LT3827B - Chimopapaine, pharmaceutical compositions containing thereof, process for purification of chimopapaine, inhibiting peptides and chromatographic carriers - Google Patents

Description

Šis išradimas susietas su chimopapainu, jo pagerintomis farmacinėmis kompozicijomis ir žinduolių, turinčių pakenktus, išsikišusius arba turinčius kitą patologiją tarpslankstelinius spinalinius diskus, gydymo būdas, įskaitant pagerintos kompozicijos tirpalo injekcij avimą prie šių diskų. Toliau išradimas susietas su paraiškoje pateikiamo chimopapaino gavimo būdais, peptidais ir afininės chromatografijos matricomis, naudojamomis tokių būdų realizavime, o taip pat su chimopaino antikūnių kompozicijomis.

Chimopapainas yra proteinazė, esanti paw-paw (Carica papaya) augale. Buvo nustatyta, kad jis gali būti naudojamas klinikinėje praktikoje, būtent, gydant išsmukusius arba išsikišusius diskus arba išialgiją metodu, kuris vadinamas chemonukleozė (L. Smith, 1964, J. Amer. Med. Assoc. 187, 137-140).

Pirmą kartą išvalyti ir identifikuoti chimopapainą pabando Jansen ir Bolls (1941, J. Biol. Chem., 137, 405-417), kurie šio fermento gavimui naudojo rūgštinio nusodinimo ir išsūdymo metodus. Vėliau valymui buvo naudojami metodai, besiremiantys jonų mainų chromatografija. Taip, pavyzdžiui, Didžiosios Britanijos patentuose Nr. 2098897 (Smith Laboratories Ine.) ir Nr. 2156821 (Simmons) aprašytas katijonitinių dervų panaudojimas chimopapaino atskyrimui nuo kitų žinomų cisteino proteinazių. Abu šiuose patentuose aprašyti metodai buvo naudojami chimopapaino gavimui pramoniniu būdu. Tačiau buvo nustatyta, kad gautos medžiagos aktyvumas yra santykinai mažesnis už chimopapaino, kurį gavo Buttle ir Barret (1984, Biochem. J., 223, 81-88) nedideliais kiekiais daugiastadijiniu būdu, į kurį įeina būtent katijoninė chromatografija. Nors ši medžiaga pasižymėjo aukštu aktyvumu, tačiau ji buvo gauta su labai žema išeiga, ir šis būdas nėra tinkamas naudoti pramoniniu būdu. Buttle ir kt. (Biochem. J., 1989 liepa, 261, 469-476) nustatė, kad tuo būdu gautas produktas yra užterštas neseniai išskirta ir identifikuota papajos proteinaze IV, kuri eliuuojasi kartu su chimopapainu iš katijonitinių dervų. Naudojant katijonitinę chromatografiją neįmanoma atskirti chimopapaino nuo papajos proteinazės IV iki tokio laipsnio, kad jį būtų galima naudoti chimopapaino, pratiškai neturinčio papajos proteinazės IV, gavimui.

Literatūroje taip pat yra duomenų apie būdus, kuriuose viena iš stadijų yra afininė chromatografija. Taip Biochem. Biophys. Actą 658, 262-269, 1981 aprašytas chimopapaino valymas, naudojant, šalia kitų metodų, afininę chromatografiją su gyvsidabrio-agarozės kolonėle, o Biol. Chem. Hoppe-Segler, 1988, 369, 733740 Dubois ir kt. publikavo pranešimą apie cisteino proteinazės išskyrimą iš Carica papaya, panaudojant analogiškus metodus. Šis afininės chromatografijos tipas remiasi gyvsidabrio ligandų, surištų su inertine matrica, sąveika su ant jos užfiksuotų baltymų tiolinėmis grupėmis. To pasėkoje visi kiti baltymai, išskyrus chimopapainą, ir būtent kitos cisteino proteinazės, pavyzdžiui, papajos proteinazė IV, gali būti surišti su medžiaga, kuria yra užpildyta kolonėlė, ir po to eliuoti kartu su chimopapainu.

Neseniai moksliniuose straipsniuose buvo aprašytas afininės chromatografijos su imobilizuotais peptidų dariniais panaudojimas valymui atskirų baltymų, tokių kaip žmogaus katepsinas (Rich ir kt. 1986, Biochem. J. 235, 731-4) ir histolizinas iš Entamoeba histolytica (Luaces ir Barrett, Biochem. J. 250, 903-909). Iki šiol šis metodas nebuvo naudojamas chimopapaino valymui, ir chimopapaino patobulinimo valymo būdo, kurį galima būtų naudoti pramoniniu mastu, sukūrimo problema išlieka aktuali.

Kai kurie sintetiniai peptidų dariniai, kurie yra serino proteinazės chimotripsino inhibitoriai, aprašyti WO 84/00365.

Šio išradimo autoriai paruošė pasižyminčio aukštu aktyvumu chimopapaino, neturinčio priemaišų, būtent kitų papajos latekse esančių cisteino proteinazių, įskaitant papajos proteinazę IV, naują valymo ir išskyrimo būdą.

Šio išradimo produktas yra praktiškai švarus chimopapainas, turintis didelį šio fermento aktyvios formos kiekį.

Pagal šį išradimą chimopapainas praktiškai neturi imunologiškai skirtingų proteinazių, aptinkamų papajos latekse, ir būtent: papaino, papajos proteinazės III (PPIII) (šios dvi proteinazės aprašytos (Buttle ir Barrett (1984), Biochem. J., 223, 81-88) ir ypatingai neseniai atrastos papajos proteinazės IV (PPIV). Todėl šiame išradime naudojamą išsireiškimą praktiškai švarus reikia suprasti kaip praktiškai imunologiškai švarus ir jis reiškia, kad praktiškai nėra kryžminių reakcijų tarp chimopapaino pagal šį išradimą ir specifinių antikūnių, indukuojamų prieš švarią PPIV, kurią išskyrė ir identifikavo Buttle ir kt. (Biochem. J., 1988 liepa, 261, 469-476) ir kuri yra trumpai aprašyta žemiau, o taip pat nėra kryžminių reakcijų su specifiniais antikūniais prieš papainą ir PPIII, kuriuos anksčiau aprašė Buttle ir Barrett (1984) (žr. aukščiau cituotą šaltinį). Reikia atskirai pažymėti, kad taip vadinamas švarus chimopapainas, gautas pagal Buttle ir Barrett aprašytą būdą, turi, kaip tai buvo nustatyta, žymų kiekį PPIV (apie 14%) ir todėl kompozicija, turinti jo indukuotus antichimopapaininius antikūnius, pasižymi specifiškumu kaip ir išvalyto šį išradimą atitinkančio chimopapaino, taip ir išvalytos PPIV atLT 3827 B žvilgiu. Pagal šį išradimą chimopapainas turi mažiau 0,2%, geriau mažiau 0,1 %, PPIV, PPIII ir papaino.

Kryžminė reakcija tarp antigeno ir antikūnio gali būti aptikta įprastiniais žinomais metodais. Prie tokių metodų priklauso, pavyzdžiui, lydalo raketinė imunoelektroforezė ir dviguba imunodifuzij a (aprašyta Buttle ir Barrett (1984) aukščiau cituotame šaltinyje, vienradialinė imuno analizė, radioimunoanalizė (RIA) ir kietafazė imunofermentinė analizė (ELISA).

Paprastai aktyvaus fermento, esančio fermentinėje kompozicijoje, kiekis yra charakterizuojamas jo specifiniu aktyvumu tam tikro substrato atžvilgiu konkrečiose analizės atlikimo sąlygose. Šiame aprašyme naudojamas išsireiškimas specifinis aktyvumas ΒΑΡΝΑ atžvilgiu reiškia proteinazinį aktyvumą pikomoliais p-nitroanilino, susidarančio per sekundę vienam mg sauso produkto (pM/s/mg) , atliekant analizę standartinėse sąlygose ir substratu naudojant Ν-α-benzoil-DL-arginino pnitroanilidą (ΒΑΡΝΑ).

Standartinės analizės sąlygos, kuriomis tiriamos žinomos farmacinės chimopapaino kompozicijos, detaliai aprašytos žemiau skyriuje ΒΑΡΝΑ analizė, I metodika ir Analizė Smito metodu.

Šiuo metodu nustatyti specifiniai aktyvumai yra išreiškiami specifinio aktyvumo vienetais ΒΑΡΝΑ atžvilgiu (1 mM) , esant 37°C ir pH=6,0. Pagal šį išradimą chimopapainas charakterizuojamas specifiniu aktyvumu ΒΑΡΝΑ atžvilgiu (1 mM, esant 37°C ir pH=6,0, lygiu 800-1700, geriau 1000-1700, pavyzdžiui, 1200-1500 vnt./mg (atliekant analizę 37°C temperatūroje ir pH=6,0). Pirmenybę turinčiame išradimo realizavimo variante gaunamo chimopapaino specifinis aktyvumas ΒΑΡΝΑ (1 mM) atžvilgiu, esant 37°C ir pH=6,0, yra mažiausiai 1300 vnt./mg.

Kadangi gausioje su chimopapainu ir kitomis cisteino proteinazėmis susietoje literatūroje proteinazinis aktyvumas labai dažnai yra išreiškiamas kaip p-nitroanilino, laisvame pavidale išsiskyrusio iš sintetinio ΒΑΡΝΑ substrato, kiekis, tai iškyla šiuose darbuose pateiktų specifinio aktyvumo reikšmių betarpiško palyginimo problema. Tikslios reikšmės priklauso nuo eilės faktorių, konkrečiai nuo analizės atlikimo sąly-gų, pavyzdžiui pH, temperatūros, buferio sudėties ir naudoto substrato koncentracijos. Buttle ir Barrett (1984, aukščiau cituotas darbas) gauto chimopapaino, pagal šiame darbe pateiktus duomenis, specifinis aktyvumas ΒΑΡΝΑ atžvilgiu yra 0,154 μΜ/min/mg arba 2567 pM/s/mg. Tačiau sąlygos, kuriomis analizę vykdė Buttle ir Barrett, skyrėsi nuo žinomos farmacinės kvalifikacijos chimopapaino sąlygų ir todėl tiesiogiai palyginti jų specifinius aktyvumus yra neįmanoma.

Kadangi laikoma, kad Buttle ir Barrett gautas chimopapainas turi didžiausią specifinį aktyvumą iš visų tuo metu žinomų medžiagų, tai pradiniame šio išradimo kūrimo etape analizė buvo atliekama nurodytame darbe aprašytomis sąlygomis.

Ši analizės atlikimo metodika toliau vadinama ΒΑΡΝΑ analizė, metodika Nr. 2 . Jos pagalba nustatyti specifiniai aktyvumai ΒΑΡΝΑ atžvilgiu -2,5 mM) , esant 40°C ir pH=6,8, šios sąlygos tikrai skiriasi nuo sąlygų, kuriomis atliekama chimopapaino farmacinių kompozicijų analizė. Naudojant šią metodiką gautų rezultatų dydžiai 2-3 kartus viršija dydžius, gautus naudojant įprastą farmacinę ΒΑΡΝΑ analizę pagal 1 metodiką, nors žiūrint iš mokslinės pusės rezultatų, gautų dviem skirtingais analizės metodais, palyginimas pasinaudojant paprastu perskaičiavimo koeficientu yra nekorektiškas. Tačiau kaip rodo rezultatai, gauti pradinėje šio išradimo realizavimo stadijoje, šį išradimą atitinkančio chimoLT 3827 B papaino specifinis aktyvumas ΒΑΡΝΑ atžvilgiu (2,5 μΜ) , esant 40°C ir pH=6,8, yra 3000-4500 ribose, pavyzdžiui, 3500-4500 vnt./mg.

Šio išradimo autoriai neseniai publikuotame (1989 m. liepa, žr. aukščiau cituojamą darbą) ir žemiau trumpai aprašytame darbe išvalė ir identifikavo anksčiau nežinomą priemaišą chimopapaine, gautame žinomais būdais, ir būtent papajos proteinazę IV (PPIV) . PPIV yra neaktyvi ΒΑΡΝΑ atžvilgiu, tačiau pasižymi aktyvumu azokazeino atžvilgiu. Be to, buvo nustatyta, kad vištų cisteino koncentracijos iki 1 mM labai mažai įtakoja PPIV aktyvumą azokazeino atžvilgiu. Tačiau šį išradimą atitinkančio chimopapaino aktyvumas azokazeino atžvilgiu, esant šioms vištų cisteino koncentracijoms, inhibuojamas mažiausiai 95 %. Šiame išradime naudojamas išsireiškimas aktyvumas azokazeino atžvilgiu reiškia proteinazinį aktyvumą, apibūdinamą kaip sauso svorio vienetui per laiko vienetą susidarantis trichloracto rūgštyje tirpių peptidų produkto kiekis, naudojant derivatizuotą baltyminį substratą azokazeiną standartinėmis analizės sąlygomis, aprašytomis žemiau. Šį išradimą atitinkantis chimopapainas geriausiai turi aktyvumą azokazeino atžvilgiu, kuris bent 97 %, geriau 98-100 %, yra inhibuojamas vištų cisteinu, kurio koncentracija neviršija 1 μΜ.

