CN112458055A - 一种基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，属于生物工程技术领域。其制备步骤如下：取细胞，加入到培养液中，进行培养，待细胞长满90％后，进行切应力处理，收集细胞并涡旋后，离心，取上清液再次离心，得沉淀；将沉淀置于磷酸盐缓冲盐水中，吹打混匀后离心，取上清液再次离心，得二次沉淀，加入水进行低渗处理，离心后，即得。本发明的基于切应力刺激用于制备微囊泡的方法，可较方便快速得到含量较多的EVs，同时在制备过程中，不需要化学试剂刺激，不会产生非均相聚合物颗粒，节省了人力、物力和财力；制得的细胞微囊泡，大小均一，平均粒径为231nm，在生物材料领域，具有推广应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法。
背景技术
细胞微囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)直径大多为100-1000nm，是由细胞膜出芽形成，细胞通过释放EVs以应答细胞激活、pH值变化、缺氧、辐射、损伤或者细胞应激等细胞生理喝病理的改变，微囊泡出芽也被认为是质膜损伤后修复破损质膜的一个机制。EVs可在许多体液中被发现，包括血液、尿液、眼泪和唾液，并参与多种生理和病理过程，如心血管疾病。现在EVs越来越多地被认为是细胞间通信、疾病诊断和预后的循环标志物的重要载体。但细胞产生EVs的量本身不大，且EVs在提取的过程中纯度不高，加上后续鉴定分离使其损失较大，从而限制了EVs的应用和发展。
现有的常规提取EVs的方法：将巨噬细胞用细胞松弛素(CB)处理2h后，将细胞用细胞刮刮下，3000rmp/min离心5min，再10000rmp/min离心10min，PBS清洗两遍备用。
常规的离心方法是应用最广泛的，但存在许多缺点，如试剂花费大、处理时间长、过程繁琐、操作过程中容易污染等。而且对于EVs来说缺乏特异性，容易产生非均相聚合物颗粒，以及提取的EVs浓度不均一等问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，目的之二在于提供一种细胞微囊泡，目的之三在于提供一种细胞微囊泡的应用。
经研究，本发明提供以下技术方案：
1、一种基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，包括以下步骤：
1)取细胞，加入到培养液中，在35～38℃条件下，进行细胞培养至90％融合；
2)将培养至90％融合的细胞放置于轨道摇床(orbital shaker)细胞培养装置上进行切应力处理，条件为：转速20～70r/min，时间为2～6h；切应力处理后用细胞刮将细胞刮下，收集细胞并涡旋0.5～1min，离心，取上清液再次离心，得沉淀；
3)将沉淀置于磷酸盐缓冲盐水中，吹打混匀后离心，取上清液再次离心，得二次沉淀；
4)向二次沉淀中加入纯水进行低渗处理15～30min，离心后，即得细胞微囊泡。
其中，步骤1)中，摇床培养的时间为4～6min。轨道摇床培养的温度为37℃。细胞培养至约90％融合表示为将细胞培养增殖量至培养瓶体积的90％。步骤2)中，所述将细胞进行切应力处理即指在轨道摇床上以转速为20～70r/min进行培养。
优选的，所述步骤1)中，细胞包括免疫细胞、内皮细胞或平滑肌细胞。
优选的，所述巨噬细胞由RAW264.7细胞系中提取而得。其中，本申请中的巨噬细胞为直接购买而得。
优选的，所述步骤1)中，培养液包括DMEM培养基和10％的血清。
更优选的，所述步骤1)中，培养液的加入量为，每50mL培养瓶中加入3mL的培养液，细胞培养至整个培养瓶总体积的90％后，结束培养，此时培养瓶中的巨噬细胞约1×108个。
优选的，所述步骤2)中，切应力处理的条件为50r/min，时间为2h。
优选的，所述步骤2)中，涡旋的时间为30s，离心的转速为1000rmp，时间为5min，再次离心的转速为10000rmp，时间为10min。
优选的，所述步骤3)中，离心的转速为1500rmp，时间为5min，再次离心的转速为10000rmp，时间为15min。
