CN117089503A - 一种大肠杆菌k-12 mg1655 blbyzt6及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及母乳低聚糖生产技术领域，具体涉及一种大肠杆菌（Escherichia coli）K‑12 MG1655 BLBYZT6及其应用，大肠杆菌K‑12 MG1655 BLBYZT6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28317，保藏日期为2023年08月31日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明大肠杆菌K‑12 MG1655 BLBYZT6应用于发酵生产2’‑岩藻糖基乳糖及二岩藻糖基乳糖中。本发明提高了2’‑岩藻糖基乳糖产率，降低非目标产物干物质占比，分离纯化简单，利于工业化生产，同时可联产纯度＞90%二岩藻糖基乳糖。
Description
技术领域
本发明涉及母乳低聚糖生产技术领域，具体涉及一种大肠杆菌K-12 MG1655BLBYZT6及其应用。
背景技术
2’-岩藻糖基乳糖（2'-FL）是由D-葡萄糖、D-半乳糖和L-岩藻糖构成，是人乳寡糖中含量最丰富的低聚糖，在人乳中浓度约为2-5g/L，约占已检出的人乳总寡糖的30%。人乳寡糖是婴儿发育不可或缺的成分，有助于婴儿肠道中双歧杆菌属、乳杆菌属和拟杆菌属等益生菌的生长，有助于预防病原菌感染，调节免疫系统，促进婴儿大脑早期发育等功能。
2’-FL已在国外婴幼儿配方奶粉、乳制品和特殊用途食品中广泛使用。目前，国内外对2’-FL的研究主要集中在微生物发酵法生产2’-FL的菌株构建上，如：
CN114774343A公开了一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用，通过CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除大肠杆菌中与底物降解以及中间产物分流相关的一系列基因，将不同的酶分别进行基因组过表达或者质粒过表达的调控，最终构建的大肠杆菌工程菌株3L发酵罐条件下2’-岩藻糖基乳糖发酵产率57.7g/L。
CN114032261A公开了一种降解发酵液中乳糖获得高纯度岩藻糖基乳糖的方法，累计通过了三次膜处理，以去除菌体和杂糖，膜过滤过程加入了重量4-6倍的水稀释料液；处理过程为降低乳糖含量，加入乳糖酶降解乳糖；离子交换脱盐处理截留浓液电导＜400us/cm，最终制备2’-岩藻糖基乳糖纯度不低于95%。
CN105814070A公开了使用模拟移动床色谱纯化中性人乳寡糖的方法，模拟移动床色谱柱对含人乳寡糖的发酵提取液进行一次或多次色谱分离，然后喷雾干燥后得到纯度92%以上的2’-岩藻糖基乳糖。
CN202110115032.6公开了一种2’-岩藻糖基乳糖的富集纯化方法，提纯步骤为过滤发酵液、低温加压浓缩发酵液、无水乙醇沉淀离心除蛋白、低温低压浓缩、活性炭层析柱预处理、层析纯化2’-岩藻糖基乳糖、低温减压浓缩、冷冻干燥得成品，成品色谱纯度85.04%。
上述专利的缺陷在于，转化率低，非目标糖干物质占比高，不利于分离纯化；同时对于2’-FL发酵液的分离纯化研究较少，且工艺路线较长，设备复杂。
二岩藻糖基乳糖（DFL）是一种存在于2’-岩藻糖基乳糖产品中的低聚糖，含量较低，具有多种生物活性，包括益生元作用、抗粘附性能和免疫调节功能，可作为人乳寡糖标准品，现有技术中一般采用合成的方式制备，产率低和产品纯化困难，现有技术中未见有发酵生产2’-岩藻糖基乳糖联产二岩藻糖基乳糖的报道。
发明内容
针对现有技术转化率低、工艺流程长等问题，本发明提供一种大肠杆菌K-12MG1655 BLBYZT6及其应用，提高了2’-岩藻糖基乳糖产率，降低非目标产物干物质占比，分离纯化流程简单，更利于工业化生产，同时可联产纯度90%以上的二岩藻糖基乳糖（DFL）。
第一方面，本发明提供一种大肠杆菌（Escherichia coli）K-12 MG1655 BLBYZT6，该大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28317，保藏日期为2023年08月31日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。领域内公知，大肠杆菌（Escherichia coli），又名大肠埃希氏菌，由Escherich在1885年发现。