Šio išradimo autoriai mano, kad jų pareiškiamas chimopapainas yra pirmą kartą gautas praktiškai švarus produktas, neturintis baltymų priemaišų ir turintis didelį kiekį nurodyto fermento aktyvios formos. Šis pasiekimas tapo įmanomu tik suprantant, kad jį užteršiantis baltymas, naudojant žinomus būdus, buvo valomas kartu su chimopapainu, šiam tikslui panaudojant, pavyzdžiui, jonitines ir žinomas afininės kolonėles. Tolimesnių tyrimų pasėkoje buvo išskirtas ir identifikuotas šis taršalas, kaip nustatyta PPIV. PPIV gaLT 3827 B vimui naudotas būdas netinka švaraus chimopapaino gavimui, tačiau PPIV gavimas leido išaiškinti du svarbius parametrus, kurių pagalba gali būti chrakterizuojamas švarus chimopapainas. Šie parametrai yra: 1) švaraus chimopapaino kryžminio reakcingumo su specifiniais PPIV antikūniais nebuvimas, 2) švaraus chimopapaino ir PPIV skirtingas aktyvumas azokazeino atžvilgiu, esant vištų cisteinui. Šie du ypatumai yra esminiai faktoriai chimopapaino valymo būdo paruošimui.

Akivaizdu, kad šį išradimą atitinkantis chimopapainas yra beveik visais atžvilgiais pranašesnis už kitus žinomus produktus. Švaraus fermento kompozicijos yra svarbios tyrimams, kurių tikslas yra detalus visų fermento charakteristikų tyrimas, pavyzdžiui, jos sudėtis ir katalizinės savybės.

Toliau šio išradimo objektas yra kompozicija, turinti savo sudėtyje pareiškiamą chimopapainą. Tokioje kompozicijoje praktiškai nėra PPIV. Joje esančio chimopapaino specifinis aktyvumas ΒΑΡΝΑ (1 mM) atžvilgiu, esant 37°C ir pH-6, yra 800-1700 vnt./mg. Siūlomos kompozicijos gali būti išleidžiamos kaip atskiros atitinkamo svorio dozės, pavyzdžiui, kaip alikvotiniai chimopapaino kiekiai, hermetizuoti nepatenkant drėgmei, pavyzdžiui, bonkutėse ir ampulėse su išsiurbtu oru. Be to, tokios kompozicijos gali turėti reduktorių, pavyzdžiui, ditiotreitolą, cisteiną laisvos bazės arba jo rūgščios konjugacinės druskos pavidale, kurių paskirtis yra užkirsti kelią fermento aktyvumo sumažėjimui dėl oksidacijos. Pagal kitą variantą siūlomos kompozicijos gali toliau turėti cisteino proteinazės grįžtamą inhibitorių druskos pavidale, pavyzdžiui, natrio tetrationatą arba gyvsidabrio chloridą. Tokie grįžtami inhibitoriai blokuoja fermento aktyvius centrus, dėka to užkertamas kelias fermento aktyvumo sumažėjimui, šiuo atveju oksiduojasi reduktorius, kuris reaktyvuoja ferLT 3827 B mentą. Kiti įprastiniai priedai, kurie norint gali įeiti į kompozicijos sudėtį, yra, pavyzdžiui, konservantai, konkrečiai, natrio bisulfitas, kompleksonai, konkrečiai EDTA, ir nešėjai, konkrečiai, natrio chloridas .

Švaraus fermento kompozicijos konkrečiai turi didelę reikšmę chimopapaino klinikiniam naudojimui, pavyzdžiui, esant chemonukleozei, kadangi, kaip rodo literatūriniai duomenys, naudojant šį gydymo metodą pas 3 % pacientų gali atsirasti alerginės reakcijos. Miltelių pavidalo papajos ekstraktas plačiau naudojamas maisto pramonėje, ir laikoma, kad daugelis chemonukleozei alerginių reakcijų atsiranda dėl priešsensibilizacijos tokiomis kompozicijomis. Tačiau gerai žinoma, kad svetimkūnių baltymų antigenų injekcija žinduoliams visada yra pavojinga dėl galimo anafilaktinio šoko. Medicininėje praktikoje priimta naudoti labiausiai švarius ir labiausiai aktyvius iš turimų baltyminių preparatų, tai leidžia pasiekti optimalų procedūros efektą ir iki minimumo sumažinti alerginių reakcijų riziką.

Todėl šio išradimo objektas taip pat yra farmacinė kompozicija, turinti savo sudėtyje pareiškiamą chimopapainą. Siūlomoje kompozicijoje praktiškai nėra PPIV. Jos sudėtyje esančio chimopapaino specifinis aktyvumas ΒΑΡΝΑ (1 mM) atžvilgiu, esant 37°C ir pH=6, yra 8001700 vnt/mg. Siūloma farmacinė kompozicija be to geriau turi farmaciškai netoksišką reduktorių, tokį kaip cisternas, laisvos bazės arba rūgščios konjugacinės druskos pavidale, pavyzdžiui, L-cisteino hidrochlorido monohidratą. Paprastai kompozicijoje reduktoriaus kiekis yra apie 0,5-3 mg 4000 chimopapaino vienetų, tai atitinka, pavyzdžiui, 15-90 svorio %, skaičiuojant chimopapainui. Šį išradimą atitinkančiose farmacinėse kompozicijose, be to, gali būti bet koks įprastinis farmaciškai priimtinas skiediklis, užpildas arba nešėjas, pavyzdžiui, konservantai, konkrečiai natrio bisulfitas, kompleksonai, konkrečiai EDTA, ir nešėjai, konkrečiai natrio chloridas.

Farmacinės kompozicijos, turinčios šį išradimą atitinkantį chimopapainą, gali būti naudojamos oftalmologijoje, pavyzdžiui, gydant akių ligas arba chirurgiškai apdorojant audinius, pavyzdžiui, nudegimo žaizdas, opas, nekrozės pasėkoje atmirusius audinius, praguląs ir kitas žaizdas su audinių atmirimu. Paprastai tokios kompozicijos yra išleidžiamos vietinio panaudojimo formoje, pavyzdžiui, sterilių tirpalų, gelių, suspensijų arba tepalų pavidale, kurie gali būti naudojami betarpiškam žaizdų apdorojimui arba užnešami ant žaizdų per jais sumirkytus raiščius.

Šį išradimą atitinkantį chimopapainą geriausia naudoti kompozicijų jo pagrindu paruošimui ortopediniams tikslams. Paprastai tokios farmacinės kompozicijos yra išleidžiamos vienkartinių dozių, skirtų parenteraliniam įvedimui, pavidale, pavyzdžiui, sterilių, neturinčių pirogenų, tirpalų arba suspensijų tinkamame nešėjuje pavidale, arba koncentratų, tinkamų rekonstruoti prieš vartojimą, pavidale. Atskirų dozių pavidalo kompozicijose, tinkamos patologinių arba pažeistų tarpslankstelinių diskų pulpozinių branduolių ištirpinimui arba gydymui, įvedant jas į šiuos diskus, gali turėti 500-5000 ΒΑΡΝΑ vienetų (analizė atliekama, esant ΒΑΡΝΑ koncentracijai 1 mM, 37°C temperatūrai ir pH=6) išradimą atitinkančio chimopapaino ir reduktorių, pavyzdžiui, natrio cisteinato hidrochloridą, kurie yra atskiroje ampulėje. Pirmenybę turinti vienkartinė dozė turi 2000 arba 4000 ΒΑΡΝΑ vienetų (1 mM ΒΑΡΝΑ, 37°C, pH=6) chimopapaino. Atskiroje dozėje gali būti, pavyzdžiui, 2-5, geriau 2,5-3,5 mg chimopapaino ir 0,2-3, geriau 1,0-2,0 natrio cisteinato hidrochlorido, esant ίο norui, mišinyje su tinkamu nešėju, pavyzdžiui, natrio chloridu, kurie yra atskiroje ampulėje.

Žemiau aprašytų eksperimentų eigoje buvo rasti 26 pavyzdžiai individualių serumų, turinčių natūraliu būdu įgytų IgE antikūnių prieš išleidžiamą chimopapaino kompoziciją Chymodiactin , kuri gaunama pagal Didžiosios Britanijos patente Nr. 2098997 aprašytą būdą. Šiuose bandymuose eksperimentiškai parodyta, kad šiuose serumuose yra IgE antikūniai prieš išradimą atitinkantį chimopapainą, o taip pat prieš tris kitas cisteino proteinazes, rastas papajos latekse, būtent, papainą, PPIII ir PPIV. Tačiau vidutiniai IgE kiekiai, rasti chimopapaine, PPIII ir PPIV, liudija apie tai, kad PPIII ir PPIV, kartu paėmus, yra atsakingi už 75% rasto IgE. Iš šių rezultatų nenuginčijamai seka, kad nurodyti baltymai turi esminį imonogeninį charakterį ir gali sudaryti didžiąją dalį antigeninių determinančių, esančių šiuo metu išleidžiamose chimopapaino kompozicijose, ir suteikia nepaprastai plačias antigenines galimybes. Todėl šį išradimą atitinkančios farmacinės kompozicijos turi didelius privalumus prieš žinomas kompozicijas.

Šio išradimo chimopapainas taip pat yra skirtas chemonukleoze pažeistų, išsikišusių arba turinčių kitus susirgimus žinduolių tarpslankstelinių spinalinių diskų gydymui.

Šis išradimas taip pat susietas su chimopapaino valymo būdu, kuris apima:

a) vandeninio neapdoroto chimopapaino inkubaciją su afininės chromatografijos matrica su aktyviais centrais, kuri turi pagrindą, kuris yra kovalentiškai surištas, esant reikalui, per speiserinę grupę su chimopapainą grįžtamai inhibuojančio peptido galiniu N u

atomu: to pasėkoje nurodytas peptidas susijungia su chimopapaino molekulės aktyviu centru, ir

b) chimopapaino eliuavimą tinkamu eliuentu.

Neapdirbtu chimopapainu, naudojamu kaip pradinė medžiaga chimopapaino valymui pagal šį išradimą, gali būti šviežio papajos latekso ekstraktas, tirpalas, gautas iš pramonėje gaminamo latekso po džiovinimo išpurškimu, papaino koncentratas arba iš dalies išvalytas chimopapainas, o taip pat gaminamo preparato, taip vadinamo švaraus % chimopapaino tirpalas^ Tačiau specialistai puikiai supranta, kad turintys labai sudėtingą sudėtį papajos ekstraktai, pavyzdžiui, papajos lateksas, turi didokus kiekius kitų komponentų, kuriuos pageidautina pašalinti iš jų. Geriausiai pagrindinį tokių komponentų kiekį pašalinti iki neapdirbto chimopapaino tirpalo inkubacijos su afininės chromatografijos matrica, tam naudojamas filtravimas arba centrifugavimas, kurių pagalba yra pašalinama netirpi medžiaga. Tačiau mes nustatėme, kad efektyvesnis yra rūgštinis nusodinimas, kurį atliekant nusėda pgrindinis priemaišų kiekis.

Rūgštinio nusodinimo procedūra, kai neapdirbto chimopapaino tirpalo pH sumažina iki 2 ir duoda tirpalui pastovėti, o po to atskiria chimopapaino tirpalą, chimopapaino valymui naudojama jau 50 metų. Visai netikėtai šio išradimo autoriai nustatė, kad pH reikšmė, kuri nustatoma atliekant šį procesą, turi lemiamos įtakos gaunamo chimopapaino tirpalo užterštumui PPIV. Kaip parodė šio proceso, į kurį anksčiau buvo žiūrima kaip į išankstinę chimopapaino grubaus valymo stadiją, tyrimas, kruopštaus dozavimo ir kontrolės pasėkoje ryškiai sumažėja PPIV priemaišos kiekis, baltymo, kuris, kaip dabar nustatyta, naudojant įprastus būdus yra vaLT 3827 B lomas kartu su chimopapainu. Tuo būdu šio išradimo objektas yra chimopapaino valymo būdas, apimantis

1. nusodinimą iš vandeninio mišinio, turinčio neapdirbtą chimopapainą, esant pH 1,2-1,8;

2. neapdirbto chimopapaino vandeninio tirpalo atskyrimą nuo šio mišinio; ir

3. neapdirbto chimopapaino tirpalo neutralizavimą ir, esant norui, išsūdymą.

Geriausiai iš tokios kompozicijos pašalinti visas joje likusias baltymų priemaišas, įtraukiant į valymo procesą bent vieną įprastos jonitinės chromatografijos stadiją, kaip tai yra aprašyta pas Buttle ir Barrett, 1984 (žr. anksčiau cituotą publikaciją). Tam tikslui geriausia naudoti, būtent paskutinei stadijai, aukštos skiriamosios galios chromatografiją, pavyzdžiui FPLC^R (skystinę baltymų ekspres-chromatografiją) su tokia katijonitine derva, kaip turinčia prekybinį pavadinimą Mono-S arba S-Sepharose^RHP (Pharmacia).

Pagal pirmenybę turintį variantą išradimo objektas yra chimopapaino valymo būdas, apimantis

I) nusodinimą vandeninio mišinio, turinčio neapdirbtą chimopapainą, esant pH reikšmei, žemesnei už 2,0;

II) neapdirbto chimopapaino vandeninio tirpalo atskyrimą nuo nurodyto mišinio;

III) neapdirbto chimopapaino tirpalo neutralizavimą ir, esant norui, išsūdymą;

IV) III stadijoje gauto tirpalo inkubaciją su afininės chromatografijos matrica su aktyviais centrais, kuri turi pagrindą, kuris yra kovalentiškai surištas, esant norui per speiserinę grupę, su chimopapainą grįžtamai inhibuojančio peptido galiniu azoto atomu, to pasėkoje peptidas susijungia su chimopapaino molekulės aktyviais centrais; ir

V) chimopapaino eliuavimą tinkamu eliuentu.