优选的，所述步骤3)中，磷酸盐缓冲盐水需用200nm孔径过筛处理。
优选的，所述步骤4)中，低渗处理的时间为20min，离心的转速为10000rmp，时间为10min。
2、上述制备方法制得的细胞微囊泡。
3、上述制备方法制得的细胞微囊泡作为药物载体的应用。
一直以来，对药物载体的研究只停留在化学合成的方法之上，直到EVs的出现，药物学研究人员已成功地将EVs应用于药物载体系统，并开发了多种给药途径，包括经静脉注射、局部注射以及口服等，大大扩展了药物的利用方式。作为药物载体，EVs赋予药物分子靶向功能，增加相关药物的溶解度和药物的生物利用度，作为一种自身细胞产物，在体内运输期间也大大降低了药物的免疫原性，减少了对自身细胞的毒副作用。EVs在药物载体领域的应用已显示出无可比拟的优势和应用前景，作为纳米级天然药物载体已被成功地用于传递多种物质，如小分子化学药物、Lnc RNA、si RNA、mi RNA、m RNA、DNA以及蛋白质等。EVs作为一种新的无细胞疾病诊断和治疗策略正在被研究，并引起了多个生物医学领域的广泛关注。越来越多的证据表明，EVs由于其独特的生理生化特性，在疾病诊断和治疗中发挥着重要作用。
本发明的有益效果在于：
1)本发明的基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，可快速得到含量较多的EVs，且实验过程对仪器的要求比较低，操作简单，减少了复杂的样品处理步骤以及解决了耗时过长的问题，同时在制备过程中，不需要CB刺激，不会产生非均相聚合物颗粒，节省了人力、物力和财力；
2)本发明制得的细胞微囊泡(EVs)，大小均一，平均粒径为231nm，电位为-20.9，稳定性好，在生物材料领域，具有推广应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中制得的细胞微囊泡的扫描电镜图；
图2为本发明实施例1中制得的细胞微囊泡的粒径分布图；
图3为本发明实施例1中制得的细胞微囊泡的电位分布图；
图4为本发明的巨噬细胞的细胞膜的电位分布图；
图5为本发明制得的细胞微囊泡的蛋白定量分析图；
图6为本发明实施例1中制得的细胞微囊泡的WB分析图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，包括以下步骤：
1)从RAW 264.7细胞系中提取得到的巨噬细胞，加入到50mL的培养瓶中，并向培养瓶中加入3mL的DMEM培养基和10％的普通血清制得的培养液，置于37℃培养箱中培养，待细胞增殖至整个培养瓶总体积的90％后，结束培养，此时培养瓶中的细胞约1×108个；
2)接着将细胞置于轨道摇床上，以转速为50r/min培养4h(即进行切应力处理)，用塑料细胞刮将细胞从培养瓶上刮取下来，并用移液器快速吹打使细胞充分分散到10mL离心管中，涡旋30s后，在转速为1000rmp条件下，离心5min，取上清液到新的离心管中，在转速为10000rmp条件下，再次离心10min，去除上清液，得沉淀；
3)将沉淀用1.5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)沉降下来，充分吹打混匀，然后加入到2mL离心管中，在转速为1500rmp条件下，离心5min，重复此步骤一遍，取上清液；
4)取上清液于新的离心管中，在转速为10000rmp条件下，再次离心15min，去除上清液，得二次沉淀，向二次沉淀中加入适量纯水进行低渗处理20min，在转速为10000rmp条件下，离心10min，即得细胞微囊泡，最后加入适量纯水吹打均匀，置于-80℃条件下，保存备用。
实施例2
基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，包括以下步骤：
1)从RAW 264.7细胞系中提取得到的巨噬细胞，加入到50mL的培养瓶中，并向培养瓶中加入3mL的DMEM培养基和10％的普通血清制得的培养液，置于37℃培养箱中培养，待细胞增殖至整个培养瓶总体积的90％后，结束培养，此时培养瓶中的细胞约1×108个；