进一步的，大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6的培养方法为，将菌株接种于种子液培养基上，在温度为36~38℃、搅拌速率为150~250r/min条件下发酵培养5~10h；种子液培养基按如下浓度的成分配制：复配蛋白胨 8～14g/L、酵母粉 4～12g/L、氯化钠 8～12g/L；复配蛋白胨包括重量比为2~3：1的胰蛋白胨和牛骨蛋白胨。
第二方面，本发明提供大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6的应用，该应用为，在发酵生产2’-岩藻糖基乳糖及二岩藻糖基乳糖中的应用。
进一步的，发酵生产2’-岩藻糖基乳糖及二岩藻糖基乳糖的方法包括如下步骤：
（1）将大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6接种于种子液培养基，获得种子液；
（2）将种子液接种于发酵培养基进行发酵，获得发酵液；
（3）发酵液经膜过滤、浓缩、乙酸结晶、离心后固形物干燥得2’-岩藻糖基乳糖晶体，乙酸结晶分离液经脱色、离子交换、浓缩、色谱分离、干燥后得二岩藻糖基乳糖。
进一步的，步骤（2）中，发酵培养基按如下浓度的成分配制：葡萄糖 5~40g/L、乳糖5~40g/L、复配蛋白胨 10～15g/L、酵母粉 20～30g/L、磷酸氢二钾 10～20g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、微量金属元素 5~15ml/L；微量金属元素包括如下浓度的成分，硫酸亚铁 6g/L、一水硫酸锰 0.35g/L、七水硫酸锌 2.2g/L、无水硫酸铜 1.0g/L、钼酸铵 0.11g/L。
进一步的，步骤（2）中，发酵的工艺条件为，首先调发酵温度为36~38℃，发酵压力为0.03~0.04MPa，发酵pH为6.8~7.0，发酵时间为8~10h；然后调发酵温度至28~32℃，发酵压力为0.05~0.08MPa，发酵pH为7.2~7.6，发酵过程中补加蛋白胨、乳糖和葡萄糖；整个发酵时间为100~130h，搅拌速率为150~300r/min。
进一步的，步骤（3）中，浓缩的温度≤70℃，发酵液浓缩至固形物含量＞83%。
进一步的，步骤（3）中，乙酸结晶的温度为恒温50℃，乙酸的添加量为料液质量的0.5~3倍，结晶的时间为30~50h。
进一步的，步骤（3）中，离心后固体物经过溶解、脱色、离子交换、浓缩、干燥得2’-岩藻糖基乳糖粉末，离子交换采用阳、阴离子树脂混合的满床式离子交换，阳离子树脂和阴离子树脂为体积比为100：110的D001树脂和D301-F树脂。D001树脂为阳离子强酸树脂，D301-F树脂为阴离子弱碱树脂，可避免过酸过碱对料液影响，保持料液稳定性。
进一步的，步骤（3）中，活性炭用量为料液干物质含量的3%~5%，脱色温度为50~60℃，脱色时间为50~70min，料液透光＞85%；离子交换进料温度为30~40℃，走料速度为2~3Bv/h，出料电导＜50us/cm，出料pH值为3~6；浓缩温度为60~67℃，浓缩至固形物含量为50%；色谱分离条件为，色谱进料质量浓度为50%，温度为60~63℃，水料比为1:（3~3.5）。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明以大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6菌株高效发酵生产2’-岩藻糖基乳糖，发酵过程采用两段式，包括变温、变压及调控pH，第一段发酵工艺的温度、压力及pH为菌种最适宜的长菌条件，有利于快速长菌；第二段发酵工艺，采用降低温度至菌株最适反应温度，同时调整压力、pH，并补加氮源和碳源，提高目标反应产物产生，降低副产物的干物质面积占比，降低后提取难度。
（2）本发明发酵液经浓缩、乙酸结晶、离心即得到纯度＞96%的2’-岩藻糖基乳糖晶体，同时本发明可进一步精制得到高品质2’-岩藻糖基乳糖粉末，缩短了后提取工艺路线。
（3）本发明对发酵浓缩液采用乙酸代替现有技术中水结晶，可以实现2’-岩藻糖基乳糖一次结晶收率65%以上。
（4）本发明对结晶离心的分离液进行提纯，实现了联产制备出纯度＞90%的二岩藻糖基乳糖（DFL）。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明所采用的大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6通过如下方式获得：
本发明采用申请人购买的大肠杆菌K-12 MG1655菌株，大肠杆菌K-12 MG1655菌株中α-1，2-岩藻糖基转移酶供体来源为螺杆菌(Helicobacter spp.)。
