CN111044721A - 一种利用间接elisa法检测破伤风抗体效价的检测方法 - Google Patents

一种利用间接elisa法检测破伤风抗体效价的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用间接ELISA法检测破伤风抗体效价的检测方法。该检测方法的试剂盒包括抗原包被板、样品稀释液A、样品稀释液B、酶标记物鼠抗人IgG、底物液、洗涤液、终止液。本发明采用间接法检测破伤风抗体，准确性高，稳定性好，能够清澈判定破伤风抗体的效价，为规范疫苗效力检测提供了依据。

Description

一种利用间接ELISA法检测破伤风抗体效价的检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用间接ELISA法检测破伤风抗体效价的检测方法。
背景技术
破伤风是由破伤风杆菌侵入人体伤口造成的一种特异性感染，是致死性传染病，其高毒力的痉挛毒素可阻断中枢神经系统的抑制性神经递质，引起肌肉强直和典型的全身痉挛。抗体效价是疾病诊断、特异性免疫球蛋白制备和疫苗评价等领域的重要指标，具有十分重要的作用。而检测血浆中破伤风抗体的效价水平，是制备用于预防破伤风的人免疫球蛋白等产品的前提，也是评价预防接种效果的重要依据。
目前，用于破伤风抗体效价检测通常采用中和实验法，而该方法耗时长，技术要求高，且影响因素多。而ELISA（酶联免疫法）由于其迅速、灵敏度高且重复性好，应用较为广泛。目前采用的ELISA法，其影响因素等仍需进一步改进。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用间接ELISA法检测破伤风抗体效价的试剂盒及其检测方法。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒检测破伤风抗体效价的方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种利用间接ELISA法检测破伤风抗体效价的检测方法，该检测方法，所需要的试剂盒包括：抗原包被板、样品稀释液A、样品稀释液B、酶标记物鼠抗人IgG、底物液、洗涤液、终止液。
本发明所使用的抗原包被板为破伤风类毒素包被微孔板，具体处理过程为：
（1）：添加100mM DTT于破伤风类毒素中，25℃避光处理1小时后添加固体尿素颗粒，至尿素浓度为4M，取处理后的破伤风类毒素于PBS缓冲液中透析4h；
（2）将处理后的破伤风类毒素经离子交换柱及疏水层析柱纯化即可。
进一步的，所述样品稀释液A含有以下成分：乙二胺四乙酸二钠 0.5~1.2g/L、季铵淀粉醚0.2~0.5g/L、甘油0.5~1.0g/L、海藻糖醇0.2g/L、氯化钠8.5~10.5g/L、硼酸盐缓冲液0.8~1.2 g/L、叠氮钠0.3~0.5g/L；所述样品稀释液B为浓度为7.5g/L的吐温-80及生理盐水。
进一步的，所述底物液含有以下成分： 4-羧乙基哌嗪乙磺酸30-35g/L、柠檬酸8-10g/L、磷酸氢二钠8.5-11.0g/L、TMB3-5g/L、。
进一步的，所述洗涤液含有以下成分：氯化钠15g/L、碘化钾3g/L、磷酸氢钠0.255g/L，磷酸氢钾0.45g/L。
进一步的，所述终止液为H2SO40.8mol/L。
本发明所提供的检测方法，具体包括以下步骤：
(1）样品预稀释：在血清稀释板上，每孔加入样品稀释液A 100ul，再加入待测样品10ul，轻轻震荡混匀待用；
(2）加样：在抗原包被板上，设标准品孔，每孔加入相应标准品 100ul；留空白对照1孔；其余样品孔，每孔加入样品稀释液B 100ul，再加入预稀释过的样品10ul，轻轻震荡混匀；
(3）温育：加好样品的抗原包被板，用封口胶封盖后置37℃温育30分钟；
(4）洗板：温育后，用洗涤液洗涤5次，每次浸泡30秒，洗完后拍干；
(5）加酶：每孔加入酶标记物100ul，轻轻震荡混匀；
(6）温育：加好酶标记物的抗原包被板，用封口胶封盖后置37℃温育20分钟；
(7）洗板：温育后，用洗涤液洗涤5次，每次浸泡30秒，洗完后拍干；
(8）显色：每孔先加入底物液100 ul，轻轻震荡混匀，用封口胶封盖后置37℃避光显色10分钟；
(9）测量：显色完毕后，每孔加入终止液50 ul，轻轻震荡混匀，10分钟内测定结果；以空白对照孔调零，置酶标仪450nm/630nm（620nm）波长处测定各孔吸光值。
进一步的，所述标准品的浓度为10、5、2.5、1 IU/ml。
本发明提供的试剂盒用破伤风类毒素包被微孔板，待检样品中的破伤风抗体与包被抗原反应，再与酶标鼠抗人IgG抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，加底物（TMB）显色，在酶标仪上测定后根据OD值判定破伤风类毒素抗体的含量，特异性强，提高了灵敏度。
本发明的有益效果为：本发明采用间接法检测破伤风抗体，准确性高，稳定性好，能够清澈判定破伤风抗体的效价，为规范疫苗效力检测提供了依据。
附图说明
图1为破伤风抗体标准曲线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
本发明提供的试剂盒，其中含有的具体内容物及规格如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
本发明所使用的抗原包被板为破伤风类毒素包被微孔板，具体处理过程为：
