CN111239384A - 一种破伤风毒素检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种破伤风毒素检测试剂盒，所述试剂盒包括：链霉亲和素包被的酶联反应板，以生物素标记的第一抗体，以酶标记的第二抗体，显色剂；其中所述第一抗体和第二抗体分别由特异针对破伤风毒素的单克隆抗体杂交瘤细胞株产生。本发明基于甲醛灭活后的破伤风毒素即破伤风类毒素制备得到针对破伤风毒素的特异性单克隆抗体，并在特异性单克隆抗体的基础上开发了破伤风毒素的链霉亲和素‑生物素双抗夹心ELISA定量检测试剂盒，可作为破伤风毒素快速、有效的检测手段。
Description
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，具体涉及一种通过链霉亲和素-生物素双抗夹心ELISA实现破伤风毒素定量检测的检测试剂盒。
背景技术
破伤风又名强直症，俗称锁口风，是破伤风梭菌感染伤口后分泌的一种神经毒素即破伤风毒素所致的一种人畜共患的致死性疾病。
破伤风毒素的毒性仅次于肉毒素，可导致中毒者骨骼肌持续性或阵发性痉挛以及对外界刺激反射兴奋性增高，恐声恐光，致死率可高达20％～50％。
酶联免疫吸附实验(ELISA)是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体在固相表面进行反应的技术。该技术可用于检测大分子抗原或抗体，具有特异性好、快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点，广泛应用于快速诊断检测领域，将链霉亲和素-生物素反应系统与ELISA技术相结合可进一步提高检测的灵敏度。
近年来，全球政治局势仍然存在许多不稳定因素，局部地区战争、恐怖活动以及暴力骚乱频发，我国也面临着许多不稳定因素的威胁。破伤风外毒素由于其高毒性、易获得等特点极易被恐怖分子利用制造生物恐怖，是一种潜在的生物战剂。在特殊时期、复杂环境下，特异灵敏的破伤风外毒素快速检测试剂是提高破伤风外毒素甄别能力必不可少的重要工具。目前市场上仅有检测破伤风毒素抗体的试剂盒，还未有破伤风毒素的检测试剂盒。
发明内容
为了填补市场上尚无破伤风外毒素快速检测试剂盒的空白，本发明基于甲醛灭活后的破伤风毒素即破伤风类毒素制备得到针对破伤风毒素的特异性单克隆抗体，并在特异性单克隆抗体的基础上开发了破伤风毒素的链霉亲和素-生物素双抗夹心ELISA定量检测试剂盒，可作为破伤风毒素快速、有效的检测手段。
本发明的技术方案具体如下：
一种破伤风毒素检测试剂盒，所述试剂盒包括：
链霉亲和素包被的酶联反应板，以生物素标记的第一抗体，以酶标记的第二抗体，显色剂；
其中所述第一抗体和第二抗体分别由特异针对破伤风毒素的单克隆抗体杂交瘤细胞株产生，且一抗体和第二抗体亲和力常数不低于1.7×10-10。在根据本发明的一个实施方案中，所述第一抗体和第二抗体为鼠源单克隆抗体。
在根据本发明的一个实施方案中，所述第一抗体和第二抗体是通过包括下述步骤的方法制备得到的：
1)以破伤风类毒素蛋白(TTP)为抗原免疫第一小鼠；
2)当免疫第一小鼠的血清ELISA效价大于1∶50000时，利用杂交瘤技术制备得到分泌特异性针对破伤风毒素的单克隆抗体杂交瘤细胞株；
3)将所述单克隆抗体杂交瘤细胞株注入第二小鼠腹腔制备单抗腹水；
4)收集单抗腹水后，通过Protein G亲和层析纯化得到单克隆抗体。
在根据本发明的一个实施方案中，所述第一小鼠和第二小鼠均为Balb/C小鼠。
在根据本发明的一个实施方案中，所述第二抗体由辣根过氧化物酶。
在根据本发明的一个实施方案中，所述试剂盒还包括显色剂，所述显色剂选自邻苯二胺(OPD)、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)和ABTS中的一种。TMB在根据本发明的一个实施方案中，所述TMB显色剂由显色液A液和显色液B液组成，其中，显色液A液为TMB溶液(TMB10mg，无水乙醇5ml，加双蒸水至50ml)，显色液B液为过氧化物溶液(0.2M NaHPO425.7ml，0.1M柠檬酸24.3ml，0.75％过氧化氢32ul，加蒸馏水至50ml)。
在根据本发明的一个实施方案中，所述试剂盒中还包括终止液。
