KR20230094102A - 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 생산 방법 - Google Patents
2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산을 위한 재조합 벡터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 포스포라이페이스 A2의 n 말단에 연결되는 신호 펩티드 PelB 또는 CelA의 절단된 돌연변이 1 의 n 말단에 연결되는 신호 펩티드 DsbA를 코딩하는 유전자를 포함하여, 숙주 세포의 세포 외 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스 생산을 촉진하는 재조합 벡터를 제공한다.
Description
본 발명은 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산을 위한 재조합 벡터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 포스포라이페이스 A2(phospholipase A2) 및 CelA의 절단된 돌연변이 1 (truncational mutant 1)를 이용하여, 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산 촉진하는 방법을 제공한다.
사람의 모유에는 200여종 이상의 독특한 구조를 가지는 올리고당 (human milk oligosaccharides, HMO)이 다른 포유류의 젖에 비해 상당히 높은 농도 (5~15 g/L)로 존재한다.
HMO는 D-글루코오스 (Glc), D-갈락토오스 (Gal), N-아세틸글루코사민 (N-aetylglucosamine, GlcNAc), L-푸코오스 (L-fucose, Fuc)와 시알산 (sialc acid) [Sia; N-acetyl neuraminic acid (Neu5Ac)]으로 구성되어 있다. 모유 중 함량이 가장 높은 올리고당 3가지를 포함하여 137개가 푸코실화되어 그 비율은 약 77%이고, 남은 올리 고당은 대부분 시알화된 것(39개)으로 약 28%에 해당한다. 이중, 특히 2'-푸코실락토오스와 3-푸코실락토오스는 장내 유산균의 생육을 돕는 프리바이오틱 (prebiotic) 효과, 병원균 감염의 예방, 면역시스템 조절 및 두뇌발달과 같이 유아의 발달 및 건강에 긍정적 영향을 미치는 다양한 생물학적 활성을 제공하는 주요 HMO이므로, 전문 가들은 유아기의 모유수유가 매우 중요하다고 강조한다.
모유에는 약 200여종의 올리고당이 함유되어 있으며, 이 중, 특히 2'-푸코실락토오스와 3-푸코실락토오스가 앞서 언급한 다양한 생물학적 활성에 관여하는 주요 HMO인 것으로 보고되어 있다. 이로 인하여 최근 푸코실락토오스가 유아용 분유, 노인용 건강기능식품 소재 및 의약품 소재로 이용될 가능성으로 주목받고 있다.
하지만, 여성의 약 20%는 푸코실올리고당을 합성하는 푸코스전이효소에 변이 때문에, 체내에서 이들을 제대로 합성하지 못하는 것으로 알려져 있다. 이로 인하여 푸코실락토오스의 산업적 생산이 필요한 실정이다. 그러나 현재 푸코실락토오스는 산업적으로 대량생산이 어렵기 때문에, 이들을 대신하여 유사체인 갈락토올리고당 (galactooligosaccharide) 또는 프럭토올리고당 (fructooligosaccharide)을 이유식에 첨가하여 유사한 효과를 기대하고 있는 실정이다.
한편, 푸코실락토오스의 생산방법으로는 직접 모유로부터 추출하는 방법과 화학적 또는 효소적 방법으로 합성하는 방법이 있다.
직접 추출하는 방법은 모유수급의 한계와 낮은 생산성이 문제이고, 화학적 합성법은 고가의 기질, 낮은 이성체 선택성 (stereo-selectivity)과 생산수율, 독성 유기용매의 사용 등의 문제가 있다. 또한, 효소적 합성법은 푸코오스의 공여체 (donor)로 이용되는 GDP-L-fucose가 매우 고가라는 점과 푸코스 전이효소(fucosyltransferase)의 정제비용이 많이 든다는 문제점이 있다.
상기와 같은 문제점으로 인하여 직접추출, 화학적 또는 효소적 생산법은 푸코실락토오스의 대량생산에 적용이 어렵고 대량 생산을 위한 기술이 거의 없는 실정이다. 그러나, 2'-푸코실락토오스를 이용한 건강기능성식품 및 의약품 소재로의 개발을 기대할 수 있기 때문에, 미생물을 이용한 2'-푸코실락토오스의 산업적 생산을 위하여 더욱 많은 연구가 필요한 실정이다.
본 발명자들은 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 대량 생산방법을 연구하던 중 포스포라이페이스 A2 또는 CelA의 절단된 돌연변이 1 (truncational mutant 1)의 신호 펩티드 결합 여부에 따라 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 세포 외 생산량이 달라질 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산을 위한 재조합 벡터를 제공하고자 한다.
본 발명은 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 세포 외 생산을 촉진하기 위한 유전자 재조합 구성을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포스포라이페이스 A2(phospholipase A2)를 코딩하는 유전자 서열 및 CelA의 절단된 돌연변이 1 (truncational mutant 1)을 코딩하는 유전자 서열을 이용한 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose) 또는 디푸코실락토오스 생산용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 포스포라이페이스 A2(phospholipase A2)를 코딩하는 유전자 서열; 및 상기 포스포라이페이스 A2의 N-말단에 연결되는 신호 펩티드 PelB 를 코딩하는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 신호 펩티드 PelB 가 N-말단에 연결된 포스포라이페이스를 코딩하는 유전자 서열이 포함된 벡터는 숙주세포에서 형질전환되어 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose) 또는 디푸코실락토오스의 생산을 촉진할 수 있으며, 바람직하게는 디푸코실락토오스의 생산을 촉진할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 CelA의 절단된 돌연변이 1 (truncational mutant 1)를 코딩하는 유전자 서열; 및 상기 CelA의 절단된 돌연변이 1 의 N-말단에 연결되는 신호 펩티드 DsbA을 코딩하는 유전자 서열을 포함할 수 있으며, 이를 포함하는 벡터는 숙주세포에서 형질전환되어 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose) 또는 디푸코실락토오스의 생산을 촉진할 수 있고, 바람직하게는 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose)의 생산을 촉진할 수 있다.