本发明采用的大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6由申请人所保存的大肠杆菌K-12MG1655菌株经采用紫外线、亚硝基胍复合诱变处理，通过生产2’-岩藻糖基乳糖的转化率测定筛选得到优良的高产菌株，具体包括如下步骤：
（1）紫外线诱变：接种环挑取大肠杆菌K-12 MG1655斜面于装有无菌水的三角瓶中，置于磁力搅拌器上振荡1h。将悬液倒入含无菌大头针的无菌平皿。打开平皿盖，在事先预热好的25W的紫外灯下28.5cm处照射0s、20s、40s、60s、80s、100s、120s，不同照射剂量菌液稀释到10-1，黑暗处放置1h。再用生理盐水分别稀释菌液到10-3，吸取稀释好的菌液0.1mL涂布培养基平板，每个稀释度涂布3个平板。将涂好的平皿用黑布包好，置生化培养箱37℃培养5d左右，至长出成熟菌落，选取紫外诱变后致死率80%以上菌株进行筛选，得优良菌株YZTUV-28。
（2）亚硝基胍诱变：对菌株YZTUV-28进行亚硝基胍诱变处理。取活化好的菌种YZTUV-28斜面，接入三角瓶中震荡2h，取出制备好的悬液10mL，加入0.5％亚硝基胍0.2mL，混匀后置于恒温震荡箱中，37℃，分别震荡10，20，30，40，50，60，70min，待反应完成后，立即加入0.1mol/L的氢氧化钠调节pH终止反应。同时以不加亚硝基胍组作为对照。用磷酸缓冲液将对照及诱变后菌液稀释。分别吸取菌液至培养基平皿上涂布，然后置生化培养箱37℃培养5d左右，至长出成熟菌落，统计致死率，并从平皿中随机挑选单菌落。
（3）筛选：选取平板菌落进行摇瓶培养，测定2’-岩藻糖基乳糖转化产量，从中筛选出高转化率菌株，编号为K-12 MG1655 BLBYZT6。
筛选出的菌株委托“中国工业微生物菌种保藏管理中心”进行微生物鉴定，鉴定报告编号:22-0607-01342.01-03129。
培养方法：TSA培养基，37℃培养18h。
宏观形态：菌落浅黄色，圆形，表面湿润，不透明，边缘整齐；
微观形态：菌体呈杆状，大小（0.4-0.6）μm×（0.9-2.1）μm，单个或成对排列，革兰氏阴性。
筛选出的菌种生理生化实验结果见表1。
表1 菌种生理生化检测结果
表中，“+”代表阳性，“-”代表阴性。
经中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定，本发明所筛选到的菌株K-12 MG1655BLBYZT6鉴定为大肠杆菌（Escherichia coli），命名为大肠杆菌（Escherichia coli）K-12MG1655 BLBYZT6。
实施例1
一种利用大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6发酵生产2’-岩藻糖基乳糖方法，具体包括如下步骤：
（1）将大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6接种于种子液培养基，获得种子液；种子液培养基包括：复配蛋白胨（重量比为3：1的胰蛋白胨和牛骨蛋白胨复配）8g/L，酵母粉12g/L，氯化钠8g/L；培养方法为，在温度为37℃、搅拌速率为150r/min条件下发酵培养10h。
（2）将种子液接种于发酵培养基进行发酵，获得发酵液；发酵培养基包括：葡萄糖20g/L、乳糖40g/L、复配蛋白胨（重量比为3：1的胰蛋白胨和牛骨蛋白胨复配）15g/L、酵母粉30g/L、磷酸氢二钾20g/L、磷酸二氢钾5g/L、微量金属元素 15ml/L；微量金属元素包括：6g/L硫酸亚铁，0.35g/L一水硫酸锰，2.2g/L七水硫酸锌，1.0g/L无水硫酸铜，0.11g/L钼酸铵；种子液以10%的接种量接入发酵培养基，发酵工艺条件为，首先调发酵温度为36~38℃，发酵压力为0.03~0.04MPa，发酵pH为6.8~7.0，发酵时间为8~10h；然后调发酵温度至28~32℃，发酵压力为0.05~0.08MPa，发酵pH为7.2~7.6，发酵过程中补加蛋白胨、乳糖和葡萄糖；整个发酵时间为120h，搅拌速率为200r/min。
（3）将步骤（2）制得的发酵液经膜过滤后收集无菌体发酵液，无菌体发酵液进行浓缩，浓缩温度≤70℃，浓缩无菌体发酵液至固形物含量83%以上；浓缩液加入料液质量2倍的乙酸，于50℃恒温结晶40h；离心后固形物干燥得到纯度大于96%的2’-岩藻糖基乳糖晶体产品。