2)接着将细胞置于轨道摇床上，以转速为70r/min培养2h(即进行切应力处理)，用塑料细胞刮将细胞从培养瓶上刮取下来，并用移液器快速吹打使细胞充分分散到10mL离心管中，涡旋30s后，在转速为1000rmp条件下，离心5min，取上清液到新的离心管中，在转速为10000rmp条件下，再次离心10min，去除上清液，得沉淀；
3)将沉淀用1.5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)沉降下来，充分吹打混匀，然后加入到2mL离心管中，在转速为1500rmp条件下，离心5min，重复此步骤一遍，取上清液；
4)取上清液于新的离心管中，在转速为10000rmp条件下，再次离心15min，去除上清液，得二次沉淀，向二次沉淀中加入适量纯水进行低渗处理20min，在转速为10000rmp条件下，离心10min，即得细胞微囊泡，最后加入适量纯水吹打均匀，置于-80℃条件下，保存备用。
对照实施例1
一种制备微囊泡(EVs)的方法，包括以下步骤：
1)从RAW 264.7细胞系中提取得到的巨噬细胞，加入到50mL的培养瓶中，并向培养瓶中加入3mL的DMEM培养基和10％的普通血清制得的培养液，置于37℃培养箱中培养，待细胞增殖至整个培养瓶总体积的90％后，此时培养瓶中的细胞约1×108个；加入细胞松弛素(CB)，加入CB的浓度为10μg/mL，置于37℃培养箱中培养，继续培养2h后；
2)用塑料细胞刮将细胞从培养瓶上刮取下来，并用移液器快速吹打使细胞充分分散到10mL离心管中，涡旋30s后，在转速为1000rmp条件下，离心5min，取上清液到新的离心管中，在转速为10000rmp条件下，再次离心10min，去除上清液，得沉淀；
3)将沉淀用1.5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)沉降下来，充分吹打混匀，然后加入到2mL离心管中，在转速为1500rmp条件下，离心5min，重复此步骤一遍，取上清液；
4)取上清液于新的离心管中，在转速为10000rmp条件下，再次离心15min，去除上清液，得二次沉淀，向二次沉淀中加入适量纯水进行低渗处理20min，在转速为10000rmp条件下，离心10min，即得细胞微囊泡，最后加入适量纯水吹打均匀，置于-80℃条件下，保存备用。
对照实施例2
一种制备微囊泡(EVs)的方法，包括以下步骤：
1)从RAW 264.7细胞系中提取得到的巨噬细胞，加入到50mL的培养瓶中，并向培养瓶中加入3mL的DMEM培养基和10％的普通血清制得的培养液，细胞松弛素(CB)，待细胞增殖至整个培养瓶总体积的90％后，结束培养，此时培养瓶中的细胞约1×108个；
2)用塑料细胞刮将细胞从培养瓶上刮取下来，并用移液器快速吹打使细胞充分分散到10mL离心管中，涡旋30s后，在转速为1000rmp条件下，离心5min，取上清液到新的离心管中，在转速为10000rmp条件下，再次离心10min，去除上清液，得沉淀；
3)将沉淀用1.5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)沉降下来，充分吹打混匀，然后加入到2mL离心管中，在转速为1500rmp条件下，离心5min，重复此步骤一遍，取上清液；
4)取上清液于新的离心管中，在转速为10000rmp条件下，再次离心15min，去除上清液，得二次沉淀，向二次沉淀中加入适量纯水进行低渗处理20min，在转速为10000rmp条件下，离心10min，即得细胞微囊泡，最后加入适量纯水吹打均匀，置于-80℃条件下，保存备用。
检测分析
1、将实施例1制得的细胞微囊泡进行扫描电镜分析
具体操作为：将提取得到的Evs膜溶液制备成浓度约为150μg/mL的水溶液，滴加一滴在200目碳膜铜网上，室温下自然风干后，再滴加一滴磷钨酸溶液于碳膜铜网上染色10min，吸走碳膜铜网表面磷钨酸液体，待进一步晾干后，样品置于TEM下选区观测。制得的细胞微囊泡(EVs)通过400的挤膜器处理后的电镜图，结果如图1所示。