본 발명에서, 상기 포스포라이페이스 A2 (phospholipase A2)를 코딩하는 유전자 서열은 서열번호 1로, 상기 PelB 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 서열은 서열번호 2로, 상기 CelA의 절단된 돌연변이 1 (truncational mutant 1)를 코딩하는 유전자 서열은 서열번호 5로, 상기 DsbA 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 서열번호 6으로 표시될 수 있으며, 각각을 포함하는 유전자일 수 있다.
본 발명에 따르면, 포스포라이페이스 A2(phospholipase A2) 및 CelA의 절단된 돌연변이 1 (truncational mutant 1)가 각각 다른 플라스미드 벡터에 존재할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 포스포라이페이스 A2 및 포스포라이페이스 A2의 n 말단에 연결되는 PelB 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 제1 플라스미드 벡터; 및 CelA의 절단된 돌연변이 1 (truncational mutant 1) 및 CelA의 절단된 돌연변이 1 의 n 말단에 연결되는 DsbA 단백질을 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 제2 플라스미드 벡터;를 포함하는, 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose) 또는 디푸코실락토오스 생산용 유전자 전달 복합체가 제공된다.
본 발명은 또한 상기 재조합 벡터 또는 유전자 전달 복합체로 형질 전환된 숙주세포를 제공하며, 상기 숙주 세포는 그 종류를 제한하지 않으나, 가장 바람직하게는 대장균(E. coli)이다.
본 발명은 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose) 또는 디푸코실락토오스의 생산방법을 제공한다. 본 발명의 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose) 또는 디푸코실락토오스 생산방법에는, (a) 서열번호 3의 유전자 서열 및 서열번호 7의 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합된 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; (c) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 배양액으로부터 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose) 또는 디푸코실락토오스를 분리 및 정제하는 단계가 포함될 수 있다.
본 발명은 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산을 위한 재조합 벡터를 제공하며, 본 발명의 재조합 벡터를 이용하는 경우, 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 세포 외 생산을 증대시킬 수 있는 이점이 있다.
본 발명은 또한, 신호 펩티드 PelB 또는 DsbA의 결합 위치에 따른 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 세포 외 생산 양상을 확인하여, 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 세포 외 생산을 증대시킬 수 있는 신호펩티드의 결합 구성 및 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산 메커니즘을 제공한다.
도 1은 E. coli의 세포 내(A) 및 세포 외(B) 분획에 존재하는 FKP 및 FucT2를 통한 푸코실화된 올리고당의 생산 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 재조합된 FF (FucT2 및 FKP 발현; 도 2의 A), PFPF (P-FucT2 및 P-FKP 발현; 도 2의 B), DFDF (D-FucT2 및 D-FKP 발현; 도 2의 C)를 각각 포함하는 벡터로 형질전환된 균주에 의한 2'-푸코실락토오스의 생산을 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 재조합된 벡터에 의해 형절전환된 E. coli 균주의 세포 내(A) 및 세포 외(B) 분획에서 FKP 및 FucT2의 발현 수준을 나타낸 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 재조합된 벡터에 의해 형질전환된 E. coli 균주에서 세포 내 2'-푸코실락토오스의 함량을 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 재조합된 FF (FucT2 및 FKP 발현; 도 5의 A), FF+P-PLA2 (FucT2, FKP 및 P-PLA2 발현; 도 5의 B), FF+D-TM1 (FucT2, FKP 및 D-TM1 발현; 도 5의 C) 유전자를 각각 포함하는 벡터로 형질전환된 균주에 의한 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산을 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 재조합된 FF (FucT2 및 FKP 발현; 도 2의 A), PFPF (P-FucT2 및 P-FKP 발현; 도 2의 B), DFDF (D-FucT2 및 D-FKP 발현; 도 2의 C)를 각각 포함하는 벡터로 형질전환된 균주에 의한 2'-푸코실락토오스의 생산을 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 재조합된 벡터에 의해 형절전환된 E. coli 균주의 세포 내(A) 및 세포 외(B) 분획에서 FKP 및 FucT2의 발현 수준을 나타낸 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 재조합된 벡터에 의해 형질전환된 E. coli 균주에서 세포 내 2'-푸코실락토오스의 함량을 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 재조합된 FF (FucT2 및 FKP 발현; 도 5의 A), FF+P-PLA2 (FucT2, FKP 및 P-PLA2 발현; 도 5의 B), FF+D-TM1 (FucT2, FKP 및 D-TM1 발현; 도 5의 C) 유전자를 각각 포함하는 벡터로 형질전환된 균주에 의한 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산을 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
본 발명에서는 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose; 이하 2'-FL) 또는 디푸코실락토오스 (이하 Di-FL) 생산용 재조합 벡터를 제공하며, 이는 2'-FL 또는 Di-FL의 생산을 촉진할 수 있다.
본 발명에서 "벡터"라는 용어는, 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제조물을 뜻한다.
본 발명의 재조합 벡터는 포스포라이페이스 A2 (이하, PLA2) 및 포스포라이페이스 A2에 작동 가능하게 연결되는 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 PLA2는 서열번호 1로 표시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 벡터는 CelA의 절단된 돌연변이 1 (truncational mutant 1; 이하 TM1)을 코딩하는 유전자 서열; 및 상기 CelA의 절단된 돌연변이 1에 작동 가능하게 연결되는 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 서열을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 TM1은 서열번호 5로 표시될 수 있다.