（4）将步骤（3）离心后得到的固形物晶体粗品溶解后利用活性炭脱色；脱色料液经混合离子交换器离子交换降低电导率，混合离子交换器树脂包括重量比为100：110的强酸D001树脂和弱碱D301-F树脂；利用蒸发器对离子交换出料进行浓缩，浓缩至固形物含量60%，浓缩液进行干燥，干燥温度为135~165℃，排风温度65~105℃，在-1.0×100Pa负压下干燥浓缩液，干燥后得到高品质2’-岩藻糖基乳糖粉末产品。
实施例2
一种利用大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6发酵生产2’-岩藻糖基乳糖方法，具体包括如下步骤：
（1）将大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6接种于种子液培养基，获得种子液；种子液培养基包括：复配蛋白胨（重量比为2：1的胰蛋白胨和牛骨蛋白胨复配）8g/L，酵母粉8g/L，氯化钠8g/L；培养方法为，在温度为37℃、搅拌速率为250r/min条件下发酵培养5h。
（2）将种子液接种于发酵培养基进行发酵，获得发酵液；发酵培养基包括：葡萄糖40g/L、乳糖40g/L、复配蛋白胨（重量比为3：1的胰蛋白胨和牛骨蛋白胨复配）10g/L、酵母粉25g/L、磷酸氢二钾15g/L、磷酸二氢钾1g/L、微量金属元素 10ml/L；微量金属元素包括：6g/L硫酸亚铁，0.35g/L一水硫酸锰，2.2g/L七水硫酸锌，1.0g/L无水硫酸铜，0.11g/L钼酸铵；种子液以6%的接种量接入发酵培养基，发酵工艺条件为，首先调发酵温度为36~38℃，发酵压力为0.03~0.04MPa，发酵pH为6.8~7.0，发酵时间为8~10h；然后调发酵温度至28~32℃，发酵压力为0.05~0.08MPa，发酵pH为7.2~7.6，发酵过程中补加蛋白胨、乳糖和葡萄糖；整个发酵时间为100h，搅拌速率为150r/min。
（3）将步骤（2）制得的发酵液经膜过滤后收集无菌体发酵液，无菌体发酵液进行浓缩，浓缩温度≤70℃，浓缩无菌体发酵液至固形物含量83%以上；浓缩液加入料液质量0.5倍的乙酸，于50℃恒温结晶30h；离心后固形物干燥得到纯度大于96%的2’-岩藻糖基乳糖晶体产品。
（4）将步骤（3）离心后得到的固形物晶体粗品溶解后利用活性炭脱色；脱色料液经混合离子交换器离子交换降低电导率，混合离子交换器树脂包括重量比为100：110的强酸D001树脂和弱碱D301-F树脂；利用蒸发器对离子交换出料进行浓缩，浓缩至固形物含量55%，浓缩液进行干燥，干燥温度为135~165℃，排风温度65~105℃，在-1.0×100Pa负压下干燥浓缩液，干燥后得到高品质2’-岩藻糖基乳糖粉末产品。
实施例3
一种利用大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6发酵生产2’-岩藻糖基乳糖方法，具体包括如下步骤：
（1）将大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6接种于种子液培养基，获得种子液；种子液培养基包括：复配蛋白胨（重量比为2：1的胰蛋白胨和牛骨蛋白胨复配）14g/L，酵母粉4g/L，氯化钠12g/L；培养方法为，在温度为37℃、搅拌速率为200r/min条件下发酵培养7h。
（2）将种子液接种于发酵培养基进行发酵，获得发酵液；发酵培养基包括：葡萄糖5g/L、乳糖5g/L、复配蛋白胨（重量比为3：1的胰蛋白胨和牛骨蛋白胨复配）15g/L、酵母粉20g/L、磷酸氢二钾10g/L、磷酸二氢钾4g/L、微量金属元素 5ml/L；微量金属元素包括：6g/L硫酸亚铁，0.35g/L一水硫酸锰，2.2g/L七水硫酸锌，1.0g/L无水硫酸铜，0.11g/L钼酸铵；种子液以8%的接种量接入发酵培养基，发酵工艺条件为，首先调发酵温度为36~38℃，发酵压力为0.03~0.04MPa，发酵pH为6.8~7.0，发酵时间为8~10h；然后调发酵温度至28~32℃，发酵压力为0.05~0.08MPa，发酵pH为7.2~7.6，发酵过程中补加蛋白胨、乳糖和葡萄糖；整个发酵时间为130h，搅拌速率为300r/min。
（3）将步骤（2）制得的发酵液经膜过滤后收集无菌体发酵液，无菌体发酵液进行浓缩，浓缩温度≤70℃，浓缩无菌体发酵液至固形物含量83%以上；浓缩液加入料液质量3倍的乙酸，于50℃恒温结晶50h；离心后固形物干燥得到纯度大于96%的2’-岩藻糖基乳糖晶体产品。
（4）将步骤（3）离心后得到的固形物晶体粗品溶解后利用活性炭脱色；脱色料液经混合离子交换器离子交换降低电导率，混合离子交换器树脂包括重量比为100：110的强酸D001树脂和弱碱D301-F树脂；利用蒸发器对离子交换出料进行浓缩，浓缩至固形物含量65%，浓缩液进行干燥，干燥温度为135~165℃，排风温度65~105℃，在-1.0×100Pa负压下干燥浓缩液，干燥后得到高品质2’-岩藻糖基乳糖粉末产品。
