HRP930700A2 - Process for the purification of chymopapain, purified chymopapain and preparations containing the same - Google Patents

Description

Područje tehnike

Izum je iz područja kemije enzima. Oznaka prema Međunarodnoj klasifikaciji patenata je C12N 9/50.

Tehnički problem

Izumom je riješen tehnički problem postupka za pročišćavanje kimopapaina, poboljšanih farmaceutskih preparata koji sadrže ovaj enzim, kao i metoda za tretiranje oštećenih, nagnječenih i na drugi način abnormalnih međupršljenskih diskova injekcijom otopine takvih poboljšanih farmaceutskih preparata.

Stanje tehnike

Kimopapain je cisteinska proteinaza prisutna u lateksu biljke pau-pau (Carica papaya). Nađeno je da ima kliničku primjenu, posebno u tretiranju izmještenih ili nagnječenih pršljenskih diskova, u postupku poznatom kao "kemonukleoliza", Smith, L. (1964), J. Amer. Med. Assoc. 187, 137-140.

Pročišćavanje i karakterizaciju kimopapaina prvi su pokušali Jansen i Balls (1941), J. Biol. Chem., 137, 405-417, koji su koristili kiselo taloženje i postupak isoljavanja da bi dobili enzim. U posljednje vrijeme su korištene metode pročišćavanja zasnovane na ionoizmjenjivačkoj kromatografiji. Tako, na primjer, britanski patent 2098997 (Smith Laboratories Inc.) i Britanski patent 2156821 (Simmons) opisuju korištenje kationoizmjenjivačkih smola za odvajanje kimopapaina od ostalih poznatih cisteinskih proteinaza; oba postupka su korištena za dobivanje kimopapaina u industrijskim razmjerima. Nađeno je, međutim, da dobiveni materijal ima relativno specifičnu aktivnost u odnosu na kimopapain koji su dobili Buttle i Barrett (1984), Biochem, J., 223, 81-88 korištenjem višefaznog postupka u laboratorijskim razmjerima u koji je, između ostalog, uključena i faza kationoizmjenjivačke kromatografije. Iako je ovaj materijal imao vrlo visoku specifičnu aktivnost, dobiven je samo u malom prinosu, a postupak nije pogodan za primjenu u komercijalnim razmjerima. Buttle i suradnici su sada (srpanj 1989.) (Biochem. J. 261, 469- 476) našli da je ovaj materijal kontaminiran nedavno izoliranom proteinazom papaje IV, koja se eluira zajedno s kimopapainom iz kationoizmjenjivačke smole. Kationoizmjenjivačka kromatografija nije u stanju odvojiti kimopapain od proteinaze bitno slobodnog od kontaminacije proteinazom papaje IV.

Literatura također sadrži referencije o metodama koje koriste stupanj afinitetne kromatografije. Polgar (1981), Biochim. Biophys. Acta, 658, 262-269, opisuju pročišćavanje kimopapaina uz korištenje, pored većeg broja drugih tehnika, afinitetne kromatografije na agar-živinom stupcu, a Dubois i suradnici, Biol. Chem. Hoppe-Seyler (1988), 369, 733-740, izvješćuju o odvajanju cisteinskih proteinaza iz lateksa Carica papaya korištenjem slične tehnike. Ovaj tip afinitetne kromatografije zasniva se na interakciji između merkuri liganada vezanih za inertnu matricu i tiolnih skupina proteina koji s njime dolaze u kontakt. Prema tome, proteini različiti od kimopapaina, posebno druge cisteinske proteinaze kao što je proteinaza papaje IV, mogu se vezati za takve stupce i kasnije se eluirati zajedno sa kimopapainom.

Naučni članci su nedavno opisali korištenje afinitetne kromatografije s imobiliziranim peptidnim derivatima za pročišćavanje specifičnih proteinaza kao što je humani katepsin B (Rich i suradnici, 1986, Biochem. J. 235, 713-4) i histolizin iz Entamoeba histolytica (luaces & Barrett, 1988, Biochem J. 250, 903-909). Ovaj prilaz do sada nije primjenjivan na postupke za pročišćavanje kimopapaina i potreba za poboljšanim postupkom za pročišćavanje kimopapaina, pogodna za korištenje u industrijskim razmjerima, još uvijek nije zadovoljena.

Opis rješenja tehničkog problema

Izumitelji su sada pronašli novi postupak za pročišćavanje i izoliranje visoko aktivnog kimopapaina, slobodnog od zagađivača, a posebno od drugih cisteinskih proteinaza koje su prisutne u lateksu papaje, uključujući i proteinazu papaje IV. Sadašnji izum osigurava kimopapain koji je bitno čist i koji sadrži visoku proporciju aktivnog oblika enzima.

Kimopapain u skladu s izumom je bitno slobodan od imunološki različitih proteinaza koje se nalaze u lateksu papaje, konkretno od papaina i proteinaze papaje III (PPIII), koje su opisali Buttle i Barett (1984), Biochem. J., 223, 81-88, a posebno od nedavno otkrivene proteinaze papaje IV (PPIV). "Suštinski čist", kako se koristi u ovom tekstu, označava preciznije "suštinski imunološki čist" i odnosi se na odsustvo bilo kakvih bitnih međureakcija između papaina prema izumu i specifičnih antitijela dobivenih protiv PPIV koja su izolirana i karakterizirana od strane Buttle-a i suradnika, Biochem. J. (srpanj 1989) 261, 469-476 i koja su ukratko opisana u daljnjem tekstu, kao i na odsustvo bilo kakvih bitnih međureakcija sa specifičnim antitijelima dobivenim protiv papaina i PPIII koja su prethodno opisali Buttle i Barett (1984), vidi gore. Treba posebno istaći da je nađeno da tzv. "čist" papain koji su opisali Buttle i Barett sadrži znatne količine (oko 14%) PPIV i prema tome preparat antitijela koji su oni prvobitno dobili ustvari pokazuje specifičnost kako za pročišćeni kimopapain prema izumu, tako i za pročišćenu PPIV. Poželjno je da kimopapain prema izumu sadrži manje od 1 mas. %, još bolje manje od 0.2 mas. % i najbolje manje od 1 mas. % kako PPIV, tako i PPIII i papaina. Monospecifična antitijela dobivena protiv kimopapaina prema izumu predstavljaju sljedeći aspekt izuma.

Međureakcija između antigena i antitijela može biti određena konvencionalnim tehnikama koje su dobro poznate u nauci. Ovakve tehnike uključuju, na primjer, fuzioniranu "rocket" imunoelektroforezu i dvostruku imunodifuziju (koju su opisali Buttle i Barett (1984), vidi gore), pojedinačno radijalno imunoispitivanja, radioimunološko ispitivanje (RIA) i enzimski vezano imunosorpcijsko ispitivanje (ELISA).

Količina aktivnog enzima prisutnog u bilo kojem enzimskom preparatu u načelu se označava preko specifične aktivnosti protiv specifičnog supstrata, pod specifičnim uvjetima ispitivanja. Izraz "specifična aktivnost protiv BAPNA", kako se koristi u ovom tekstu, označava proteinazno djelovanje u pikomolima p-nitroanilina dobivenog u sekundi po miligramu suhe mase proizvoda (pmol/sec/mg) kada se ispitivanje vrši sa sintetičkim supstratom N-alfa-benzoil-DL-arginin p-nitroanilidom (BAPNA) pod standardnim uvjetima. Standardni uvjeti ispitivanja korišteni za poznate farmaceutske preparate kimopapaina detaljno su opisani u daljnjem tekstu kao "BAPNA Metoda ispitivanja Br. 1" ili kao "Smith-ovo ispitivanje", a u njima dobivene specifične aktivnosti označene su kao specifične aktivnosti u odnosu na BAPNA (1 mM) na 37°C i pri pH 6.0. Kimopapain u skladu s izumom je definiran kao proizvod koji ima specifičnu aktivnost u odnosu na BAPNA (1 mM) na 37°C i pri pH 6.0 do najmanje 750 jedinica po miligramu. U načelu, kimopapain prema izumu ima specifičnu aktivnost u odnosu na BAPNA (1 mM) između 800 i 1700 jedinica po miligramu, poželjno između 1000 i 1700 jedinica po mg, na primjer 1200 do 1500 jedinica/mg, uz ispitivanje na 37°C i pri pH 6.0. U poželjnom aspektu izuma, dobiva se kimopapain sa specifičnom aktivnošću u odnosu na BAPNA (1 mM) na 37°C i pH 6.0 od najmanje 1300 jedinica/mg.

Iako je proteinazna aktivnost vrlo široko definirana u bogatoj literaturi koja se bavi kimopapinom i drugim cisteinskim proteinazama, preko oslobađanja p-nitroanilina iz sintetičkog supstrata BAPNA, mogu se javiti problemi kada se učini direktna usporedba između objavljenih vrijednosti specifične aktivnosti. Točne vrijednosti do kojih se dolazi ovise o većem broju faktora, posebno u smislu točnih uvjeta, npr. pH, temperature, sastava pufera i koncentracija supstrata koji su korišteni prilikom ispitivanja. Buttle i Barett (1984), vidi gore, u svom članku navode da je kimopapain koji su dobili imao specifičnu aktivnost u odnosu na BAPNA od 0.154 μmol/min/mg, što je jednako 2567 pmol/sec/mg. Međutim, uvjeti ispitivanja koje su koristili Buttle i Barett razlikovali su se od uvjeta korištenih za poznate farmaceutske čistoće kimopapaina, pa se tako specifične aktivnosti ne mogu direktno usporediti.

S obzirom da se za materijal koji su dobili Buttle i Barett vjerovalo da ima najveću do tada objavljenu specifičnu aktivnost, početni rad koji se odnosi na sadašnji izum vršen je uz korištenje uvjeta ispitivanja koji su navedeni u njihovom članku. Ovdje se ova metoda naziva BAPNA metodom ispitivanja Br. 2, a specifične aktivnosti koje su ovom metodom dobivene izražene su kao specifična aktivnost u odnosu na BAPNA (2.5 mM) na 40°C i pri pH 6.8, kako bi se istaklo da se uvjeti ispitivanja razlikuju od onih korištenih za farmaceutske preparate kimopapaina. Rezultati dobiveni ovom metodom ispitivanja su, kako se pokazalo, bili dva do tri puta veći od rezultata dobivenih korištenjem konvencionalne BAPNA metode ispitivanja Br. 1, iako bi bilo naučno nekorektno primijeniti jednostavan faktor konverzije da bi se rezultati dobiveni jednom metodom usporedili sa rezultatima iz druge. Ipak, počeci rada u vezi sa sadašnjim izumom pokazali su da specifična aktivnost u odnosu na BAPNA (2.5 mM) na 40°C pri pH 6.8, za čisti kimopapain u skladu sa sadašnjim izumom, može se definirati kao najmanje 2500 jedinica/mg, poželjno između 3000 i 4500 jedinica/mg, na primjer 3500 do 4500 jedinica/mg. U poželjnom aspektu, sadašnji izum osigurava kimopapain specifične aktivnosti u odnosu na BAPNA (2.5 mM) na 40°C pri pH 6.8 od najmanje 3000 jedinica/mg.

Izumitelji sadašnjeg izuma su u nedavno objavljenom radu (srpanj 1989, vidi gore), koji je ovdje ukratko opisan, pročistili i izvršili karakterizaciju prije toga nepoznatog zagađivača kimopapaina dobivenog postupcima iz ranije nauke. To je proteinaza papaje IV (PPIV). Dok je PPIV neaktivna u odnosu na BAPNA, posjeduje proteinazno djelovanje u odnosu na azokazein. Osim toga, nađeno je da se aktivnost PPIV u odnosu na azokazein bitno ne inhibira pilećim cistatinom u koncentracijama do 1 μM. Aktivnost kimopapaina iz sadašnjeg izuma u odnosu na azokazein je, s druge strane, pri ovakvim koncentracijama pilećeg cistatina inhibirana barem 95 %. Izraz "aktivnost u odnosu na azokazein" u ovom tekstu označava proteinaznu aktivnost u smislu količine peptida topivih u triklorooctenoj kiselini koji se grade u jedinici vremena po jedinici suhe mase proizvoda kada se ispitivanje vrši s derivatiziranim proteinskim supstratom azokazeinom pod standardnim uvjetima ispitivanja koji će biti opisani u daljnjem tekstu. Poželjno, kimopapain prema izumu ima aktivnost u odnosu na azokazein koja je najmanje 97% u. bliže, 98 do 100% inhibirana pilećim cistatinom u koncentracijama do 1 μM.

Izumitelji vjeruju da kimopapain prema sadašnjem izumu predstavlja bitno čist kimopapain, koji je po prvi puta pripremljen bez proteina-zagađivača i koji sadrži visoku proporciju aktivnog oblika enzima. Ovaj prodor se mogao ostvariti jedino zahvaljujući otkriću da se protein-zagađivač do sada pročišćavao zajedno s kimopapainom, na primjer na ionoizmjenjivačkim i na poznatim afinitetnim stupcima. Daljnji rad vodio je izoliranju i karakterizaciji zagađivača kao PPIV. Postupak korišten za dobivanje PPIV nije se mogao koristiti za dobivanje čistog kimopapaina, ali je dobivanje PPIV ipak dalo dva važna parametra za karakterizaciju kimopapaina, tj. 1) nedostatak međureakcija čistog papaina s antitijelima specifičnim za PPIV, i 2) razlika u aktivnosti čistog kimopapaina i PPIV u odnosu na azokazein u prisustvu pilećeg cistatina. Ove dvije osobine su neophodno oruđe potrebno za razvijanje postupaka pogodnih za pročišćavanje kimopapaina. Lako je primijetiti da će kimopapain prema izumu biti upravo onaj kimopapain koji će se birati za gotovo sva moguća područja primjene. Preparati čistih enzima su od vitalne važnosti za one koji poduzimaju njihovu kompletnu karakterizaciju, na primjer u smislu njihove katalitičke specifičnosti i strukture.

Sljedeći aspekt sadašnjeg izuma je, prema tome, preparat koji se sastoji od kimopapaina prema izumu, pri čemu je ovaj preparat bitno slobodan od PPIV. Poželjno je da kimopapain ima specifičnu aktivnost u odnosu na BAPNA (1 mM) na 37°C pri pH 6.0 od najmanje 750 jedinica/mg. Preparati mogu biti u obliku diskretnih jedinica pogodne mase, na primjer u obliku alikvota kimopapaina zatisnut pod anhidriranim uvjetima kao što su evakuirane fiole ili ampule. Ovakvi preparati mogu dalje sadržavati redukcijsko sredstvo kao što je ditiotreitol ili njegova aditivna sol s bazom ili kiselinom koja ne sadrži cistein, čime se bitno sprečava inaktivacija enzima uslijed oksidacije. Alternativno, preparati mogu dodatno sadržavati reverzibilni inhibitor cisteinskih proteinaza u obliku soli kao što je, na primjer, natrij tetrationat ili merkuri klorid. Ovi reverzibilni inhibitori blokiraju aktivno mjesto enzima, čime se spriječava njegova inaktivacija oksidacijom sve dok se sol ne istisne, na primjer, redukcijskim sredstvom koje reaktivira enzim. Po želji mogu se dodati i drugi konvencionalni aditivi, na primjer konzervansi kao što je natrij bisulfit, sredstva za

helatiranje kao što je EDTA i nosači kao što je natrij klorid.

Korištenje preparata čistog enzima je naročito važno u kliničkim primjenama kimopapaina, na primjer u kemonukleolizi, gdje je objavljeno da se alergijske reakcije na takvo liječenje mogu javiti kod čak 3 % tretiranih pacijenata. U prehrambenoj industriji se široko koristi ekstrakt papaje u prahu, pa se vjeruje da se alergijske reakcije na kemonukleolizu javljaju uslijed prethodne senzitivacije takvim preparatima. Međutim, dobro je poznato da je ubrizgavanje stranih proteinskih antigena sisavcima uvijek povezano s rizikom anafilaktičkog šoka. Korištenje najčistijeg i najaktivnijeg raspoloživog oblika bilo kojeg od takvih proteina, kako bi se postigli optimalni učinci tretmana kao i minimalni rizici alergijskih reakcija, predstavljat će odliku dobre medicinske prakse.

Poželjan aspekt sadašnjeg izuma, prema tome, osigurava farmaceutski preparat koji se sastoji od kimopapaina prema izumu, pri čemu je preparat bitno slobodan od PPIV. Poželjno je da kimopapain ima specifičnu aktivnost u odnosu na BAPNA (1 mM) na 37°C pri pH 6.0 od najmanje 750 jedinica/mg. Farmaceutski preparat dalje poželjno sadrži farmaceutski prihvatljivo, netoksično redukcijsko sredstvo kao što je cisteinska slobodna baza ili njena aditivna sol s kiselinom, na primjer L-cistein klorhidrat monohidrat. Redukcijsko sredstvo je u načelu prisutno u količini od oko 0.5 do 3 mg na 4000 jedinica kimopapaina, što predstavlja, na primjer, od 15 do 90 mas. % u odnosu na kimopapain. Farmaceutski preparat prema izumu može, međutim, sadržavati bilo koji odgovarajući farmaceutski prihvatljiv razblaživač, ekscipijent ili nosač. Na primjer konzervansi kao što je natrij bisulfit, sredstva za helatiranje kao što je EDTA i nosače kao što je natrij klorid mogu se dodati po želji.

Farmaceutski preparati koji sadrže kimopapain prema izumu mogu se koristiti u oftamologiji, na primjer u tretiranju lezija oka ili za čišćenje krasta nastalih nakon, na primjer, opekotina, čireva, nekroza izazvanih pritiskom, rana nastalih dugotrajnim ležanjem i drugih rana kod kojih se javlja devitalizirano tkivo. Ovakvi preparati se u načelu osiguravaju u obliku prikladnom za lokalno davanje, na primjer u obliku sterilnih otopina, želea, suspenzija ili ulja koja se mogu nanositi izravno na ranu ili se primjenjuju preko zavoja za ranu koji je natopljen preparatom.

Poželjno je da se kimopapain prema izumu formulira za ortopedsku primjenu. Ovakvi farmaceutski preparati se pogodno pripremaju u obliku pojedinačnih doza za parenteralno davanje, na primjer u obliku sterilnih apirogenih otopina ili suspenzija u pogodnom nosaču ili u koncentriranom obliku pogodnom za rekonstituiranje prije upotrebe. Jedinični dozni oblici pogodni za korištenje u otapanju ili tretiranju pulpozne jezgre abnormalnog ili oštećenog međupršljenskog diskusa injekcijom koja se u njega ubrizgava, mogu se sastojati od 500 do 5000 BAPNA jedinica (određeno sa 1 mM BAPNA na 37°C pri pH 6.0) kimopapaina prema izumu i redukcijskog sredstva kao što je natrij cisteinat klorhidrat, pakiranih u evakuiranu fiolu. Poželjan jedinični dozni oblik se nominalno sastoji od 2000 ili 4000 BAPNA jedinica (1 mM BAPNA, 37°C, pH 6.0) kimopapaina. Jedinični dozni oblik može se uglavnom sastojati od 2 do 5 mg, poželjno od 2.5 do 3.5 mg kimopapaina i od 0.2 do 3 mg, poželjno od 1.0 do 2.0 mg natrij cisteinat klorhidrata pakiranih u evakuiranoj posudi, po potrebi u smjesi s pogodnim nosačem kao što je natrij klorid.