본 발명에서 "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는, PLA2 및 TM1의 유전자 서열과 신호 펩티드 유전자 서열의 기능적 연결, 즉 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다.
본 발명의 신호 펩티드는 신호 펩티드 PelB (서열번호 2) 또는 DsbA (서열번호 6)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 바람직하게는 PLA2의 N-말단에 신호 펩티드 PelB가, CelA의 절단된 돌연변이 1 (truncational mutant 1)의 N-말단에는 신호 펩티드 DsbA가 연결될 수 있다. 이하에서는 N-말단에 신호 펩티드 PelB가 결합된 PLA2는 P-PLA2 (서열번호 3), N-말단에 신호 펩티드 DsbA가 결합된 TM1은 D-TM1 (서열번호 7)이라 한다.
본 발명은 또한 상기의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하며, 본 발명의 숙주세포는 가장 바람직하게는 대장균일 수 있다.
본 발명에서 "숙주세포"라는 용어는, 벡터가 숙주세포에 형질전환됨으로서 숙주세포 내에서 다양한 유전적 또는 분자적 영향을 미치게 되는 세포를 의미한다.
본 발명에서 "형질전환"이라는 용어는, DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외의 인자로서 또는 염색체로의 삽입에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
본 발명에 따라 P-PLA2 및 D-TM1의 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주세포는 세포 내 2'-FL의 축적을 감소시키고, 세포 외 2'-FL 및 Di-FL의 생산을 촉진할 수 있다.
본 발명의 상기 P-PLA2 및 상기 D-TM1의 유전자 서열은 하나의 플라스미드 벡터에 존재하거나 각각의 다른 플라스미드 벡터에 존재할 수 있다.
즉, 상기 P-PLA2 및 상기 D-TM1의 유전자 서열이 각각의 다른 플라스미드 벡터에 존재하는 경우, 2개 이상의 플라스미드 벡터가 포함된 유전자 전달 복합체로 숙주세포의 형질전환에 이용될 수 있다. 본 발명의 상기 유전자 전달 복합체에는 포스포라이페이스 A2 및 포스포라이페이스 A2의 N-말단에 연결되는 PelB 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 제1 플라스미드 벡터; 및, CelA의 절단된 돌연변이 1 (truncational mutant 1) 및 CelA의 절단된 돌연변이 1 의 N-말단에 연결되는 DsbA 단백질을 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 제2 플라스미드 벡터가 포함될 수 있다.
본 발명에서 "유전자 전달 복합체"는 유전자 전달 물질인 플라스미드 또는 벡터 등이 둘 이상 혼합되어 있는 물질을 의미할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 제1 플라스미드에 의해 형질전환된 숙주세포에서 Di-FL의 세포 외 분비가 촉진될 수 있으며, 상기 제2 플라스미드에 의해 형질전환된 숙주세포에서 2'-FL의 세포 외 분비가 촉진될 수 있어, 상기 유전자 전달 복합체에 의해 Di-FL 및 2'-FL의 세포 외 분비가 촉진되며, 결론적으로 Di-FL 및 2'-FL의 생산이 촉진된다.
본 발명은 또한, 상기의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose) 또는 디푸코실락토오스의 생산방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 생산 방법은 (a) 서열번호 3의 유전자 서열 및 서열번호 6의 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합된 발현 벡터로 미생물을 형질전환하는 단계; (c) 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 배양액으로부터 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose) 또는 디푸코실락토오스를 분리 및 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는 당업계에 공지된 방법에 따라 숙주세포 내로 도입될 수 있다. 세포 내로 본 발명의 벡터를 도입하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션 (Electroporation), 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법 (Microinjection), PEG, DAEA 덱스트란, 양이온 피로좀법, 초산 리튬-DMSO법 등이 사용될 수 있다.
상기한 바와 같은 형질전환된 숙주세포 (형질전환체)의 배양은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌 [Chmiel, (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991);및 Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))에 기술되어 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
1-1. 유전자 서열
본 발명에서, 유전자 조작에는 E. coli TOP10 균주를, 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산에는 E. coli BL21 star (DE3) ΔLFAR-YA 균주가 이용되었다. 본 실험에서 FKP 및 FucT2 유전자는 플라스미드 pCOLADuet-1 (Novagen, 다름슈타트, 독일)의 T7 프로모터 서열 이후에 위치한다.
본 발명에 이용된 균주 및 플라스미드 벡터는 하기 표 1과 같다.
| 명칭 | 설명 |
| E. coli | |
| E. coli TOP10 | F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(Str R ) endA1 nupG |
E. coli BL21 star (DE3) |
F- ompT hsdSB(r B -m B -) gal dcm rne131 (DE3) ΔlacZYA Tn7::lacYA ΔfucI-fucK ΔaraA ΔrhaA |
| 플라스미드 벡터 | |
| pFF | FucT2, FKP 및 KanR 의 유전자 서열을 포함하는 발현 벡터 |
| pPFPF | P-FucT2, P-FKP 및 KanR 의 유전자 서열을 포함하는 발현 벡터 |
| pDFDF | D-FucT2, D-FKP 및 KanR 의 유전자 서열을 포함하는 발현 벡터 |
| pFF-Amp | FucT2, FKP 및 AmpR 의 유전자 서열을 포함하는 발현 벡터 |
| pFF-Amp-His | FucT2-His6-tag, FKP-His6-tag 및 AmpR 의 유전자 서열을 포함하는 발현 벡터 |
| pP-PLA2 | P-PLA2 및 KanR 의 유전자 서열을 포함하는 발현 벡터 |
| pD-TM1 | D-TM1 및 KanR 의 유전자 서열을 포함하는 발현 벡터 |
표 1에서, 'D-'는 신호 펩티드 DsbA가 결합되었음을 의미하며, 'P-'는 신호 펩티드 PelB가 결합되었음을 의미한다.