实施例4
取实施例1-3的步骤（3）中乙酸结晶分离液，分离液加干物质3%~5%活性炭，55~60℃脱色50~70min过滤后离交；离交进料温度30~40℃，离交流速2~3Bv/h（按树脂体积），60~67℃浓缩至固形物含量50%，色谱提纯二岩藻糖基乳糖，色谱分离条件为，色谱进料质量浓度为50%，温度为60~63℃，水料比为1:（3~3.5），提纯的二岩藻糖基乳糖经过干燥得到高纯度二岩藻糖基乳糖，纯度91.34%。
对比例1
与实施例1不同的是，种子液和发酵培养基的蛋白胨为胰蛋白胨。
对比例2
与实施例1不同的是，步骤（3）中，发酵工艺条件为，发酵温度为36~38℃、压力为0.05~0.08MPa、pH值为6.8~7.0，发酵过程补加蛋白胨、乳糖和葡萄糖，150~300r/min条件下发酵培养110~140h，得发酵液。
对比例3
与实施例1不同的是，步骤（3）中，浓缩液结晶的方法为，浓缩液以2℃/h速率降温至50℃，加晶体质量0.08%的晶种，然后以1℃/h速率降温至20℃，20℃保温15h后离心干燥晶体。
实验例1
取实施例1-3，对比例1-3制得的2'-岩藻糖基乳糖发酵液各1mL，10000rpm离心10min，取上清，用于HPLC测定，记录发酵液中各组分面积占比，并根据测定结果计算2'-FL发酵产率，结果如下表2所示。HPLC检测条件：通过高效液相色谱(HPLC)系统(Waterse2695) ；色谱柱：Carbohydrate Analysis(Shodex sugar SH1011)；检测器：示差检测器；流动相：0.5mmol/L H2SO4；流速：0.6mL/min；柱温：60℃；进样量：20μL。
实验例2
记录实施例1-3和对比例4结晶料液离心前后的质量，测定结晶后晶体的水分含量，然后计算结晶收率；HPLC测定离心后晶体纯度，HPLC检测条件同实施例1；结果如下表3所示。
表2 实施例1-3和对比例1-2发酵液中2'-FL和其他糖干物质面积占比及2'-FL发酵产率数据
| 项目 | 2'-FL发酵产率 g/L | 发酵液中2'-FL干物质面积占比 % | 发酵液中其他糖干物质面积占比 % |
| 实施例1 | 77.72 | 82.33 | 17.67 |
| 实施例2 | 75.89 | 80.00 | 20.00 |
| 实施例3 | 76.11 | 81.59 | 18.41 |
| 对比例1 | 60.68 | 69.41 | 30.59 |
| 对比例2 | 44.98 | 61.4 | 38.6 |
表3 实施例1-3和对比例3制得2'-FL晶体收率和晶体纯度
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6，其特征在于，该大肠杆菌（Escherichia coli）K-12 MG1655 BLBYZT6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28317，保藏日期为2023年08月31日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6，其特征在于，大肠杆菌K-12MG1655 BLBYZT6的培养方法为，将菌株接种于种子液培养基上，在温度为36~38℃、搅拌速率为150~250r/min条件下发酵培养5~10h；种子液培养基按如下浓度的成分配制：复配蛋白胨 8～14g/L、酵母粉 4～12g/L、氯化钠 8～12g/L；复配蛋白胨包括重量比为2~3：1的胰蛋白胨和牛骨蛋白胨。
3.一种权利要求1所述大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6的应用，其特征在于，在发酵生产2’-岩藻糖基乳糖及二岩藻糖基乳糖中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵生产2’-岩藻糖基乳糖及二岩藻糖基乳糖的方法包括如下步骤：
（1）将大肠杆菌K-12 MG1655 BLBYZT6接种于种子液培养基，获得种子液；
（2）将种子液接种于发酵培养基进行发酵，获得发酵液；