Eksperimenti koji su opisani u daljnjem tekstu pokazuju da su u 26 pojedinačnih uzoraka seruma nađena prirodno stvorena IgE antitijela protiv komercijalno dostupnog preparata kimopapaina, Chymodiactin-a®, proizvedenog prema postupku iz Britanskog patenta 2098997. Ovdje je eksperimentalno pokazano da ovi serumi sadrže IgE antitijela za kimopapain prema izumu i za tri druge cisteinske proteinaze koje se nalaze u lateksu papaje, tj. papain, PPIII i PPIV. Međutim, korigirani nivoi IgE za kimopapain, PPIII i PPIV pokazuju da su PPIII i PPIV zajedno odgovorni za gotovo 75% detektiranog IgE. Ovi rezultati jasno pokazuju da ovi proteini imaju znatan imunogeni karakter i mogu predstavljati glavnu proporciju antigenih determinanti sadržanih u do sada raspoloživim oblicima kimopapaina, čime su odgovorni za iznenađujuće veliki potencijalni antigenski rizik. Farmaceutski preparati prema sadašnjem izumu, prema tome, imaju veliku prednost u odnosu na preparate iz dosadašnje nauke.

Sadašnji izum se također odnosi na metodu za liječenje oštećenih, izmještenih ili na drugi način abnormalnih međupršljenskih kičmenih diskusa kod sisavaca kemonukleolizom, koja se sastoji u ubrizgavanju u navedeni diskus farmaceutski prihvatljive otopine kimopapaina iz izuma, u količini dovoljnoj da selektivno otopi dijelove tog diskusa.

Izum se dalje odnosi na metodu za tretiranje abnormalnih kičmenih diskusa kod sisavaca, koji se sastoji od:

i) ubacivanje igle u navedeni diskus;

ii) provjere položaja igle pomoću rendgenskih zraka; i

iii) ubrizgavanja u diskus farmaceutski prihvatljive otopine kimopapaina prema izumu, u količini dovoljnoj da selektivno otopi dijelove tog diskusa.

Sadašnji izum također osigurava postupak za pročišćavanje kimopapaina, koji se sastoji u:

a) inkubaciji vodene otopine sirovog kimopapaina s matricom za afinitetnu kromatografiju usmjerenu na aktivno mjesto, pri čemu se matrica sastoji od nosive matrice koja je kovalentno, po potrebi preko lanca za razmak, vezana za N-terminus reverzibilnog peptida za inhibiciju kimopapaina, tako da se navedeni peptid vezuje za aktivno mjesto molekula kimopapaina; i

b) eluiranju kimopapaina s pogodnim eluentom.

Sirovi kimopapain koji se koristi kao polazna materija za pročišćavanje kimopapaina prema izumu može biti ekstrahiran iz svježeg lateksa papaje, otopina dobivena s komercijalno dostupnim lateksom koji je sušen raspršivanjem, koncentratom papaina ili djelomično pročišćenim kimopapainom, ili otopina komercijalnog preparata tzv. "čistog" kimopapaina. Stručnjacima će, međutim, biti jasno da će relativno kompletni ekstrakti papaje, kao što je papajin lateks, sadržavati vrlo značajne količine drugih prirodno prisutnih komponenata koje je poželjno ukloniti. Poželjno je da se znatna proporcija ovakvih komponenata ukloni prije nego što se sirova otopina kimopapaina podvrgne inkubaciji s matricom za afinitetnu kromatografiju, na primjer filtriranjem ili centrifugiranjem, kako bi se odstranio netopivi materijal. Našli smo, međutim, da je posebno pogodan stupanj kiselog taloženja, tijekom

kojeg se taloži značajna količina nečistoća.

Procedure kiselog taloženja, u kojima se pH vodene otopine sirovog kimopapaina snižava čak do pH 2, otopina se ostavlja stajati i zatim se odvaja otopina kimopapaina, koriste se za pročišćavanje kimopapaina gotovo 50 godina. Prijavitelj je, iznenađujuće, sada pokazao da precizna pH korištena u ovakvim procedurama kritično utječe na kontaminaciju rezultirajuće otopine kimopapaina sa PPIV. Nađeno je da pažljivo nadgledanje i kontroliranje ovog postupka, za koji se do sada mislilo da je sirov, preliminarni postupak u pročišćavanju kimopapaina, dramatično smanjuje kontaminaciju sa PPIV, proteinom za koji je sada nađeno da se pročišćava zajedno s kimopapainom kada se koriste konvencionalne tehnike. Prema tome, izum osigurava postupak za pročišćavanje kimopapaina koji se sastoji od:

1. taloženja vodene smjese koja sadrži sirovi kimopapain, pri pH nižoj od 2.0;

2. odvajanja vodene otopine sirovog kimopapaina iz navedene smjese; i

3. neutralizacije i, po potrebi, odsoljavanja navedenog sirovog kimopapaina.

Poželjno je da se eventualni ostaci proteinskih kontaminanata uklone iz preparata uključivanjem barem jednog stupnja konvencionalne kationoizmjenjivačke kromatografije u postupak pročišćavanja, na primjer kao što su opisali Buttle i Barett, 1984, vidi gore. Posebno je poželjno da se koristi visoko-učinkovita kromatografija, na primjer FPLC®, na kationoizmjenjivačkoj smoli kao što su smole koje se nabavljaju pod trgovačkim nazivima Mono-S ili S-Sepharose® HP (Pharmacia). Stupanj ionoizmjenjivačke kromatografije koristi se kao posljednji stupanj.

Posebno poželjan aspekt sadašnjeg izuma osigurava postupak za pročišćavanje kimopapaina koji se sastoj i od:

i) kiselog taloženja vodene smjese koja sadrži sirovi kimopapain, poželjno na pH manjem od 2.0;

ii) odvajanja vodene otopine sirovog kimopapaina od ove smjese;

iii) neutralizacije i, po potrebi, odsoljavanja navedene otopine sirovog kimopapaina;

iv) inkubacije otopine dobivene u stupnju (iii) s matricom za afmitetnu kromatografiju usmjerenu na aktivno mjesto, koja se sastoji od nosive matrice kovalentno, po potrebi preko rastavnog niza, vezane za N-terminus reverzibilnog peptida za inhibiciju kimopapaina, tako da se navedeni peptid vezuje za aktivno mjesto na molekulu kimopapaina; i

v) eluiranja kimopapaina sa pogodnim eluentom.

Stručnjacima će biti jasno da se poželjni stupanj kationoizmjenjivačke kromatografije može alternativno ili dodatno vršiti neposredno prije ili, po želji, neposredno nakon stupnja afinitetne kromatografije.

Vodena smjesa koja sadrži sirovi kimopapain može se sastojati od, na primjer, svježeg lateksa papaje, lateksa papaje sušenog raspršivanjem ili od koncentrata papina (na primjer, lateksa sušenog raspršivanjem koji je komercijalno dostupan od tvrtki Powell & Scholefield, Velika Britanija ili Siebels, SAD) suspendiranih u vodi ili u vodenom puferu kao što je fosfatni ili acetatni pufer. Poželjno je da se netopivi materijal ukloni na konvencionalan način, na primjer filtriranjem ili centrifugiranjem, prije nego što se izvrši kiselo taloženje smjese. Smjesa se može zakiseliti postupnim dodavanjem organske ili neorganske kiseline, poželjno vodene otopine neorganske kiseline kao što je klorovodična kiselina, kako bi se pH smjese snizilo do vrijednosti između 1.0 i 2.0, poželjno od 1.2 do 1.8 i, bliže, do pH oko 1.5. Staloženi materijal može se ukloniti na konvencionalan način, na primjer filtriranjem ili centrifugiranjem. Dobivena kisela otopina sirovog kimopapaina je, kako je pronađeno, oslobođen od prisustva PPIV, papina i, do manje mjere, PPIII.

Prije podvrgavanja kisele otopine sirovog kimopapaina daljnjim strupnjevima kromatografije, stručnjaku će biti jasno da otopinu treba neutralizirati alkalnim reagensom kao što je vodena otopina natrij hidroksida, kao i da treba ukloniti višak soli iz otopine na konvencionalan način, na primjer gel filtriranjem ili dijalizom. Bilo kakav naknadno staloženi materijal može se ukloniti filtriranjem ili centrifugiranjem.

U području cisteinskih proteinaza je dobro poznato da se aktivnost ovih enzima može znatno povećati aktivacijom sa redukcijskim sredstvom kao što je ditiotreitol ili cistein, kao i uklanjanjem tragova teških metala kao što je živa pomoću helatnog reagensa kao što je EDTA ili helatna smola, na primjer smola koja se prodaje pod trgovačkim nazivom Chelex (Bio-Rad, Velika Britanija). Ovakve mjere optimiziraju prisustvo slobodnih tiolnih skupina, za koje se zna da predstavljaju bitnu karakteristiku aktivnih mjesta cisteinskih proteinaza i da su neophodne za aktivnost. Poželjno je da se uklanjanje teških metala izvrši dijalizom preko pufera koji sadrži EDTA. Alternativno, kada se koristi stupanj kationoizmjenjivačke kromatografije, teški metali se mogu ukloniti aktivacijom kimopapaina sa redukcijskim sredstvom, dok je vezan za kationoizmjenjivački stupac. Nakon toga se vrši ispiranje stupca.

Pogodno je da se otopina sirovog kimopapaina, dobivena nakon neutralizacije, tretira sa redukcijskim sredstvom kao što je cistein, čime se osigurava maksimalno eksponiranje aktivnih mjesta, i da se zatim razblaži do pogodnog sadržaja proteina, na primjer 30 mg/ml. Neutralizirana otopina sirovog kimopapaina se zatim podvrgava inkubaciji s matricom za afinitetnu kromatografiju usmjerenu na aktivno mjesto, tako da se kimopapain specifično veže, preko aktivnog mjesta, za inhibitorski peptid koji je vezan s matricom. Otopina kimopapaina može se nanositi na stupac matrice za afinitetnu kromatografiju, na primjer, brzinom od 35-40 ml/sat/cm2. Svaka litra matrice za afinitetnu kromatografiju može se vezati približno 1-4 g kimopapaina.

Matrica za afinitetnu kromatografiju predstavlja nosivu matricu, kao što je gel ili membranska matrica, za koju se kovalentno kuplira i tako imobilizira inhibitorski peptid. Poželjno je da nosiva matrica bude agarni gel, kao što je gel dostupan pod trgovačkim nazivom Sepharose® (Pharmacia), iako se mogu koristiti i derivatizirane matrice od celulozne membrane kao što je ona koja se prodaje pod trgovačkim nazivom Zeta (Anachem). N-terminus peptida može se vezati za nosivu matricu bilo direktno ili indirektno, preko rastavnog niza, na primjer rastavnog niza sa 9 ugljikovih atoma kao što je onaj prisutan u poželjnoj gel-matrici koja se prodaje pod trgovačkim nazivom ECH Sepharose® 4B (Pharmacia). Kupliranje između slobodne akrboksi skupine u ovoj gel matrici i slobodne amino skupine inhibitorskog peptida, što dovodi do oblikovanja peptidne veze, može se izvršiti na konvencionalan način, na primjer kiselo kataliziranom kondenzacijom koja je potpomognuta u vodi topivim karbodiimidom kao što je N-etil-N'-(3- dimetilaminopropil)karbodiimid klorhidrat (EDC). U načelu se kupliranje postiže blagim miješanjem gel matrice i otopine inhibitorskog peptida zajedno, u prisustvu EDC, na primjer na sobnoj temperaturi tijekom 24 sata. Pogodan odnos kupliranja peptida i gel matrice je, na primjer, 3-4 g peptida na svaku litru gela.

Matrica za afinitetnu kromatografiju može se prethodno pakirati u stupce. Međutim, kada korištena matrica za kromatografiju predstavlja gel matricu, moguće je koristiti stupanj inkubacije u partijama, pa se tek nakon toga matrica pakira u stupac i eluira se enzim. Poželjno je da se matrica dobro ispere s vodenom otopinom pufera prije upotrebe, kako bi se uklonili tragovi nevezanog peptida i katalizatora za kondenzaciju. Za korištenje u dobivanju, stupca sa matricom za afinitetnu kromatografiju poželjno se treba podvrći sterilizaciji in situ, na primjer sa vodenom otopinom etanola, što omogućava da se stupac koristi više puta.

Reverzibilni peptidi za inhibiciju kimopapaina predstavljaju peptide koji, kada se imobiliziraju na nosivu matricu, imaju sposobnost vezivanja za aktivno mjesto kimopapaina snažnije nego za aktivna mjesta drugih cisteinskih proteinaza koje se nalaze u preparatima sirovog kimopapaina, posebno PPIV, ali koji se kasnije mogu istisnuti. U poželjnoj skupini inhibitorskih peptida, amino kiselina na C-terminusu predstavlja aldehidni derivat kao što je semikarbazon, metoksiimin ili oksim fenilalanina ili fenilalaninskog analoga. Bliže, C-terminalna amino kiselina može biti derivat fenilalanina kao što je D ili L-fenilalanin semikarbazon (PheSc), metoksiimin (PheMo) ili oksim (PheOx), ili derivat analoga fenilalanina kao što je D ili L-alanin semikarbazon (AlaSc), D ili L-cikloheksilalanin semikarbazon (ChaSc), ili D ili L-leucin semikarbazon (LeuSc). Nađeno je da sljedeći C-terminalni dipeptidi predstavljaju pogodne peptide za inhibiciju kimopapaina: L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-D-PheSc, L-Phe-L-PheSc, L-Phe-L-PhMo, L-Phe-L-PheOx, L-Tyr-LPheSc, L-Ala-L-ChaSc i L-Ala-L-LeuSc.

Dipeptid L-Phe-L-PheSc su opisali Luaces i Barett (1988), 250, 903-909. Posebno poželjni peptidi su dipeptidi, naročito L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc i L-Phe-D-PheSc. Novi inhibitorski peptidi sami po sebi, kao i nove matrice za afinitetnu kromatografiju koje ih sadrže, također predstavljaju jedan od aspekata sadašnjeg izuma.

Prije eluiranja kimopapaina s matrice za afinitetnu kromatografiju, poželjno je da se matrica ispere kako bi se uklonio nespecifično vezan materijal, na primjer vodenim puferom kao što je citratni ili acetatni pufer sa pH od 4 do 5. Nađeno je da posebno pogodnost predstavlja dodavanje reagenasa u pufer za ispiranje i u pufer za eluiranje, čime se smanjuju hidrofobne interakcije i druge nespecifične reakcije vezivanja između matrice i komponenata sirovog kimopapaina. Ovakvi reagensi uključuju, na primjer, EDTA, izopropanol i etandiol.

Kimopapain se zatim može eluirati s matrice pogodnim eluentom. Pogodni eluenti razaraju vezu između imobiliziranog inhibitorskog peptida i za njega vezanog kimopapaina, bilo redukcijom afiniteta aktivnog mjesta za inhibitorski peptid ili selektivnim istiskivanjem peptida sa aktivnog mjesta. Afinitet kimopapaina za inhibitorski peptid se može, na primjer, smanjiti mijenjanjem karakteristika aktivnog mjesta sa sredstvom za denaturiranje kao što je izopropanol, ili sa eluentom čiji pH je iznad ili ispod aktivnog pH opsega kimopapaina. Međutim, stručnjaci će razumjeti da eluent mora biti takav da ne uzrokuje ireverzibilnu inaktivaciju eluiranog enzima. Alternativno, kimopapain se može selektivno istisnuti s imobiliziranog inhibitorskog peptida eluentom koji sadrži višak komoponente koja se čvrsto vezuje za inhibitorski peptid, na primjer neke druge cisteinske proteinaze.

Međutim, u poželjnom aspektu sadašnjeg izuma, eluent se sastoji od reverzibilnog inhibitora cisteinskih proteinaza koji se kompetitivno vezuje za aktivno mjesto kimopapaina i tako ga istiskuje sa imobiliziranog inhibitorskog peptida. Konvencionalni inhibitori uključuju, na primjer, disulfide niske molekulske težine kao što su 2,2'-dipiridildisulfid, hidroksietilsulfld, metil-2-piridilsulfid i natrij tetrationat, kao i merkuri reagense kao što je merkuri klorid, p-kloromerkuribenzoat i mersalil. Stručnjaci će znati da će afinitet između kimopapaina i imobiliziranog inhibitorskog peptida biti različit, ovisno o tome koji konkretan peptid je korišten, koja je pH, koja je ionska jačina i sastav korištenog pufera za eluiranje i kolika je temperatura. Prema tome, varirat će i točna priroda i koncentracija inhibitora proteinaze koji je potreban da bi se eluirao kimopapain. Osim toga, merkuri reagensi se uravnotežavaju sa vezanim kimopapainom brže nego disulfidni reagensi, pa sa ovakvim inhibitorima može se koristiti kontinualno eluiranje. Inhibitori koji se slabo uravnotežavaju sa vezanim kimopapainom mogu zahtijevati inkubaciju matrice sa inhibitorom, na primjer tijekom 1-2 sata ili više, prije nego što se izvrši eluiranje. Sadržaj proteina i proteinazna aktivnost eluiranih frakcija, međutim, mogu se rutinski kontrolirati, a ionska jačina ili priroda eluenta i vrijeme inkubacije matrice sa inhibitorom mogu se varirati, kako bi se kimopapain selektivno istisnuo sa matrice. Eluirane frakcije sa niskim sadržajem proteina ili sa niskim količinama aktivnosti kimopapaina mogu se zatim odbaciti.

Poželjno je da pH eluenta bude dovoljno niska da oslabi interakciju između kimopapaina i inhibitorskog peptida, na primjer pH 4 do 5 i, bliže, 4.5. Pogodni eluenti uključuju, kako je nađeno, hidroksietildisulfid (100 mM) u vodenoj otopini (33%) etandiola koji sadrži natrij citrat (50 mM) i EDTA (1 mM), pH 4.5; dipiridildisulfid (30 mM) u vodenoj otopini (33%) etandiola koji sadrži natrij citrat (50 mM) i EDTA (1 mM), pH 4.5; metilpiridilsulfid ((30 mM) u vodenoj otopini (33%) etandiola) koji sadrži natrij citrat (50 mM) i EDTA (1 mM), pH 4.5; mersalilnu kiselinu ((10 mM) u vodenoj otopini (33%) etandiola) koji sadrži natrij hidroksid (50 mM) i EDTA (25 mM) koji je prilagođen na pH 4.5 dodatkom octene kiseline; i merkuri klorid (10 mM) u vodenoj otopini (33%) etandiola koji sadrži natrij acetat (50 mM), pH 4.5. Merkuri klorid je posebno poželjan reverzibilni inhibitor cisteinskih proteinaza.