1-2. 유전자 조작(Genetic manipulation)
pPFPF 플라스미드는 FucT2 및 FKP의 N-말단에 PelB 신호 펩티드를 부착하기 위해 2단계로 구축되었다. 먼저, FucT2의 N-말단에 PelB 신호 펩티드를 부착하기 위해 pFF 플라스미드를 주형으로 활용하여 HL48 (5'-AAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGCT TTTAAGGTGGTGCAAATTTG-3')과 HL49 (5'-GTCGGCAGCAGGTATTTCATGGTATATCTCCTTATTAAAGT TAACAAAAT-3') 프라이머(primer)로 PCR 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편은 NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 이용해 결합하여 중간체 플라스미드인 pPFPF-itermediate를 생성하였다. 다음으로, FKP의 N-말단에 PelB 신호 펩티드를 부착하기 위해 pPFPF-itermediate 플라스미드를 HL50 (5'-ACCGCTGCTG CTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCCAAAAACTACTATCTTTACCGTCCAA-3')과 HL51 (5'-AGACCAGCAGCAGCGGTCGGCAGCAGGTATTTCATATGTATATCTCCTTCTTATACTTAACTAATATACTAA-3') 프라이머를이용하여 PCR 증폭한 후, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (New England Biolabs)를 이용해 결합하여 최종적으로 pPFPF 플라스미드를 구축하였다. 또한, FucT2 및 FKP의 N-말단에 DsbA 신호 펩티드를 부착시키기 위해 pDFDF 플라스미드는 상기에 언급된 방법과 같은 절차를 통해 구축하였다. 이 때 사용된 프라이머는 1차 PCR의 경우 HL52 (5'-AAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGCTTTTAAGGTGGTGCAAATTTG-3')과 HL53 (5'-GCCAGCCAAATCTTTTTCATGGTATATCTCCTTATTAAAGTTAAACAAAAT-3')이었고, 2차 PCR의 경우 HL54 (5'-CTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGCAAAAACTACTATCTTTA CCGTCCAA-3')과 HL55 (5'-CTAAAACTAAACCAGCCAGCGCCAGCCAAATCTTTTTCATATGTATATCTC CTTCTTATACTTAACTAATATACTAA-3')이었다.
pFF 플라스미드의 카나마이신 (kanamycin) 항생제 마커를 암피실린(ampicillin) 항생제 마커로 대체한 pFF-Amp 플라스미드를 구축하기 위해, pFF 플라스미드를 주형으로 사용하여 SpeI 제한효소(restriction enzyme) 자리를 포함하는 HL20 (5'-AGAACTAGTTAGGCATGCTAGCGCA-3')과 KpnI 제한효소 자리를 포함하는 HL41 (5'-AGAGGTACCAGAATTA ATTCATGAGCGGATACATATT-3') 프라이머로 카나마이신 마커를 제외한 DNA 단편을 PCR 증폭하였다. 또한, 암피실린 마커를 포함하는 DNA 단편은 pHLK13 플라스미드를 주형으로 사용하여 SpeI 제한효소 자리를 포함하는 HL22 (5'- AGAACTAGTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCC-3')과 KpnI 제한효소 자리를 포함하는 HL39 (5'-AGAGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGG-3') 프라이머로 PCR증폭하였다. 이렇게 증폭된 두 개의 DNA 단편을 SpeI과 KpnI으로 동시에 절단한 후 T4 DNA 리가아제 (Takara, Shiga, Japan)로 결합하여 pFF-Amp 플라스미드를 구축하였다.
C-말단에 His6-tag이 부착된 형태의 FucT2와 FKP를 포함하는 pFF-Amp-His 플라스미드는 2단계로 구축되었다. 먼저, FucT2의 C-말단에 His6-tag를 부착하기 위해 pFF-Amp 플라스미드를 주형으로 이용하여 KH05 (5'-ATCCCAAAAGTATAACGCTCACCACCACCACCACCACTAAGAGCTCGGCGCG-3')과 KH06 (5'- GTGGTGGTGGTGGTGAGCGTTATACTTTTGGGATTTTACC-3') 프라이머로 PCR 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편은 NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (New England Biolabs)를 이용해 결합하여 중간체 플라스미드인 pFF-Amp-His-itermediate를 생성하였다. 다음으로, pFF-Amp-His-itermediate를 주형으로 이용하여 KH07 (5'-CACCACCACCACCACTAATTAATTAACCTAGGCTGCTGC-3')과 KH08 (5'-TGAGCGTTATACTTTTGGGATTTTACC-3') 프라이머로 PCR 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편은 NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (New England Biolabs)를 이용해 결합하여 최종적으로 pFF-Amp-His 플라스미드를 구축하였다.
1-3. 형질전환 및 균주 배양(culture)
2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산을 위한 플라스미드는 염화칼슘 침전법을 이용해 대장균 BL21 star (DE3) ΔLFAR-YA 균주에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 균주는 카나마이신 단독 혹은 카나마이신/암피실린 동시 포함 5 mL 루리아-베타니(Luria-Bertani) 액체 배지에 접종하여 12시간동안 37℃, 230 rpm 조건에서 진탕 배양하였다.