（3）发酵液经膜过滤、浓缩、乙酸结晶、离心后固形物干燥得2’-岩藻糖基乳糖晶体，乙酸结晶分离液经脱色、离子交换、浓缩、色谱分离、干燥后得二岩藻糖基乳糖。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，发酵培养基按如下浓度的成分配制：葡萄糖 5~40g/L、乳糖 5~40g/L、复配蛋白胨 10～15g/L、酵母粉 20～30g/L、磷酸氢二钾 10～20g/L、磷酸二氢钾 1～5g/L、微量金属元素 5~15ml/L；微量金属元素包括如下浓度的成分，硫酸亚铁 6g/L、一水硫酸锰 0.35g/L、七水硫酸锌 2.2g/L、无水硫酸铜 1.0g/L、钼酸铵 0.11g/L。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，发酵的工艺条件为，首先调发酵温度为36~38℃，发酵压力为0.03~0.04MPa，发酵pH为6.8~7.0，发酵时间为8~10h；然后调发酵温度至28~32℃，发酵压力为0.05~0.08MPa，发酵pH为7.2~7.6，发酵过程中补加蛋白胨、乳糖和葡萄糖；整个发酵时间为100~130h，搅拌速率为150~300r/min。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，浓缩的温度≤70℃，发酵液浓缩至固形物含量＞83%。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，乙酸结晶的温度为恒温50℃，乙酸的添加量为料液质量的0.5~3倍，结晶的时间为30~50h。
9.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，离心后固体物经过溶解、脱色、离子交换、浓缩、干燥得2’-岩藻糖基乳糖粉末，离子交换采用阳、阴离子树脂混合的满床式离子交换，阳离子树脂和阴离子树脂为体积比为100：110的D001树脂和D301-F树脂。
10.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，脱色采用活性炭脱色，活性炭用量为料液干物质含量的3%~5%，脱色温度为50~60℃，脱色时间为50~70min，料液透光＞85%；离子交换进料温度为30~40℃，走料速度为2~3Bv/h，出料电导＜50us/cm，出料pH值为3~6；浓缩温度为60~67℃，浓缩至固形物含量为50%；色谱分离条件为，色谱进料质量浓度为50%，温度为60~63℃，水料比为1:（3~3.5）。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117487868A (zh) * | 2023-12-28 | 2024-02-02 | 保龄宝生物股份有限公司 | 一种利用d-阿洛酮糖酶发酵上清液联产2′-岩藻糖基乳糖的方法 |
| CN117866996A (zh) * | 2024-03-13 | 2024-04-12 | 保龄宝生物股份有限公司 | 一种高活性α-1,2-岩藻糖基转移酶酶液的制备方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160333042A1 (en) * | 2014-01-20 | 2016-11-17 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | PROCESS FOR EFFICIENT PURIFICATION OF NEUTRAL HUMAN MILK OLIGOSACCHARIDES (HMOs) FROM MICROBIAL FERMENTATION |
| CN111218488A (zh) * | 2020-02-10 | 2020-06-02 | 中国科学院上海高等研究院 | 一种利用大肠杆菌生产2’-岩藻糖基乳糖的方法 |
| CN111575220A (zh) * | 2020-05-25 | 2020-08-25 | 江南大学 | 合成2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 |
| CN112662715A (zh) * | 2021-01-27 | 2021-04-16 | 南开大学 | 一种2’-岩藻糖基乳糖的分批发酵方法 |
| WO2022136337A2 (en) * | 2020-12-22 | 2022-06-30 | Glycom A/S | A dfl-producing strain |
| CN114874964A (zh) * | 2022-06-13 | 2022-08-09 | 江南大学 | 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用 |