Stupanj afinitetne kromatografije u poželjnom postupku prema izumu u znatnoj mjeri povećava specifičnu aktivnost tako pročišćenog kimopapaina mjerenu preko aktivnosti u odnosu na BAPNA ili preko titracije aktivnog mjesta sa E-64 ili jodooctenom kiselinom. Aktivni oblik kimopapaina je poželjno vezan i eluiran, čime se razlikuje od neaktivnih oblika kimopapaina i od nekih drugih cisteinskih proteinaza prisutnih u sirovom preparatu.

Svježe pripremljen kimopapain prema izumu, pročišćen afinitetnom kromatografijom, u načelu sadrži najmanje 70 %, poželjno najmanje 80 % i, bliže, najmanje 90 % aktivnog enzima.

U načelu, pročišćeni kimopapain se izolira iz eluata prije skladištenja ili upotrebe. Poželjno je da se eluirani kimopapain dodatno pročisti, kako bi se iz aktivnih mjesta enzima istisnuo inhibitor cisteinskih proteinaza. Inhibitor se može istisnuti dodavanjem viška redukcijskog sredstva kao što je cistein i, po potrebi, uklanjanjem istisnutog inhibitora korištenjem konvencionalnih tehnika kao što je gel filtriranje ili dijaliza. Alternativno, inhibitor se može ukloniti apsorpcijom na specifičnoj smoli, na primjer disulfidi male molekulske težine mogu se adsorbirati na glutationskom afmitetnom stupcu, a merkuri reagensi na helatnoj smoli. Poželjno je da se inhibitor ukloni aktiviranjem enzima sa redukcijskim sredstvom kao što je cistein, dok je enzim još vezan za kationoizmjenjivački stupac, nakon čega se inhibitor spire sa stupca. Izolirani pročišćeni kimopapain se poželjno liofilizira prije skladištenja, npr. putem sušenja zamrzavanjem.

Kimopapain prema sadašnjem izumu može se dodatno karakterizirati metodama koje su poznate stručnjacima u ovom području. Ove metode uključuju, na primjer, analizu N-terminalnih amino kiselina, titraciju aktivnog mjesta sa E-64 ili jodooctenom kiselinom, kao i određivanje brzine inaktivacije sa ovim sredstvima, natrij dodecil sulfatnu ili višezonsku katodnu elektroforezu s poliakrilamidnim gelom, kao i određivanje aktivnosti u odnosu na različite proteinazne supstrate.

Novi inhibitorski peptidi prema izumu mogu se dobiti na način koji je analogan metodama poznatim u ovom području. Na primjer, dipeptidni derivati mogu se sintetizirati u sljedećoj seriji stupnjeva:

a) C-terminus amino kiseline koja bi trebala graditi C-terminus inhibitorskog peptida (prva amino kiselina) može se zaštiti, na primjer, reakcijom sa O,N-dimetilhidroksilamin klorhidratom u prisustvu izobutilkloroformata i N-metilmorfolina, da bi se dobio dimetilhidroksiamidni derivat. Poželjno je da se N-terminus prve amino kiseline prvo zaštiti sa, na primjer, tercijarnim butoksikarbonilom.

b) Zaštićena prva amino kiselina, na primjer dimetilhidroksiamidni derivat, može zatim reagirati s jakom kiselinom, na primjer sa trifluorooctenom kiselinom, da bi se dobila kvaternerna amonij sol.

c) Kvaternerna amonij sol zaštićene prve amino kiseline može zatim reagirati sa drugim aminokiselinskim derivatom, na primjer sa N-karbobenzoksi derivatom, da bi se dobio dipeptidni derivat.

d) Gore dobiveni dipeptidni derivat može se reducirati s blagim redukcijskim sredstvom, na primjer s diizobutilaluminij hidridom ili sa litij aluminij hidridom, da bi se dobila slobodna aldehidna skupina na C-terminalnom kraju dipeptida.

e) Dobiveni aldehid može se prevesti u derivat, na primjer u semikarbazon reakcijom sa semikarbazidom, u metoksiimin reakcijom sa metoksiamin klorhidratom, ili u oksim reakcijom s hidroksilaminom.

f) Na kraju zaštićeni N-terminus može se deblokirati, na primjer N-karbobenzoksi skupina može se ukloniti katalitičkom redukcijom uz korištenje 10% paladija na uglju.

OPIS ANALITIČKIH METODA

ODREĐIVANJE PROTEINA

Kada god je bilo moguće, koncentracija proteina je određivana pomoću A280 uz korištenje A280,1% = 20.0 za preparate lateksa papaje i A280,1% = 18.3 za pročišćene ili djelomično pročišćene preparate kimopapaina (Robinson, 1975, Biochemistry 14, 3695-3700). Izvjesni reagensi koji sadrže tiole i izvjesni disulfidi imaju tendenciju apsorbiranja na 280 nm. U slučaju njihovog prisustva korišteno je Bio-Rad ispitivanje vezivanja boje (Bio-Rad Laboratories, Velika Britanija) kako bi se odredila koncentracija proteina. Filtrirane otopine lateksa papaje sušenog raspršivanjem (A280,1% = 20.0) korišteni su kao standardi. Ova metoda je manje osjetljiva na interferencije nego metoda A280. Protein u pročišćenim preparatima enzima je procijenjen preko ukupne suhe mase proizvoda.

ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI KIMOPAPAINA

a) Aktivnost u odnosu na BAPNA (Metoda ispitivanja Br 1) - Smith-ov test

Saki uzorak je dodan u "Pufer 1", vodeni natrij fosfatni pufer (0.1 M), pH 6.0 koji sadrži EDTA (1 mM) i cistein klorhidrat monohidrat (10 mM), do ukupne zapremine od 1.0 ml. Ostavljeno je da se enzim (ukoliko je prisutan u preparatu) aktivira tijekom 5 minuta na 37°C prije nego što započne reakcija dodavanjem 4 ml N-alfa-benzoil-DL-arginin- p-nitroanilida (BAPNA) (1.25 mM) kao otopine supstrata, prethodno zagrijanog na 37°C.

Napomena: Otopina supstrata je pripremljena otapanjem 300 mg BAPNA u toplom dimetil sulfoksidu, dodavanjem otopine lagano u 450 ml pufera i koji je prethodno zagrijan na 37°C i zatim dodavanjem još pufera 1 do zapremine od 500 ml. Otopina supstrata je održavana na temperaturi iznad 30°C kako bi se izbjeglo taloženje BAPNA.

Inkubacija na 37°C je nastavljena tijekom 30 minuta i zatim je reakcija zaustavljena dodavanjem 1 ml octene kiseline (4 N). Oslobođeni p-nitroanilin je određen mjerenjem ΔA240. Jedna jedinica aktivnosti odgovara oslobađanju 1 pikomola 4-nitroanilina (ε = 8800 M-1. cm-1) u sekundi pod navedenim uvjetima.

Ovi uvjeti ispitivanja odgovaraju uvjetima danim u Britanskom patentu 2098997 podnesenom u ime Smith Laboratories Inc. i koriste se za ispitivanje farmaceutskih preparata kimopapaina koji se prodaju širom svijeta, na primjer kimopapaina koji se prodaje pod nazivom Chymodiactin od strane The Boots Company PLC, Velika Britanija ili kimopapaina koji se prodaje pod nazivom Disken od strane kompanije Sinpoong iz Južne Koreje. Ove jedinice aktivnosti su međunarodno priznate i obično se nazivaju "jedinice prema Smith-ovom BAPNA ispitivanju".

b) Aktivnost u odnosu na BAPNA (Metoda ispitivanja Br 2)

Svaki uzorak je dodan u vodeni natrij fosfatni pufer (0.10 M), pH 6.8, koji sadrži EDTA (1mM) i bilo ditiotreitol (2 mM) ili cistein (4 mM), do ukupne zapremine od 0.975 ml. Enzim je (ukoliko je prisutan u uzorku) ostavljen da se aktivira tijekom 5 minuta na 40°C prije nego što je reakcija započeta dodatkom 25 μl N-alfa-benzoil -DL-arginin p-nitroanilida (BAPNA) (100 mM) u dimetil sulfoksidu. Inkubacija na 40°C nastavljena je 10 minuta i zatim je reakcija zaustavljena dodatkom 1 ml vodene otopine natrij kloracetata (0.10 M)/natrij acetata (0.20 M) kao pufera, pH 4.3. Oslobođeni 4-nitroanilin je određen mjerenjem ΔA410. Jedna jedinica aktivnosti odgovarala je oslobađanju 1 pikomola 4- nitroanilina (ε = 8800 M-1. cm-1) u sekundi pod navedenim uvjetima.

Uvjeti ispitivanja potpuno odgovaraju uvjetima koje su opisali Buttle i Barett (1984), vidi gore, i korišteni su u prethodnim eksperimentima opisanim u Primjerima 21, 23 i 26.

Apsolutne vrijednosti dobivene za aktivnost kimopapaina uz korištenje BAPNA metoda ispitivanja Br. 1 i Br. 2 se razlikuju, pri čemu su vrijednosti dobivene uz korištenje metode Br. 2 približno dva do tri puta veće nego vrijednosti dobivene korištenjem metode Br. 1 (vidi Primjer 31).

c) Titracija aktivnog mjesta s jodooctenom kiselinom

Titracija aktivnog mjesta kimopapaina s jodooctenom kiselinom vršena je na način koji je analogan titraciji aktivnog mjesta sa E-64 koju su opisali Zucker i suradnici u Biochim. Biophys. Acta 828 (1985), 196-204. Otopina kimopapaina je razblažena u puferu 1 kao što je opisano u odjeljku (a), da bi se dobila otopina koja sadrži 60 μM proteina (ε280 = 4.3284 x 104 M-1cm-1 izračunato iz A280,1% = 18.3, Robinson (1975), vidi gore, i MW = 23656 izračunato iz aminokiselinske sekvencije Jacquet-a i suradnika (svibanj 1989), Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 370, 425-434). Alikvote od po 20 μl otopine kimopapaina su postavljene u titracijske cjevčice i podvrgnute inkubaciji tijekom 5 minuta na 37°C sa 20 μl pufera 1 (40 μl u kontrolnom uzorku). U svaku titracijsku cjevčicu je dodano po 20 μl otopine jodooctene kiseline (koncentracije 10, 20, 30, 40, 50 odnosno 60 μM), pa je smjesa podvrgnuta prethodnoj inkubaciji tijekom 10-20 minuta na 37°C. Reakcija je započeta dodavanjem 4 ml otopine BAPNA supstrata kao što je opisano u (a), prethodno zagrijanog na 37°C. Inkubacija je nastavljena na 37°C i reakcija je zaustavljena nakon 30 minuta kao što je opisano u (a). Oslobođeni 4-nitroanilin je određivan pomoću ΔA410. Molarna koncentracija tako dobivenog aktivnog kimopapaina uspoređena je s molarnom koncentracijom proteina na bazi molarnog ekstincijskog koeficijenta 4.3284 x 104 M-1cm-1 za kimopapain. Količina aktivnog proteina je zatim izražena kao postotak od ukupnog proteina.

d) Aktivnost u odnosu na azokazein

Aktivnost u odnosu na azokazein je određena metodom koju su ranije opisali Rowan i suradnici, (1988), Arch. Biochem. Biophys. 267, 262-270, u kojoj se koristi manje od 1 μM enzima (na bazi molekulske težine od 24000) i, kada je poželjno 1 μM pilećeg cistatina. Sve koncentracije enzima i inhibitora se odnose na koncentracije aktivnih molekula.

IMUNOLOŠKO ISPITIVANJE POJEDINAČNOM RADIJALNOM IMUNODIFUZIJOM

Ispitivanje pojedinačnom radijalnom imunodifuzijom zasnovana su na metodi Mancini-ja i suradnika, 1965, Immunochem. 2, 235-254, na sljedeći način. Agaroza (1 % mas/zapr.) u vodenoj otopini natrij fosfata (10 mM) koja sadrži NaCl (0.14 M), pH 7.3 i koja sadrži preparat mono-specifičnog IgC, sipana je na Gel Bond® (FMC korporacija, Maine, SAD), pa je isječen pravokutni niz udubljenja (r = 1 mm). Referenti i nepoznati uzorci su u slučajnom rasporedu postavljeni među udubljenja, kako bi se na minimum svela pogreška usljed efekta ruba. Nakon nanošenja antitijela u udubljenja, ploče su ostavljene 24 sata kako bi se razvili taložni prstenovi. Zatim su ploče isprane, sušene i bojene. Za dobivanje standardnih krivulja je korišten čist, blago karboksimetilizirani antigen, pa su standardne krivulje nacrtane kao antigen u odnosu na kvadrat promjera prstena. Koristan opseg ispitivanja je bio 25-300 ng antigena po udubljenju.

DOBIVANJE PPIV I ANTITIJELA ZA NJU

a) Pripremanje afinitetnog stupca

Miješanoj smjesi alfa-NH2CH2CH•HCl (20 mmol) i diizopropiletilamina (20 mmol) u dimetilformamidu (20 ml) dodan je butiloksikarbonil-L-Phe-p-nitrofenil ester (10 mmol). Smjesa je miješana na 20°C tijekom 2 sata i zatim je razblažena sa etil acetatom (100 ml), isprana s vodom (2 x), vodenom otopinom trietilamina (5 x), vodom (3 x), vodenom otopinom kalij bisulfata (2 x), vodom (3 x), pa je sušena i uparena. Ostatak je kristaliziran iz etilacetat: cikloheksana, da bi se dobio Boc-L-Phe-NHCH2CN, t.t. 134.5-135°C.

Otopini Boc-L-Phe-NHCH2CN (5 mmol) u diklorometanu (10 ml) dodana je ledeno hladna vodena otopina trifluorooctene kiseline (10 ml). Reakcijska smjesa je podvrgnuta inkubaciji na 20°C tijekom 30 minuta i zatim je otapalo uklonjeno uparavanjem na 40°C. Ostatak je otopljen u kloroformu, uparen, pa je cijela procedura ponovljena još dva puta. Dobivena sirova trifluoroacetatna sol je otopljena u otopini diizopropiletilamina (7.5 mmol) u dimetilformamidu (10 ml) i dodani su Boc-Gly-p-nitrofenil ester (6.25 mmol) i N-hidroksibenzotriazol monohidrat (6.25 mmol). Zatim je dodana povoljna količina diizopropiletilamina, u kapima, da bi se dobio p-nitrofenol (zlatna boja) i smjesa je miješana na sobnoj temperaturi tijekom 2 sata. Dodan je N,N-dietilendiamin (1.5 ml) i 15 minuta nakon njega etil acetat (60 ml), pa je smjesa isprana s vodom, vodenom otopinom trietilamina, vodom, vodenom otopinom kalij bisulfata, vodom, pa je sušena i uparena. Ostatak je pročišćen kromatografijom na stupcu silikagela uz eluiranje s etil aceta:heksanom (20:1), da bi se dobio Boc-Gly-L-Phe-NHCH2CN u obliku pjene.

Boc-Gly-L-Phe-NHCH2CN (30 mg) je otopljen u trifluorooctenoj kiselini: diklorometanu:anizolu (25:65:10, 1 ml), pa je podvrgnut inkubaciji na 0°C tijekom 30 minuta. Smjesa je sušena u rotacijskom uparivaču na 34°C i ostatak je otopljen u metanolu (1.5 ml) i vodenoj otopini NaHCO3 (0.1 M, pH 8.0, 1.5 ml), da bi dao otopinu liganda.

Aktivirana CH-Sepharose®4B (Pharmacia; 3 g suhe mase) hidratizirana je preko noći u vodenoj otopini klorovodične kiseline (1 mM, 75 ml) na 4°C, pa je zatim isprana sa klorovodičnom kiselinom (1 mM, 600 ml) i nakon toga vodenim NaHCO3 (0.1 M, pH 8.0, 300 ml). Gel je suspendiran u vodenoj otopini NaHCO3 (0.1 M, OH 8.0, 30 ml), dodana je gornja otopina liganda i smjesa je blago miješana preko noći na 20°C. Gel je prikupljen na filteru od sinter-stakla, ispran s vodenom otopinom metanola (50 zapr./zapr. %, 180 ml) i zatim s vodom (180 ml), pa je suspendiran u vodenoj otopini etanolamina (0.1 M, 30 ml) koji je prilagođen na pH 9.0 sa klorovodičnom kiselinom. Suspenzija je mućkana 4 sata na 20°C i zatim je gel prikupljen, ispran s vodom (500 ml) i čuvan u puferu "za nanošenje" (natrij fosfat (50 mM); EDTA (1 mM); etandiol (33%), pH 6.8) na 4°C.

b) Pročišćavanje PPIV

Stupac Sepharose®-Ahx-Gly-L-Phe-NHCH2CN (zapremina sloja 4 ml) je isprana s puferom "za eluiranje" (natrij citrat (50 mM); etandiol (33 %), pH 4.5; 12 ml) i zatim puferom "za nanošenje" (vidi gore, 12 ml).