이렇게 전 배양된 대장균은 카나마이신 단독 혹은 카나마이신/암피실린 동시 포함 100 mL 라이젠버그 [13.5 g/L KH2PO4, 4.0 g/L (NH4)2HPO4, 1.7 g/L citric acid, 1.4 g/L MgSO4·7H2O, and 10 mL/L trace metal solution (10 g/L FeSO4·7H2O, 2.25 g/L ZnSO4·7H2O, 1.0 g/L CuSO4·5H2O, 0.5 g/L MnSO4·5H2O, 0.23 g/L Na2B4O7·10H2O, 0.1 g/L (NH4)6Mo7O24, and 2.0 g/L CaCl2), pH 6.8 containing 20 g/L glycerol] 액체 배지에 1% 접종하여 회분식 배양 (Batch culture)을 진행하였다. 회분식 진탕 배양은 37℃, 230 rpm 조건에서 진행하였으며, 광학밀도 (OD600)가 0.6에서 0.8 사이에 도달하였을 때, FKP와 FucT2의 발현을 유도하기 위해 배양 온도를 25℃로 전환한 후 최종적으로 배양액이 0.1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG), 10 g/L 유당 (lactose), 10 g/L 푸코오스 (fucose), 15 mM 아데노신 삼인산 (Adenosine triphosphate, ATP) 및 15 mM 구아노신 삼인산 (Guanosine triphosphate, GTP)을 포함하도록 첨가하였다.
단백질의 발현 분석
2-1. ΔLFAR-YA/FF, ΔLFAR-YA/PFPF 및 ΔLFAR-YA/DFDF 균주의 2'-FL, Di-FL 생산 비교
2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 배지 중 농도는 Rezex ROA-organic acid H+ 컬럼 (Phenomenex, Torrance, CA) 및 RI (Refractive index) 검출기가 장착된 HPLC (High performance liquid chromatography) (Thermo fisher Ultimate 3000)를 통해 측정하였다. 컬럼 온도는 70℃로 유지하였으며 이동상으로 5 mM의 H2SO4 용액을 0.6 mL/min의 유속으로 흘려주어 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스 생산 농도를 측정하였다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 재조합된 pFF(FucT2 및 FKP 발현; 도 2의 A), pPFPF(P-FucT2 및 P-FKP 발현; 도 2의 B), pDFDF(D-FucT2 및 D-FKP 발현; 도 2의 C)를 각각 포함하는 벡터로 형질전환된 균주에 의한 2'-푸코실락토오스의 생산을 비교한 그래프이다.
신호 펩티드 없이 FKP 및 FucT2를 발현하는 대조군 ΔLFAR-YA 균주(ΔLFAR-YA/FF)에서 FKP의 발현 수준은 FucT2의 발현 수준보다 훨씬 높다. 본 실시예에서는, FKP 및 FucT2에 번역 후 또는 번역과 동시 분비를 매개할 수 있는 대표적인 신호 펩티드(signal peptide)인 PelB와 DsbA 신호 펩티드를 효소의 N-말단에 부착하였다. 그러나 신호 펩타이드의 부착은 FKP 및 FucT2의 발현 수준을 유의하게 감소시켰다. N-말단 DsbA 신호 펩티드(ΔLFAR-YA/DFDF)와 융합된 FKP 및 FucT2를 발현하는 ΔLFAR-YA 균주에서는 FKP 발현되지 않았다.
도 2를 참조하면, ΔLFAR-YA/DFDF 균주에서는 2'-FL 생산이 확인되지 않은 반면, 0.31 ± 0.01 g/L의 2'-FL이 ΔLFAR-YA/PFPF 균주에 의해 생산되었으며, 이는 ΔLFAR-YA/FF에 의해 생산된 것보다 48% 더 낮았다. 이러한 결과는 신호 펩티드를 세포질 단백질(FKP 또는 FucT2)에 부착하는 것이 FKP, FucT2의 기능적 발현 또는 막을 가로지르는 전위(translocation)를 보장하지 않는다는 것을 의미한다.
2-2. 웨스턴 블랏(Western blot)
IPTG 유도 (Induction) 87시간 후 배양액을 원심분리하여 상층액만 회수한 후, 3-kDa의 cut-off를 지닌 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)를 사용하여 10배 농축하였다. 또한, 회수한 세포는 B-PERTM Bacterial Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여 용해시켰다. 용해된 세포의 단백질 총체 (도 3의 T), 수용성 단백질(도 3의 S) 그리고 세포 외 단백질에 존재하는 FKP 및 FucT2의 발현 확인은 웨스턴 블랏 방법을 이용하였다. 상기의 시료를 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 이용해 전기영동한후, polyvinylidene difluoride membrane (Millipore, Billerica, MA, USA)에 이동시켰다. FKP 및 FucT2 검출에 사용한 1차 항체는 Anti-6X His tag 항체 (ab18184, Abcam) (1:1000 dilution)이고, 2차 항체는 Goat Anti-Mouse 항체 (ab205719, Abcam) (1:1000 dilution)이다.
2-3. 세포 내 2'-FL의 축적 비교
IPTG 유도 (Induction) 87시간 후 배양액을 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 B-PERTM Bacterial Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 용해시켰다. 이후, 용해된 세포의 불용성 물질은 원심분리로 제거한 후에 세포 내에 존재하는 2'-푸코실락토오스 농도를 상기에 언급된 HPLC 분석방법을 이용하여 측정하였다.
본 발명자들은 세포 외 FKP 및 FucT2로 구성된 시스템이 푸코실화된 올리고당의 세포 외 생산에서 세포 내 FKP 및 FucT2보다 우수함을 확인하고자 하였다. 본 실시예에서는 배양액에서 생산된 푸코실화 올리고당을 비교하기 전에 ΔLFAR-YA/FF, ΔLFAR-YA/FF+P-PLA2, ΔLFAR-YA/FF+D-TM1 균주의 세포내 분획에 축적된 푸코실화 올리고당의 양을 측정하였다.