Specialistui akivaizdu, kad nurodytą pirmenybę turinčią katijonitinės chromatografijos stadiją galima vykdyti alternatyviai arba papildomai prieš arba afininės chromatografijos stadiją.

Vandeninis mišinys, turintis neapdirbtą chimopapainą, gali turėti savo sudėtyje, pavyzdžiui, šviežią papajos lateksą, papajos lateksą, išdžiovintą išpurškimo džiovykloje, arba papaino koncentratą (pavyzdžiui, išpurškimo džiovykloje išdžiovintą lateksą, kurį gamina firma Powell and Scholefield, Didžioji Britanija arba Siebels, JAV) suspenduotą vandenyje arba vandeniniame buferyje, pavyzdžiui, fosfatiniame arba acetatiniame. Prieš rūgštinį nusodinimą geriausia yra pašalinti mišinio visą joje netirpią medžiagą, tam yra naudojamas įprastas būdas, pavyzdžiui, filtravimas arba centrifugavimas. Tam, kad sumažinti terpės pH iki 1,0-2,0, geriau iki 1,2-1,8, dar geriau iki maždaug 1,5, ją galima parūgštinti palaipsniui pridedant organinę arba neorganinę rūgštį, geriau vandeninį neorganinės rūgšties tirpalą, konkrečiai druskos rūgšties tirpalą. Nusodinta medžiaga gali būti pašalinta įprastu būdu, pavyzdžiui, filtruojant arba centrifuguoj ant. Buvo nustatyta, kad gautas rūgštus neapdirbto chimopapaino tirpalas turi žymiai mažiau PPIV, papaino ir mažiau PPIII.

Bet kuriam specialistui suprantama, kad prieš vykdant vėlesnę chromatografinio valymo stadiją, rūgštų neapdirbto chimopapaino tirpalą reikia neutralizuoti šarLT 3827 B miniu reagentu, pavyzdžiui, vandeniniu natrio hidroksido tirpalu, ir geriausia iš jo pašalinti druskų perteklių, pavyzdžiui, naudojant gel-filtravimo arba dializės būdus. Bet kokios tuo būdu susidariusios nuosėdos gali būti pašalintos filtruojant arba centrifuguoj ant.

Gerai žinoma, kad cisteino proteinazių aktyvumas gali būti apčiuopiamai padidintas aktyvuojant jas reduktoriumi, pavyzdžiui, ditiotreitolu arba cisteinu, o taip pat išvalant jas nuo tokių sunkiųjų metalų, kaip gyvsidabris, pėdsakų, panaudojant kompleksonus, pavyzdžiui EDTA, arba chlatinėmis savybėmis pasižyminčias dervas, pavyzdžiui, prekybinį pavadinimą Chelex (firma Bio-Rad, Didžioji Baritanija) turinčią dervą. Tokių priemonių pagalba pavyksta pasiekti optimalų kieki laisvų tiolilinių grupių, kurios, kaip yra žinoma, cisteino proteinazių aktyvių centrų skiriamasis bruožas, o jų buvimas yra būtinas paskutiniųjų aktyvumo pasireiškimui. Geriausiai sunkiųjų metalų priemaišos pašalinamos dializuojant buferyje, kuriame yra EDTA. Pagal kitą variantą (naudojant katijonitinę chromatografiją) sunkiųjų metalų pašalinimui galima Įvykdyti chimopapaino aktyvavimą, panaudojant reduktorių. Šiuo atveju chimopapainas susijungia su katijonitinę derva ir po to yra išplaunamas iš kolonėlės. Norint gauti maksimalų aktyvių centrų kieki, neapdoroto chimopapaino tirpalą, gautą po neutralizacijos, apdorojant reduktoriumi, pavyzdžiui, cisteinu, ir praskiedžia iki reikiamos baltymo koncentracijos, pavyzdžiui, iki 30 g/1 koncentracijos. Po to neutralizuotas neapdoroto chimopapaino tirpalas yra inkubuojamas su šiems aktyviems centrams jautria afininės chromatografijos matrica, to pasėkoje chimopapainas per aktyvius centrus specifiškai susijungia su inhibuojančia matricos peptidine jungtimi. Chimopapaino tirpalą per afininės chromatografijos kolonėlę su matrica galima leisti, pavyzdžiui, 35-40 ml/val/cm greičiu. Vienas litras afininės chromatografijos matricos gali surišti maždaug 1-4 g chimopapaino.

Afininės chromatografijos matrica turi pagrindo matricą, pavyzdžiui, gelio arba membraninę matricą, su kuria yra kovalentiškai susijungęs, ir tuo būdu imobilizuotas, inhibitorinis peptidas. Geriausia pagrindo matrica yra agarozės gelis, pavyzdžiui gelis, išleidžiamas prekybiniu pavadinimu Sepharose^R (Pharmacia), nors gali būti vartojamos ir derivatizuotos celiuliozinės membraninės matricos, pavyzdžiui matricos, išleidžiamos prekybiniu pavadinimu Zeta (Anachem). Peptido galinis azoto atomas gali būti susijungęs su pagrindo matrica arba betarpiškai, arba per speiserinę grupę, pavyzdžiui, speiserinę grupę iš devynių anglies atomų, kaip tai yra pirmenybę turinčios gelio matricos, kuri išleidžiama prekybiniu pavadinimu ECH Sepharose^R (Pharmacia) atveju. Ryšys tarp šios gelio matricos karboksilinių grupių ir inhibitorinio peptido laisvomis amino grupėmis, ko pasėkoje susidaro peptidinis ryšys, gali būti gautas įprastu būdu, pavyzdžiui, kondensacijos būdu, kuri vykdoma esant rūgštiniam katalizatoriui, ir kurios vyksmui padeda vandenyje tirpaus karbodiimido, pavyzdžiui N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)karbodiimido hidrochlorido (EDC), priedas. Paprastai prijungimo reakcija yra vykdoma vidutiniškai maišant gelio matricą su inhibitorinio peptido tirpalu, esant EDC, pavyzdžiui, 24 valandas kambario temperatūroje. Santykis tarp reagentų gali būti, pavyzdžiui,

3-4 g peptido 1 litrui gelio.

Afininės chromatografijos matrica gali būti Įdėta į kolonėlę prieš naudojimą. Tačiau naudojant gelio matricą kaip chromatografijos matricą, inkubaciją galima vykdyti ir periodiniu būdu ir, esant norui, įdėti matricą į kolonėlę, norint po to eliuuoti fermentą. Prieš naudojimą geriausia matricą kruopščiai praplauti vanLT 3827 B deniniu buferiu, norint pašalinti nesurišto peptido ir katalizatoriaus pėdsakus. Vykdant procesą pramoniniu būdu, koloną su afininės chromatografijos matrica geriausia apdoroti sanitariškai in situ, pavyzdžiui, vandeniniu etanolio tirpalu, ir tuo būdu padaryti ją tinkama pakartotiniam panaudojimui.

Peptidai, grįžtamai inhibuoj antys chimopapainą, yra peptidai, kurie, būdami imobilizuoti ant pagrindo matricos, sugeba susijungti su aktyviais chimopapaino centrais stipriau, negu su kitų cisternų, esančių neapdoroto chimopapaino preparatuose, konkrečiai PPIV, aktyviais centrais, tačiau kurie po to gali būti išstumti iš šių centrų. Tinkamiausia inhibitorinių peptidų grupė yra aminorūgštys su galiniais anglies atomais, turinčiais tokius aldehidinius darinius, kaip semikarbazonai, fenilalanino metoksiiminai arba ūksimai, arba jo analogai. Labiausiai tinkamos aminorūgštys su galiniais anglies atomais yra tokie fenilalanino dariniai, kaip D arba L-fenilalanino semikarbazonai (PheSc), metoksiiminai (PheMo) arba oksimai (PheOx), arba tokie fenilalanino alanogų dariniai, kaip D arba L-alaninsemikarbazonai (AlaSc) , D arba L-cikloheksilalaninsemikarbazonai (ChaSc) , arba D arba L-leucinsemikarbazonai (LeuSc). Buvo nustatyta, kad kaip chimopapainą inhibuojantys peptidai, su pasisekimu gali būti naudojami šie dipeptidai su

L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc,

PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-L-PheOx, L-Tyr-L-PheSc, L-Ala-L-ChaSc ir L-Ala-L-LeuSc. Dipeptidą L-Phe-L-PheSc aprašė Luaces ir Barrett (1988), 250, 903-909. Pirmenybę turintys peptidai yra, konkrečiai, dipeptidai, ypač L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc ir L-Phe-D-PheSc. Savaime patys inhibuojantys peptidai ir naujos afininės chromatografijos matricos, turinčios šiuos peptidus, taip pat yra šio išradimo objektas.

galiniu anglies atomu: L-Phe-D-PheSC, L-Phe-LLT 3827 B n

Prieš eliuuojant chimopapainą iš afininės chromatografijos matricos, geriausia praplauti ją, norint pašalinti nespecifiškai surištą medžiagą. Praplaunama, pavyzdžiui, vandeniniu buferiu, pavyzdžiui, acetatiniu buferiu su pH 4-5. Buvo nustatyta, kad į plovimui arba eliuavimui naudojamą buferį tikslinga yra pridėti reagentus, kurie neleidžia vykti hidrofobinėms sąveikoms ir kitoms nespecifinėms jungimosi reakcijoms tarp matricos ir neapdorotame chimopapaine esančių komponentų. Tokie reagentai yra, būtent, EDTA, izopropanolis ir etandiolis.

Po to surištas chimopapainas gali būti eliuotas iš matricos, panaudojant tinkamą eliuentą, kuris suardo ryšį tarp imobilizuoto inhibuojančio peptido ir su juo susijungusio chimopapaino, sumažindamas aktyvių centrų giminingumą inhibuojančiam peptidui, tai gali būti pasiekta, pavyzdžiui, pakeičiant aktyvių centrų charakteristikas, panaudojant tokį denatūruojantį agentą, kaip izopropanolį, arba eliuentą, kurio pH yra žemiau ar aukščiau pH intervalo, kuriame vyksta chimopapaino surišimas. Tačiau, reikia pažymėti, kad tam tikslui tinkami eliuentai yra tik tokie, kurie neiššaukia chimopapaino negrįžtamo inaktyvavimo. Pagal kitą variantą chimopapainas gali būti selektyviai išstumtas iš imobilizuoto inhibuojančio peptido panaudojant eliuentą, kuriame yra perteklius komponento, patvariai susijungiančio su inhibuojančiu peptidu. Tuo būdu šiuo komponentu gali būti, pavyzdžiui, kita cisteino proteinazė.

Tačiau pagal pirmenybę turintį šio išradimo realizavimo variantą toks eliuentas turi cisteino proteinazės grįžtamą inhibitorių, kuris konkurentiškai susijungia su chimopapaino aktyviais centrais ir tuo būdu išstumia jį iš imobilizuoto inhibuojančio peptido. Tinkami yra žinomi inhibitoriai, pavyzdžiui, tokie nedidelės moleLT 3827 B kulinės masės disulfidai, kaip 2,2'-dipiridilsulfidas, oksietildisulfidas, metil-2-piridildisulfidas ir natrio tetrationatas, o taip pat tokie gyvsidabrio reagentai, kaip gyvsidabrio chloridas, p-chlormerkurilbenzoatas ir mersalilas. Specialistui akivaizdu, kad chimopapaino giminingumas imobilizuotam inhibitoriniam peptidui priklausys nuo naudojamo peptido prigimties, pH, joninės jėgos ir eliuavimui naudojamo buferio sudėties, o taip pat nuo temperatūros. Todėl, priklausomai nuo šių parametrų, keisis chimopapaino eliuavimui naudojamos inhibuojančios proteinazės ir prigimtis, ir koncentracija. Toliau reikia pažymėti, kad gyvsidabrio reagentų atveju pusiausvyrinė būsena su surištu chimopapainu nusistovi greičiau, negu disulfidinių reagentų atveju, ir todėl tokius inhibitorius galima naudoti eliuavimo vykdymui nepertraukiamu metodu. Naudojant inhibitorius, kurių pusiausvyros su surištu chimopapainu susidarymas yra lėtas, prieš chimopapaino eliuavimą gali prireikti matricos su inhibitoriumi, pavyzdžiui, 1-2 arba daugiau valandų inkubavimo. Tačiau baltymo kiekis ir proteinazės aktyvumas eliuato frakcijoje gali būti kontroliuojamas įprastu būdu, efektyviam ir selektyviam chimopapaino išstūmimui iš matricos galima keisti joninę jėgą arba eliuanto prigimtį ir matricos su inhibitoriumi inkubavimo trukmę.

Eliuento frakcijos su žemu baltymo kiekiu arba su žemu chimopapaino aktyvumu po to gali būti atmestos.