Lateks papaje sušen raspršivanjem (0.5 g) je otopljen u puferu "za nanošenje" (10 ml) i filtriran (filter s porama od 0.22 μm). Koncentracija proteina u filtratu određena je korištenjem Bio-Rad ispitivanja vezivanja boje (Bio-Rad Laboratories, Velika Britanija). U smjesu je dodan ditiotreitol do konačne koncentracije od 2 mM, pa je smjesa podvrgnuta inkubaciji na 0°C tijekom 20 minuta. Na stupcu je naneseno 80 mg proteina iz lateksa (38 ml/sat/cm2) na 20°C, nakon čega je slijedio pufer za nanošenje (8 ml) i poslije njega pufer za eluiranje (8 ml). Zatim je nanesen pufer za eluiranje (4 ml) koji je sadržavao hidroksietildisulfid (50 mM), protok je prekinut i stupac je ostavljen preko noći na 20°C. Eluiranje s puferom za eluiranje koji sadrži hidroksietildisulfid je zatim nastavljeno (10 ml) i prikupljane su eluirane frakcije (po 1 ml). Frakcije koje pokazuju aktivnost u odnosu na BAPNA su prikupljene i direktno nanesene na stupac (kationoizmjenjivačku) Mono S HR 5/5® koja je prethodno uravnotežena s vodenom otopinom natrij acetata/octenom kiselinom (50 mM), pH 5.0 koji je sadržavao EDTA (1 mM), nakon čega je stupac ispran istim puferom (1 ml/minut) sve dok je A280 nm, nije vratila na nulu. Na stupcu je zatim nanošen gradijent (21.5 mM Na+/ml) do 1 M natrij acetata (Buttle i Barett, 1984, vidi gore) i prikupljane su frakcije od po 1 ml. Eluirana su dva glavna proteinska maksimuma, pri čemu je prvi eluiran na oko 0.17 M Na+ i odgovara papainu, a drugi na oko 0.38 M Na+ i odgovara PPIV. Frakcije maksimuma PPIV su prikupljene, dijalizirane preko vodene otopine EDTA (1 mM), liofilizirane i čuvane na -20°C. Čista PPIV nije imala nikakvu aktivnost u odnosu na BAPNA koja bi se mogla detektirati, ali je bila povezana s aktivnošću digeriranja azokazeina koja se nije mogla inhibirati pilećim cistatinom pri koncentraciji od 1 μM.

c) Dobivanje antitijela specifičnih za PPIV

Čisti PPIV antigen je blago karboksimetiliran prije upotrebe, metodom koju je opisao Zucker sa suradnicima, 1985, Biochim. Biophys. Acta, 828, 196-204. Antiserum za PPIV je zatim odgajan kod kunića, intramuskularnom injekcijom 360 μg karboksimetiliranog proteina u Freund-ovom kompletnom ađuvantu, nakon čega je slijedila, nakon dva tjedna, potkožna injekcija 100 μg u nekompletnom ađuvantu. IgG je djelomično pročišćen iz antiseruma amonij sulfatnim frakcioniranjem kao što su opisali Heide i Schwich (1978) u Handbook of Experimental Immunology (Weir, D.M., redaktor) Vol. 1, 7.1-7.11, Blackwell, Oxford, nakon čegaje slijedila dijaliza u vodeni natrij fosfat (10 mM) koji je sadržavao NaCl (0.14 M), pH 7.3.

Preparat IgG speciflčnog za PPIV je korišten za ispitivanje PPIV pojedinačnom radijalnom imunodifuzijom kao što je opisano gore.

Primjeri koji slijede ilustriraju aspekte izuma potpunije, ali ih ne treba smatrati na bilo koji način ograničavajućim za obujam izuma.

Ovdje korištene skraćenice uključuju ABTS, 2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolin sulfonsku kiselinu); Ahx, 6-aminoheksanoil; Ala, alanin; BAPNA, N-alfa-benzoil-DL-arginin-p-nitroanilid; Boc, butiloksikarbonil; CBZ, karbobenzoksi; Cha, cikloheksilalanin; DMF, N,N-dimetilformamid; E-64, L-3-karboksi-2,3-trans-epoksipropionilleucilamido-(4-guanidino)butan; EDC, N-til-N'-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid klorhidrat; EDTA, etilenamintetraoctena kiselina (dinatrijeva sol); Gly, glicin; Leu, leucin; Mo, metoksiimin; OBZ, oksibenzil; Ox, oksim; Phe, fenilalanin; Sc, semikarbazon; THF, tetrahidrofuran; i Tyr, tirozin.

Bio-Rad, Chelex, Chymodiactin, CH-SEpharose 4B, Chymofast, Disken, ECH-Sepharose, Enzfltter, FPLC, Gel Bond, Mono S HR, S-Sepharose HP, Tween, Zeta i Zetaffinity su registrirani trgovački nazivi.

Sve faze su vršene na sobnoj temperaturi ukoliko nije drukčije naznačeno.

Primjer 1 - L-alanil-L-fenilalanil semikarbazon

Stupanj a

A) O,N-Dimetilhidroksilamin•HCl (10.23 g) dodan je uz miješanje suhom N,N-dimetilformamidu (DMF) (100 ml) na sobnoj temperaturi. Tijekom 5 minuta je, uz održavanje temperature ispod 30°C, dodan N-metilmorfolin (10.6 g). Formiran je bijeli talog i smjesa je hlađena na 0°C.

B) N-t-Boc-L-Phe (26.5 g) je otopljen u suhom tetrahidrofuranu (THF) (200 ml) i ohlađen do -10°C. Otopini je tijekom 5 minuta, uz održavanje temperature ispod -10°C, dodan Izobutilkloroformat (14.38 g). Tijekom 10 minuta, uz održavanje temperature na -10°C, dodan je N-metilmorfolin (10.6 g), pa je miješanje nastavljeno još 10 minuta.

C) Suspenzija A je zatim dodana suspenziji B tijekom 15 minuta na -10°C. Smjesa je ostavljena da se zagrije do sobne temperature i zatim je miješana 3 sata. Dobivena smjesa je zatim ohlađena na 0°C i tijekom 5 minuta je dodan 3-dimetilaminopropilamin (10.2 g). Dodani su voda (200 ml) i etil acetat (200 ml), pa je gornji organski sloj odvojen i ispran, jedno za drugim, sa (a) vodom (200 ml), (b) vodenom otopinom KHCO3 (5%, 200 ml), (c) vodenom otopinom HCI (0.5 N, 200 ml), i (d) vodom (3 x 200 ml). Otapalo je uklonjeno pod vakuumom, u rotacijskom uparivaču, pri čemu je temperatura održavana ispod 30°C, da bi se dobio N-t-Boc-L-Phe-O,N-dimetilhidroksamat.

Stupanj b

N-t-Boc-L-Phe-O,N-dimetilhidroksamat (2.9 g) i trifluorooctena kiselina (8 ml) miješani su zajedno na sobnoj temperaturi tijekom 4 sata. Višak trifluorooctene kiseline je zatim uklonjen pod vakuumom, u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C. Ostatku je dodan dietil eter (30 ml) da bi se dobila otopina, a zatim je eter uklonjen pod vakuumom. Etersko tretiranje je ponavljano sve dok se nije javila kristalizacija. Kruta supstancija je prikupljena filtriranjem, isprana eterom i zatim sušena pod vakuumom preko P2O5, da bi se dobila trifluoroacetatna sol L-Phe-O,N-dimetilhidroksamata.

Stupanj c

A) Trifluoroacetatna sol L-Phe-O,N-dimetilhidroksamata (7.15 g) je otopljena u suhom DMF (30 ml), uz miješanje na sobnoj temperaturi. Tijekom 5 minuta je, uz održavanje temperature ispod 30°C, dodan N-metilmorfolin (2.35 g), pa je dobivena smjesa ohlađena do 0°C.

B) CBZ-L-Ala (4.96 g) je otopljen u suhom THF (55 ml), uz miješanje, pa je smjesa ohlađena na -10°C. Dodan je izobutilkloroformat (3.05 g), tijekom 5 minuta na -10°C, zatim N-metilmorfolin (2.35 g) tijekom 10 minuta, pa je reakcijska smjesa miješana na -10°C još 10 minuta.

C) Otopina A je dodana otopini B tijekom 15 minuta na -10°C i zatim je ostavljena da se temperatura smjese popne do sobne i miješanje je nastavljeno još 3 sata. Smjesa je ohlađena na 0°C, tijekom 5 minuta je dodan 3-dimetilaminopropilamin (2.27 g) i miješanje je nastavljeno još 5 minuta. Zatim su dodani voda (50 ml) i etil acetat (50 ml), gornja organska faza je odvojena i isprana, jedno za drugim, (a) vodom (50 ml) i zasićenom vodenom otopinom NaCl (5 ml), (b) vodenom otopinom KHCO3 (5%, 50 ml), (c) vodenom otopinom HCl (0.5 N, 50 ml) i (d) vodom (3 x 50 ml). Otapalo je uklonjeno pod vakuumom, u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C. Dodan je svježi etil acetat (50 ml) i zatim je uklonjen uparavanjem da bi dao CBZ-L-Ala-L-Phe-O,N-dimetilhidroksamat.

Stupanj d

CBZ-L-Ala-L-Phe-O,N-dimetilhidroksamat (27.8 g) je otopljen u suhom THF (280 ml) i ohlađen na -70°C pod atmosferom N2. Pod atmosferom dušika je, tijekom 60 minuta na

-70°C, dodan diizobutilamonij hidrid u THF (1 M, 372 ml), pa je miješanje nastavljeno još 60 minuta na -70°C. Reakcija je prekinuta sipanjem smjese u zasićenu vodenu otopinu NaCl (400 ml) i otopina Rochell-ove soli (600 ml) uz miješanje na 0°C pod atmosferom dušika, pa je smjesa ostavljena da se zagrije do sobne temperature. Dodan je etil acetat (600 ml), smjesa je filtrirana i vodeni sloj je odvojen i ekstrahiran s etil acetatom (200 ml). Kombinirane organske faze su isprane vodom (600 ml)/zasićenom vodenom otopinom NaCl (400 ml) i to tri puta. Otapalo je uklonjeno pod vakuumom, u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C. Ostatak je prekristaliziran iz toluola i kruta supstancija je sušena u vakuumu preko P2O5, da bi dala CBZ-L-Ala-L-Phe aldehid.

Stupanj e

A) CBZ-L-Ala-L-Phe aldehid (3 g) je otopljen u industrijskom metiliranom špiritusu (20 ml). Otopina je zagrijana na 50°C i filtrirana kako bi se uklonile netopive materije.

B) Otopina B je dodana otopini A, pa je dobivena smjesa miješana na 50°C tijekom 2 sata. Dodani su etil acetat (50 ml) i voda (100 ml), vodeni sloj je odvojen i ekstrahiran sa etil acetatom (2 x 20 ml), pa su kombinirane organske faze isprane, jedno za drugim, (a) vodenom otopinom KHCO3 (5 %, 50 ml); (b) vodenom otopinom HCl (0.5 N, 50 ml) i (c) vodom/zasićenom vodenom otopinom NaCl (50 ml/20 ml x 3). Otapalo je uklonjeno pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C, da bi se dobio CBZ-L-Ala-L-PheSc.

Stupanj f

CBZ-L-Ala-L-PheSc (680 mg) je otopljen u metanolu (90 ml) i netopive materije su uklonjene filtriranjem. Uređaj koji sadrži metanolsku otopinu CBZ-L-Ala-L-PheSc je propuhan s dušikom i dodan je katalizator, 10% paladijum na ugljenu (100 mg). Vodik je propuštan u zatvorenom sustavu tijekom 75 minuta. Katalizator je uklonjen filtriranjem, a metanol je uparen u rotacijskom uparivaču pod vakuumom, uz održavanje temperature ispod 30°C. Ostatak je kristalizirao stajanjem, pa je kruta supstancija sušena pod vakuumom preko P2O5 da bi se dobio L-alanil-L-fenilalanil semikarbazon (L-Ala-L-PheSc).

Primjer 2 - L-fenilalanil-L-fenilalanil

Stupnjevi a i b

Trifluoroacetatna sol L-Phe-O,N-dimetilhidroksamata dobivena je u skladu sa stupnjevima a i b iz Primjera 1.

Stupanj c

A) Trifluoroacetatna sol L-Phe-O,N-dimetilhidroksamata (1.932 g) je otopljena u suhom DMF (8 ml) uz miješanje, na sobnoj temperaturi. Tijekom 5 minuta je, uz održavanje temperature ispod 30°C, dodan N-metil-morfolin (0.606 g), pa je dobivena smjesa ohlađena na 0°C.

B) CBZ-L-Phe (1.794 g) je otopljen u suhom THF (15 ml) uz miješanje, pa je smjesa ohlađena na -10°C. Tijekom 5 minuta na -10°C je dodan izobutilkloroformat (0.822 g), zatim je tijekom 10 minuta dodan N-metilmorfolin (0.606 g), pa je reakcijska smjesa miješana na -10°C još 10 minuta.

C) Otopina A je dodana otopini B tijekom 5 minuta na -10°C, pa je temperatura smjese porasla do sobne i miješanje je nastavljeno još 3 sata. Smjesa je ohlađena na 0°C, tijekom 5 minuta je dodan 3-dimetilaminopropilamin (0.612 g) i miješanje je nastavljeno još 5 minuta. Dodani su voda (20 ml) i etil acetat (30 ml), organska faza je odvojena i isprana, jedno za drugim, (a) vodenom otopinom KHCO3 (5%, 20 ml), (b) vodenom otopinom HCI (0.5 N, 20 ml) i (c) vodom (2 x 30 ml). Otapalo je uklonjeno pod vakuumom, u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 35°C, pa je ostatak prekristaliziran iz izopropil alkohola da bi dao CBZ-L-Phe-L-Phe-O,N-dimetilhidroksamat.

Stupanj d

CBZ-L-Phe-L-Phe-O,N-dimetilhidroksamat (4.89 g) je otopljen u suhom THF (40 ML). Suhi balon je napunjen litijum alumij hidridom (0.493 g), pa je pod atmosferom dušika dodan suhi THF (20 ml) i miješan je na sobnoj temperaturi tijekom 10 minuta prije nego je ohlađen na -50°C. Zatim je, tijekom 10 minuta na -50°C, pod atmosferom dušika, dodana otopina hidroksamata u THF i miješanje je nastavljeno još 20 minuta na 0-5°C.

Reakcijska smjesa je ohlađena na -50°C i pod atmosferom dušika je dodana zasićena otopina Rochell-ove soli (60 ml). Ostavljeno je da se smjesa zagrije do sobne temperature, dodana je HCI (konc., 10 ml) da bi se pH vodene faze prilagodilo na 3, pa su netopive materije uklonjene filtriranjem. Dodan je etil acetat (50 ml), pa je organska faza odvojena i isprana, jedno za drugim, (a) vodom (50 ml), (b) vodenom otopinom KHCO3 (5%, 50 ml), (c) vodenom otopinom HCl (0.5 N, 50 ml) i (d) vodom (3 x 50 ml). Etil acetat je zatim uklonjen pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C. Ostatak je ostavljen preko noći, sušen pod vakuumom preko P2O5 i na kraju iz toluola da bi dao CBZ-L-Phe-L-Phe aldehid.

Stupanj e

A) CBZ-L-Phe-L-Phe aldehid (0.645 g) je otopljen u industrijskom metiliranom špiritu (10 ml) na 70°C.

B) Natrij acetat trihidrat (0.224 g) je dodan otopini semikarbazida•HCl (0.183 g) u vodi (3 ml), dodan je industrijski metilirani špiritus (2 ml), pa je smjesa zagrijana na 60°C.

C) Otopina A je dodana otopini B i balon koji je sadržavao A je ispran sa još industrijskog metiliranog špiritusa (3 ml), pa je tekućina od ispiranja dodana smjesi koja je miješana 30 minuta na 60-70°C. Smjesa je ostavljena da se lagano hladi tijekom 1 sata, ostavljena stajati na ledu još 1 sat, pa je na kraju stajala preko noći na 4°C. Kruta supstancija je prikupljena filtriranjem, isprana sa industrijskim metiliranim špiritusom: vodom (4:1, 3 ml) i sušena pod vakuumom preko P2O5 da bi dala CZB-L-Phe-L-PheSc.

Stupanj f

CBZ-L-Phe-L-PheSc (2.1 g) je otopljen u metanolu (315 ml) na 30°C, pa su netopive materije uklonjene filtriranjem. Uređaj koji sadrži metanolsku otopinu semikarbazona je propuhan dušikom, dodan je katalizator, 10% paladijum na ugljenu (0.35 g), pa je vodik propuštan u zatvoreni sustav tijekom 30 minuta. Katalizator je uklonjen filtriranjem i otapalo je uklonjeno pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C. Ostatak je sušen pod vakuumom preko P2O5 da bi dao L-fenilalanil-L-fenilalanil semikarbazon (L-Phe-L-PheSc).

Primjer 3 - L-fenilalanil-L-fenilalanil metoksiimin

Stupnjevi a-d

CBZ-L-Phe-L-Phe aldehid kao što je opisano u Primjeru 2, stupnjevi a-d.

Stupanj e

A) CBZ-L-Phe-L-Phe aldehid (0.645 g) je otopljen u industrijskom metiliranom špiritusu (35 ml) na 60-65°C i filtriran da bi se uklonile netopive materije.

B) Natrij acetat trihidrat (0.224 g) je dodan u otopinu metoksilamina•HCl (0.138 g) u vodi (25 ml) na 60°C.

C) Otopina B je dodana u otopinu A, balon koji je sadržao B je ispran vodom (10 ml) na 60°C, tekućina od ispiranja je kombinirana sa smjesom koja je zagrijavana na 60°C pola sata i zatim ostavljena da se ohladi do sobne temperature tijekom 2 sata. Kruta supstancija je prikupljena filtriranjem, isprana industrijskim metiliranim špiritusom:vodom (1:1, 6 ml) i sušena pod vakuumom preko P2O5 da bi dala CBZ-L-Phe-L-Phe-metoksiimin.

Stupanj f

CBZ-L-Phe-L-Phe-metoksiimin (550 mg) je otopljen u metanolu (300 ml) i netopive materije su uklonjene filtriranjem. Uređaj koji sadrži metanolsku otopinu metoksiimina je propuhan s dušikom, pa je dodan katalizator, 10% paladij na ugljenu (100 mg). Vodik je propuštan u zatisnutu posudu i po potrebi dodavan tijekom 4 1/2 sata. Katalizator je uklonjen filtriranjem, pa je otapalo uklonjeno pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C, da bi se dobio L-fenilalanil-L-fenilalanil-metoksiimin (L-Phe-L-PheMo).

Primjer 4 - L-Fenilalanil-D-fenilalanil semikarbazon

Stupanj a

A) O,N-Dimetilhidrokilamin•HCl (3.891) je suspendiran u suhom DMF (40 ml) na sobnoj temperaturi. Tijekom 5 minuta je, uz održavanje temperature ispod 30°C, dodan N-metilmorfolin (4.032 g), pa je smjesa uz miješanje ohlađena do 0°C.

B) N-t-Boc-D-Phe (10.08 g) je otopljen u THF (80 ml) i ohlađen do -10°C. Tijekom 5 minuta je, uz održavanje temperature na -10°C, dodan izobutilkloroformat (5.47 g). Uz održavanje temperature na -10°C je, tijekom 10 minuta, dodan i N-metilmorfolin (4.032 g), pa je miješanje nastavljeno još 10 minuta.

C) Suspenzija A je dodana suspenziji B tijekom 15 minuta na -10°C, smjesa je ostavljena da se zagrije do sobne temperature i miješana je 3 sata. Zatim je smjesa ohlađena na 0°C, tijekom 5 minuta je dodan 3-dimetilaminopropilamin (3.88 g), pa je miješanje nastavljeno još 5 minuta. Dodani su voda (60 ml) i etil acetat (60 ml), organski sloj je odvojen i ispran, jedno za drugim, (a) vodom (60 ml), (b) vodenom otopinom KHCO3 (5%, 60 ml), (c) vodenom otopinom HCI (0.5 N, 60 ml) i (d) vodom (3 x 60 ml). Otapalo je uklonjeno pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C, da bi se dobio N-t-Boc-D-Phe-O, N-dimetilhidroksamat.