（1）：添加100mM DTT于破伤风类毒素中，25℃避光处理1小时后添加固体尿素颗粒，至尿素浓度为4M，取处理后的破伤风类毒素于PBS缓冲液中透析4h；
（2）将处理后的破伤风类毒素经离子交换柱及疏水层析柱纯化即可。
实施例1
(1）样品预稀释：在血清稀释板上，每孔加入样品稀释液A 100ul，再加入待测样品10ul，轻轻震荡混匀待用；
所述样品稀释液A含有以下成分：乙二胺四乙酸二钠 1.2g/L、季铵淀粉醚0.3g/L、甘油0.8g/L、海藻糖醇0.2g/L、氯化钠9g/L、硼酸盐缓冲液1.0 g/L、叠氮钠0.3g/L，基础液为生理盐水；
(2）加样：在抗原包被板上，设标准品孔，每孔加入相应标准品 100ul（10、5、2.5、1 IU/ml）；留空白对照1孔；其余样品孔，每孔加入样品稀释液B 100ul，再加入预稀释过的样品10ul，轻轻震荡混匀；
所述样品稀释液B为浓度为7.5g/L的吐温-80及基础液生理盐水
(3）温育：加好样品的抗原包被板，用封口胶封盖后置37℃温育30分钟；
(4）洗板：温育后，用洗涤液洗涤5次，每次浸泡30秒，洗完后拍干；
(5）加酶：每孔加入酶标记物鼠抗人IgG抗体100ul，轻轻震荡混匀；
(6）温育：加好酶标记物的抗原包被板，用封口胶封盖后置37℃温育20分钟；
(7）洗板：温育后，用洗涤液洗涤5次，每次浸泡30秒，洗完后拍干；
所述洗涤液含有以下成分：氯化钠15g/L、碘化钾3g/L、磷酸氢钠0.255g/L，磷酸氢钾0.45g/L。
(8）显色：每孔先加入底物液100 ul，轻轻震荡混匀，用封口胶封盖后置37℃避光显色10分钟；
所述底物液含有以下成分： 4-羧乙基哌嗪乙磺酸35g/L、柠檬酸8g/L、磷酸氢二钠10g/L、TMB 5g/L，基础液为纯化水；
(9）测量：显色完毕后，每孔加入0.8mol/L的终止液50 ul，轻轻震荡混匀，10分钟内测定结果；以空白对照孔调零，置酶标仪450nm/630nm（620nm）波长处测定各孔吸光值。
对比例1
(1）样品预稀释：在血清稀释板上，每孔加入样品稀释液A 100ul，再加入待测样品10ul，轻轻震荡混匀待用；
所述样品稀释液A含有以下成分：乙二胺四乙酸二钠 1.2g/L、季铵淀粉醚0.3g/L、甘油0.8g/L、氯化钠9g/L、硼酸盐缓冲液1.0 g/L、叠氮钠0.3g/L，基础液为生理盐水；
其他步骤同实施例1。
对比例2
(1）样品预稀释：在血清稀释板上，每孔加入样品稀释液A 100ul，再加入待测样品10ul，轻轻震荡混匀待用；
所述样品稀释液A含有以下成分：乙二胺四乙酸二钠 1.2g/L、季铵淀粉醚0.3g/L、海藻糖醇0.2g/L、氯化钠9g/L、硼酸盐缓冲液1.0 g/L、叠氮钠0.3g/L，基础液为生理盐水；
其他步骤同实施例1。
效果实施例1
检定用仪器设备为：酶免分析仪JY047-001；洗板机JY048-001；恒温水浴箱JY046-003。
(1）将标准品（10、5、2.5、1 IU/ml）的抗体效价值与对应的吸光值做曲线，导出线性回归方程，将待测样品吸光值代入方程，计算得到样品的抗体效价值。
以标准品的抗体效价值为自变量（X），以对应的吸光值为因变量（Y），导出线性回归方程为：Y＝0.1091X+0.0936，某一样品在450nm的吸光值A＝0.612时，带入以上方程计算抗体效价值为：（0.612-0.0936）÷0.1091=4.75IU/ml。具体结果如表2。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE003
破伤风抗体标准曲线图如图1所示。本发明提供的检测方法可提供准确检测值的线性范围为1-10IU/ml，待检样品抗体效价高于10 IU/ml时，需增加样品稀释倍数。标准品10IU/ml孔吸光值均值≥0.7；空白对照孔吸光值≤0.10，线性回归系数R≥0.98，实验视为有效。
（2）将本发明提供的试剂盒进行线性范围、重复性、稳定性试验等的检测
其中，内控标准如表3所示。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE005
其中，“B”为空白；“STD”为试剂盒标准品，单位为IU/mL；“CV”为重复性质控品；“P1-P5”为阳性质控品；“N1-N5”为阴性质控品。
线性范围：检测试剂盒标准品线性范围1-10IU/mL，应R≥0.98,经检测，本发明中R=0.999。
重复性检测：用重复性质控品（CV）进行效价检测，要求CV≤15%（n=10）检测结果显示，CV=5.377%，表明该方法重复性良好。
稳定性检测：
将实施例1和对比例1-2，采用实施例和对比例对质控品进行稀释后，将稀释后的质控品置于0℃条件下保存，检测质控品的浓度变化，具体检测结果见表4。
表4
Figure DEST_PATH_IMAGE007
物理外观：液体组分无沉淀或絮状物。
质控品符合率：10份质控品（P1-P5，N1-N5）进行效价检测，符合率为100%。
具体效价检测结果见表5。
表5
Figure DEST_PATH_IMAGE009
采用实施例1提供的方法检测待检样品，检测样品为随机抽取的企业生产的HTIG待检品，并进行稀释，采用TNT法作为对照，分别检测5批样品，具体结果见表6。
表6
Figure DEST_PATH_IMAGE011
效果实施例3
将实施例1和对比例1-2，采用实施例和对比例对质控品进行稀释后，将稀释后的质控品置于0℃条件下保存，检测质控品的浓度变化，具体检测结果见表7。
表7
Figure DEST_PATH_IMAGE013