从图1中分析可知，细胞微囊泡(EVs)的直径约在200纳米左右，其形态呈椭圆形，且大小均一，具有完整的包膜。
2、将实施例1制得的细胞微囊泡进行粒径分析
利用Malvern粒径仪检测其粒径大小、分布，以及细胞微囊泡和巨噬细胞的细胞膜的表面电位，结果如图2，图3和图4所示。
从图2中分析可知，在水溶液中EVs的平均粒径为231.1nm，最大粒径为600nm左右，且分布均匀，PDI(多分散系数)为0.090，从而证明了其粒径分布均一，且在水溶液中具有较好的分散特性。
从图3中分析可知，EVs在水溶液中表面电位为负电性，约为-20.9。从图4中的细胞膜的电位分布图显示，细胞膜在水溶液中表面电位为负电性，约为-29.1。通过图3和图4综合对比分析，证明了Evs膜的带电性与细胞膜电位一致。
3、蛋白定量分析
将实施例1和对照实施例1制得的EVs，用BCA蛋白定量试剂盒对样品中蛋白进行定量检测，测量方法按照试剂盒说明书进行。结果如图5所示。
从图5中分析可知，只加入CB而未加切应力处理，即对照实施例1得到的EVs含量为0.13mg左右，加切应力处理，即实施例1得到的EVs的量为0.28mg左右，通过对比分析可知，采用切应力处理后提取得到的EVs含量是只加CB处理后的两倍。从而证明了切应力的引入，可大大提高EVs的生产，提取得到的EVs的量更多。
4、蛋白质印迹(WB)分析
具体操作为：以实施例1制得的EVs和巨噬细胞的细胞膜作为样品分别进行处理。①样品中蛋白的提取：将提取得到EVs膜或巨噬细胞的细胞膜，使用非变性组织/细胞裂解液提取。首先配置裂解液，将PMSF加入到裂解液中，使PMSF的最终浓度为1mM，混匀配置得到工作裂解液。样品分别离心沉淀后，每管样品中加入250μL裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和样品充分混匀，冰上放置裂解5-10min，期间多次来回晃动离心管，以使样品充分裂解。充分裂解后，将裂解后的样品4℃，14000rpm离心5min，吸取离心后的上层清液至预冷的1.5mL离心管中，迅速存放于-20℃冰箱保存备用；②蛋白定量：用BCA蛋白定量试剂盒对样品中蛋白进行定量，测量方法按照试剂盒说明书进行。根据定量结果用PBS缓冲液将要一起电泳样本的蛋白浓度调整成一致，按照每4:1(v/v)比例向样品中加入蛋白上样缓冲液(5×)，充分混匀蛋白样品和蛋白上样缓冲液，100℃金属浴加热4min，以充分变性蛋白；③SDS-PAGE凝胶的制备：12％的聚丙烯酰胺分离胶使用SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒制备，制备方法按照说明书制备得到。待分离胶凝固后除去上层的水并用吸水纸吸干，按说明书配制上层5％的浓缩胶，待浓缩胶凝固好后，将凝胶放入电泳槽中；倒入预先配置好的电泳缓冲液，使电泳液液面没过点样孔。拔去凝胶中的梳子，用上样针将样品分别缓慢加入到凝胶上样孔中，每孔上样35μL。然后使用BIO-RAD电泳系统跑胶；先在70V条件下跑胶0.5h，随后在140V条件下跑胶1h以实现充分的蛋白质分离；④转膜：取与分离胶大小一致的PVDF膜，将PVDF先在甲醇中浸泡5min使其活化，然后浸泡于预先配置好的转膜缓冲液中。取下电泳后的蛋白分离胶，除去浓缩胶，用蒸馏水清洗分离胶后再用转膜缓冲液清洗几次，将蛋白分离胶放在用转膜缓冲液浸泡后的多层滤纸上，再将PVDF膜放置在蛋白分离胶上，注意不能在蛋白分离胶和PVDF膜接的触面上产生气泡。然后在PDVF膜上再覆盖多层转膜缓冲液浸泡后的滤纸，用夹子夹紧后放入电泳槽内，加入足够量的转膜缓冲液，40V转膜1.5h；⑤封闭：转膜完成后将PVDF膜取出，注意保持PDVF膜的湿润，用TBST漂洗3次，然后将PVDF膜放置于用TBST配制的5％脱脂奶粉中封闭2h；⑥孵育一抗：将一抗(Anti CD47、Anti Integrinα4、Anti Integrinβ1)按照说明书中的使用方法用TBST稀释至工作浓度，将PDVF膜置于孵浴盒内，加入稀释的一抗，让一抗稀释液浸没PVDF膜。将孵浴盒放置4℃冰箱孵育过夜。次日取出PVDF膜，将其置于TBST中，摇床摇晃漂洗3次，每次10min；⑦孵育二抗：将用TBST漂洗后的PVDF膜重新放入孵浴盒中，加入用TBST稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，使其浸没PVDF膜，室温孵育1h；⑧显色：孵育二抗后，将PVDF膜置于TBST中，摇床摇晃漂洗3次，每次10min。用蛋白显影液显色，显影液按照说明书的方法配置，然后滴加在PVDF膜上，最后成像系统中曝光显影。结果如图6所示。