Tam, kad būtų susilpninta chimopapaino ir inhibitorinio peptido tarpusavio sąveika, eliuento pH geriau palaikyti pakankamai žemame lygyje, pavyzdžiui, 4-5 ribose, geriausia kad pH būtų lygus 4,5. Buvo nustatyta, kad tinkami eliuentai yra, pavyzdžiui, oksietildisulfidas (100 mM) vandeniniame etandiolio (33 %) tirpale, turinčiame natrio citratą (50 mM) ir EDTA (1 mM) ir kurio pH=4,5; dipirildilsulfidas (30 mM) vandeniniame etanLT 3827 B diolio (33 %) tirpale, turinčiame natrio citratą (50 mM) ir EDTA (1 mM) ir kurio pH=4,5; metilpiridildisulfidas (30 mM) vandeniniame etandiolio (33 %) tirpale, turinčiame natrio citratą (50 mM) ir EDTA (1 mM) ir kurio pH=4,5; mersalilo rūgštis (10 mM) vandeniniame etandiolio (33 %) tirpale, turinčiame natrio hidroksidą (50 mM) ir EDTA (25 mM) ir kurio pH nustatomas acto rūgšties pagalba iki 4,5; ir gyvsidabrio chloridas (10 mM) vandeniniame etandiolio tirpale, turinčiame natrio acetatą (50 mM) ir kurio pH=4,5) . Geriausiu grįžtamu proteinazės inhibitoriumi yra gyvsidabrio chloridas.

Afininė chromatografija, naudojama pirmenybę turinčiame būdo realizavimo variante pagal šį išradimą chimopapaino valymui, žymiai padidina chimopapaino specifinį aktyvumą, kuris nustatomas kaip aktyvumas ΒΑΡΝΑ atžvilgiu, arba titruojant reagentų aktyvius centrus E-64 arba jodacto rūgštimi. Aktyvi chimopapaino forma yra surišama pirmiausia ir eliuuojasi, ir tuo būdu skiriasi nuo neaktyvios formos ir kitų cisteino proteinazių, esnčių pradiniame produkte. Šį išradimą atitinkantis šviežiai pagamintas chimopapainas, išvalytas panaudojant afininę chromatografiją, paprastai turi ne mažiau 70, geriau ne mažiau 80, geriausia ne mažiau 90 % aktyvaus fermento.

Paprastai išvalytą chimopapainą prieš laikymą arba naudojimą išskiria iš eliuato. Tinkamiausiu atveju eliuuotą chimopapainą papildomai valo, kad iš aktyvių fermentų centrų būtų išstumtas cisteino proteinazės inhibitorius. Inhibitorius gali būti išstumtas pridedant reduktoriaus, pavyzdžiui, cisteino, perteklių, ir po to, esant norui, pašalintas įprastais būdais, pavyzdžiui, gel-filtravimu arba dialize. Pagal kitą variantą inhibitorius gali būti pašalintas adsorbcijos ant tam tikros dervos būdu. Taip, pavyzdžiui, nedidelės molekulinės masės disulfidai gali adsorbuotis ant afininės chromatografijos galiutationo kolonėlės, o gyvsidabrio reagentai - ant dervų, pasižyminčių kompleksinančiomis savybėmis. Pagal pirmenybę turintį variantą inhibitorių pašalina aktyvuojant fermentą reduktoriumi, pavyzdžiui cisteinu, kuris katijonitinėje kolonėlėje yra surištame būvyje, ir po to išplaunant inhibitorių iš kolonėlės.

Tinkamiausiu atveju išskirtą išvalytą chimopapainą prieš laikymą liofilizuoj a, pavyzdžiui, sublimacinio džiovinimo būdu.

Šį išradimą atitinkančio chimopapaino charakteristikos gali būti nustatytos žinomais metodais. Tokiems metodams priklauso, pavyzdžiui, aminorūgščių analizė {aminorūgščių su galiniu azoto atomu); aktyvių centrų titravimas reagentu E-64 (arba jodacto rūgštimi ir tuo pačiu metu inaktyvavimo greičio nustatymas; elektroforezė natrio dodecilsulfate arba daugiazoninė katodinė elektroforezė poliakrilamido gelyje, o taip pat aktyvumo nustatymas įvairių proteinazių substratų atžvilgiu .

Šį išradimą atitinkantys nauji inhibitoriniai peptidai gali būti gauti analogiškais žinomais metodais. Taip, pavyzdžiui, dipeptidų dariniai gali būti gauti daugiastadijinės sintezės keliu šiuo būdu:

a) galinis aminorūgšties (pirmos aminorūgšties) anglies atomas, kuris po to turi tapti inhibuojančio peptido galiniu C atomu, gali būti apsaugotas, pavyzdžiui, reaguojant su O,N-dimetilhidroksilamino hidrochloridu, esant izobutilchloroformiatui ir N-metilmorfolinui; reakcijos pasėkoje susidaro dimetilhidroksiamido darinys. Geriausia, kad pirmosios aminorūgšties galinis atomas pradžioje būtų apsaugotas, pavyzdžiui, tretiniu butoksikarbonilu.

b) apsaugota pirmoji aminorūgštis, pavyzdžiui, jos dimetilhidroksamido darinys, gali po to reaguoti su stipria, pavyzdžiui, trifluoracto, rūgštimi, susidarant ketvirtinei amonio druskai.

c) po to apsaugota pirmosios aminorūgšties ketvirtinė amonio druska gali reaguoti su antrosios aminorūgšties dariniu, pavyzdžiui, su N-karbobenzoksi-dariniu, susidarant dipeptido dariniui;

d) gautas dipeptido darinys gali būti suredukuotas, reaguojant jam su švelniu reduktoriumi, pavyzdžiui, diizobutilaliuminio hidridu arba ličio aliuminio hidridu, susidarant laisvai aldehidinei grupei prie dipeptido galinio anglies atomo;

e) gautas aldehidas gali būti paverstas, pavyzdžiui, į semikarbazoną, reaguojant su semikarbazidu, į metoksiiminą, reaguojant su metoksiaminohidrochloridu, arba i, oksimą, reaguojant su hidroksilaminu;

f) paskutinėje stadijoje nuo apsaugoto galinio azoto atomo gali būi pašalinta apsauginė grupė: pavyzdžiui, N-karbobenzoksigrupė gali būti pašalinta, katalitiškai redukuojant su 10 % paladžiu ant aktyvuotos anglies.

Analizės metodų aprašymas

Baltymo nustatymas

Tuo atveju, jei galima, baltymo koncentraciją nustatinėjome A₂₈₀ metodu, naudojant A₂₈₀ 1% = 20,0 papajos latekso preparatų analizei ir A₂₈₀ 1 % = 18,3 išvalyto arba iš dalies išvalyto chimopapaino produktų analizei (Robinson, 1975, Biochemistry, 14, 3695-3700). Kai kurie tiolą turintys reagentai ir disulfidai pasižymi šviesos sugėrimu prie 280 nm, todėl, jei jie yra baltyme, tai baltymo koncentracijos nustatymui naudojome Bio-Rad analizę su dažo surišimu (Bio-Rad Laboratories, Didžioji Britanija). Standartais naudojami išpurškimo džiovykloje išdžiovinto papajos latekso tirpalai (A₂₈₀ 1 %

20,

Šis metodas mažiau jautrus priemaišoms, negu A₂₈₀. Išvalyto fermento preparatuose baltymo kiekis buvo nustatomas, skaičiuojant bendram sausos medžiagos kiekiui.

Chimopapaino aktyvumo nustatymas

a) Aktyvumas ΒΑΡΝΑ atžvilgiu (Metodika Nr. 1) - analizė Smito metodu

Tiriamą bandini supildavo i 1 buferį , vandeninį natrio fosfato (0,1 M) tirpalą, kurio pH=6,0, ir kuriame yra EDTA (lmM) ir cisteino hidrochlorido monohidratas (10 mM), su tokiu apskaičiavimu, kad galutinis tūris būtų 1 ml. Prieš reakcijos pradžią fermentą (jei jis yra bandinyje) aktyvavo 5 min 37°C temperatūroje, pridedant 4 ml substrato Ν-α-benzoil-DL-arganino pnitroanilido (ΒΑΡΝΑ) (1,25 mM) tirpalo, prieš tai pašildyto iki 37°C.

Pastaba: substrato tirpalą gaminome ištirpinant 300 mg ΒΑΡΝΑ šiltame dimetilsulfokside, po to gautą tirpalą lėtai supylėme į 450 ml, prieš tai iki 37°C pašildyto, 1 buferio tirpalą ir pylėme 1 buferį iki bendro 500 ml tūrio; tam, kad neiškristų i nuosėdas ΒΑΡΝΑ, substrato tirpalo temperatūrą palaikėme virš 30°C.

Inkubaciją 37°C temperatūroje tęsėme 30 minučių, po to reakciją nutraukdavome 1 ml acto rūgšties (4 N) pridėjimu i reakcijos mišinį. Išsiskyrusį 4-nitroaniliną nustatydavome matuojant ΔΑ₄₁₀. Vienas aktyvumo vienetas šiomis sąlygomis atitiko 1 pikomolio 4-nitroanilino išsiskyrimui (ε=8800 M’¹.cm’¹) per sekundę.

Pateiktos analizės atlikimo sąlygos atitiko sąlygas, aprašytas Didžiosios Britanijos patente Nr. 2098997, pateiktame Smith Laboratories Ine. Šiomis sąlygomis yra analizuojami chimopapaino preparatai visame pasaulyje, pavyzdžiui, chimopapainas, išleidžiamas firmos The Boots Company PLC su prekybiniu pavadinimu Chymodiactin, ir chimopapainas, išleidžiamas Pietų Korėjos firmos Sinpoong su prekybiniu pavadinimu Disken. Šie aktyvumo vienetai yra tarptautiškai pripažinti ir paprastai vadinami Smith ΒΑΡΝΑ Assay Units.

b) Aktyvumas ΒΑΡΝΑ atžvilgiu (Metodika Nr. 2)

Tiriamą bandinį supildavo į vandeninį buferinį natrio fosfato tirpalą (0,10 M), kurio pH=6,8 ir kuriame yra EDTA (1 mM) ir ditiotreitolas (2 mM) arba cisternas (4 mM) , su tokiu apskaičiavimu, kad galutinis tūris būtų 0, 975 ml. Prieš reakcijos pradžią fermentą (jei jis yra bandinyje) aktyvavo 40°C temperatūroje 5 minutes, pridedant 25 μΐ Ν-α-benzoil-DL-arganino p-nitroanilido (ΒΑΡΝΑ) tirpalo (100 mM) dimetilsulfokside. Inkubaciją 40°C temperatūroje tęsė 10 min, o po to reakciją nutraukdavome 1 ml (0,10 M) vandeninio buferinio tirpalo, turinčio natrio chloracetatą ir natrio acetatą (0,20 M) ir pH=4,3, pridėjimu į reakcijos mišinį. Išsiskyrusį 4-nitroaniliną nustatinė j ome matuojant ΔΑ₄₁₀. Vienas aktyvumo vienetas šiomis sąlygomis atitiko 1 pikomolio 4-nitroanilino išsiskyrimui (ε = 8800 M ^L, cm ^J) per sekundę.

Chimopapaino aktyvumo absoliučios reikšmės, gautos pasinaudojant aprašytomis Metodikomis Nr. 1 ir Nr. 2, skiriasi viena nuo kitos, ir būtent: reikšmės, gautos pasinaudojant Metodika Nr. 2 maždaug 2-3 kartus didesnės, už reikšmes, gautas pagal Metodiką Nr. 1 (žr. 31 pavyzdį).

c) Aktyvių centrų titravimas jodacto rūgštimi

Chimopapaino aktyvių centrų titravimą jodacto rūgštimi vykdėme taip pat, kaip ir aktyvių centrų titravimą reagentu E-64, aprašytą Zucker ir kt. Biochim. Biophys. Actą (1985), 828, 196-204. Chimopapaino tirpalą skiedėme 1 buferyje, kaip tai aprašyta aukščiau esančiame skyriuje (a) , gaudami tirpalą, kuriame yra 60 μΜ baltymo (ε₂₈ο ⁼ 4, 3284 x 10 M , cm , paskaičiuotą iš A_28o, % = 18,3, Robinson (1985) (žr. aukščiau cituotą darbą) ir MW (molekulinis svoris) = 23656, apskaičiuotas iš aminorugščių sekos Jacąuet ir kt. (1989 gegužė),

Bio. Chem. Hoppe-Seyler, 37 0, 425-434) . Alikvotines, po ml chimopapaino tirpalo dalis patalpinome į titravimo mėgintuvėlius ir 5 min 37°C temperatūroje inkubavome su 20 μΐ 1 buferio (40 μΐ kontroliniame bandyme) . Po to į kiekvieną mėgintuvėlį pridėjome 20 ml (atitinkamai 10, 20, 30, 40, 50 ir 60 μΜ) jodacto rūgšties ir mišinį palaikydavome 10-20 min 37°C temperatūroje, Reakciją inicijuodavome pridedant į mišinį 4 ml ΒΑΡΝΑ substrato tirpalo, aprašyto aukščiau esančiame skyriuje (a), ir iš anksto pašildyto iki 37°C. 37°C temperatūroje inkubaciją tęsėme 30 min, po to reakciją nutraukdavome, kaip tai yra aprašyta skyriuje (a), ir išsiskyrusio 4-nitroanilino kiekį nustatydavome matuojant ΔΑ₄₁₀. Tuo būdu gautą aktyvaus chimopapaino molinę koncentraciją lygindavome su baltymo moline koncentracija, remiantis chimopapaino moliniu ekstinkcijos koeficientu, kuris lygus 4,3284 10 M cm . Po to aktyvaus chimopapaino koncentraciją išreikšdavome procentais nuo bendro baltymo kiekio.

d) Aktyvumas azokazeino atžvilgiu

Aktyvumą azokazeino atžvilgiu nustatinėj ome pagal metodiką, aukščiau aprašytą Rowan ir kt. (1988), Arch.