在根据本发明的一个实施方案中，所述试剂盒中还包括标准品优选地，所述标准品为5mg破伤风类毒素(TTP)，用3％BSA-PBS溶液将标准品稀释成不同浓度——2560ng/ml、1280ng/ml、640ng/ml、320ng/ml、160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml。
在根据本发明的一个实施方案中，所述试剂盒中还包括样品稀释液和清洗液。
本申请具有如下优点：
为本发明基于甲醛灭活后的破伤风毒素即破伤风类毒素制备得到针对破伤风毒素的特异性单克隆抗体，并在特异性单克隆抗体的基础上开发了破伤风毒素的链霉亲和素-生物素双抗夹心ELISA定量检测试剂盒，可作为破伤风毒素快速、有效的检测手段,本发明的破伤风毒素定量检测试剂盒能够满足国家安全对毒素快速灵敏检测的需求，填补了破伤风外毒素快速检测试剂盒的空白。
附图说明
图1为破伤风类毒素纯化后SDS—PAGE图电泳分析图；其中，M为Maker，箭头所示为纯化后样品，泳道3显示纯度>95％。
图2为单克隆抗体纯化后SDS-PAGE电泳分析图；M为Maker，箭头所示为纯化后样品，泳道3显示纯度>95％。
图3为单克隆抗体与天然破伤风毒素进行western-blot分析图。
图4为ELISA标准曲线和四参数拟合方程。
图5同一批次的破伤风毒素ELISA试剂盒分0，4，6，9，12月检测三个不同浓度破伤风毒素样本的检测结果。
图6五个不同批次的破伤风毒素ELISA试剂盒分0，4，6，9，12月检测三个不同浓度破伤风毒素样本的检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。
下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
如无特别说明，本发明所使用的菌株与各种试剂均可通过合法途径商购获得。
实施例1破伤风类毒素蛋白(TTP)的制备与纯化
将天然破伤风毒素采用甲醛灭活后制备成无毒的破伤风类毒素(购自成都欧琳生物科技股份有限公司)，经Superdex200层析纯化后用SDS-PAGE凝胶蛋白电泳对纯化后的破伤风类毒素进行验证，其结果如图1所示，纯化后破伤风类毒素蛋白的纯度>95％,。
实施例2破伤风毒素单隆抗体的制备
采用实施例1中得到的破伤风类毒素蛋白免疫Balb/C小鼠(购自重庆腾鑫华阜实验动物销售有限公司)，当免疫小鼠血清ELISA效价大于1∶50000时，采用杂交瘤技术获得分泌特异针对破伤风毒素的单克隆抗体杂交瘤细胞株，将细胞株注入小鼠腹腔制备单抗腹水，收集单抗腹水后，采用Protein G亲和层析纯化单克隆抗体；用SDS--PAGE凝胶蛋白电泳对纯化后的单抗进行验证，结果如图2所示，其纯度>95％；将单抗与天然破伤风毒素进行western-blot验证，结果如图3所示，上述制备的单克隆抗体特异性良好。
实施例3破伤风毒素的链霉亲和素-生物素双抗夹心ELISA检测方法的建立和条件优化
1)链霉亲和素(SA)酶标板的制备
将SA稀释至5ug/ml，加入酶标板，100ul/孔，4℃过夜，次日洗板排干后5％脱脂奶粉-PBS 300ul/孔，4℃封闭过夜，次日洗板拍干后密封4℃保存备用。
2)单克隆抗体的辣根过氧化物酶的标记
采用辣根过氧化物酶标记单克隆抗体，辣根过氧化物酶和单克隆抗体混合比例为1:2，采用直接法评价偶联后单克隆抗体-HRP活性，并与间接法评价结果进行对比，不得低于25％。
3)单克隆抗体的生物素标记
采用生物素标记单克隆抗体，生物素和单克隆抗体的混合比例为4:1，标记物透析后测OD280值，确定浓度后按一定比例加入甘油、叠氮钠-20℃保存。
4)单抗-单抗配对筛选
在SA酶标板中，按生物素标记的单克隆抗体(单抗-B)-TTP蛋白-辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体(单抗-HRP)的顺序，对不同的标记抗体配对进行双抗体夹心ELISA检测，比较检测结果，筛选出最好的两株配对标记抗体。
5)单抗-B和单抗-HRP最佳工作浓度的确定
利用棋盘法确定两种单抗最佳工作浓度，当OD值接近1，P/N值最大时为最佳浓度，其最佳抗原捕获单抗-B浓度为2μg/ml，最佳检测单抗-HRP浓度为2μg/ml。
6)ELISA标准曲线的建立