Claims (8)

1.一种利用间接ELISA法检测破伤风抗体效价的检测方法，其特征在于，所述检测的试剂盒包括：抗原包被板、样品稀释液A、样品稀释液B、酶标记物鼠抗人IgG、底物液、洗涤液、终止液。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述抗原包被板为破伤风类毒素包被微孔板，具体处理过程为：
（1）：添加100mM DTT于破伤风类毒素中，25℃避光处理1小时后添加固体尿素颗粒，至尿素浓度为4M，取处理后的破伤风类毒素于PBS缓冲液中透析4h；
（2）将处理后的破伤风类毒素经离子交换柱及疏水层析柱纯化即可。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样品稀释液A含有以下成分：乙二胺四乙酸二钠 0.5~1.2g/L、季铵淀粉醚0.2~0.5g/L、甘油0.5~1.0g/L、海藻糖醇0.2g/L、氯化钠8.5~10.5g/L、硼酸盐缓冲液 0.8~1.2 g/L、叠氮钠0.3~0.5g/L；所述样品稀释液B为浓度为7.5g/L的吐温-80及生理盐水。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述底物液含有以下成分： 4-羧乙基哌嗪乙磺酸30-35g/L、柠檬酸8-10g/L、磷酸氢二钠8.5-11.0g/L、TMB3-5g/L。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述洗涤液含有以下成分：氯化钠15g/L、碘化钾3g/L、磷酸氢钠0.255g/L，磷酸氢钾0.45g/L。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述终止液为H2SO40.8mol/L。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1）样品预稀释：在血清稀释板上，每孔加入样品稀释液A 100ul，再加入待测样品10ul，轻轻震荡混匀待用；
(2）加样：在抗原包被板上，设标准品孔，每孔加入相应标准品 100ul；留空白对照1孔；其余样品孔，每孔加入样品稀释液B 100ul，再加入预稀释过的样品10ul，轻轻震荡混匀；
(3）温育：加好样品的抗原包被板，用封口胶封盖后置37℃温育30分钟；
(4）洗板：温育后，用洗涤液洗涤5次，每次浸泡30秒，洗完后拍干；
(5）加酶：每孔加入酶标记物100ul，轻轻震荡混匀；
(6）温育：加好酶标记物的抗原包被板，用封口胶封盖后置37℃温育20分钟；
(7）洗板：温育后，用洗涤液洗涤5次，每次浸泡30秒，洗完后拍干；
(8）显色：每孔先加入底物液100 ul，轻轻震荡混匀，用封口胶封盖后置37℃避光显色10分钟；
(9）测量：显色完毕后，每孔加入终止液50 ul，轻轻震荡混匀，10分钟内测定结果；以空白对照孔调零，置酶标仪450nm/630nm（620nm）波长处测定各孔吸光值。
8. 根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述标准品的浓度为10、5、2.5、1IU/ml。
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