Biochem. Biophys. 267, 262-270, naudojant mažiau 1 μΜ fermento (priimant molekulinį svorį 2400) ir, esant reikalui, 1 μΜ vištų cisteino. Visos fermentų ir inhibitoriaus koncentracijos susijusios su aktyvių molekulių koncentracija.

Imunologinė analizė paprastos radialinės imunodifuzijos metodu

Paprasta radialinė imunodifuzij a remiasi Mancini ir kt. , 1965, Imunochem. Jį, 235-254 metodu ir yra atliekama šiuo būdu. Agarozę (1 %) , esančią vandeniniame natrio fosfato tirpale (10 mM) , turinčiame NaCl (0,14 M) ir kurio pH=7,3 bei turinčią monospecifinio IgG preparatą, užpildavo ant Gel Bond (FMC Corporation. Maine, JAV) ir 1,5 cm plote išpjaudavo stačiakampės formos figūras (r=l mm) . Kontrolinius pavyzdžius ir tiriamus bandinius figūrose išdėstydavo atsitiktiniu būdu tam, kad minimizuoti kraštinį efektą. Po antigeno įnešimo į figūras, jas laikydavo 24 valandas precipitino žiedų susidarymui. Po to jas nuplaudavo, išdžiovindavo ir dažydavo. Antigeno priklausomybės nuo žiedo diametro kvadrato priklausomybės gavimui naudojome švarų, saikingai karboksimetilintą antigeną. Nustatymo intervalas buvo 25-300 ng antigeno vienai figūrai .

PPIV ir jos antikūnių gavimas

a) Afininės kolonėlės gavimas

Butiloksikarbonil-L-Phe-p-nitrofenilo esteris (10 mM) maišant buvo pridedamas į a-NH₂CH₂CN.HCI (20 mM) ir diLT 3827 B izopropiletilamino (20 mM) mišinį dimetilformamide (20 ml). Mišinys 20°C temperatūroje buvo maišomas 2 valandas, po to praskiedžiamas etilacetatu (100 ml) , 2 kartus praplaunamas vandeniu, 5 kartus vandeniniu trietilamino tirpalu, 3 kartus vandeniu, 2 kartus kalio bisulfito tirpalu, 3 kartus vandeniu, džiovinamas ir išgarinamas. Nuosėdas perkristalinome iš etilacetato ir heksano mišinio, gaudami BOC-L-Phe-NHCH₂CN, lyd. temp. 134,5-135°C. Ledu atšaldytą trifluoracto rūgštį (10 ml) pridėjome į Boc-L-Phe-NHCH₂CN (5 mM) tirpalą dichlormetane (10 ml) . Reakcijos mišinį 30 min laikėme 20°C temperatūroje, po to tirpiklį pašalinome išgarinant 40°C temperatūroje. Liekaną tirpinome chloroforme, tirpalą išgarindavome ir aprašytą operaciją kartojome dar du kartus. Gautą neapdirbtą trifluoracetatinę druską ištirpinome diizopropiletilamino (7,5 mM) tirpale dimetilformamide (10 ml) ir pridėjome į paruoštą Boc-Glyp-nitrofenilo eterio (6,25 mM) ir N-hidroksibenzotriazolo monohidrato (6,25 mM) tirpalą. Po to, p-nitrofenolio išskyrimui (auksinė spalva), į mišinį lašais buvo pridedamas pakankamas kiekis diizopropiletilamino ir mišinys buvo maišomas kambario temperatūroje 2 valandas. Po to į šį mišinį pridėjome N,N-dietiletilendiamino (1,5 ml) , po 15 min etilacetato (60 ml) , o po to mišinį plovėme vandeniu, vandeniniu trietilamino tirpalu, vandeniu, kalio bisulfito vandeniniu tirpalu, vandeniu, džiovinome ir išgarinome. Liekaną valėme chromatografijos ant silikagelio būdu, eliuavimas buvo atliekamas etilacetato ir heksano (20:1) mišiniu. Buvo gautas putų pavidalo Boc-L-Phe-NHCH₂CN.

Boc-Gly-L-Phe-NHCH₂CN (30 mg) tirpinome 1 ml trifluoracto, dichlormetano ir anizolo mišinio (25:65:10) ir tirpalą 30 min laikėme 0°C temperatūroje. Po to mišinį džiovinome rotaciniame garinimo aparate 34°C temperatūroje ir liekaną tirpinome metanolyje (1,5 ml) ir vandeniniame NaHCO₃ tirpale (0,1 M, pH=8,0. 1,5 ml), gaudami ligando tirpalą.

Aktyvuotą CH-Sepharos^R4B (Pharmacia, 3 g sauso svorio) hidratavome per naktį vandeniniame druskos rūgšties tirpale (1 mM, 75 ml) 4°C temperatūroje, po to plovėme druskos rūgštimi (mM, 600 ml), o po to vandeniniu NaHCO₃ tirpalu (0,1 M, pH=8,0, 300 ml) . Gelį suspendavome vandeniniame NaHCO₃ tirpale (0,1 M, pH=8,0, 30 ml), pridėdami į suspensiją iš anksto paruoštą ligando tirpalą, ir mišinį atsargiai maišėme per naktį 20°C temperatūroje. Gautą gelį surinkome sukepto stiklo filtre, praplovėme vandeniniu metanolio tirpalu (50 tūrinių %, 180 ml), vandeniu ir suspendavome vandeniniame etanolamino tirpale (0,1 M, 30 ml) , kurio pH buvo nustatytas lygiu 9, panaudojant druskos rūgštį. Suspensija buvo purtoma 4 vai 20°C temperatūroje, po to gelį surinkome, praplovėme vandeniu (500 ml) ir laikėme darbiniame buferyje (natrio fosfatas (50 mM) ; EDTA (1 mM); etandiolis (33 %), pH=6,8, 4°C).

b) PPIV valymas

Kolonėlę, užpildytą Sepharose^R-Ahx-Gly-L-Phe-NHCH₂CN, praplovėme eliuuoj ančių buferiu (natrio citratas (50 mM) ; etandiolis (33 %), pH=4,5; 12 ml) ir po to darbiniu buferiu (žr. aukščiau, 12 ml).

Išpurškimo džiovykloje išdžiovintą papajos lateksą (0,5 g) ištirpinome darbiniame buferyje (10 ml) ir tirpalą filtravome per filtrą, kurio porų diametras buvo 0,22 μΜ. Baltymo koncentraciją filtrate nustatinėj ome pasinaudojant Bio-Rad dye-binding analize (Bio-Rad Laboratories, Didžioji Britanija). į mišinį pridėjome tokį ditiotreitolo kiekį, kad jo koncentracija būtų 2 mM, ir mišinį laikėme 20 min 0°C temperatūroje. Per kolonėlę praleidome 80 mg baltymo latekso (38 ml/val/cm )

20°C temperatūroje, o po to darbinį (8 ml) ir eliuuojantį (8 ml) buferius. Po to pro ją praleidome 4 ml eliuuojančio buferio, turinčio oksietildisulfido (50 mM), po to tirpalų leidimą pro kolonėlę nutraukdavome ir palikdavome ją nakčiai 20°K temperatūroje. Po išlaikymo per naktį pratęsėme eliuavimą oksietildisulfidą turinčiu eliuuojančiu buferiu (10 ml) ir surinkome eliuato frakcijas (po 1 ml). Frakcijas, aktyvias ΒΑΡΝΑ atžvilgiu, surinkome į vieną vietą ir praleidome pro kolonėlę, užpildytą Mono HR 5/5^R (katijonitinė derva), kuri prieš tai buvo apdorota vandeniniu natrio acetato/acto rūgšties mišiniu (50 mM), kurio pH=5 ir kuriame buvo EDTA (1 mM) . Po to kolonėlę plovėme tuo pačiu buferiu (1 ml/min) iki tol, kol A₂₈₀ vėl nerodė nulinės reikšmės. Po to pro kolonėlę leidome gradientą (21,5 mMNa⁺/ml) iki 1 M natrio acetato (Buttle ir Barrett, 1984, aukščiau cituotas darbas) ir surinkinėjome frakcijas po 1 ml. Eliuavome du pagrindinius baltymo pikus: pirmą piką, kurio eliuavimas vyko esant maždaug 0,17 M Na⁺, atitinkantį papainui, ir antrą piką, kurio eliuavimas vyko esant maždaug 0,38 M Na⁺, atitinkantį PPIV. Frakcijas su piku, atitinkančiu PPIV, apjungėme, dializavome vandeniniame EDTA tirpale (1 mM) , džiovinome sublimacinio džiovinimo būdu ir laikėme 20°C temperatūroje. Švari PPIV nepasižymėjo aktyvumu ΒΑΡΝΑ atžvilgiu, tačiau pasižymėjo aktyvumu hidrolizuoto azokazeino atžvilgiu, šis aktyvumas nebuvo inhibuojamas 1 mM koncentracijos vištų cisteinu.

c) PPIV antikūnių gavimas

Švarų PPIV antigeną prieš naudojimą minkštai karboksimetilinome pagal Zucker ir kt. metodą, 1985, Biochim. Biophys. Actą, 828, 196-204. Po to PPIV antiserumą inicijavome triušyje, darydami 360 mg karboksimetilinto baltymo pilname Freund adjuvante injekciją į raumenis, bei darydami po 2 savaičių 100 mg nepilname adjuvante poodinę injekciją. IgG iš dalies valėme nuo serumo frakcionuojant su amonio sulfatu, kaip tai aprašė Heide ir Schwick (1978) Handbook of Experimental Immunology (Weir, D. M. ed.). Vol. 1, 7.1-7.11, Blackwell, Oxford, bei po to dializuojant vandeniniame natrio fosfato tirpale (10 mM) , turinčiame NaCl (0,14 M) ir kurio pH=7,3.

PPIV analizei paprastos radialinės imunodifuzijos būdu (žr. aukščiau) naudojome specifinį PPIV atžvilgiu preparatą IgG.

Atskiri šio išradimo aspektai nuodugniau iliustruojami žemiau pateiktų pavyzdžių pagalba, tačiau kurie yra tik išimtinai iliustracinė medžiaga ir jokiu būdu neapriboja patentu ginamo išradimo turinio.

Panaudotų abreviatūrų reikšmės yra šios: ABTS, 2,2'azinobis(3-etilbenztriazolino sulforūgštis); Ahx, 6aminoheksanoilas; Ala, alaninas; ΒΑΡΝΑ, Ν-α-benzoil-DLarginino p-nitroanilidas; Boc, butiloksikarbonilas; CBZ, karbobenzoksi; Cha, cikloheksilalaninas; DMF, N,Ndimetilformamidas; E-64, L-3-karboksi-2,3-trans-epoksipropionilleucilamido-4(-guanidino)butanas; EDC, N-etilN'-(2-dimetilaminopropil)karbodiimido hidrochloridas; EDTA, etilendiamintetraacto rūgštis (dinatrio druska); Gly, glicinas; Leu, leucinas; Mo, metoksiiminas; OBZ, oksibenzilas; Ox, oksimas; Phe, fenilalaninas; Sc, semikarbazonas; THF, tetrahidrofuranas; ir Tyr, tirozinas.

Bio-Rad, Chelex, Chymodiactin. Ch-Sepharose 4B, Chymofast, Disken, ECH-Sepharose, Enzifitter, FPLC, Gel Bond, Mono SHR, S-Sepharose HP, Tween, Zeta ir Zetaffinity yra prekybiniai pavadinimai.

Visos stadijos, jei tai nepaminėta atskirai, buvo vykdomos kambario temperatūroje.

PAVYZDYS - L-alanil-L-fenilalanil semikarbazonas a stadija

A) Į sausą N,N-dimetilformamidą (DMF) (100 ml) maišant kambario temperatūroje pridėjome 0,N-dimetilhidroksilamino hidrochlorido. Po to į mišinį per 5 minutes buvo pridedamas N-metilmorfolinas (10,6), palaikant temperatūrą žemiau 30°C. To pasėkoje iškrito baltos nuosėdos ir mišinį atšaldėme iki 0°C.

B) N-t-Boc-L-Phe (26,5 g) ištirpinome sausame tetrahidrofurane (THF) (200 ml) ir atšaldėme tirpalą iki —10°C, po to per 5 minutes į jį pridėjome izobutilchloroformatą (14,38 g), palaikant temperatūrą -10°C.

Po to į mišinį per 10 min pridėjome N-metilmorf oliną (10,6 g), palaikant mišinio temperatūrą -10°C, ir maišymą tęsėme dar 10 minučių.