以纯化的破伤风类毒素(TTP)为标准品，用3％BSA-PBS溶液将标准品稀释不同浓度，即2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5ng/ml，采用以上优化好条件的链霉亲和素-生物素双抗夹心ELISA检测方法进行检测，根据检测结果，采用四参数的拟合方式进行线性拟合及计算后绘制标准曲线，标准曲线如图4所示，本发明的试剂盒最低检测限为5ng/ml。
实施例4破伤风毒素的链霉亲和素-生物素双抗夹心ELISA检测试剂盒
根据上述优化过程制备破伤风毒素的链霉亲和素-生物素双抗夹心ELISA检测试剂盒，试剂盒包含以下成分：链霉亲和素包被的酶联反应板、生物素标记的小鼠单克隆抗体、HRP标记的另外一株小鼠单克隆抗体、标准品(TTP)、样品稀释液、清洗液、TMB显色剂A、TMB显色剂B、阳性对照、阴性对照、终止液。
其中，包被缓冲液为0.05mol/L，pH＝9.6的碳酸缓冲液。
洗液：将吐温20与浓度为0.01mol/L，pH7.4的磷酸缓冲液按体积比为1:2000混合配制而成。
封闭液：用1×PBS溶液稀释脱脂奶粉，使其浓度为5％，制得封闭液。
显色液为TMB显色液；终止液为2mol/L的H2SO4溶液。
破伤风毒素的链霉亲和素-生物素双抗夹心ELISA试剂盒检测方法，包括以下步骤：
1)平衡：将所需试剂移到室温(18～25℃)平衡30分钟。
2)配液：
①1×洗液：取1瓶20×洗液，用去离子水稀释至1000ml，混匀后备用。
②稀释液(3％BSA)：将BSA(3g/袋)完全溶解到100ml已配置好的①溶液中，充分混匀备用。
③生物素抗体工作液：计算实验所需工作液体积，取适量生物素抗体用②配制的稀释液100倍稀释，充分混匀备用。
④样品配置：样品使用溶液②配制的稀释液稀释标准品。建议稀释浓度分别为2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5ng/ml。
⑤酶结合物工作液：取所需酶结合物用②配制的稀释液100倍稀释，充分混匀备用。
3)再次包被：将配置好的生物素抗体工作液每孔加入100μl，封板后置37℃温育60分钟。
4)洗涤:弃去各孔内液体，用1×洗液注满微孔(350μl/孔)，静置30秒后弃去孔内液体；重复3次，最后一次洗板完成后在面巾纸上拍干。
5)加样:将包被板从密封袋中取出，将配置好的样品，每孔加入100μl，同时设阴性对照，用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
6)洗涤:同步骤4)。
7)加酶结合物工作液:每孔加酶结合物工作液100μl，用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
8)洗涤:弃去各孔内液体，用1×洗液注满微孔(350μl/孔)，静置30秒后弃去孔内液体；重复3次，最后一次洗板完成后在面巾纸上拍干。
9)显色:每孔分别加底物显色液A 50μl，底物显色液B 50μl，轻微振荡混匀后用封板膜封板置37℃显色10分钟。
10)测定:每孔加终止液50μl，轻微混匀。选择酶标仪波长450nm，测定各孔吸光值(OD值)。
11)结果处理：采用四参数的拟合方式进行线性拟合及计算，并绘制标准曲线。根据标准曲线计算待检样品的浓度。
实施例5试剂盒的特异性鉴定
采用本试剂盒分别对破伤风毒素、肉毒素、志贺毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素同时进行检测，结果显示仅有破伤风毒素样品孔呈阳性(判
断标准：待检样品OD大于阴性对照OD值的2.1)，其余毒素样品检测孔为阴性，说明该试剂盒特异性好。结果如下表：
实施例6试剂盒的重复性、稳定性鉴定
在12个月里，用同一批次的破伤风毒素ELISA检测试剂盒，分别在0月、4月、6月、9月、12月对已知高、中、低三个不同浓度的破伤风毒素样本进行检测(结果见图5)，计算平行结果的变异系数(CV)，结果显示：0月三浓度CV在1％-2.3％，3月三浓度CV在2.7％-3.6.3％，6月三浓度CV在4.6％-8.4％，9月高三浓度CV在3.3％-7.9％，12月三浓度CV在5.9％-9.2％。