도 4를 참조하면, 상당한 양(0.55g/L)의 2'-FL이 ΔLFAR-YA/FF 균주의 세포내 분획에 축적되었으나, 대조적으로, ΔLFAR-YA/FF+P-PLA2 및 ΔLFAR-YA/FF+D-TM1 균주는 대조군 균주보다 46% 더 낮은 세포내 2'-FL 농도를 나타내었다(도 4).
본 실시예에 따르면, Di-FL 생산이 모든 균주의 세포내 분획에서 관찰되지 않았음을 알 수 있으며, 이 결과는 P-PLA2 또는 D-TM1의 동시발현을 통한 FucT2 및/또는 FKP의 세포 외 분비가 2'-FL의 세포내 축적을 유의적으로 감소시킴을 알 수 있다.
2-4. ΔLFAR-YA/FF, ΔLFAR-YA/FF+P-PLA2 및 ΔLFAR-YA/FF+D-TM1 균주의 2'-FL, Di-FL 생산 비교
ΔLFAR-YA/FF, ΔLFAR-YA/FF+P-PLA2 및 ΔLFAR-YA/FF+D-TM1 균주의 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스 생산 비교는 실시예 2-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
본 실시예에서는 ΔLFAR-YA/FF, ΔLFAR-YA/FF+P-PLA2 및 ΔLFAR-YA/FF+D-TM1 균주에 의해 생산되는 2'-FL 및 Di-FL의 시간 경과에 따른 세포 외 농도를 측정했다. 이는 세포 내 2'-FL의 감소된 축적과 푸코실화된 올리고당의 세포 외 생산과 연관성이 있다.
본 실시예에 따른 결과인 도 5를 참조하면, ΔLFAR-YA/FF+P-PLA2 균주(도 5의 B)에서 푸코실화된 올리고당의 상이한 생산이 확인된다. ΔLFAR-YA/FF+P-PLA2 균주에 의해 생성된 2'-FL의 세포 외 농도는 대조군 ΔLFAR-YA/FF 균주의 것과 유사하지만, ΔLFAR-YA/FF+P-PLA2 균주의 배양 배지에서 상당한 양의 Di-FL (1.22 ± 0.01g/L)가 확인되었다(도 5의 A 및 B). 이에 따르면,ΔLFAR-YA/FF+P-PLA2 균주는 배양 배지에서 1.69 ± 0.01g/L 푸코실화 올리고당(즉, 2'-FL 및 Di-FL)을 생산하여 대조 균주에 비해 역가가 2.6배 증가함을 알 수 있다.
또한, D-TM1의 동시발현(ΔLFAR-YA/FF+D-TM1)은 대조군에 비해 2'-FL 및 푸코실화 올리고당의 농도가 각각 35% 및 44% 더 높았으며, 푸코실화 올리고당(fucosylated oligosaccharides)의 세포 외 생산을 증가시켰지만, P-PLA2 동시발현(ΔLFAR-YA/FF+P-PLA2) 보다 적은 정도였다.
즉, P-PLA2 및 D-TM1의 발현이 기질 접근성을 향상시키고 2'-FL의 세포내 축적을 감소시켜 푸코실화 올리고당(2'-FL 및 Di-FL)의 생산 역가를 증가시킨다는 것을 확인할 수 있다.
이상 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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DIFUCOSYLLACTOSE AND PRODUCTION METHOD USING THE SAME
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PLA2
<400> 1
gcccccgcgg acaagcccca ggtactcgcc tccttcacgc agaccagcgc gtccagccag 60
aacgcctggc tcgcggccaa ccggaaccag tccgcctggg ccgcctacga gttcgactgg 120
tccacggacc tgtgcaccca ggcgcccgac aaccccttcg gcttcccgtt caacacggcc 180
tgcgcgcgcc acgacttcgg ttaccgcaac tacaaggcgg cgggcagctt cgacgccaac 240
aagagccgta tcgacagcgc cttctacgag gacatgaagc gcgtctgcac cggctacacc 300
ggcgagaaga acacggcctg caacagcacc gcctggacct actaccaggc cgtcaagatc 360
ttcggc 366
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PelB signal
<400> 2
atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60
atggcc 66
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-PLA2 sequence
<400> 3
atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60
atggccatgg cccccgcgga caagccccag gtactcgcct ccttcacgca gaccagcgcg 120
tccagccaga acgcctggct cgcggccaac cggaaccagt ccgcctgggc cgcctacgag 180
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ggctacaccg gcgagaagaa cacggcctgc aacagcaccg cctggaccta ctaccaggcc 420
gtcaagatct tcggc 435
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Plasmids for P-PLA2 expression
<400> 4
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
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gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
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tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DsbA signal
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D-TM1
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3360
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmids for D-TM1 expression
<400> 8
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
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tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
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gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
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taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
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cctgatggtc ggagacaaaa ggaatattca gcgatttgcc cgagcttgcg agggtgctac 1920
ttaagccttt agggttttaa ggtctgtttt gtagaggagc aaacagcgtt tgcgacatcc 1980
ttttgtaata ctgcggaact gactaaagta gtgagttata cacagggctg ggatctattc 2040
tttttatctt tttttattct ttctttattc tataaattat aaccacttga atataaacaa 2100
aaaaaacaca caaaggtcta gcggaattta cagagggtct agcagaattt acaagttttc 2160
cagcaaaggt ctagcagaat ttacagatac ccacaactca aaggaaaagg actagtaatt 2220
atcattgact agcccatctc aattggtata gtgattaaaa tcacctagac caattgagat 2280
gtatgtctga attagttgtt ttcaaagcaa atgaactagc gattagtcgc tatgacttaa 2340
cggagcatga aaccaagcta attttatgct gtgtggcact actcaacccc acgattgaaa 2400
accctacaag gaaagaacgg acggtatcgt tcacttataa ccaatacgct cagatgatga 2460
acatcagtag ggaaaatgct tatggtgtat tagctaaagc aaccagagag ctgatgacga 2520
gaactgtgga aatcaggaat cctttggtta aaggctttga gattttccag tggacaaact 2580
atgccaagtt ctcaagcgaa aaattagaat tagtttttag tgaagagata ttgccttatc 2640
ttttccagtt aaaaaaattc ataaaatata atctggaaca tgttaagtct tttgaaaaca 2700