C) Į suspensiją B per 15 min buvo pridedama suspensija A, palaikant temperatūrą -10°C. Mišiniui leidome sušilti iki kambario temperatūros ir po to maišėme jį 3 valandas. Gautą mišinį atšaldėme iki 0°C ir per 5 min pridėjome 3-dimetilaminopropilaminą (10,2 g). Po to pridėjome vandenį (200 ml) ir etilacetatą (200 ml) , atskyrėme viršutinį organinį sluoksnį ir nuosekliai plovėme jį (a) vandeniu (200 ml) , (b) vandeniniu KHCO₃ tirpalu (5 %, 200 ml), (c) vandeniniu HCI tirpalu (0,5 N,

200 ml) ir (d) vandeniu (3x200 ml) . Po to tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei 30°C temperatūrai, ir gavome N-t-Boc-L-Phe0,N-dimetilhidroksamatą.

b stadija

N-t-Boc-L-Phe-O,N-dimetilhidroksamato (2,9 g) ir trifluoracto rūgšties (8 ml) mišinį maišėme keturias valandas kambario temperatūroje. Po to trifluoracto rūgšties perteklių pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei 30°C temperatūrai. Prie liekanos pridėjome dietilo eteri, (30 ml) ir gavome tirpalą, po to eteri, nudistiliavome vakuume. Apdorojimą eteriu kartojome iki tol, kol prasidėjo kristalizacija. Kietą medžiagą nufiltravome, praplovėme eteriu ir džiovinome vakuume virš P₂O₅, gavome L-Phe-O,N-dimetildichroksamato trifluoracetato druską.

c stadija

A) L-Phe-0,N-dimetilhidroksamato trifluoracetato druską (7,15 g) ištirpinome sausame DMF (30 ml) maišant kambario temperatūroje, po to i tirpalą per 5 min pridėjome N-metilmorfolino (2,35 g), palaikydami žemesnę nei 30°C temperatūrą. Gautą mišinį atšaldėme iki 0°C.

B) CBZ-L-Ala (4,96 g) maišant ištirpinome sausame THF (55 ml) ir mišinį atšaldėme iki -10°C. Po to 1 mišinį per 5 min pridėjome izobutilchloroformiatą (3,05 g) — 10°C temperatūroje, N-metilmorfoliną (2,35 g) per 10 min ir reakcijos mišinį po to dar maišėme 10 min —10°C temperatūroje.

C) A tirpalą per 15 min pridėjome prie B tirpalo -10°C temperatūroje, po to leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros ir maišymą tęsėme dar 3 valandas. Po to mišinį atšaldėme iki 0°C, per 5 min pridėjome 3dimetilaminopropilaminą (2,27 g) ir po to maišėme dar 5 min. Po to i mišinį pridėjome vandeni (50 ml) ir etilacetatą (50 ml), viršutini organini sluoksnį atskyrėme ir nuosekliai plovėme ji (a) vandeniu (50 ml) ir sočiu vandeniniu NaCI tirpalu (5 ml), (b) vandeniniu

KHCO₃ tirpalu (5 %, 50 ml) , (c) vandeniniu HCl tirpalu (0,5 N, 50 ml) ir (d) vandeniu (3x50 ml) . Po to tirpiklį nugarinome vakuume rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai, prie liekanos pridėjome šviežio etilacetato (50 ml) ir pašalinome jį išgarinant, gavome CBZ-L-Ala-L-Phe-0,N-dimetilhidroksamatą .

d stadija

CBZ-L-Ala-L-Phe-O,N-dimetilhidroksamatą (27,8 g) ištirpinome sausame THF (280 ml) ir atšaldėme tirpalą iki -70°C azoto atmosferoje. Po to per 60 min, -70°C temperatūroje ir azoto atmosferoje į šį tirpalą pridėjome diizobutilaliuminio hidrido tirpalo THF (1 M, 372 ml) ir maišymą tęsėme dar 60 min -70°C temperatūroje. Reakcija būdavo užbaigiama maišant supilant mišinį 0°C temperatūroje ir N₂ atmosferoje į sotų vandeninį NaCI tirpalą (400 ml) ir Segneto druskos tirpalą (600 ml)

Po to mišiniui buvo leidžiama sušilti iki kambario temperatūros ir į jį pridėjome etilacetatą (600 ml) sluoksnį

Po to mišinį filtravome, atskyrėme vandeninį ir jį ekstrahavome Sujungtas organines fazes tris kartus plovėme vandeniu (600 ml) ir sočiu vandeniniu NaCI tirpalu (400 ml) . Tirpiklį pašalinome vakuume rotaciniame išgarinimo apaetilacetatu

1200 ml' rate, esant žemesnei nei perkristalinome iš toluolo

P₂O₅. Gavome CBZ-L-Ala-L-Phe-aldehidą.

C temperatūrai. Liekaną ir džiovinome vakuume virš e stadija

A) CBZ-L-Ala-L-Phe-aldehidą (3 g) ištirpinome techniniame metilo spirite (20 ml) . Tirpalą pašildėme iki

50°C ir filtravome, norint pašalinti netirpią medžiagą.

B) Semikarbazido hidrochlorido (1,3 g) tirpalą vandenyje (10 ml) pridėjome i KHCO₃ (1,1 g) vandenyje (10 ml).

C) Tirpalą B pridėjome i tirpalą A ir gautą mišinį maišėme 2 vai 50°C temperatūroje, po to į jį pridėjome etilacetatą (50 ml) ir vandenį (100 ml), vandeninį sluoksnį atskyrėme, ekstrahavome jį etilacetatu (2x20 ml) ir sujungtas organines fazes nuosekliai plovėme (a) vandeniniu KHCO₃ tirpalu (5 %, 50 ml·) , (b) vandeniniu

HCI tirpalu (0,5 N, 50 ml) ir (c) vandeniu ir sočiu vandeniniu NaCl tirpalu (50 ml/20 ml x 3) . Po to tirpiklį išgarindavome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant temperatūrai žemesnei nei 30°C. Gavome CBZ-L-Ala-L-PheSc.

f stadija

CBZ-L-Ala-L-PheSc (680 mg) ištirpinome metanolyje (90 ml) ir netirpią liekaną atskyrėme filtruojant. Aparatą, kuriame buvo CBZ-L-Ala-L-PheSc metanolis tirpalas, prapūtėme N₂ ir pridėjome į jį katalizatorių - 10 %-nį paladį ant aktyvuotos anglies (100 mg) . Į uždarą sistemą 75 min leidome H₂. Po to katalizatorių nufiltravome ir metanolį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant temperatūrai žemesnei nei 30°C. Iš liekanos stovint išsikristalindavo kristalinės nuosėdos, kurias džiovinome vakuume virš P₂05. Gavome L-alanil-Lfenilalanil semikarbazoną (L-Ala-L-PheSc).

PAVYZDYS L-fenilalanil-L-fenilalanil semikarbazonas a ir b stadijos

L-Phe-O,N-dimetilhidroksamato trifluoracetato druską sintezavome taip pat, kaip 1 pavyzdžio a ir b stadijose .

c stadija

A) L-Phe-O,N-dimetilhidroksamato trifluoracetato druską (1,932 g) ištirpinome sausame DMF (8 ml) maišant kambario temperatūroje. Į gautą tirpalą per 5 min pridėjome N-metilmorfoliną (0,606 g), palaikant temperatūrą žemiau nei 30°C, ir gautą mišinį atšaldėme iki 0°C.

B) CBZ-L-Phe (1,794 g) maišant ištirpinome sausame THF (15 ml) ir mišinį atšaldėme iki -10°C, po to į mišinį per 5 min -10°C temperatūroje pridėjome izobutil·chloroformiatą (0,822 g), ir per 10 min N-metilmorfoliną (0,606 g), ir gautą reakcijos mišinį maišėme dar 10 min -10°C temperatūroje.

C) Per 15 min tirpalą A pridėjome į tirpalą B -10°C temperatūroje, leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros ir maišymą tęsėme dar 3 vai. Po to mišinį atšaldėme iki 0°C, per 5 min pridėjome į jį 3-dimetilaminopropilaminą (0,612 g) ir maišymą tęsėme dar 5 min. Po to į mišinį pridėjome vandenį (20 ml) ir etilacetatą (30 ml), atskyrėme organinę fazę ir nuosekliai plovėme ją (a) vandeniniu KHCO₃ tirpalu (5 %, 20 ml, ) (b) vandeniniu HCI tirpalu (0,5 N, 20 ml) ir (c) vandeniu (2x30 ml). Tirpiklį pašalinome rotaciniame džiovinimo aparate vakuume žemesnėje nei 35°C temperatūroje. Liekaną perkristalinome iš izopropilo spirito. Gavome CBZ-L-Phe-L-Phe-0,N-dimetilhidroksamatą.

d stadija

CBZ-L-Phe-L-Phe-0,N-dimetilhidroksamatą (4,89 g) ištirpinome sausame THF (40 ml) . į sausą kolbą (azoto atmosferoje) įdėjome ličio-aliuminio hidridą (0,493 g) ir sausą THF (20 ml) ir maišėme gautą mišinį 10 min, o po to gautą mišinį atšaldėme iki -10°C. Po to į šitą miLT 3827 B šinį N₂ atmosferoje ir -50°C temperatūroje pridėjome hidroksamato tirpalą sausame THF ir maišymą tęsėme dar 20 min 0-5°C temperatūroje.

Po to reakcijos mišinį atšaldėme iki -50°C temperatūros ir azoto atmosferoje pridėjome į jį sotų Segneto druskos tirpalą (60 ml) . Leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros, pridėjome į jį HCI (kone., 10 ml) ir nustatėme vandeninės fazės pH=3, netirpią dalį nufiltravome. Po to į nufiltruotą tirpalą pridėjome etilacetatą (50 ml) , organinę fazę atskyrėme ir nuosekliai praplovėme (a) vandeniu (50 ml) , (b) vandeniniu KHCO₃ tirpalu (5 %, 50 ml) , (c) vandeniniu HCI tirpalu (0,5 N, 50 ml) ir (d) vandeniu (3x50 ml). Po to etilacetatą pašalinome rotacinio išgarinimo aparate vakuume žemesnėje nei 30°C temperatūroje. Liekaną palikome nakčiai, po to džiovinome vakuume virš P₂O₅ ir kristalinome iš toluolo. Gavome CBZ-L-Phe-L-Phe aldehidą.

e stadija

A) CBZ-L-Phe-L-Phe aldehidą 70°C temperatūroje ištirpinome techniniame metilo spirite (10 ml).

B) Į semikarbazido hidrochlorido (0,183 g) tirpalą vandenyje (3 ml) ir techninį metilo spiritą (2 ml) pridėjome natrio acetato trihidratą (0,224) ir tirpalą pašildėme iki 60°C.

c) Tirpalą A pridėjome į tirpalą B, kolbą nuo A tirpalo praplovėme techniniu metilo spiritu, praplovimo skystį pridėjome prie mišinio ir 60-70°C temperatūroje maišėme jį 30 min. Po to leidome mišiniui lėtai atšalti, palikome stovėti jį ant ledo dar valandą ir po to palikome nakčiai 4°C temperatūroje. Kietą produktą atskyrėme filtruojant, praplovėme jį techninio metilo spirito ir vandens mišiniu (4:1, 3 ml) , išdžiovinome vakuume virš P₂O₅. Gavome CBZ-L-Phe-L-PheSc.

f stadija

CBZ-L-Phe-L-PheSc (2,1 g) ištirpinome metanolyje (315 ml) 30°C temperatūroje ir netirpią liekaną pašalinome nufiltruojant. Prietaisą, kuriame buvo metanolinis semikarbazono tirpalas, prapūtėme azotu, įdėjome katalizatorių - 10 %-nį paladį ant aktyvuotos anglies (0,35 g) ir į uždarą sistemą 30 min leidome vandenį. Po to katalizatorių nufiltravome ir tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Liekaną išdžiovinome vakuume virš P₂O₅. Gavome L-fenilalanil-L-fenilalanil semikarbazoną (L-Phe-L-PheSc).

PAVYZDYS L-fenilalanil-L-fenilalanil metoksiiminas a-d stadijos

CBZ-L-Phe-L-Phe aldehidą sintezavome taip pat, kaip tai aprašyta 2 pavyzdžio a-d stadijose.

e stadija

A) CBZ-L-Phe-L-Phe aldehidą (0,645 g) ištirpinome techniniame metanolyje (35 ml) 60-65°C temperatūroje ir netirpią liekaną nufiltravome.

B) Į metoksilamino hidrochlorido (0,138 g) tirpalą vandenyje 60°C temperatūroje pridėjome natrio acetato trihidratą (0,224 g) .

C) Į tirpalą A pridėjome tirpalą B, B medžiagos kolbą praplovėme 60°C vandeniu (10 ml) , praplovimo vandenį apjungėme su mišiniu ir jį kaitinome pusę valandos 60°C temperatūroje, po to palikome 2 valandas atvėsti iki kambario temperatūros. Kietą produktą nufiltravome, praplovėme techninio metanolio mišiniu su vandeniu (1:1, 6 ml) ir džiovinome vakuume virš P₂O₅. Gavome CBZL-Phe-L-Phe metoksiiminą.

f stadija

CBZ-L-Phe-L-Phe metoksiiminą (550 mg) ištirpinome metanolyje ir netirpią liekaną nufiltravome. Prietaisą, kuriame buvo metanolinis metoksiimino tirpalas, prapūtėme azotu, įdėjome katalizatorių - 10 %-nį paladį ant aktyvuotos anglies (100 mg) . Po to į hermetizuotą indą pūtėme vandenilį, esant reikalui, pūtimą tęsėme 4,5 valandos. Po to katalizatorių nufiltravome ir tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant ne didesnei nei 30°C temperatūrai. Gavome L-feni1-alani1-L-fenilaianil-metoksiiminą (L-Phe-L-PheMo) .

PAVYZDYS L-fenilalanil-D-fenilalanil semikarbazonas a stadija

A) O,N-dimetilhidroksilamino hidrochloridą (3,891 g) suspendavome sausame DMF (40 ml) kambario temperatūroje. Į paruoštą suspensiją per 5 min pridėjome Nmetilmorfoliną (4,032 g), mišinio temperatūrą palaikant žemiau 30°C, po to mišinį maišant atšaldėme iki 0°C.