在12个月里，用五个不同批次的破伤风毒素ELISA试剂盒，分别在0月、4月、6月、9月、12月对已知高、中、低三个不同浓度的破伤风毒素样本进行检测(结果见图6)，计算平行结果的变异系数(CV),结果显示:0月三浓度CV在2.4％-4.3％，4月三浓度CV在奥3.6％-5.4％，6月三浓度CV在3.1％-4.9％，9月三浓度CV在3.8％-5.8％，12月三浓度CV在7.2％-10.3％。
综上，试剂盒的批内和批间CV值不高于10.3％。说明本发明开发的破伤风毒素ELISA检测试剂盒的重复性、稳定性好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种破伤风毒素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
链霉亲和素包被的酶联反应板，以生物素标记的第一抗体，以酶标记的第二抗体，显色剂；
其中所述第一抗体和第二抗体分别由特异针对破伤风毒素的单克隆抗体杂交瘤细胞株产生，且一抗体和第二抗体的亲和力常数不低于1.7×10-10。
2.如权利要求1所述的破伤风毒素检测试剂盒，其特征在于，所述第一抗体和第二抗体为鼠源单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的破伤风毒素检测试剂盒，其特征在于，所述第一抗体和第二抗体是通过包括下述步骤的方法制备得到的：
1)以破伤风类毒素蛋白(TTP)为抗原免疫第一小鼠；
2)当免疫第一小鼠的血清ELISA效价大于1∶50000时，利用杂交瘤技术制备得到分泌特异性针对破伤风毒素的单克隆抗体杂交瘤细胞株；
3)将所述单克隆抗体杂交瘤细胞株注入第二小鼠腹腔制备单抗腹水；
4)收集单抗腹水后，通过Protein G亲和层析纯化得到单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的破伤风毒素检测试剂盒，其特征在于，所述第一小鼠和第二小鼠均为Balb/C小鼠。
5.如权利要求1-4中任一项所述的破伤风毒素检测试剂盒，其特征在于，所述第二抗体由辣根过氧化物酶。
6.如权利要求5所述的破伤风毒素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括显色剂，所述显色剂选自邻苯二胺(OPD)、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)和ABTS中的一种。
7.如权利要求6所述的破伤风毒素检测试剂盒，其特征在于，所述TMB显色剂由显色液A液和显色液B液组成，其中，显色液A液为TMB溶液，显色液B液为过氧化物溶液。
8.如权利要求1-7中任一项所述的破伤风毒素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括终止液。
9.如权利要求1-8中任一项所述的破伤风毒素检测试剂盒，其特征，所述试剂盒中还包括标准品，优选地，所述标准品为5mg破伤风类毒素干粉，用3％BSA-PBS溶液将标准品稀释成不同浓度——2560ng/ml、1280ng/ml、640ng/ml、320ng/ml、160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml。
10.如权利要求1-8中任一项所述的破伤风毒素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括样品稀释液和清洗液。
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| CN (1) | CN111239384A (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070172904A1 (en) * | 2004-11-24 | 2007-07-26 | Dementieva Ekaterina I | Method for quantitative detection of biological toxins |
| EP1867988A1 (en) * | 2006-06-12 | 2007-12-19 | Centro Biotecnologie Avanzate | Cytokine capture assay in high throughput format for determining antigen-specific T-cell responses |