Stupanj b

N-t-Boc-D-Phe-O, N-dimetilhidroksamat (11.3 g) je ohlađen na ledu, dodana je trifluorooctena kiselina (30 ml), pa je smjesa miješana na sobnoj temperaturi tijekom 3 sata. Višak trifluorooctene kiseline je uklonjen pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C, pa je ostatku dodan dietil eter (100 ml) da bi se dobila otopina. Otapalo je uklonjeno pod vakuumom i postupak je ponavljan sve dok se nije javila kristalizacija. Kruta supstancija je prikupljena filtriranjem, isprana dietil eterom i sušena pod vakuumom preko P2O5 da bi dala trifluoroacetatnu sol D-Phe-O,N-dimetilhidroksamata.

Stupanj c

A) Trifluoroacetatna sol D-Phe-O,N-dimetilhidroksamata (10. 1 g) je otopljena u suhom DMF (41 ml) uz miješanje na sobnoj temperaturi. Tijekom 5 minuta je, uz održavanje temperature ispod 30°C, dodan N-metilmorfolin (3.155 g), pa je dobivena smjesa ohlađena na 0°C.

B) CBZ-L-Phe (9.4 g) je otopljen u suhom THF (80 ml) uz miješanje, pa je smjesa ohlađena na -10°C. Tijekom 5 minuta na -10°C je dodan izobutilkloroformat (4.307 g), tijekom 10 minuta je dodan i N-metilmorfolin, pa je smjesa miješana na -10°C tijekom još 10 minuta.

C) Otopina A je dodana otopini B tijekom 15 minuta na -10°C i zatim je ostavljeno da se temperatura smjese popne do sobne i miješanje je nastavljeno još 3 sata. Smjesa je ohlađena na 0°C, tijekom 5 minuta je dodan 3-dimetilaminopropilamin (3.20 g), pa je miješanje nastavljeno još 5 minuta. Zatim su dodani voda (60 ml) i etil acetat (60 ml), organska faza je odvojena i isprana jedno za drugim, (a) vodom (60 ml) i zasićenom vodenom otopinom NaCl (60 ml), (b) vodenom otopinom KHCO3 (5%, 60 ml), (c) vodenom otopinom HCl (0.5 N, 60 ml) i (d) vodom (3 x 60 ml). Otapalo je uklonjeno pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C. Dodan je svjež etil acetat koji je zatim uklonjen uparavanjem. Ostatak je prekristaliziran iz izopropanola da bi dao CBZ-L-Phe-D-Phe-O,N-dimetilhidroksamat.

Stupanj d

Diizobutilaluminij hidrat u diklorometanu (1M, 10 ml) dodan je balon koji je prethodno propuhan s dušikom. Balon je zagrijan do 50°C dok sav diklorometan nije ispario, pa je sustav ponovo propuhan s dušikom. Dodan je suhi THF (10 ml) i smjesa je ohlađena na -70°C. CBZ-L-Phe-D-Phe-O,N-dimetilhidroksamat (0.978 g) je otopljen u suhom THF (10 ml) i dodan je tijekom 10 minuta na -70°C u otopinu diizobutilalumij hidrida, pa je miješanje nastavljeno još 10 minuta na -70°C. Reakcija je zatim prekinuta sipanjem reakcijske smjese u metanol (30 ml) i u zasićenu otopinu Rochell-ove soli (30 ml) na -60°C, pa je ostavljeno da se smjesa zagrije do sobne temperature. Dodani su voda (50 ml) i etil acetat (50 ml), pa je organska faza odvojena i vodena faza je ekstrahirana sa etil acetatom (50 ml). Kombinirane organske faze su isprane vodom (2 x 200 ml) i filtrirane. Organska faza je zatim odvojena i otapalo je uklonjeno pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C. Dodan je svjež etil acetat koji je zatim uklonjen, pa je dobiven CBZ-L-Phe-D-Phe aldehid.

Stupanj e

A) CBZ-L-Phe-D-Phe aldehid (400 mg) je otopljen u industrijskom metiliranom špiritusu (10 ml) na 60°C.

B) Natrij acetat trihidrat (0.298 g) u vodi (3 ml) na 60°C dodan je otopini semikarbazida•HCl (0.244 g) u vodi (3 ml) na 60°C.

C) Otopine A i B su kombinirane i dobivena smjesa je miješana na 60°C tijekom 5 sati prije nego što je ostavljena stajati preko noći na 4°C. Kruta supstancija je prikupljena filtriranjem i sušena pod vakuumom preko P2O5, da bi dala CBZ-L-Phe-D-PheSc.

Stupanj f

CBZ-L-Phe-D-PheSc (600 mg) je otopljen u metanolu (90 ml) i netopive materije su uklonjene filtriranjem. Uređaj koji sadrži metanolsku otopinu semikarbazona je propuhan s dušikom, pa je dodan katalizator, 10% paladij na ugljenu (100 mg). Vodik je uvođen u zatvorenu posudu oko 2 sata. Katalizator je uklonjen filtriranjem, a metanol je uparen u rotacijskom uparivaču pod vakuumom, uz održavanje temperature ispod 30°C, da bi se dobio L-fenilalanil-D-fenilalanil semikarbazon (L-Phe-D-PheSc).

Primjer 5 - L-fenilalanil-L-fenilalanil oksim

Stupnjevi a-d

CBZ-L-Phe-L-Phe aldehid je dobiven kao što je opisano u Primjeru 2, stupnjevi a-d.

Stupanj e

A) CBZ-L-Phe-L-Phe aldehid koji je dobiven kao što je opisano gore (0.645 g) otopljen je u industrijskom metiliranom špiritusu (35 ml) na 60-65°C i otopina je filtrirana da bi se uklonile netopive materije.

B) Natrij acetat trihidrat (0.224 g) je dodan otopini hidroksilamina•HCl (0.114 g) u vodi (25 ml) na 60°C.

C) Otopina B je dodana otopini A, pa je balon koji je sadržao B ispran vodom (10 ml) i tekućina od ispiranja je dodana smjesi koja je nakon toga miješana na 60-65°C tijekom 3/4 sata i zatim hlađena 2-3 sata na 4°C. Kruta supstancija je odfiltrirana, isprana sa industrijskim metiliranim špiritusom/vodom (1:1, 5 ml) i sušena pod vakuumom preko P2O5 da bi dala CBZ-L-Phe-L-PheOx kao smjesu syn- i anti-izomera.

Stupanj f

CBZ-L-Phe-L-PheOx (500 mg) je otopljen u metanolu (130 ml) i netopive materije su uklonjene filtriranjem. Uređaj koji sadrži metanolsku otopinu oksima je propuhan s dušikom i dodan je katalizator, 10% paladij na ugljenu (83 g). Zatim je u zatisnutu posudu tijekom 30 minuta uvođen vodik. Katalizator je uklonjen filtriranjem i otapalo je uklonjeno pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C. Preostalo otapalo je uklonjeno pod visokim vakuumom, uz korištenje crpke, a ostatak je sušen pod vakuumom preko P2O5 da bi dao L-fenilalanil-L-fenilalanil oksim (L-Phe-L-PheOx).

Primjer 6 - L-alanil-D-fenilalanil semikarbazon

Stupnjevi a i b

Trifluoroacetatna sol D-Phe-O,N-dimetilkidroksamata je dobivena prema stupnjevima a i b iz Primjera 4.

Stupanj c

A) Trifluoroacetatna sol D-Phe-O,N-dimetilhidroksamata (5000 g) otopljena je u suhom THF (20 ml). Lagano je, uz održavanje temperature ispod 30°C, dodan N-metilmorfolin (1.578 g), pa je dobivena smjesa ohlađena do 0°C.

B) CBZ-L-Ala (3.463 g) je otopljen u suhom THF (40 ml) uz miješanje, pa je smjesa ohlađena na -10°C. Tijekom 5 minuta je dodan izobutilkloroformat (2.158 g), a tijekom 10 minuta N-metilmorfolin (1.578 g), oba na -10°C, pa je smjesa na ovoj temperaturi miješana još 10 minuta.

C) Obje otopine, A i B, pomiješane su na -10°C tijekom 10 minuta, a zatim je ostavljeno da se temperatura smjese podigne do sobne i miješanje je nastavljeno još 3 sata. Smjesa je ohlađena na 0°C, dodan je 3-dimetilaminopropilamin (1.585 g), pa je reakcija prekinuta dodatkom vode (50 ml). Dodan je etil acetat (50 ml), organska faza je odvojena, a vodeni sloj je ekstrahiran etil acetatom (2 x 30 ml). Organski slojevi su kombinirani i isprani, jedno za drugim, sa (a) vodom (50 ml) i zasićenom otopinom NaCl (10 ml), (b) vodenom otopinom KHCO3 (5 %, 50 ml), (c) vodenom otopinom HCl (0.5 N, 50 ml) i (d) vodom (3 x 50 ml). Otapalo je uklonjeno pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C. Kruta supstancija je prekristalizirana iz etil acetata, da bi dala CBZ-L-ala-D-PheO, N-dimetilhidroksamat.

Stupanj d

CBZ-L-Ala-D-Phe-O,N-dimetilhidroksamat (2.9 g) je otopljen u suhom THF (25 ml). Otopina je ohlađena na -70°C pod atmosferom dušika. Tijekom 10 minuta je, na -70°C, dodan diizobutilaluminij hidrid u THF (1 M, 37 ml), pa je miješanje nastavljeno još 10 minuta.

Reakcija je prekinuta sipanjem smjese u zasićenu otopinu Rochell-ove soli (125 ml) i THF (125 ml) uz miješanje na -30°C uz propuhavanje dušika, pa je smjesa ostavljena da se zagrije do sobne temperature. Dodanje etil acetat (100 ml), pa je organska faza odvojena. Vodeni sloj je ekstrahiran etil acetatom (2 x 30 ml), pa su organski slojevi spojeni i isprani vodom (3 x 100 ml). Reakcijska smjesa je filtrirana i otapalo je uklonjeno pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C. Dodan je svježi etil acetat koji je zatim uklonjen da bi se dobio CBZ-L-Ala-D-Phe aldehid.

Stupanj e

A) CBZ-L-Ala-D-Phe aldehid (1.2 g) je otopljen u THF (20 ml) u industrijskom metiliranom špiritusu (20 ml), pa je zagrijan na 50°C.

B) Vruća otopina semikarbazida•HCl (1.8 g) u vodi (15 ml) dodana je vruća otopina KHCO3 (1.5 g) u vodi (15 ml).

C) Otopina B je dodana otopini A, pa je dobivena smjesa miješana 4 sata na 50°C. Otapalo je uklonjeno pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C. Dodana je voda (50 ml), kruta supstancija je prikupljena filtriranjem, isprana s vodom:industrijskim metiliranim špiritusom (1:1) i vakuumski sušena preko P2O5 da bi dala CBZ-L-Ala-D-PheSc.

Stupanj f

CBZ-L-Ala-D-PheSc (750 mg) je otopljen u metanolu (50 ml) i netopive materije su uklonjene filtriranjem. Uređaj koji sadrži metanolsku otopinu je propuhan s dušikom pa je dodan katalizator, 10% paladij na ugljenu (100 mg). U zatvoreni sustav je tijekom 90 minuta uvođen vodik. Katalizator je uklonjen filtriranjem, a otapalo je uklonjeno pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C. Ostatak je sušen pod vakuumom preko P2O5 da bi dao L-alanil-D-fenilalanil semikarbazon (L-Ala-D-PheSc).

Primjer 7 - L-tirozinil-L-fenilalanil semikarbazon

Stupnjevi a i b

Trifluoroacetatna sol L-Phe-O,N-dimetilhidroksamata je dobivena prema stupnjevima a i b iz Primjera 4.

Stupanj c

A) Trifluoroacetatna sol L-Phe-O,N-dimetilhidroksamata (7.95 g) otopljena je u suhom DMF (30 ml) uz miješanje na sobnoj temperaturi. Tijekom 5 minuta je, uz održavanje temperature ispod 30°C, dodan N-metilmorfolin (2.49 g), pa je smjesa ohlađena na 0°C.

B) CBZ-OBZ-Tyr (10 g) je otopljen u suhom DMF (60 ml) uz miješanje, pa je smjesa ohlađena na -10°C. Tijekom 10 minuta je dodan N-dimetilmorfolin (2.49 g), pa je reakcijska smjesa miješana na -10°C još 10 minuta.

C) Otopina A je dodana otopini B tijekom 15 minuta na -10°C, pa je ostavljeno da temperatura smjese poraste do sobne i miješanje je nastavljeno još 3 sata. Smjesa je ohlađena na 0°C i tijekom 5 minuta je dodan 3-dimetilaminopropilamin (2.52 g). Dodani su voda (50 ml) i etil acetat (50 ml), gornja organska faza je odvojena i isprana, jedno za drugim, sa (a) vodom (50 ml), (b) vodenom otopinom KHCO3 (5%, 50 ml), (c) vodenom otopinom HCl (0.5 N, 50 ml) i (d) vodom (3 x 50 ml). Otapalo je uklonjeno pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C, pa je ostatak prekristaliziran iz izopropil alkohola da bi dao CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe-O,N-dimetilhidroksamat.

Stupanj d

CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe-O,N-dimetilhidroksamat (1.012 g) je otopljen u suhom THF (10 ml). Pod atmosferom dušika je, tijekom 10 minuta na -70°C, dodan diizobutilaluminij hidrid u RHF (1 M, 8.5 ml), pa je miješanje nastavljeno još 10 minuta.

Reakcija je prekinuta sipanjem smjese u metanol (20 ml) i otopina Rochell-ove soli (30 ml) uz miješanje na -60°C pod atmosferom dušika, pa je smjesa ostavljena da se zagrije do sobne temperature. Dodani su voda (50 ml) i etil acetat (50 ml), pa je organska faza odvojena i isprana vodom (200 ml). Reakcijska smjesa je filtrirana i otapalo je upareno pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C. Zatim je dodan svježi etil acetat koji je nakon toga uklonjen u rotacijskom uparivaču. Dobivena kruta supstancija je sušena pod vakuumom preko P2O5, da bi dala CBZ-OBZ-L-Tyr-L--Phe aldehid.

Stupanj e

A) CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe aldehid (400 mg) je otopljen u industrijskom metiliranom špiritusu (20 ml) i THF (10 ml), pa je zagrijan na 60°C.

B) Vruća otopina semikarbazida•HCL (600 mg) u vodi (5 ml) dodana je vrućoj otopini KHCO3 (500 mg) u vodi (5 ml).

C) Otopina B je dodana otopini A i dobivena smjesa je miješana 2 sata na 60°C. Otapalo je uklonjeno pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C i ostatak je ugašen s vodom. Kruta supstancija je prikupljena filtriranjem, isprana vodom i industrijskim metiliranim špiritusom, pa je vakuumski sušena preko P2O5 da bi dala CBZ-OBZ-L-Tyr-L-PheSc.

Stupanj f

CBZ-OBZ-L-Tyr-L-PheSc (770 mg) je otopljen u suhom THF (70 ml), filtriran, pa je zatim filtratu dodan metanol (20 ml). Uređaj koji sadrži otopinu semikarbazona je propuhan s dušikom i dodan je katalizator, 10% paladij na ugljenu (100 mg). Vodik je uvođen u zatvoreni sustav tijekom nekoliko sati. Katalizator je uklonjen filtriranjem a otapalo je uklonjeno uparavanjem, da bi se dobio L-tirozinil-L-fenilalanil semikarbazon (L-Tyr-LPheSc).

Primjer 8 - L-alanil-L-cikloheksilalanil semikarbazon

Stupanj a

A) O,N-Dimetilhidroksilamin•HCl (8.51 g) je dodan uz miješanje suhom DMF (75 ml), pa je tijekom 5 minuta, uz održavanje temperature ispod 30°C, dodan N-metilmorfolin (8.8 g). Oblikovao se bijeli talog, a smjesa je ohlađena na 0°C.

B) N-t-Boc-L-Cha (22.5 g) je otopljen u suhom THF (200 ml) i ohlađen na -10°C. Tijekom 5 minuta je, uz održavanje temperature na -10°C, dodan izobutilkloroformat (11.94 g). Tijekom 10 minuta je, također uz održavanje temperature na -10°C, dodan N-metilmorfolin (8.8 g), pa je miješanje nastavljeno još 10 minuta.

C) Suspenzija A je dodana suspenziji B tijekom 15 minuta na -10°C, pa je smjesa ostavljena da se zagrije do sobne temperature na kojoj je miješana 4 sata. Smjesa je ohlađena na 0°C i tijekom 5 minuta je dodan 3-dimetilaminopropilamin (8.6 g), nakon čega je miješanje nastavljeno još 5 minuta. Dodani su voda (200 ml) i etil acetat (100 ml), pa je vodeni sloj odvojen i ekstrahiran sa etil acetatom (2 x 100 ml). Kombinirane organske faze su isprane, jedno za drugim, sa (a) vodom (100 ml) i zasićenom otopinom NaCl (20 ml), (b) vodenom otopinom KHCO3 (5%, 100 ml). Otapalo je uklonjeno pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C, da bi dao N-t-Boc-L-Cha-O, N-dimetilhidroksamat.

Stupanj b

N-t-Boc-L-Cha-O,N-dimetilhidroksamat (26 g) i trifluorooctena kiselina (65 ml) su miješani na 0°C tijekom 5 minuta i zatim je ostavljeno da se temperatura smjese podigne do sobne i miješanje je nastavljeno još 3 sata. Višak trifluorooctene kiseline je zatim uklonjen pod vakuumom u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C. Ostatku je dodan dietil eter da bi se dobila otopina, nakon čega je eter uklonjen pod vakuumom. Etersko tretiranje je ponavljano sve dok nije dobiveno žuto ulje trifluoroacetatne soli L-Cha-O,N-dimetilhidroksamata.

Stupanj c

A) Trifluoroacetatna sol L-Che-O,N-dimetilhidroksamata (17 g) je otopljena u suhom THF (50 ml). Tijekom 5 minuta je, uz održavanje temperature ispod 30°C, dodan N-metilmorfolin (3.95 g), pa je smjesa zatim ohlađena na 0°C.

B) CBZ-L-Ala (9.25 g) je otopljen u suhom THF (100 ml) uz miješanje pa je smjesa ohlađena na -10°C. Tijekom 5 minuta na -10°C je dodan izobutilkloroformat (5.35 g), N-metilmorfolin (3.95 g) tijekom 10 minuta, pa je reakcijska smjesa miješana na -10°C tijekom još 10 minuta.