B) N-t-Boc-D-Phe (10,08 g) ištirpinome sausame THF (80 ml) ir gautą tirpalą atšaldėme iki -10°C. Po to į jį, palaikant tą pačią temperatūrą, per 5 min pridėjome izobutilchloroformatą (5,47 g) . Po to palaikant tą pačią temperatūrą per 10 min pridėjome N-metilmorfoliną (4,032 g) ir maišymą tęsėme dar 10 min.

C) Per 15 min esant -10°C temperatūrai, suspensiją A pridėjome į suspensiją B, leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros, o po to maišėme jį dar 3 valandas. Po to mišinį atšaldėme iki 0°C, per 5 min pridėjome 3-dimetilaminopropilamino (3,88 g) ir maišymą tęsėme dar 5 min. Po to į mišinį pridėjome vandenį (60 ml) ir etilacetatą (60 ml), organini sluoksnį atskyrėme ir nuosekliai praplovėme (a) vandeniu (60 ml), (b) vandeniniu KHCO₃ tirpalu (5 %, 60 ml) , (c) vandeniniu HCI tirpalu (0,5 M, 60 ml) ir (d) vandeniu (3 x 60 ml) . Tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo prietaise vakuume, esant žemesnei nei 30“C temperatūrai. Gavome N-t-Boc-D-Phe-0,N-dimetilhidroksamatą.

b stadija

N-t-Boc-D-Phe-O,N-dimetilhidroksamatą (11,3 g) atšaldėme ledu, pridėjome į jį trifluoracto rūgštį (30 ml) ir mišinį maišėme kambario temperatūroje 3 valandas. Trifluoracto rūgšties perteklių pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai, liekaną ištirpinome dietilo eteryje (100 ml) . Tirpiklį nudistiliavome vakuume ir operaciją kartojome tol, kol prasidėjo kristalizacija. Kietą nuosėdą nufiltravome, praplovėme dietilo eteryje ir džiovinome vakuume virš P₂O₅. Gavome D-Phe-O,N-dimetilhidroksamato trifluoracetato druską.

c stadija

A) D-Phe-0,N-dimetilhidroksamato trifluoracto druską (10,1 g) maišant ištirpinome sausame DMF kambario temperatūroje. į gautą tirpalą per 5 min pridėjome Nmetilmorfoliną (3,155 g) , palaikant temperatūrą žemiau nei 30°C, po to mišinį atšaldėme iki 0°C.

B) CBZ-L-Phe (9,4 g), maišant ištirpinome sausame THF (80 ml) ir tirpalą atšaldėme iki -10°C. Po to į tirpalą -10°C temperatūroje pridėjome per 5 min izobutilchloroformiatą (4,307 g), per 10 min N-metilmorfoliną (3,155 g) ir reakcijos mišinį maišėme dar 10 min -10°C temperatūroje.

C) Per 15 min į tirpalą B pridėjome A tirpalą -10°C temperatūroje, po to leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros ir maišymą tęsėme 3 valandas. Mišinį atšaldėme iki 0°C, per 5 min pridėjome į jį 3dimetilaminopropilamino (3,20 g) ir maišymą tęsėme dar 5 min, po to į jį pridėjome vandenį (60 ml) ir etilacetatą (60 ml) , atskyrėme organinę fazę ir nuosekliai plovėme ją (a) vandeniu (60 ml) ir sočiu NaCl tirpalu (60 ml) , (b) vandeniniu KHCO₃ tirpalu (5 %, 60 ml), (c) vandeniniu HCI tirpalu (0,5 N, 60 ml) ir (d) vandeniu (3x60 ml) . Tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo prietaise vakuume, esant žemesnei nei 30°C tempera20 turai. Prie liekanos pridėjome šviežią etilacetatą ir po to jį pašalinome išgarinant. Liekaną perkristalinome iš izopropanolio. Gavome CBZ-L-Phe-D-Phe-O,N-dimetilhidroksamatą.

d) stadija

Į azotu prapūstą kolbą įdėjome diizobutilaliuminio hidridą dichlormetane (1 M, 10 ml) . Kolbą pašildėme iki 50°C, kol pasišalino visas dichlormetanas, ir visą vėl prapūtėme azotu. Po to į kolbą pridėjome sausą THF (10 ml) ir mišinį atšaldėme iki -70°C. CBZ-L-Phe-D-Phe0,N-dimetilhidroksamatą (0,978 g) ištirpinome sausame THF (10 ml) ir paruoštą tirpalą per 10 min -70°C temperatūroje pridėjome į diizobutiloaliuminio hidratą, po to maišymą tęsėme dar 10 min -70°C temperatūroje. Po to reakcijos mišinį išpylėme į metanolio (30 ml) ir sočios Segneto druskos (30 ml) tirpalą -60°C temperatūroje, reakcijos mišiniui leidome sušilti iki kambario temperatūros, po to į jį pridėjome vandenį (50 ml) ir etilacetatą (50 ml), atskyrėme organinę fazę, o vandeninę fazę ekstrahavome etilacetatu (50 ml) . Apjungtas organines fazes praplovėme vandeniu (2x200 ml) ir nufiltravome. Organinę fazę atskyrėme ir tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo prietaise vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Gavome CBZ-L-PheD-Phe aldehidą.

e stadija

A) CBZ-L-Phe-D-Phe aldehidą ištirpinome metilo spirite (10 ml) 60°C temperatūroje.

B) Natrio acetato trihidrato (0,298 g) tirpalą vandenyje (3 ml) pridėjome prie semikarbazido hidrochlorido (0,244 g) tirpalo vandenyje (3 ml) 60°C temperatūroje .

C) Sumaišėme A ir B tirpalus ir gautą mišinį maišėme 5 vai 60°C temperatūroje, po to jį palikome nakčiai 4°C temperatūroje. Iškritusias kietas nuosėdas nufiltravome ir džiovinome vakuume virš P₂O₅. Gavome CBZ-L-Phe-DPheSc.

f stadija

CBZ-L-Phe-D-PheSc (600 mg) ištirpinome metanolyje (90 ml) ir netirpią liekaną nufiltravome. Prietaisą, kuriame buvo metanolinis semikarbazono tirpalas, prapūtėme azotu ir į jį įdėjome katalizatorių - 10 % paladį ant aktyvuotos anglies (100 mg) . Į hermetizuotą indą 2 vai leidome vandenilį, po to katalizatorių nufiltravome ir metanolį pašalinome rotaciniame išgarinimo prietaise vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Gavome

L-fenilalanil-D-fenilalanil semikarbazoną (L-Phe-DPheSc).

PAVYZDYS L-fenilalanil-L-fenilalanil oksimas a-d stadijos

CBC-L-Phe-L-Phe aldehidas buvo sintezuojamas kaip tai aprašyta 2 pavyzdžio a-d stadijose.

e stadija

A) CBZ-L-Phe-L-Phe aldehidą (0,645 g), gautą aukščiau aprašytu būdu, ištirpinome techniniame metilo spirite (35 ml) 60-65°C temperatūroje ir netirpios liekanos pašalinimui tirpalą filtravome.

B) Į hidroksilamino hidrochlorido (0,144 g) tirpalą vandenyje (25 ml) 60°C temperatūroje pridėjome natrio acetato trihidratą (0,244 g).

C) Tirpalą B pridėjome į tirpalą A ir kolbą B tirpalo praplovėme vandeniu (10 ml) , kurį pridėjome prie mišinio, mišinį maišėme 3-4 vai 60-65°C temperatūroje, po to atšaldėme iki 4°C ir šioje temperatūroje laikėme 34 vai. Iškritusias kietas nuosėdas nufiltravome ir praplovėme techninio metilo spirito ir vandens mišiniu (1:1; 5 ml) , išdžiovinome vakuume virš P₂O₅. Gavome CBZL-Phe-L-PheOx sin- ir anti-izomerų mišinį.

f stadija

CBZ-L-Phe-L-PheOx (500 mg) ištirpinome metanolyje (130 ml) ir kietą netirpią nuosėdą atskyrėme filtruojant. Prie35 taisą, kuriame buvo metanolinis oksimo tirpalas, prapūtėme azotu ir į jį įdėjome katalizatorių - 10 % paladį ant aktyvuotos anglies (83 mg) . Po to į herLT 3827 B metizuotą indą 30 min leidome vandenilį, vėliau katalizatorių nufiltravome ir tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, žemesnėje nei 30°C temperatūroje. Tirpiklio liekanas pašalinome siurblio sudarytame aukštame vakuume. Liekaną džiovinome vakuume virš P₂O₅. Gavome L-fenilalanil-L-fenilalanil oksimą (LPhe-L-PheOx).

PAVYZDYS. L-alanil-D-fenilalanil semikarbazonas a ir b stadijos

D-Phe-O,N-dimetilhidroksamato trifluoracetatinė druska buvo sintezuojama taip pat, kaip tai nurodyta 4 pavyzdyje (a ir b stadijos).

c stadija

A) D-Phe-O,N-dimetilhidroksamato trifluoracetatinę drus-ką (5,000 g) ištirpinome sausame THF (20 ml). į gautą tirpalą lėtai pridėjome N-metilmorfoliną (1,578 g), palaikant žemesnę nei 30°C temperatūrą, gautą mišinį atšaldėme iki 0°C.

B) CBZ-L-Ala (3,463 g) maišant ištirpinome sausame THF (40 ml) ir tirpalą atšaldėme iki -10°C, po to į jį pridėjome per 5 min -10°C temperatūroje izobutilchloroformiatą (2,158 g), per 10 min N-metilmorfoliną (1.578 g) ir reakcijos mišinį -10°C temperatūroje maišėme dar 10 min.

C) — 10°C temperatūroje per 10 min sumaišėme A ir B tirpalus, po to leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros ir maišymą tęsėme dar 3 vai. Po to mišinį atšaldėme iki 0°C, pridėjome į jį 3-dimetilaminopropilaminą (1,585 g) ir baigėme reakciją pridėdami vandenį (50 ml) . Po to į reakcijos mišinį pridėjome etil43 acetatą (50 ml) , atskyrėme organinę fazę ir vandeninį sluoksnį ekstrahavome etilacetatu (2x30 ml). Organinius sluoksnius apjungėme ir nuosekliai praplovėme (a) vandeniu (50 ml) ir sočiu NaCl tirpalu (10 ml) , (b) van5 deniniu KHCO₃ tirpalu (5 %, 50 ml) , (c) vandeniniu HCI tirpalu (0,5 N, 50 ml) ir (d) vandeniu (3x50 ml) . Tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume ir esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Kietą liekaną perkristalinome iš etilacetato. Gavome CBZ-L10 Ala-D-Phe-O,N-dimetilhidroksamatą.

d stadija

CBZ-L-Ala-D-Phe-O,N-dimetilhidroksamatą (2,9 g) ištir15 pinome sausame THF (25 ml) ir tirpalą atšaldėme azoto atmosferoje iki -70°C. Po to į jį per 10 min -70°C temperatūroje pridėjome diizobutilaliuminio hidrido tirpalą (1 M, 37 ml) ir maišymą tęsėme dar 10 min.

Reakciją nutraukėme pildami mišinį į sotų Segneto druskos (125 ml) ir THF (125 ml) mišinį, prapučiant azotą ir maišant -30°C temperatūroje, po to leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros. Pridėjome etilacetatą (100 ml) ir organinį sluoksnį atskyrėme. Vandeninį sluoksnį ekstrahavome etilacetatu (2x30 ml), organinius sluoksnius apjungėme ir praplovėme vandeniu Reakcijos mišinį filtravome ir (3x30 ml) pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate \O_Z tirpiklį vakuume, esant žemesnei nei 30 C temperatūrai. Pridėjome šviežią etilacetatą ir po to vėl jį pašalinome. Gavome CBZ-LAla-D-Phe aldehidą.

e stadija

A) CBZ-L-Ala-D-Phe aldehidą (1,2 g) ištirpinome THF (20 ml) ir techniniame metilo spirite (20 ml) , tirpalą pašildėme iki 50°C.

B) Karštą semikarbazono hidrochlorido (1,8 g) tirpalą vandenyje (15 ml) pridėjome į karštą KHCO₃ (1,5 g) tirpalą vandenyje (15 ml).

C) Tirpalą B maišant pridėjome į tirpalą A ir gautą mišinį maišėme 4 vai 50°C temperatūroje. Po to tirpikli pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Prie liekanos pridėjome vandenį (50 ml), kietą produktą nufiltravome, praplovėme vandens ir techninio metilo spirito mišiniu (1:1) ir išdžiovinome vakuume virš P₂O₅. Gavome CBZ-LAla-D-PheSc.

f stadija

CBZ-L-Ala-D-PheSc (750 mg) ištirpinome metanolyje (50 ml) ir netirpią liekaną nufiltravome. Prietaisą su metanoliniu tirpalu prapūtėme azotu ir įdėjome į jį katalizatorių - 10 % paladį ant aktyvuotos anglies (100 mg) . Į hermetizuotą sistemą 90 min leidome vandenilį. Po to katalizatorių nufiltravome ir tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Liekaną džiovinome vakuume virš P₂O₅. Gavome L-alanil-D-fenilalanil semikarbazoną (L-Ala-D-PheSc).