| CN102206275A (zh) * | 2011-04-27 | 2011-10-05 | 上海生物制品研究所 | 抗破伤风毒素单克隆中和抗体，其组合物及其用途 |
| WO2012007688A1 (fr) * | 2010-07-12 | 2012-01-19 | Lfb Biotechnologies | Anticorps monoclonaux diriges contre la toxine tetanique |
| CN102690789A (zh) * | 2012-04-28 | 2012-09-26 | 中国人民解放军第三军医大学 | 分泌破伤风外毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及由其制备的单克隆抗体、Fab抗体与应用 |
| CN104911151A (zh) * | 2015-05-26 | 2015-09-16 | 云南沃森生物技术股份有限公司 | 一种抗破伤风类毒素的单克隆抗体和杂交瘤细胞株及应用 |
| CN105039262A (zh) * | 2015-07-10 | 2015-11-11 | 北京科兴中维生物技术有限公司 | 破伤风类毒素单克隆抗体及其应用 |
| CN105759055A (zh) * | 2016-03-31 | 2016-07-13 | 广州菲康生物技术有限公司 | P1np检测试剂盒及其制备方法 |
-
2020
- 2020-01-15 CN CN202010044252.XA patent/CN111239384A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070172904A1 (en) * | 2004-11-24 | 2007-07-26 | Dementieva Ekaterina I | Method for quantitative detection of biological toxins |
| EP1867988A1 (en) * | 2006-06-12 | 2007-12-19 | Centro Biotecnologie Avanzate | Cytokine capture assay in high throughput format for determining antigen-specific T-cell responses |
| WO2012007688A1 (fr) * | 2010-07-12 | 2012-01-19 | Lfb Biotechnologies | Anticorps monoclonaux diriges contre la toxine tetanique |
| CN102206275A (zh) * | 2011-04-27 | 2011-10-05 | 上海生物制品研究所 | 抗破伤风毒素单克隆中和抗体，其组合物及其用途 |
| CN102690789A (zh) * | 2012-04-28 | 2012-09-26 | 中国人民解放军第三军医大学 | 分泌破伤风外毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及由其制备的单克隆抗体、Fab抗体与应用 |
| CN104911151A (zh) * | 2015-05-26 | 2015-09-16 | 云南沃森生物技术股份有限公司 | 一种抗破伤风类毒素的单克隆抗体和杂交瘤细胞株及应用 |
| CN105039262A (zh) * | 2015-07-10 | 2015-11-11 | 北京科兴中维生物技术有限公司 | 破伤风类毒素单克隆抗体及其应用 |
| CN105759055A (zh) * | 2016-03-31 | 2016-07-13 | 广州菲康生物技术有限公司 | P1np检测试剂盒及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 胡昌勤，胡新，金少鸿: "酶联免疫吸附法（ELISA）试验中链霉素包被方法的比较", 《中国免疫学杂志》 * |
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