| KR20230094102A (ko) * | 2021-12-20 | 2023-06-27 | 중앙대학교 산학협력단 | 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 생산 방법 |
| CN116769808A (zh) * | 2023-02-27 | 2023-09-19 | 江南大学 | 一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用 |
-
2023
- 2023-10-17 CN CN202311336921.0A patent/CN117089503B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160333042A1 (en) * | 2014-01-20 | 2016-11-17 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | PROCESS FOR EFFICIENT PURIFICATION OF NEUTRAL HUMAN MILK OLIGOSACCHARIDES (HMOs) FROM MICROBIAL FERMENTATION |
| CN111218488A (zh) * | 2020-02-10 | 2020-06-02 | 中国科学院上海高等研究院 | 一种利用大肠杆菌生产2’-岩藻糖基乳糖的方法 |
| CN111575220A (zh) * | 2020-05-25 | 2020-08-25 | 江南大学 | 合成2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 |
| WO2022136337A2 (en) * | 2020-12-22 | 2022-06-30 | Glycom A/S | A dfl-producing strain |
| CN112662715A (zh) * | 2021-01-27 | 2021-04-16 | 南开大学 | 一种2’-岩藻糖基乳糖的分批发酵方法 |
| KR20230094102A (ko) * | 2021-12-20 | 2023-06-27 | 중앙대학교 산학협력단 | 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 생산 방법 |
| CN114874964A (zh) * | 2022-06-13 | 2022-08-09 | 江南大学 | 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用 |
| CN116769808A (zh) * | 2023-02-27 | 2023-09-19 | 江南大学 | 一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HYUN-JAE LEE 等: "Simultaneous production of 2\'-fucosyllactose and difucosyllactose by engineered Escherichia coli with high secretion efficiency", BIOTECHNOL. J., vol. 17, no. 3 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117487868A (zh) * | 2023-12-28 | 2024-02-02 | 保龄宝生物股份有限公司 | 一种利用d-阿洛酮糖酶发酵上清液联产2′-岩藻糖基乳糖的方法 |
| CN117866996A (zh) * | 2024-03-13 | 2024-04-12 | 保龄宝生物股份有限公司 | 一种高活性α-1,2-岩藻糖基转移酶酶液的制备方法 |
| CN117866996B (zh) * | 2024-03-13 | 2024-06-04 | 保龄宝生物股份有限公司 | 一种高活性α-1,2-岩藻糖基转移酶酶液的制备方法 |
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| Publication number | Publication date |
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