C) Otopina A je dodana otopini B tijekom 15 minuta na -10°C i zatim je ostavljeno da se temperatura smjese popne do sobne, na kojoj je miješanje nastavljeno tijekom 3 sata. Smjesa je ohlađena na 0°C, tijekom 5 minuta je dodan 3-dimetilaminopropilamin (3.98 g), pa je miješanje nastavljeno još 5 minuta. Dodani su voda (150 ml) i etil acetat (2 x 75 ml). Kombinirane organske faze su isprane, jedno za drugim, s (a) vodom (125 ml), (b) vodenom otopinom KHCO3 (5%, 125 ml), (c) vodenom otopinom HCI (0.5 N, 125 ml) i (d) vodom (3 x 125 ml). Otapalo je uklonjeno u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C. Dodan je svježi etil acetat koji je uklonjen uparavanjem, da bi se dobio CBZ-L-Ala-LCha-O,N-dimetilhidroksamat.

Stupanj d

CBZ-L-Ala-L-Cha-O,N-dimetilhidroksamat (7.22 g) je otopljen u suhom THF (160 ml) i ohlađen na -70°C pod atmosferom dušika. Pod dušikom je, tijekom 20 minuta na -70°C, dodan diizopropilamonij hidrid u THF (1 M, 86 ml), pa je miješanje nastavljeno još 20 minuta.

Reakcija je prekinuta sipanjem u otopinu Rochell-ove soli (400 ml), uz miješanje na 0°C pod atmosferom dušika, pa je smjesa ostavljena da se zagrije do sobne temperature. Zatim je dodan etil acetat (150 ml) i smjesa je miješana 5 minuta. Reakcijska smjesa je filtrirana, organski sloj je odvojen i vodena faza je ekstrahirana etil acetatom (2 x 50 ml). Kombinirane organske faze su isprane vodom (3 x 200 ml), pri čemu se u završna ispiranja dodaje zasićena vodena otopina natrij klorida (3 x 200 ml). Otapalo je uklonjeno u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C, da bi se dobilo ulje CBZ-L-Ala-L-Cha aldehida.

Stupanj e

A) CBZ-L-Ala-L-Cha aldehid (8 g) je otopljen u industrijskom metiliranom špiritusu (50 ml) i zagrijan do 50°C.

B) Vruća otopina semikarbazida•HCl (3.0 g) u vodi (25 ml) dodan je vrućoj otopini KHCO3 (2.67 g) u vodi (25 ml).

C) Otopina B je dodana otopini A i dobivena smjesa je miješana 3 sata na 50°C. Smjesa je ostavljena da se ohladi i stajala je preko noći na 4°C. Najveći dio industrijskog metiliranog špiritusa je uklonjen u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C, pa je ostatku dodan etil acetat (50 ml). Organska faza je odvojena i isprana, jedno za drugim, (a) vodom (30 ml), (b) vodenom otopinom KHCO3 (5 %, 30 ml), (c) vodenom otopinom HCl (0.5 N, 30 ml) i (d) vodom (2 x 50 ml), pri čemu je zasićena otopina NaCl dodavana po potrebi, da bi olakšala odvajanje. Otapalo je uklonjeno u rotacijskom uparivaču uz održavanje temperature ispod 30°C, pa je kruta supstancija prekristalizirana iz izopropanola i etera da bi dala CBZ-L-Ala-L-ChaSc.

Stupanj f

CBZ-L-Ala-L-ChaSc (900 mg) je otopljen u metanolu (30 ml) i dodan je katalizator, 10% paladij na ugljenu (100 mg), pod atmosferom dušika. U zatvoreni sustav je tijekom 6 sati uvođen vodik i zatim je katalizator uklonjen filtriranjem. Otapalo je uklonjeno u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C, kruta supstancija je isprana eterom i sušena pod vakuumom preko P2O5, da bi dala L-alanil-L-cikloheksilalanil semikarbazon (LAla-L-ChaSc).

Primjer 9 - L-alanil-L-leucinil semikarbazon

Stupanj a

A) O,N-dimetilhidroksilamin•HCl (9.17 g) dodanje uz miješanje suhom DMF (110 ml) na sobnoj temperaturi. Tijekom 5 minuta je, uz održavanje temperature ispod 30°C, dodan N-metilmorfolin (9.51 g). Oblikovan je talog i smjesa je ohlađena do 0°C.

B) N-t-Boc-L-Leu (23.3 g) je otopljen u suhom THF (220 ml) i ohlađen do -10°C. Tijekom 5 minuta je, uz održavanje temperature na -10°C, dodan izobutilkloroformat (12.90 g). Zatim je tijekom 10 minuta, uz održavanje temperature na -10°C, dodan N-metilmorfolin (9.51 g), pa je miješanje nastavljeno još 10 minuta.

C) Suspenzija A je dodana suspenziji B tijekom 15 minuta na -10°C. Smjesa je ostavljena da se zagrije do sobne temperature i miješana je 3 sata. Smjesa je zatim ohlađena na 0°C, tijekom 5 minuta je dodan 3-dimetilaminopropilamin (9.13 g), pa je miješanje nastavljeno još 5 minuta. Dodani su etil acetat (110 ml) i voda (110 ml), pa je organski sloj odvojen i ispran, jedno za drugim, sa (a) vodom (2 x 100 ml), (b) vodenom otopinom KHCO3 (5%, 100 ml), (c) vodenom otopinom HCl (0.5 N, 100 ml) i (d) vodom (3 x 100 ml). Otapalo je upareno u rotacijskom uparivaču, pri čemu je temperatura održavana ispod 30°C, da bi se dobio N-t-Boc-L-Leu-O,N-dimetilhidroksamat.

Stupanj b

N-t-Boc-L-Leu-O,N-dimetilhidroksamat (23.4 g) i trifluorooctena kiselina (165 ml, ohlađena na 0°C) miješani su zajedno na sobnoj temperaturi tijekom 18 sati. Višak trifluorooctene kiseline je zatim uklonjen u rotacijskom uparivaču, pri čemu je temperatura održavana ispod 30°C. Ostatku je dodan dietil eter da bi se oblikovala otopina, a onda je eter uklonjen pod vakuumom. Ovo je ponavljano sve dok se nije javila kristalizacija na 4°C, da bi se dobila trifluoroacetatna sol L-Leu-O,N-dimetilhidroksamata.

Stupanj c

A) Trifluoroacetatna sol L-Leu-O,N-dimetilhidroksamata (1.8 g) je otopljena u suhom THF (10 ml), uz miješanje na sobnoj temperaturi. Smjesa je ohlađena na 0°C i tijekom 5 minuta je dodan N-metilmorfolin (0.635 g).

B) CBZ-L-Ala (1.40 g) je otopljen u suhom THF (20 ml) i ohlađen na -10°C. Tijekom 5 minuta je, na -10°C, dodan izobutilkloroformat (0.869 g), zatim je tijekom 10 minuta dodan N-metilmorfolin (0.635 g), pa je reakcijska smjesa miješana na -10°C tijekom daljnjih 10 minuta.

C) Otopina A je dodana otopini B tijekom 15 minuta na -10°C i zatim je temperatura smjese podignuta do sobne i miješanje je nastavljeno 18 sati. Smjesa je ohlađena na 0°C, dodan je 3-dimetilaminopropilamin (0.64 g), pa je reakcija prekinuta vodom (25 ml) i etil acetatom (25 ml). Vodena faza je odvojena i ekstrahirana sa etil acetatom (2 x 25 ml). Kombinirane organske faze su isprane, jedno za drugim, (a) vodom (50 ml) i zasićenom otopinom NaCl (da bi se potpomoglo odvajanje), (b) vodenom otopinom KHCO3 (5%, 30 ml). Otapalo je uklonjeno u rotacijskom uparivaču uz održavanje temperature ispod 30°C, pa je kruta supstancija sušena pod vakuumom preko P2O5 da bi se dobio CBZ-L-Ala-L-Leu-O, N-dimetilhidroksamat.

Stupanj d

CBZ-L-Ala-L-Leu-O,N-dimetilhidroksamat (1.9 g) je otopljen u suhom THF (40 ml) i ohlađen na -70°C pod dušikom. Pod atmosferom dušika je zatim, tijekom 10 minuta na 70°C, dodan diizobutilaluminij hidrid u THF (1 M, 29.5 ml), pa je miješanje nastavljeno još 10 minuta.

Reakcija je prekinuta sipanjem reakcijske smjese u metanol (50 ml) i otopina Rochell-ove soli (50 ml), uz miješanje na -60°C pod atmosferom dušika i zatim je smjesa ostavljena da se zagrije do sobne temperature. Dodani su voda (50 ml) i etil acetat (50 ml), smjesa je filtrirana i vodeni sloj je odvojen i ekstrahiran sa etil acetatom (2 x 50 ml). Kombinirane organske faze su isprane vodom (3 x 100 ml) i zasićenom otopinom NaCl kako bi se pomoglo odvajanje. Otapalo je uklonjeno u rotacijskom uparivaču, uz održavanje temperature ispod 30°C, zatim je dodan svježi etil acetat koji je nakon toga uklonjen u rotacijskom uparivaču, i dobiven je CBZ-L-Ala-L-Leu aldehid.

Stupanj e

A) CBZ-L-Ala-L-Leu aldehid (6.7 g) je otopljen u industrijskom metiliranom špiritusu (50 ml) i zagrijan na 50°C.

B) Vruća otopina KHCO3 (9 g) u vodi (9 ml) je dodana vrućoj otopini semikarbazida•HCl (10.8 g) u vodi (30 ml).

C) Otopina B je dodana otopini A i smjesa je miješana 3 sata na 50°C, pa je ostavljena stajati preko noći na sobnoj temperaturi. Kruta supstancija je proflltrirana, isprana industrijskim metiliranim špiritusom: vodom (1:1, 20 ml), pa je sušena pod vakuumom preko P2O5 da bi dala CBZ-L-Ala-L-LeuSc.

Stupanj f

CBZ-L-Ala-L-LeuSc (950 mg) je otopljen u metanolu (100 ml) i netopive materije su uklonjene filtriranjem. Dodano je još metanola (50 ml) i uređaj je propuhan dušikom. Pod atmosferom dušika je dodan katalizator, 10% paladij na ugljenu (100 mg) i zatim je u zatvoreni sustav uvođen vodik tijekom 135 minuta. Katalizator je uklonjen filtriranjem, a otapalo je uklonjeno u rotacijskom uparivaču uz održavanje temperature ispod 30°C. Kruta supstancija je sušena pod vakuumom preko P2O5 da bi dala L-alanil-l-leucinil semikarbazon (L-Ala-L-LeuSc).

Primjer 10 - Dobivanje matrice za afinitetnu kromatografiju usmjerenu na aktivno mjesto, ECH-Sepharose 4B-L-Ala-L-PheSc

ECH-Sepharose® 4B (3 g vlažne mase) isprana je na filteru od sinteriranog stakla s vodenom otopinom NaCl (0.5 M, 240 ml) i zatim vodom (120 ml). N-Etil-N'-(3- dimetilaminopropil)karbodiimid klorhidrat (EDC) je otopljen u vodi da bi dao 0.1 M otopine EDC je stabilizirano na 4.5 dodatkom klorovodične kiseline ili krutog natrij acetata. L-Ala-LPheSc (10 mg), dobiven kao što je opisano u Primjeru 1, otopljen je u metanolu (400 μl) i dodan ispranom gelu zajedno s vodenom otopinom EDC (0.1 M, 2.4 ml). Smjesa je blago miješana 1 sat na 20°C, pH je po potrebi ponovo prilagođeno na 4.5 i miješanje je nastavljeno 23 sata na 20°C. Zatim je dodan L-glicin do završne koncentracije od 1 M i miješanje je nastavljeno sljedeća 3 sata. Gel za afinitetnu kromatografiju je ispran, jedno za drugim vodenom otopinom metanola (50%, 60 ml), vodom (60 ml) i puferom za nanošenje (60 ml), pa je čuvan na 4°C do upotrebe.

Primjeri 11-18 - Dobivanje matrica za afmitetnu kromatografiju

Svaki od dipeptidnih derivata dobivenih kao što je opisano u Primjerima 2 do 9 kupliran je sa gel-matricom na način analogan onom opisanom u Primjeru 10, da bi se dobili gelovi za afinitetnu kromatografiju iz Primjera 11 do 18.

Primjer 19 - Afinitetna kromatografija

Lateks papaje sušen raspršivanjem (0.03 g proteina), nabavljen od Powell & Scholefield, Velika Britanija, u puferu "za nanošenje" (natrij fosfat (50 mM); EDTA (1 mM); etandiol (33%), pH 6.8), zajedno s ditiotretitolom (2 mM) ili cisteinom (4 mM) (1.5 ml) nanesen je do stupca od 1 ml koje sadrže matrice za afinitetnu kromatografiju iz Primjera 11-18. Korišten je barem jedan od sljedećih eluenata:

Eluent A = Hidroksietildisulfid (100 mM) u vodenom etandiolu (33%) koji sadrži natrij citrat (50 mM) i EDTA (1 mM), pH 4.5; stupac je prije eluiranja ostavljen da se uravnoteži preko noći.

Eluent B = 2,2'-Dipiridilsulfid (30 mM) u vodenom etandiolu (33%) koji sadrži natrij citrat (50 mM), EDTA (1 mM), pH 4.5; stupac je prije eluiranja ostavljen da se uravnoteži preko noći.

Eluent C = Metilpiridilsulfld (30 mM) u vodenom etandiolu (33%) koji sadrži natrij citrat (50 mM) i EDTA (1 mM), pH 4.5; stupac je prije eluiranja ostavljen da se uravnoteži preko noći.

Eluent D = Mersalilna kiselina (10 mM) u vodenom etandiolu (33%) koji sadrži natrij hidroksid (50 mM) i EDTA (25 mM), prilagođeno na pH 4.5 dodatkom octene kiseline; kontinualno eluiranje.

Eluiranje sa svakim od eluenata je vrednovano provjerom tragova eluiranog materijala na A280 nakon standardne kromatografije na Mono S (Pharmacia). Rezultati su prikazani u Tablici 1:

Tablica 1

Vezivanje i eluiranje kimopapaina

[image]

+ Kimopapain vezan i eluiran

- Kimopapain nije vezan ili/niti eluiran

ND Nije određivano

Primjer 20 - Pročišćavanje kimopapaina

(i) Komercijalni lateks Carica papaya-e sušen raspršivanjem (1 g), dobiven je od Powell & Scholefield, Velika Britanija, miješan je 1 sat s destiliranom vodom (5 ml) i netopivi materijal je uklonjen centrifugiranjem na 9000 x g tijekom 30 minuta na 4°C. Peleta je odbačena, a pH supernatanta je prilagođeno na 1.8 sa klorovodičnom kiselinom (1 M) tijekom 20 minuta. Miješanje je nastavljeno na 4°C tijekom 60 minuta, pa je pH po potrebi ponovo prilagođeno na 1.8.

(ii) Smjesa je centrifugirana na 9000 x g tijekom 30 minuta na 4°C i peleta je odbačena.

(iii) (a) pH supernatanta je prilagođeno na 6.8 dodatkom NaOH (5M) u kapima, tijekom 10 minuta. U otopini se, kako je zapaženo, javilo tamno-plavo obojenje.

(b) Dobivena tamno-plava otopina je ekstenzivno dijalizirana preko 10 zapremina pufera "za nanošenje" (natrij fosfat (50 mM); EDTA (1 mM); etandiol (33%), pH 6.8), uz tri izmjene pufera. Dijalizat je centrifugiran pri 4000 x g tijekom 10 minuta i sadržaj proteina u dekantiranom supernatantu koji sadrži kimopapain je prilagođen na približno 30 mg/ml. Otopina kimopapaina je aktivirana dodatkom cisteina do završne koncentracije od 4 mM, pa je ostavljena stajati 15 minuta na 0°C.

(iv) Aktivirana otopina kimopapaina je nanesena na stupac od 8 ml ECH-Sepharose® kuplirane sa L-Ala-L-PheSc (pripremljenog kao što je opisano u Primjeru 10), pri čemu je stupac prethodno uravnotežen s puferom "za nanošenje", brzinom od 36 ml/cm2/sat. Stupac je ispran, jedno za drugim, s puferom za nanošenje (2 zapremine sloja), vodenom otopinom natrij citrata (50 mM) u etandiolu (33 %), pH 4.5 (2 zapremine sloja) i vodenom otopinom natrij acetata (50 mM); EDTA (25 mM); mersalilom (10 mM) u etandiolu (33%), pH 4.5 (2 zapremine sloja) i zatim je podvrgnuta inkubaciji na sobnoj temperaturi tijekom 2 sata.

(v) Kimopapain je eluiran s vodenom otopinom natrij acetata (50 ml) koji sadrži mersalil (10 mM) (3 zapremine sloja) i prikupljene su frakcije od po 4 ml. Enzimska aktivnost prikupljenih frakcija ispitana je u odnosu na BAPNA kao što je opisano u dosadašnjem tekstu.

Aktivne frakcije su prikupljene i dalje pročišćene kationoizmjenjivačkom kromatografijom na Mono-S HR® 10/10 (Pharmacia) stupcu s "polaznim" fosfatnim puferom sa Na+ (50 mM); EDTA (1 mM); NaN3 (0.01 %), pH 7.2 i "ograničavajućim" fosfatnim puferom sa Na+ (800 mM); EDTA (1 mM); NaN3 (0.01 %), pH 7.2. Eluiranje je vršeno sa gradijentom soli od 2.7 mM/ml i pri protoku od 2 ml/min. Prikupljene su frakcije (po 4 ml), koncentracija proteina je procijenjena mjerenjem apsorbance na 280 nm, a enzimska aktivnost je mjerena preko hidrolize BAPNA.

Frakcije koje sadrže kimopapain su prikupljene i ekstenzivno dijalizirane preko destilirane i deionizirane vode ili vodenog EDTA (1 mM), pa su skladištene nakon sušenja raspršivanjem.

Primjer 21 - Pročišćavanje kimopapaina - rezultati BAPNA ispitivanja

(i) Komercijalni lateks "Carica papaya"-e (1 g) sušen raspršivanjem, nabavljen od Powell-a i Schoefield-a, miješan je u vodi (5 ml) tijekom 60 minuta na 20°C. Netopivi materijal je uklonjen centrifugiranjem pri 9000 x g tijekom 30 minuta na 4°C. Peleta je odbačena, a pH otopine je prilagođen na 1.8 dodavanjem klorovodične kiseline (1M) u kapima, tijekom 20 minuta. Smjesa je miješana tijekom 15 minuta na 4°C i nakon 5 minuta je pH provjereno i po potrebi prilagođeno.

(ii) Talog je uklonjen centrifugiranjem pri 9000 x g tijekom 30 minuta na 4°C.

(ii) (a) pH supernatanta je prilagođeno na 7.0 dodavanjem, u kapima i uz miješanje, vodene otopine natrij hidroksida (5 M). Talog je uklonjen centrifugiranjem na 9000 x g tijekom 30 minuta na 4°C.