aatactctat gaggatttat gagtggttat taaaagaact aacacaaaag aaaactcaca 2760
aggcaaatat agagattagc cttgatgaat ttaagttcat gttaatgctt gaaaataact 2820
accatgagtt taaaaggctt aaccaatggg ttttgaaacc aataagtaaa gatttaaaca 2880
cttacagcaa tatgaaattg gtggttgata agcgaggccg cccgactgat acgttgattt 2940
tccaagttga actagataga caaatggatc tcgtaaccga acttgagaac aaccagataa 3000
aaatgaatgg tgacaaaata ccaacaacca ttacatcaga ttcctaccta cataacggac 3060
taagaaaaac actacacgat gctttaactg caaaaattca gctcaccagt tttgaggcaa 3120
aatttttgag tgacatgcaa agtaagtatg atctcaatgg ttcgttctca tggctcacgc 3180
aaaaacaacg aaccacacta gagaacatac tggctaaata cggaaggatc tgaggttctt 3240
atggctcttg tatctatcag tgaagcatca agactaacaa acaaaagtag aacaactgtt 3300
caccgttaca tatcaaaggg aaaactgtcc atatgcacag atgaggtacc gagttgcatg 3360
ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca ccggaaggag 3420
ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta atgagtgagc 3480
taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 3540
cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgccag 3600
ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca ccgcctggcc 3660
ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa aatcctgttt 3720
gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt atcccactac 3780
cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg cgcccagcgc 3840
catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca gcatttgcat 3900
ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta tcggctgaat 3960
ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg agacagaact 4020
taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat gctccacgcc 4080
cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct ggtcagagac 4140
atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg catcctggtc 4200
atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat tgtgcaccgc 4260
cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc tggcacccag 4320
ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca gggccagact 4380
ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg ccacgcggtt 4440
gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt tcgcagaaac 4500
gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg catactctgc 4560
gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct cttccgggcg 4620
ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga tctcgacgct 4680
ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg ccgttgagca 4740
ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc ccggccacgg 4800
ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg cgagcccgat 4860
cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga 4920
tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga aattaatacg 4980
actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa 5040
ctttaagaag gagatggatc catgaaaaag atttggctgg cgctggctgg tttagtttta 5100
gcgtttagcg catcggcggg ttcgtttaac tatggggaag ctttacaaaa agctatcatg 5160
ttttacgaat ttcaaatgtc tggtaaactt ccgaattggg tacgcaacaa ctggcgtggc 5220
gactcagcat taaaggatgg tcaagacaat gggcttgatt tgacaggtgg ttggtttgac 5280
gcaggtgatc acgtcaagtt taaccttcca atgtcataca ctggtacaat gttgtcatgg 5340
gcagtgtatg agtacaaaga tgcatttgtc aagagtggtc aattggaaca tatcttaaat 5400
caaatcgaat gggttaatga ctattttgta aaatgtcatc caagcaaata tgtatactat 5460
taccaggttg gggatggaag taaagatcat gcatggtggg gacctgctga ggttatgcaa 5520
atggagagac cttcatttaa ggtcacccaa agcagtcctg gatctacagt agtagcagag 5580
acagcagctt ccttagcagc agcttcaatt gttttgaaag acagaaatcc cactaaagca 5640
gcaacatatc tgcaacatgc aaaagaatta tatgagtttg cagaagtaac aaaaagcgat 5700
gcaggttaca ctgctgcaaa tggatattac aattcatgga gcggtttcta tgatgagctt 5760
tcttgggcag cagtttggtt gtatttggca acaaatgatt caacatatct cacaaaagct 5820
gagtcatatg tccaaaattg gcccaaaatt tctggcagta acacaattga ctacaagtgg 5880
gctcattgct gggatgatgt tcacaatgga gcggcattat tgttagcaaa aattaccggt 5940
aaggatattt ataaacaaat tattgaaagt cacttagatt actggactac aggatacaat 6000
ggcgaaagga ttaagtatac accaaaagga ttagcatggc ttgatcaatg gggttcgttg 6060
agatatgcaa caactacagc atttttggca tttgtttata gcgattgggt tggctgtcca 6120
agcacaaaaa aagaaatata tagaaaattt ggagaaagcc agattgatta tgcgttaggc 6180
tcagctggaa gaagctttgt tgttggattt ggtacaaatc caccaaagag accgcatcac 6240
agaactgctc atagctcatg ggcagacagt cagagtatac cttcatatca cagacataca 6300
ttatatggag cgcttgttgg tggtccaggc tctgatgata gctacacaga tgatataagt 6360
aactatgtga acaatgaggt tgcatgtgat tataatgcag ggtttgtggg tgcattagca 6420
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acaaacgacg aattctttgt tgaagctggt ataaatgcat ccggaactaa ctttattgaa 6540
attaaagcga tagttaataa ccaaagtggt tggcctgcca gagcaacaga taagcttaaa 6600
