱纹深度减少了81.42%,表明芋螺肽具有良好的持久祛皱功效。试验结果表明,本发明的芋螺肽具有显著的祛皱功效,而芋螺肽只有在线性肽发生正确折叠的情况才能具有祛皱的生理活性,由此可知本发明的芋螺肽制备纯化方法可以得到正确构象的μ-芋螺肽,所述芋螺肽可以应用于祛皱产品。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细的说明,但是不表示本发明的具体实施是局限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或是替换,都应视为属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种μ-芋螺肽的规模化制备纯化方法,所述μ-芋螺肽是C端酰胺化的,具有如下序列:pGlu-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Lys-Ser-Trp-Cys-Arg-Asp-His-Ala-Arg-Cys-Cys,所述制备纯化方法包括合成线性肽氨基树脂的制备、裂解、线性肽折叠、粗肽纯化,其特征在于,所述氨基树脂的替代度是0.6-0.8,所述线性肽折叠是在pH值8.0-10.0的Tri缓冲液体系中直接空气氧化一步折叠。
2.根据权利要求1所述的μ-芋螺肽在制备祛皱化妆品中的应用。
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