(b) Dobiveni supernatant je nanesen na stupac Mono-S HR 10/10 (Pharmacia) (kationoizmjenjivačka), koja je prethodno uravnotežena s vodenim Na2HPO4/NaH2PO4 (50 mM Na+) koji sadrži EDTA (1 mM), pH 7.2 (pufer A). Nakon nanošenja uzorka, stupac je ispran (2 ml/min) s puferom A sve dok se A280 nije vratila na nulu. Zatim je primijenjen gradijent (2.7 mM Na+/ml) do Na2HPO4/NaH2PO4 (0.80 M Na+) i prikupljane su frakcije od po 4 ml. Frakcije su ispitane na aktivnost u odnosu na BAPNA. Veliki maksimum kimopapaina, određen imunološkim putem, eluiran je između 0.17 i 0.28 M Na+. Frakcije iz ovog područja su aktivne na BAPNA su kombinirane, pa je dodan etandiol do 33 zapr/zapr. %. Sve ostale frakcije, uključujući i frakcije sa aktivnošću u odnosu na BAPNA iz kasnijeg maksimuma proteinaze papaje III, koji se eluira na 0.47 - 0.59 M Na+, bile su odbačene.

(iv) Stupac (25 ml zapremine sloja) ECH-Sepharose kuplirane sa L-Ala-L-PheSc (koji je dobiven kao što je opisano u Primjeru 10), ispran je (39 ml/sat/cm2) vodenom otopinom NaH2PO4/Na2HPO4 (50 mM Na+) koji je sadržavao EDTA (1 mM) u etandiolu (33 zapr/zapr. %), pH 6.8 (pufer za nanošenje. Kombinirane kimopapainske frakcije (vidi gore) su aktivirane dodatkom cisteinske baze (konačna koncentracija od 4 mM), pa su ostavljene stajati 15 minuta na 0°C. Frakcije su zatim nanesene na stupac i nakon njih je slijedilo 60 ml pufera za nanošenje.

(v) Natrij acetatni (50 mM) pufer, pH 4.5, koji sadrži HgCl2 (10 mM, 45 ml) je zatim nanesen na stupac. Tijekom cijelog rada su uzimane frakcije od po 5 ml. Frakcije su ispitane na aktivnost u odnosu na BAPNA.

Frakcije koje sadrže maksimum aktivnosti zadržane na stupcu, i koje su eluirane s puferom koji sadrži HgCl2 su prikupljene i ponovo nanesene na stupac Mono-S. Stupac je ispran puferom A i zatim je na stupac naneseno 7 zapremina sloja pufera A koji sadrži cisteinsku bazu (4 mM). Protok je zaustavljen na 30 minuta, kako bi se omogućilo da se živa istisne iz enzima. Protok je zatim nastavljen i stupac je ponovo ispran puferom A, prije primjene gradijenta sve do NaH2PO4/Na2HPO4 (0.80 M Na+) kao što je opisano gore. Frakcije sa aktivnošću u odnosu na BAPNA su kombinirane, dodana je cisteinska baza (4 mM završne koncentracije) i kombinirane frakcije su zatim ostavljene stajati 15 minuta na 0°C.

U stupcu je pakirana smola Chelex (Bio-Rad, Vel. Britanija; 05 g) koja je isprana s puferom A. Kombinirane frakcije koje sadrže kimopapain su propuštene kroz stupac Chelex, a zatim su ekstenzivno dijalizirane preko vodenog EDTA (1 mM) i liofilizirane.

Tijek pročišćavanja kimopapaina predstavljen je u Tablici 2.

Tablica 2

Pročišćavanje kimopapaina

[image]

≠ Dani prinos predstavlja prinos aktivnosti u odnosu na BAPNA (koja je supstrat i za papain i proteinazu papaje III)

* BAPNA metoda ispitivanja Br. 2

Primjer 22 - Dobivanje kimopapaina - specifična IgG antitijela dobivena kod kunića

Čisti kimopapain dobiven kao što je opisano u Primjeru 21 je blago karboksimetiliran prije upotrebe, metodom koju su opisali Zucker i suradnici (1985), vidi gore. Antiserum protiv kimopapaina je dobiven kod kunića, intramuskularnom injekcijom 360 μg karboksimetiliranog proteina u Freund-ovom kompletnom ađuvantu, nakon čega je, nakon 14 dana, slijedila potkožna injekcija 100 μg u nekompletnom ađuvantu. IgG je djelomično pročišćen iz antiseruma amonij sulfatnim frakcioniranjem, kako su opisali Heide i Schwick (1978), vidi gore, nakon čega je slijedila dijaliza u vodenu otopinu natrij fosfata (10 mM) koji sadrži NaCl (0.14 M), pH 7.3.

Primjer 23 - Pročišćavanje kimopapina i imunološka kvantifikacija kimopapaina i PPIV

(i-iii) Pripremljen je komercijalni lateks Carica papaya-e (1 g) nabavljen od Powell & Scholefield-a, Vel. Britanija, pa je podvrgnut tretiranju na pH 1.8 kao što je opisano u Primjeru 21 (i-iiia).

(iv) Stupac (15 ml zapremine sloja) ECH-Sepharose kuplirane sa L-Ala-L-PheSc (koji je dobiven kao što je opisano u Primjeru 10) isprana je kao što je opisano u Primjeru 21 (iv). Završni supernatant nakon tretiranja na pH 1.8 je dijaliziran u vodenu otopinu NaH2PO4/Na2HPO4 (50 mM Na+) koji sadrži EDTA (1 mM) u etandiolu (33 zapr/zapr. %), pH 6.8 (pufer za nanošenje), centrifugiran na 4000 x g tijekom 10 minuta, pa je supernatant aktiviran dodatkom ditiotreitola (konačna koncentracija od 2 mM) tijekom 15 minuta na 20°C. Zatim je nanesen na afmitetni stupac (39 ml/sat/cm2) i nakon toga je slijedilo 60 ml pufera za nanošenje. Na stupac su zatim naneseni natrij citratni pufer (50 mM), pH 4.5, koji sadrži EDTA (1 mM) i metilpiridildisulfid (30 mM; 15 ml) sintetiziran kao što su opisali Salih i suradnici, Biochem. J. (1987), 247, 181-193. Protokje zaustavljen i pufer koji sadrži disulfid je ostavljen na stupcu preko noći (18 sati) na 20°C.

(v) Protok je ponovo uspostavljen dodatkom 45 ml istog pufera koji sadrži metilpiridilsulfid i zatim 30 ml pufera za nanošenje. Sve vrijeme su prikupljane frakcije od po 5 ml.

Frakcije su ispitane na aktivnost u odnosu na BAPNA. Frakcije koje su sadržavale maksimum aktivnosti zadržane na stupcu i eluirane u metilpiridildisulfidnom puferu su kombinirane i nanesene (40 ml/sat/cm2) na stupcu (80 ml zapremine sloja) Sephadex LH-20 (Pharmacia) koja je prethodno uravnotežena s vodenom otopinom EDTA (1 mM) u etandiolu (33 zapr/zapr. %). Kromatografija je nastavljena dodatkom 300 ml ovog pufera. Frakcije (po 8 ml) su kontrolirane pomoću ΔA271 i ispitivane na aktivnost u odnosu na BAPNA.

Frakcije koje čine maksimum aktivnosti u odnosu na BAPNA (nakon kojeg je slijedio još jedan maksimum na A271) su kombinirane i nanesene na stupac Mono-S HR 10/10 (kationoizmjenjivačku); pa su propuštane kao što je opisano u Primjeru 21 (iiib). Kombinirane su frakcije koje su aktivne u odnosu na BAPNA.

Lateks sušen raspršivanjem i materijal dobiven u tretmanu na pH 1.8, u afinitetnoj kromatografiji i u ionoizmjenjivačkoj kromatografiji, analizirani su na prisustvo PPIV pojedinačnom radijalom imunodifuzijom kao što je opisano ranije. Ista metoda je korištena i za kvantifikaciju kimipapapina, sa antitijelom monospecifičnim za kimopapain dobivenim kod kunića kao što je opisano u Primjeru 22. Standardna krivulja za kimopapain je dobivena korištenjem kimopapaina pročišćenim ovdje opisanim metodama, za koje je pojedinačnom radijalnom imunodifuzijom pokazano da je slobodan kako od PPIV tako i od PPIII. Rezultati su prikazani u Tablici 3.

Tablica 3

Pročišćavanje kimopapaina i imunološka

kvantifikacija kimopapaina i PPIV

[image]

† = nije detektirano

* = BAPNA metoda ispitivanja Br. 2

Primjer 24 - Proučavanje alergije na kimopapain

Četrdeset uzoraka humanog seruma je nabavljeno od 3M Diagnostic Systems, SAD. Ovi uzorci su već prošli komercijalno dostupno testiranje, poznato pod imenom Chymofast, na IgE u odnosu na komercijalno dostupni oblik kimopapaina, Chymodiactin. Dvadeset uzoraka su označeni kao pozitivni na Chymofast, a dvadeset je bilo negativo. Svih četrdeset uzoraka je dobilo "blind" i dalje su testirani na prisustvo prirodno stečenih IgE antitijela protiv Chymodiactin-a, PPIII, PPIV i protiv pročišćenog kimopapaina (pročišćenog ovdje opisanim metodama, slobodnog od PPIV i PPIII što je pokazano pojedinačnom radijalnom imunodifuzijom), uz korištenje modificiranog enzimski vezanog imunosorbentnog ispitivanja (ELISA) u četvrtoj fazi, uz korištenje sustava biotin-avidin, kao što je sažeto na sljedeći način:

Mikrotitarske ploče prevučene sa: Test antigenom

↓

Test serumom

↓

Monoklonskim anti-humanim IgE

↓

Biotinilirani anti-mišji Ig kunića

↓

Kompleks avidin-peroksidaza

↓

Supstrat (ABTS)

↓

Zaustavljanje i mjerenja A410

Chymodiactin je korišten u okviru roka trajanja, PPIV je pročišćena kao što je opisano ovdje, a PPIII je pročišćena u skladu s Buttle-om i Barett-om (1984), vidi gore. Svi antigeni su inaktivirani blagim karboksimetiliranjem s jodooctenom kiselinom (10 mM) kao što su opisali Buttle i Barett (1984), vidi gore, neposredno prije upotrebe.

Udubljenja mikrotitarske ploče su prevučena test antigenom inkubacijom svakog udubljenja sa 100 μl test antigena (10 μg/ml) u natrij karbonatnom puferu (0.05 M, pH 9.6). Donorski serum konja (4 %) je zatim korišten da bi se reduciralo nespecifično vezivanje tijekom sljedećih faza. Inkubacija s test serumom (razblaženje 1/20) u PBS (0.1 % Tween, 2% seruma konja, 10 mM EDTA, 50 μg/ml heparina; pH 7.2 (100 μl, po udubljenju), vršena tijekom 4 sata nastavljena je inkubacijom s monoklonskim anti-humanim IgE (dobivenim kao što su opisali Kemeny i Richards u J. Immunol. Methods (1988), 108, 105 -1 μg/ml, 100 μl po udubljenju) na 37°C tijekom 3 sata i zatim sa biotiniliranim anti-mišjim imunoglobulinom kunića (koji se nabavlja od Dakopatts, Danska - 1 μg/ml, 100 μl po udubljenju) na sobnoj temperaturi preko noći. Udubljenja su podrvgnuta inkubaciji tijekom 30 minuta na 37°C sa avidin-peroksidazom (10 μl/ml, 100 μl po udubljenju), dodan je supstrat /2,2'-azinobis(3-etilbenztiazolin sulfonska kiselina), ABTS, 0.5 mg/ml/ u puferu (100 mM limunske kiseline, 200 mM Na2HPO4, pH 4.2, aktiviran sa 1 μl/ml H2O2), pa je inkubacija udubljenja vršena na sobnoj temperaturi tijekom 30 minuta. Reakcija je zaustavljena dodatkom 100 μl po udubljenju 100 mM limunske kiseline, 0.01 % NaN3, p je za svako udubljenje određena apsorbanca na 410 nm uz korištenje Micro ELISA čitača (Dynatech).

Standardi IgE su ispitivani u obujmu od 0.075 do 4.8 ng/ml (2.4 ng IgE su jedna međunarodna jedinica IgE). Za kalkulaciju koncentracija IgE usmjerenih protiv svakog od četiri antigenska preparata korišten je program Enzifitter (Leatherbarrow, R.J., 1985, Enzifitter for IBM PC, Elsevier-Biosoft, 68 Hills Road, Cambridge CB2 1 LA, Vel. Britanija). Ovaj program je korišten i za Chymodiactin, PPIII, PPIV i kimopapain dobiven kao što je opisano u Primjeru 23.

26 od 40 testiranih uzoraka sadržavali su IgE antitijela protiv Chymodactin-a, a vrijednosti dobivene za PPIII, PPIV i kimopapain za dvanaest uzoraka koji su najaktivniji protiv Chymodiactin-a prikazani su u Tablici 4.

Vidi se da je, od dvanaest uzoraka seruma koji sadrže anti-Chymodiactin antitijela, samo kod dva anti-kimopapain predstavljao glavnu reakciju IgE, dok su antitijela za PPIII i PPIV odgovorna za približno 75 % relevantnog detektiranog IgE.

Tablica 4

Specifične koncentracije IgE (IU/ml) u uzorcima seruma

koji sadrže IgE antitijela protiv Chymodiactin-a

[image]

Primjer 25 - Inhibicija smjesa kimopapaina i PPIV s pilećim cistatinom

Kimopapain je pročišćen kao što je opisano u Primjeru 23 i standardiziran je titracijom aktivnog mjesta sa E-64 uz korištenje BAPNA kao supstrata (Zucker i suradnici, 1985, Biochem. Biophys. Acta 828, 196-204). PPIV, pročišćena kao što je opisano gore, također je titrirana sa E-64, adaptacijom ove metode u kojoj se kao supstrat koristi azokazein.

Pileći cistatin oblika 2 je pročišćen kao što su opisali Anastasi i suradnici, 1983. Biochem. J. 211, 129-138 i standardiziran je titracijom s papinom koji je prethodno titriran sa E-64.

Ispitivanja na azokazeinsku hidrolizu vršena su metodom Rowan-a i suradnika, 1988, vidi gore, osim što je prije dodavanja supstrata izvršena prethodna inkubacija enzima i inhibitora tijekom 15 minuta na 40°C.

Uzete su dvije skupine od po 9 cjevčica, pa je u svaku postavljeno po 125 μl 0.40 M natrij fosfatnog pufera koji sadrži 4 mM EDTA i 16 mM cisteinske baze. Dodani su kimopapain i PPIV, u različitim odnosima, do konačne koncentracije proteinaza od 1 μM, a u drugu skupinu ista količina vode. Zatim je izvršena prethodna inkubacija cjevčica i ispitivanje na aktivnost azokazeinske hidrolize.

Djelovanje pilećeg cistatina na hidrolizu azokazeina pomoću smjese enzima izraženo je kao postotna inhibicija aktivnosti u odnosu na aktivnost iste smjese enzima u odsustvu cistatina, kao što je prikazano u Tablici 5.

Tablica 5

Postotna inhibicija smjesa kimopapaina i PPIV pilećim cistatinom

[image]

Vidi se da stupanj inhibicije pilećim cistatinom pokazuje obrnutu proporcionalnost s koncentracijom PPIV.

Primjer 26 - Pročišćavanje kimopapaina kiselim taloženjem na pH 2.2-1.2

i) Komercijalni lateks Carica papaya-e sušen raspršivanjem, nabavljen od Powell & Scholefield-a, Vel. Britanija, otopljen je do 20 mas/zapr. % s destiliranom vodom i miješan je 1 sat. Netopivi materijal je uklonjen centrifugiranjem na 9000 x g tijekom 30 minuta na 4°C. Peleta je odbačena, a pH supernatanta je smanjeno dodatkom klorovodične kiseline (1M) u kapima, uz miješanje na 4°C, brzinom od 40 μ1/min/ml. pH smjese je stalno kontrolirano uz korištenje Radiometer kombinirane elektrode (Tip GK 2401C) kalibrirane sa pH 4.01 i pH 1.09 standardnim puferima (Radiometer, 25°C). Pri pH 2.2 i u intervalima od po 0.2 pH jedinice ispod toga, sve do pH 1.2, dodavanje kiseline je prekidano i pH je održavano konstatnim dok je nastavljeno miješanje na 4°C. Tada je uzimana alikvota (ekvivalentna 10 ml polazne otopine) koja je čuvana. Dodavanje kiseline u ostatak otopine je zatim nastavljeno do sljedećeg pH intervala.

ii) Svi uzorci su centrifugirani pri 9000 x g tijekom 30 minuta na 4°C, a pelete su odbačene.

iii) pH svakog supernatanta je prilagođeno na 6.8 dodavanjem, u kapima (400 μl/min) NaOH (1 M). Svaki uzorak je centrifugiran ponovo na 9000 x g tijekom 30 minuta, da bi se uklonilo bilo kakav naknadni talog.

U još jednom eksperimentu, kiselo taloženje na pH 1.8 vršeno je na 25°C.

Konačni supernatani su ispitivani na aktivnost u odnosu na BAPNA i na prisustvo PPIV i kimopapaina prema izumu pojedinačnom radijalnom imunodifuzijom kao što je opisano u dosadašnjem tekstu. Rezultati su prikazani u Tablici 6 i ukazuju da uklanjanje PPIV do nivoa od <0.1% od ukupnog proteina može se postići kiselim taloženjem na 4°C pri pH 1.8 i ispod, a do <0.5% taloženjem na 25°C pri pH 1.8.

Tablica 6

[image]

* BAPNA metoda ispitivanja Br. 2

Primjer 27 - Preparat monospecifičnih IgC antitijela dobivenih kod ovce

Čisti kimopapain dobiven kao što je opisano u Primjeru 21 je blago karboksimetiliran prije upotrebe, metodom koju su opisali Zucker i suradnici (1985), vidi gore, i dijaliziran u vodenu otopinu natrij fosfata (10 mM), pH 7.3, koji sadrži NaCl (0.14 M). Antiserum za kimopapain je dobiven kod ovce, intramuskularnom injekcijom 100 μg karboksimetiliranog proteina u Freund-ovom kompletnom ađuvantu i nakon mjesec dana sa 50 μg danog na isti način. IgC je djelomično pročišćen iz antiseruma amonij sulfatnim frakcioniranjem kao što su opisali Heide i Schwick (1978), vidi gore, nakon čega je slijedila dijaliza u vodenu otopinu natrij fosfata (10 mM) koji sadrži NaCl (0.14 M), pH 7.3.

Preparati IgC antitijela protiv papaina, proteinaze papaje III i proteinaze papaje IV dobiveni su na sličan način.