从图6中分析可知，Evs膜上的CD47、整合素α4和整合素β1蛋白都没有丢失，相比巨噬细胞的细胞膜含量上有些许降低，但是总的没有改变。从而证明了EVs膜上保留了与巨噬细胞的细胞膜上类似的膜蛋白。
本发明的基于切应力用于快速制备微囊泡(EVs)的方法，可快速得到含量较多的EVs，且实验过程对仪器的要求比较低，操作简单，减少了复杂的样品处理步骤以及解决了耗时过长的问题，同时在制备过程中，不需要CB刺激，不会产生非均相聚合物颗粒，节省了人力、物力和财力；且制得的细胞微囊泡(EVs)，大小均一，平均粒径为231nm，电位为-20.9，稳定性好，在生物材料领域，具有推广应用价值。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取细胞，加入到培养液中，在35～38℃条件下，进行细胞培养至90％融合；
2)将培养至90％融合的细胞放置于轨道摇床(orbital shaker)细胞培养装置上进行切应力处理，条件为：转速20～70r/min，时间为2～6h；切应力处理后用细胞刮将细胞刮下，收集细胞并涡旋0.5～1min，离心，取上清液再次离心，得沉淀；
3)将沉淀置于磷酸盐缓冲盐水中，吹打混匀后离心，取上清液再次离心，得二次沉淀；
4)向二次沉淀中加入纯水进行低渗处理15～30min，离心后，即得细胞微囊泡。
2.根据权利要求1所述基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，其特征在于，所述步骤1)中，细胞包括免疫细胞、内皮细胞或平滑肌细胞。
3.根据权利要求2所述基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，其特征在于，所述巨噬细胞由RAW264.7细胞系中提取而得。
4.根据权利要求1所述基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，其特征在于，所述步骤1)中，培养液包括DMEM培养基和10％的血清。
5.根据权利要求1所述基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，其特征在于，所述步骤2)中，切应力处理的条件为转速50r/min，时间为4h。
6.根据权利要求1所述基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，其特征在于，所述步骤2)中，涡旋的时间为30s，离心的转速为1000rmp，时间为5min，再次离心的转速为10000rmp，时间为10min。
7.根据权利要求1所述基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，其特征在于，所述步骤3)中，离心的转速为1500rmp，时间为5min，再次离心的转速为10000rmp，时间为15min。
8.根据权利要求1所述基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，其特征在于，所述步骤4)中，低渗处理的时间为20min，离心的转速为10000rmp，时间为10min。
9.如权利要求1至权利要求8任一所述制备方法制得的细胞微囊泡。
10.如权利要求1至权利要求8任一所述制备方法制得的细胞微囊泡作为药物载体的应用。
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