tttagatatt ttgttgacct gagtgaatta attaaagcag gatattcacc aaatcaatta 6660
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agcaaaaata tatactacat tttagtagac tttactggca cattgattta tccaggtggt 6780
caagacaaat ataagaaaga agtccaattc agaattgcag caccacagaa tgtacagtgg 6840
gataattcta acgactattc tttccaggat ataaagggag tttcaagtgg ttcagttgtt 6900
aaaactaaat atattccact ttatgatgga gatgtgaaag tatggggtga agaaccagga 6960
acttctggag caacaccgac accaacagca acagcaacac caacaccaac gccgacagta 7020
acaccaacac cgactccaac accaacatca actgctacac caacaccgac accaacaccg 7080
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agcagcagca tagatttgag cagggtaacg ataaggtact ggtacacggt agatggggac 7320
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agtggagctg ggcagttgca ggctggcaaa gacacagggg agatacagat aaggtttaac 7500
aagagtgatt ggagcaatta caatcagggg aatgactggt catggatgca gagcatgacg 7560
aattatggag agaatgtgaa ggtaacagcg tatatagatg gtgtattggt atggggacag 7620
gagccgagtg gagcgacacc aacaccgaca gcgacaccag caccgacagt gacaccgaca 7680
cctacaccaa caccaacgtc aacaccaact gctacaccaa cagcaacgcc aacaccaaca 7740
ccgacgccga gcagcacacc tgtagcaggc gggcagataa aggtattgta tgctaacaag 7800
gagacaaata gcacaacaaa cacgataagg ccatggttga aggtagtgaa cactggaagc 7860
agcagcatag atttgagcag ggtaacgata aggtactggt acacggtaga tggggacaag 7920
gcacagagtg cgatatcaga ctgggcacag ataggagcaa gcaatgtgac attcaagttt 7980
gtgaagctga gcagtagcgt aagtggagcg gactattatt tagagatagg atttaagagt 8040
ggagctgggc agttgcaggc tggtaaagac acaggggaga tacagataag gtttaacaag 8100
agtgactgga gcaattacaa tcaggggaat gactggtcat ggatgcagag catgacgaat 8160
tatggagaga atgtgaaggt aacagcgtat atagatggtg tattggtatg gggacaggag 8220
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acaccagcac caactccaac cccgacacca acaccaactg ctacaccaac accaacgcca 8340
acaccaaccc caaccgcgac accaacagta acagcaacac caacaccgac gccgagcagc 8400
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ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc 8580
ggat 8584
Claims (12)
- 포스포라이페이스 A2(phospholipase A2)를 코딩하는 유전자 서열; 및
상기 포스포라이페이스 A2의 n 말단에 연결되는 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 서열을 포함하고,
상기 신호 펩티드는 PelB 신호 펩티드인, 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose) 또는 디푸코실락토오스 생산용 재조합 벡터. - 제1 항에 있어서,
CelA의 절단된 돌연변이 1 (truncational mutant 1)를 코딩하는 유전자 서열; 및
상기 CelA의 절단된 돌연변이 1 의 n 말단에 연결되는 신호 펩티드 DsbA을 코딩하는 유전자 서열을 더 포함하는, 재조합 벡터. - 제1 항에 있어서,
상기 포스포라이페이스 A2(phospholipase A2)를 코딩하는 유전자 서열은 서열번호 1로 표시되는 것인, 재조합 벡터. - 제1 항에 있어서,
상기 PelB 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 서열은 서열번호 2로 표시되는 것인, 재조합 벡터. - 제2 항에 있어서,
상기 CelA의 절단된 돌연변이 1 (truncational mutant 1)를 코딩하는 유전자 서열은 서열번호 5로 표시되는 것인, 재조합 벡터. - 제2 항에 있어서,
상기 DsbA 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 서열번호 6으로 표시되는 것인, 재조합 벡터. - 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질 전환된, 숙주세포.
- 제7 항에 있어서,
상기 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주세포는 대장균인, 숙주세포. - 제7 항의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose) 또는 디푸코실락토오스의 생산방법.
- 포스포라이페이스 A2 및 포스포라이페이스 A2의 n 말단에 연결되는 PelB 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 제1 플라스미드 벡터; 및,
CelA의 절단된 돌연변이 1 (truncational mutant 1) 및 CelA의 절단된 돌연변이 1 의 n 말단에 연결되는 DsbA 단백질을 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 제2 플라스미드 벡터;를 포함하는, 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose) 또는 디푸코실락토오스 생산용 유전자 전달 복합체. - (a) 서열번호 3의 유전자 서열 및 서열번호 7의 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 재조합된 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계;
(c) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 배양액으로부터 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose) 또는 디푸코실락토오스를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose) 또는 디푸코실락토오스의 생산방법. - 제11 항에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균인, 2'-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose) 또는 디푸코실락토오스의 생산방법.
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|---|---|---|---|
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| KR1020220037482A KR20230094102A (ko) | 2021-12-20 | 2022-03-25 | 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 생산 방법 |
Country Status (1)
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117089503A (zh) * | 2023-10-17 | 2023-11-21 | 保龄宝生物股份有限公司 | 一种大肠杆菌k-12 mg1655 blbyzt6及其应用 |
-
2022
- 2022-03-25 KR KR1020220037482A patent/KR20230094102A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117089503A (zh) * | 2023-10-17 | 2023-11-21 | 保龄宝生物股份有限公司 | 一种大肠杆菌k-12 mg1655 blbyzt6及其应用 |
| CN117089503B (zh) * | 2023-10-17 | 2024-01-02 | 保龄宝生物股份有限公司 | 一种大肠杆菌k-12 mg1655 blbyzt6及其应用 |
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