Pojedinačni karboksimetilirani antigeni su odvojeno kuplirani u skladu s proizvodačevim uputstvom, za stupce koji se nabavljaju pod trgovačkim nazivom Zetaffinity (Anachem) uravnotežene u vodenoj otopini natrij fosfata (10 mM), pH 7.3 koji sadrži NaCl (0.14 M). Antitijela koja predstavljaju potencijalne zagađivače ili koja bi mogla izazvati bočne reakcije su apsorbirane iz preparata IgG propuštanjem kroz ove stupce, tako da su konačni preparati IgG dali taložne reakcije sa svojim antigenim, ali nisu izazvati taložne bočne reakcije sa drugim antigenima. Stupci s vezanim antigenom su regenerirane za ponovnu upotrebu s vodenom otopinom dietilamina (0.05 M), pH 11.5 i brzo su ponovo uravnotežene u fosfatnom puferu.

Na ovaj način su pripremljena monospecifična antitijela protiv kimopapaina, PPIII, PPIV i papaina koja se mogu koristiti u kvantitativnom ispitivanju svakog antigena pojedinačnom radijalno imunodifuzijom kao što je opisano u dosadašnjem tekstu.

Primjer 28 - Pročišćavanje kimopapaina - kiselo taloženje na H 1.5

i) Komercijalni lateks Carica papaya-e sušen raspršivanjem (20 g), nabavljen od Siebelsa, SAD, miješan je u deioniziranoj u destiliranoj vodi (prethodno ohlađenoj na 4°C, 250 ml) tijekom 60 minuta na 0°C. pH smjese je prilagođeno na 1.5 dodatkom HCl (1N) brzinom od 10 lμ/min/ml tijekom kontinuinalnog promatranja pH uz korištenje kombinirane elektrode Radiometer (Tip GK 2401C) kalibrirane sa standardnim puferima pH 4.01 i 1.09 (Radiometer, 25°C). Kada je postignuto pH 1.5, ostavljeno je 10 minuta da se pH stabilizira i za to vrijeme je po potrebi vršeno dalje prilagođavanje.

ii) Smjesa je centrifugirana na 12000 x g tijekom 30 minuta na 4°C i peleta je odbačena.

iii) (a) pH supernatanta je prilagođeno do 7.0 dodatkom NaOH (1M) brzinom od 10 μl/min/ml tijekom konstatnog kontroliranja pH uz korištenje elektrode Radiometer kalibrirane s puferom pH 7.01 (Radiometer, 25°C). Kada je postignuto pH 7.0, ostavljeno je 10 minuta da se pH stabilizira i za to vrijeme je po potrebi vršeno dodatno prilagođavanje. Smjesa je centrifugirana na 12000 x g tijekom 30 minuta na 4°C, a peleta je odbačena.

(b) Supernatant je ekstenzivno dijaliziran na 4°C preko 30 zapremina deionizirane i destilirane vode, pri čemu su u intervalima od 12 sati izvršene dvije zamjene.

Dijalizirana otopina je dalje pročišćena kationoizmjenjivačkom kromatografijom na S-Sepharose High Performance 35/100 stupcu (Pharmacia). Za svaki ciklus rada je korišteno maksimalno 3 g proteina (određeno preko A280). Stupac je prethodno uravnotežen s vodenom otopinom EDTA (1 mM) na 4°C. Nakon nanošenja uzorka, stupac je ispran s vodenom otopinom EDTA (1 mM) pri 10 ml/min, sve dok se A280 nije vratila na nulu.

Na stupcu je primijenjen gradijent (0.175 mM K+/ml) do 0.5 M K+, pa su tijekom cijelog rada prikupljane frakcije od po 25 ml. Frakcije maksimuma su ispitivane na aktivnost u odnosu na BAPNA.

Frakcije koje sadrže kimopapain s najvećom specifičnom aktivnošću u odnosu na BAPNA (eluirane između 0.17 i 0.22 M K+) su kombinirane. Kombinirani kimopapain je ekstenzivno dijaliziran na 4°C preko 30 zapremina deionizirane i destilirane vode, uz pet izmjena u intervalima od po 12 sati. Dijalizat je liofiliziran i čuvan na -20°C.

Kompletan postupak pročišćavanja je ponovljen veći broj puta. Prisustvo kimopapina prema izumu, papaina, PPIII i PPIV je ispitivano korištenjem pojedinačne radijalne imunodifuzije kao što je opisano u dosadašnjem tekstu, i antitijela dobivenih kod ovce kao što je opisano u Primjeru 27. Aktivnost u odnosu na BAPNA i titracija aktivnog mjesta s jodooctenom kiselinom ispitani su uz korištenje BAPNA metode Br. 1, opisanog gore. Tok pročišćavanja je sažeto prikazan preko srednjih vrijednosti u Tablici 7.

Tablica 7

[image]

ND - nije određeno

≠ protein procijenjen preko ukupne suhe mase

Primjer 29 - Pročišćavanje kimopapaina - kiselo taloženje na pH 1.5 i afinitetna kromatografija

(i-iii) Komercijalni lateks Carica papaya-e sušen raspršivanjem (50 g) nabavljen kod Siebelsa, SAD, pripremljen je i podvrgnut tretiranju na pH 1.5 kao što je opisano u Primjeru 28 (i-iiia). Supernatant je dijaliziran ekstenzivno na 4°C preko 30 zapremina deionizirane i destilirane vode, uz dvije izmjene u intervalima od po 12 sati.

iv) Stupac (350 ml zapremine sloja) ECH-Sepharose kuplirane sa L-Ala-L-PheSc (dobivenim kao što je opisano u Primjeru 10), uravnotežena je s vodenom otopinom etandiola (33 zapr/zapr. %) koji sadrži natrij acetat (50 mM), pH 4.5, preko noći, pa je zatim uravnotežen s vodenim NaH2PO4/Na2HPO4 (50 mM Na+) koji sadrži EDTA (1 mM) u etandiolu (33 zapr/zapr. %), pH 6.8 (pufer za nanošenje).

Dijalizirani supernatant (gore) je filtriran uz korištenje filtra s porama od 0.2 μm i etandiol je dodan do 33 zapr/zapr. %. pH otopine je provjereno i po potrebi prilagođeno na 7.0. Svježe pripremljena vodena otopina L-cisteina (200 mM) je dodana do koncentracije od 4 mM, otopina je dobro promiješana i ostavljena stajati 15 minuta na 4°C. Zatim je nanesen na afinitetni stupac na 4°C pri protoku od najviše 40 ml/sat/cm2. Stupac je ispran s 10 zapremina sloja puferom za nanošenje.

v) Kimopapain je eluiran sa 3 zapremine sloja vodene otopine HgCl2 (10 mM) i etandiolu (33 zapr/zapr. %) koji sadrži natrij acetat (50 mM), pH 4.5 i prikupljene su frakcije od po 25 ml. Frakcije koje sadrže aktivnost u odnosu na BAPNA su kombinirane i dalje pročišćene kationoizmjenjivačkom kromatografijom na S-Sepharose High Performance 35/100 stupcu (Pharmacia).

Stupac je prethodno uravnotežen s vodenom otopinom EDTA (1 mM) na 4°C.

Nakon nanošenja uzoraka, stupac je ispran s vodenim EDTA (1 mM) pri 10 ml/min, sve dok se A280 nije vratila na nulu. Na stupcu su nanesene tri zapremine sloja vodene otopine K2HPO4/KH2PO4 (50 mM K+), pH 7.2 sa sadržajem EDTA (1 mM) i L-cisteina (500 mM), pa je protok prekinut na 30 minuta. Na stupcu je naneseno još tri zapremine sloja svježe pripremljenog cisteinskog pufera, pa je protok ponovo prekinut na 30 minuta. Stupac je ispran sa daljnjih šest zapremina sloja cisteinskog pufera, pa je ponovo uravnotežena s vodenim K2HPO4/KH2PO4 (50 mM K+) koji sadrži EDTA (1 mM), pH 7.2.

Na stupcu je primijenjen gradijent (0.175 mM K+/ml) do 0.5 M K+, pa su tijekom cijelog rada prikupljane frakcije od po 25 ml. Frakcije maksimuma su ispitane na aktivnost u odnosu na BAPNA. Prvi maksimum, koji se eluira između 0.2 i 0.25 M K+, bio je kimopapain. Sljedeći maksimum, koji se eluira na oko 0.45 M K+, bila je proteinaza papaje III.

Frakcije koje sadrže kimopapain s najvišom specifičnom aktivnošću u odnosu na BAPNA su kombinirane. Prikupljeni kimopapain je ekstenzivno dijaliziran na 4°C preko 30 zapremina deionizirane i destilirane vode, pri čemu je u intervalima od po 12 sati izvršeno 5 zamjena vode.

Kimopapain eluiran iz kationoizmjenjivačkog stupca je aktiviran cisteinskim puferom i prema tome je bio podložan dezaktivaciji pomoću oksidiranja. Kako bi se bitno spriječila ili smanjila inaktivacija aktivnog enzima oksidiranjem, frakcije su prikupljene u cjevčice koje sadrže suspenziju natrij tetrationata (200 mM), da bi se u svakoj frakciji dobila konačna koncentracija od 5 mM NaS4O6. Alternativno, prikupljeni kimopapain je dijaliziran pod atmosferom dušika preko vode koja je propuhana dušikom da bi se iz nje uklonio kisik, brzinom od 0.11/min tijekom 30 minuta, u posudi koja je zatisnuta pod atmosferom dušika.

Dijalizat je na kraju liofiliziran i čuvan na -20°C.

Kompletna procedura pročišćavanja je ponovljena puno puta, a tijek pročišćavanja (ispitivanje je kao što je opisano u Primjeru 28) je sažet preko srednjih vrijednosti prikazanih u Tablici 8.

Tablica 8

[image] ND - nije određivano

≠ - protein je procijenjen na osnovu ukupne suhe mase

Primjer 30 - Pročišćavanje kimopapaina - kiselo taloženje na pH 1.5 i afinitetna kromatografija

(i-iii) Komercijalni lateks Carica papaya-e sušen raspršivanjem, nabavljen kod Siebels-a, SAD, pripremljen je i podvrgnut tretiranju na pH 1.5, dijalizi i kationoizmjenjivačkoj kromatografiji na S-Sepharose kao što je opisano u Primjeru 28.

iv) Frakcije koje sadrže kimopapin s najvišom specifičnom aktivnošću u odnosu na BAPNA su kombinirane i dodan je etandiol do 33 zapr/zapr. %. Svježe pripremljena otopina L-cisteina (200 mM) je dodana do koncentracije od 4 mM; pa je otopina nanesena na stupac ECH-Sepharose kuplirane sa L-Ala-L-PheSc kao što je opisano u Primjeru 29 (iv).

v) Kimopapain je eluiran sa 3 zapremine sloja vodene otopine HgCl2 (10 mM) u etandiolu (33 zapr/zapr. %) koji sadrži natrij acetat (50 mM), pH 4.5 i prikupljane su frakcije od po 25 ml. Frakcije koje sadrže aktivnost u odnosu na BAPNA su kombinirane i ekstenzivno dijalizirane na 4°C preko 30 zapremina dejonizirane i destilirane vode, uz pet izmjena u intervalima od po 12 sati. Dijalizat je liofiliziran i čuvan na -20°C.

Tijek pročišćavanja (ispitan kao u Primjeru 28) je sažeto prikazan u Tablici 9.

Tablica 9

[image]

ND - nije određivano

≠ - protein procijenjen prema ukupnoj suhoj masi.

Primjer 31

Dva preparata Kimopapaina u skladu s izumom su ispitivani uz korištenje BAPNA metode ispitivanja Br. 1 i Br. 2 istog dana. Protein je procijenjen preko ukupne suhe mase. Kimopapainski preparat A dobiven je postupkom pročišćavanja opisanim u Primjeru 28. Preparat kimopapaina B je dobiven postupkom pročišćavanja opisanom u Primjeru 29 (završne frakcije prikupljene u natrij tetrationatu). Rezultati ispitivanja koje je vršeno sa trostrukim uzorcima bili su kao što je prikazano u Tablici 10.

Tablica 10

[image]

Primjer 32

Kimopapain pročišćen kao što je opisano u Primjeru 29 i dijaliziran pod atmosferom dušika kao što je u tom primjeru opisano, liofiliziran je i čuvan na -20°C. Liofilizirani kimopapain je imao specifičnu aktivnost u odnosu na BAPNA (1 mM) na 37°C i pH 6.0, od 1345 jedinica po miligramu.

Za dobivanje 100 liofila preparata koji sadrži pročišćeni kimopapain pravi se osnovna otopina koja sadrži 43.75 g, na način koji je opisan u daljnjem tekstu. Osnovna otopina se tijekom cijelog postupka održava na 4 do 12°C.

L-(+) cistein klorhidrat monohidrat (166 mg) dodaje se u oko 30 ml vode za injekcije, kako bi se dobila koncentracija od 22 mM u završnoj zapremini. pH otopine se prilagođava na 5.0 do 5.5 sa NaOH (1 M) ili HCl (0.1 M). Otopina cisteina se dodaje pročišćenom kimopapainu (358 mg) da bi se postigla koncentracija od 11000 jedinica po mililitru završne zapremine. pH miješane otopine se prilagođava na 5.9 do 6.1 sa NaOH (1 M) ili HCl (0.1 M), nakon čega se dopunjava do 43.75 g vodom za injekcije. Otopina se sterilizira propuštanjem kroz filtere s veličinom pora od 0.2 mikrona i to dva jedan za drugim. Alikvote od po 0.4 g otopine se pune u staklene fiole 100 x 5 ml. Fiole se poklapaju, voda se uklanja liofilizacijom pod smanjenim pritiskom, pa se fiole koje sadrže liofilizirani proizvod zatisnu pod vakuumom.

Svaka fiola sadrži bijeli amorfni prah koji sadrži 3.27 mg kimopapina i 1.52 mg natrij cisteinat klorhidrata (nominalno 4000 jedinica i 8 μmol, što ostavlja rezervu od 10%). Preparati se u načelu rekonstruiraju neposredno prije upotrebe dodatkom 2 ml vode za injekcije, da bi se dobila otopina za ubrizgavanje koja nominalno sadrži 4000 jedinica kimopapina i 4 mM L-cisteina.

Claims (21)

1. Postupak za pročišćavanje kimopapina, naznačen time, što se sastoji od inkubacije vodene otopine sirovog kimopapaina s matricom za afinitetnu kromatografiju usmjerenu na aktivno mjesto, pri čemu se matrica sastoji od nosive matrice koja je kovalentno, po potrebi preko rastavnog niza, kuplirana sa N-terminusom reverzibilnog proteina koji inhibira kimopapain, tako da se navedeni peptid vezuje za aktivno mjesto na molekulu kimopapaina, nakon čega se kimopapain eluira pogodnim eluentom; što se taloži vodena smjesa koja sadrži sirov kimopapain, na pH nižem od 2.0, nakon čega se vodena otopina sirovog kimopapaina odvaja od navedene smjese, pa se vrši neutralizacija i, po potrebi, odsoljavanje navedene otopine sirovog kimopapaina; ili što se vodena smjesa koja sadrži sirovi kimopapain prvo podvrgava kiselom taloženju, nakon čega se vodena otopina sirovog kimopapaina odvaja od navedene smjese, pa se dobivena otopina sirovog kimopapaina neutralizira i po potrebi odsoljava, da bi se zatim dobivena otopina podvrgla inkubaciji s matricom za afinitetnu kromatografiju usmjerenu na aktivno mjesto, pri čemu se matrica sastoji od nosive matrice koja je kovalentno, po potrebi preko rastavnog niza, kuplirana sa N-terminusom reverzibilnog proteina koji inhibira kimopapain, tako da se navedeni peptid vezuje za aktivno mjesto na molekulu kimopapaina; i što se kimopapain eluira korištenjem pogodnog eluenta.

2. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time, što se kiselo taloženje vrši na pH od 1.2 do 1.8.

3. Postupak prema zahtjevu 1 ili 2, naznačen time, što obuhvaća i barem jedan stupanj kationoizmjenjivačke kromatografije.

4. Pročišćeni kimopapain, naznačen time, što ima specifičnu aktivnost protiv N-α-benzoil-DL-arginin ρ-nitroanilida (BAPNA) na 37°C i pH 6.0 u opsegu od 800 do 1700 jedinica po miligramu i što sadrži manje od 0.2 % proteinaze papaje III (PPIII), papaina i proteinaze papaje IV (PPIV).

5. Kimopapain prema zahtjevu 4, naznačen time, što ima specifičnu aktivnost prema BAPNA (1 mM) na 37°C i pH 6.0 u opsegu od 1000 do 1700 jedinica po miligramu.

6. Pročišćeni kimopapain, naznačen time, što ima specifičnu aktivnost protiv BAPNA (2.5 mM) na 40°C i pH 6.8 u opsegu od 3000 do 4500 jedinica po miligramu i što sadrži manje od 0.2 % proteinaze papaje III (PPIII), papaina i proteinaze papaje IV (PPIV).

7. Kimopapain prema zahtjevu 6, naznačen time, što ima specifičnu aktivnost protiv BAPNA (2.5 mM) na 40°C i pH 6.8 u opsegu od 3500 do 4500 jedinica po miligramu.

8. Kimopapain prema bilo kojem od zahtjeva 4 do 7, naznačen time, što ima aktivnost protiv azokazeina, pri čemu je ova aktivnost najmanje 95% inhibirana pilećim cistatinom u koncentracijama do 1 μM.

9. Kimopapain prema bilo kojem od zahtjeva 4 do 8, naznačen time, što sadrži najmanje 70% aktivnog enzima.

10. Preparat, naznačen time, što sadrži kimopapain prema bilo kojem od zahtjeva 4 do 9.

11. Preparat prema zahtjevu 10, naznačen time, što sadrži i nosač.

12. Preparat prema zahtjevu 10 ili 11, naznačen time, što se pod bezvodnim uvjetima pakira u evakuirane fiole ili ampule.

13. Preparat prema zahtjevu 12, naznačen time, što dodatno sadrži reduktivno sredstvo.

14. Preparat prema bilo kojem od zahtjeva 10 do 13, naznačen time, što dodatno sadrži inhibitor reverzibilne cisteinske proteinaze.

15. Farmaceutski preparat, naznačen time, što sadrži kimopapain prema bilo kojem od zahtjeva 4 do 9.

16. Farmaceutski preparat prema zahtjevu 15, naznačen time, što sadrži i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, ekscipijent ili nosač.

17. Farmaceutski preparat prema zahtjevu 15 ili 16, naznačen time, što se pod bezvodnim uvjetima pakira u evakuirane fiole ili ampule.

18. Farmaceutski preparat prema zahtjevu 17, naznačen time, što dodatno sadrži farmaceutski prihvatljivo reduktivno sredstvo.

19. Farmaceutski preparat prema bilo kojem od zahtjeva 15 do 18, naznačen time, što ima oblik pojedinačnih doza za parenteralno davanje.

20. Kimopapain prema bilo kojem od zahtjeva 4 do 9, naznačen time, što se koristi za kemonukleolizu.

21. Kimopapain prema bilo kojem od zahtjeva 4 do 9, naznačen time, što se koristi u izradi lijekova za kemonukleolizu.