PAVYZDYS L-tirozinil-L-fenilalanil semikarbazonas a ir b stadijos

L-Phe-O,N-dimetilhidroksamato trifluoracetato druską sintezavome taip pat, kaip ir 4 pavyzdyje (a ir b stadijos).

c stadija

A) L-Phe-O,N-dimetilhidroksamato trifluoracetato druską (7.95 g) maišant kambario temperatūroje ištirpinome DMF (30 ml), po to į tirpalą per 5 min pridėjome Nmetilmorfoliną (2,49 g), palaikant žemesnę nei 30°C temperatūrą, ir mišinį atšaldėme iki 0°C.

B) CBZ-OBZ-L-Tyr (10 g) maišant ištirpinome sausame DMF (60 ml) ir tirpalą atšaldėme iki -10°C, po to, per 5 min toje pat temperatūroje pridėjome izobutilchloroformiatą (3,39 g). Po to per 10 min į mišinį pridėjome N-dimetilmorfoliną (2,49 g) ir maišėme jį dar 10 min -10°C temperatūroje.

C) Per 15 min tirpalą A pridėjome į tirpalą B -10°C temperatūroje, po to leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros ir maišymą tęsėme 3 vai. Po to mišinį atšaldėme iki 0°C ir per 5 min pridėjome į jį 3dimetilaminopropilaminą (2,52 g). Į gautą mišinį pridėjome vandenį (50 ml) ir etilacetatą (50 ml) , viršutinį organinį sluoksnį atskyrėme ir nuosekliai praplovėme jį (a) vandeniu (50 ml) , (b) vandeniniu KHCO₃ tirpalu (5 %, 50 ml) , (c) vandeniniu HCI tirpalu (0,5 M, ml) ir (d) vandeniu (3x30 ml) . Tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai, ir liekaną perkristalinome iš izopropilo spirito. Gavome CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe-O,N-dimetilhidroksamatą.

d stadija

CBZ-OBZ-Tyr-L-Phe-O,N-dimetilhidroksamatą (1,012 g) ištirpinome sausame THF (10 ml) . Į gautą tirpalą per min, esant -70°C, azoto atmosferoje pridėjome diizobutilaliuminio hidrido tirpalą THF (1 M, 8,5 ml) ir maišymą tęsėme dar 10 min.

Tęsdami reakciją, maišant, esant -60°C temperatūrai, azoto atmosferoje mišinį pylėme į metanolį (20 ml) ir Segneto druskos tirpalą (30 ml) ir leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros. Po to į jį pridėjome vandenį (50 ml) ir etilacetatą (50 ml) , organinę fazę atskyrėme ir praplovėme ją vandeniu (200 ml) . Po to reakcijos mišinį filtravome ir tirpiklį iš jo pašalinome rotaciniame aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Po to pridėjome šviežią etilacetatą ir vėl jį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate. Kietą liekaną išdžiovinome vakuume virš P₂O₅ ir gavome CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe aldehidą.

e stadija

A) CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe aldehidą (400 mg) ištirpinome techniniame metilo spirite (20 ml) ir THF (1 ml) ir tirpalą pašildėme iki 60°C.

B) Karštą semikarbazono hidrochlorido (600 mg) tirpalą vandenyje (5 ml) pridėjome į karštą KHCO₃ (500 mg) tirpalą vandenyje (5 ml).

C) B tirpalą pridėjome į A tirpalą ir mišinį maišėme 2 valandas 60°C temperatūroje, po to tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai, liekaną užpylėme vandeniu. Kietą medžiagą nufiltravome, praplovėme vandeniu ir techniniu metilo spiritu ir išdžiovinome vakuume virš P₂O₅. Gavome CBZ-OBZ-L-Tyr-L-PheSc.

f stadija

CBZ-OBZ-L-Tyr-PheSc (770 mg) ištirpinome sausame THF (70 ml) , tirpalą filtravome ir į filtratą pridėjome metanolį (20 ml) . Prietaisą su semikarbazono tirpalu prapūtėme azotu ir į jį įdėjome katalizatorių - 10 % paladį ant aktyvuotos anglies (100 mg) . Į hermetizuotą sistemą kelias valandas leidome vandenilį, po to katalizatorių nufiltravome ir tirpiklį išgarinome. Gavome L-tironizil-L-fenilalanil semikarbazoną (L-Tyr-L-PheSc).

PAVYZDYS. L-alanil-L-cikloheksilalanil semikarbazonas a stadija

A) Į sausą DMF (75 ml) maišant pridėjome O,N-dimetilhidroksilamino hidrochloridą (8,51 g), o po to per min N-metilformaliną, palaikant žemesnę nei 30°C temperatūrą. Iškritusias baltas nuosėdas ir mišinį atšaldėme iki 0°C.

B) N-t-Boc-L-Cha (22,5 g) ištirpinome sausame THF (200 ml) ir tirpalą atšaldėme iki -10°C. Po to per 5 min, palaikydami -10°C temperatūrą, į jį pridėjome izobutilchlorof ormiatą (11,94 g), o po to per 10 min toje pat temperatūroje pridėjome N-metilmorfoliną ir maišymą tęsėme dar 10 min.

C) Per 15 min, esant -10°C, suspensiją A pridėjome į suspensiją B, leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros ir maišėme jį 4 vai. Po to mišinį atšaldėme iki 0°C ir per 5 min pridėjome 3-dimetilaminopropilaminą (8,6 g) ir maišymą tęsėme dar 5 min. Po to pridėjome vandenį (200 ml) ir etilacetatą (100 ml) , vandeninį sluoksnį atskyrėme ir ekstrahavome jį etilacetatu (2x100 ml) . Apjungtas organines fazes nuosekliai praplovėme (a) vandeniu (100 ml) ir sočiu NaCl tirpalu (20 ml) , (b) vandeniniu KHCO₃ tirpalu (5 %, 100 ml) , (c) vandeniniu HCI tirpalu (0,5 N, 100 ml) ir (d) vandeniniu (3x100 ml). Tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Gavome N-t-Boc-L-Cha-Ο,N-dimetilhidroksamatą.

b stadija min 0°C temperatūroje maišėme N-t-Boc-L-Cha-O,N-dimetilhidroksamato (26 g) ir trifluoracto rūgšties (65 ml) mišinį, po to leidome jam sušilti iki kambario temperatūros ir maišymą tęsėme 3 vai. Trifluoracto rūgšties perteklių pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate vakuume, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Prie liekanos pridėjome dietilo eterį ir iš gauto tirpalo vakuume nudistiliavome eterį. Eterinį apdirbimą kartojome, kol gavome aliejinio skysčio pavidalo L-ChaΝ,Ο-dimetilhidroksamato trifluoracetatinę druską.

c stadija

A) L-Cha-O,N-hidroksamato trifluoracetatinę druską (17 g) ištirpinome sausame THF (50 ml) . Į gautą tirpalą per 5 min pridėjome N-metilmorfoliną (3,95 g), palaikant temperatūrą žemiau nei 30°C, ir po to mišinį atšaldėme iki 0°C.

B) CBZ-L-Ala (9,25 g) maišant ištirpinome sausame THF (100 ml) ir tirpalą atšaldėme iki -10°C. Po to per min, esant -10°C temperatūrai, pridėjome į jį izobutilchloroformiatą (5,85 g), ir per 10 min N-metilmorfoliną (3,95 g) ir po to reakcijos mišinį maišėme dar 10 min -10°C temperatūroje.

C) Per 15 min -10°C temperatūroje tirpalą A pridėjome į tirpalą B, leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros ir maišymą tęsėme 3 vai. Po to mišinį atšaldėme iki 0°C per 5 min, pridėjome į jį 3-dimetilaminopropilaminą (3,98 g) ir maišymą tęsėme dar 5 min. Po to pridėjome vandenį (150 ml) ir etilacetatą (150 ml) , atskyrėme vandeninę fazę ir ekstrahavome ją etilacetatu (2x75 ml). Apjungtas organines fazes nuosekliai praplovėme (a) vandeniu (125 ml), (b) vandeLT 3827 B niniu KHCO₃ tirpalu (5 %, 125 ml) , (c) vandeniniu HCI tirpalu (0,5 N, 125 ml) ir (d) vandeniu (3x125 ml) . Tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Pridėjome šviežią etilacetatą ir po to ji nudistiliavome. Gavome CBZ-LAla-L-Cha-O,N-dimetilhidroksamatą.

d stadija

CBZ-L-Ala-L-Cha-0,N-dimetilhidroksamatą (7,22 g) ištirpinome azoto atmosferoje sausame THF (160 ml) ir tirpalą atšaldėme iki -70°C, po to per 20 min azoto atmosferoje ir -70°C temperatūroje į jį pridėjome diizobutilaliuminio hidrato tirpalą THF (1 M, 86 ml) ir maišymą tęsėme dar 20 min.

Reakciją baigėme 0°C temperatūroje ir azote atmosferoje supildami maišant į Segneto druskos tirpalą (400 ml) , po to leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros. Po to į jį pridėjome etilacetatą ir maišėme 5 min bei filtravome, atskyrėme organinį sluoksnį ir vandeninę fazę ekstrahavome etilacetatu (2x50 ml). Apjungtas organines fazes plovėme vandeniu (3x200 ml) , paskutiniame praplovime pridėjome sotų NaCl tirpalą. Tirpikli pašalinome rotaciniame išdžiovinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Gavome CBZ-L-AlaL-Cha aldehidą.

e stadija

A) CBZ-L-Ala-L-Cha aldehidą (8 g) ištirpinome techniniame metilo spirite (50 ml) ir tirpalą pašildėme iki 50°C.

B) Į karštą tirpalą KHCO₃ (2,67 g) tirpalą vandenyje pridėjome karštą semikarbazido hidrochlorido (3,0 g) tirpalą vandenyje (25 ml).

C) Tirpalą B pridėjome į tirpalą A ir 50°C temperatūroje mišinį maišėme 3 vai, po to mišinį atšaldėme ir palikome stovėti per naktį 4°C temperatūroje. Didžiąją dalį techninio metilo spirito pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai, ir prie liekanos pridėjome etilacetatą (50 ml). Organinę fazę atskyrėme ir praplovėme ją nuosekliai (a) vandeniu, (b) vandeniniu KHCO₃ tirpalu (5 %, 30 ml), (c) vandeniniu HCI tirpalu (0,5 N, 30 ml) ir (d) vandeniu (2x50 ml), esant reikalui, pridedant sotaus NaCl tirpalo fazių atskyrimo palengvinimui. Tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Kietą liekaną perkristalinome iš izopropanolio. Gavome CBZ-L-Ala-LChaSc.

f stadija

CBZ-L-Ala-L-ChaSc (900 mg) azoto atmosferoje ištirpinome metanolyje (30 ml) ir į tirpalą pridėjome katalizatorių - 10 %-nį paladį ant aktyvuotos anglies. Į hermetizuotą sistemą 6 vai leidome vandenilį, po to katalizatorių nufiltravome, tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai, o kietą liekaną praplovėme eteriu ir išdžiovinome vakuume virš P₂O₅. Gavome L-alanil-L-cikloheksilalanil semikarbazoną (L-Ala-L-ChaSc).

PAVYZDYS. L-alanil-L-leucinil semikarbazonas a stadija

A) O,N-dimetilhidroksilamino hidrochloridą (9,17 g) maišant kambario temperatūroje pridėjome į sausą DMF (110 ml) , po to per 5 min, palaikydami žemesnę nei 30°C temperatūrą, į mišinį pridėjome N-metilmorfoliną (9,51 g).

Susidariusias nuosėdas ir mišinį atšaldėme iki 0°C.

B) N-t-Boc-L-Leu (23,3) ištirpinome sausame THF (220 ml) ir atšaldėme tirpalą iki -10°C, po to per 5 min, palaikant mišinio temperatūrą -10°C, pridėjome izobutilchloroformiatą. Po to per 10 min, palaikant -10°C temperatūrą, pridėjome N-metilmorfoliną, ir maišymą tęsėme dar 10 min.

C) Per 15 min -10°C temperatūroje suspensiją A pridėjome į suspensiją B. Mišiniui leidome sušilti iki kambario temperatūros ir maišėme jį 3 vai, po to atšaldėme iki 0°C ir per 5 min pridėjome 3-dimetilaminopropanaminą (9,13 g) ir maišymą tęsėme dar 5 min. Po to į mišinį pridėjome etilacetatą (110 ml) ir vandenį (110 ml), organinį sluoksnį atskyrėme ir nuosekliai praplovėme (a) vandeniu (2x100 ml), (b) vandeniniu

KHCO₃ tirpalu (5 %, 100 ml) , (c) vandeniniu HCl tirpalu (0,5 N, 100 ml) ir (d) vandeniu (3x100 ml) . Tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Gavome N-t-Boc-L-Leu-Ο,Ndimetilhidroksamatą.

b stadija

N-t-Boc-L-Leu-Ο,N-hidroksamato (23,4 g) ir trifluoracto rūgšties (165 ml, atšaldyta iki 0°C) mišinį 18 vai maišėme kambario temperatūroje. Trifluoracto rūgšties perteklių pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai, prie liekanos pridėjome dietilo eterį ir eterį iš gauto tirpalo pašalinome vakuume. Šią operaciją kartojome tol, kol prasidėjo kristalizacija 4°C temperatūroje. Gavome L-Leu0,N-dimetilhidroksamato trifluoracetatinę druską.

c stadija

A) L-Leu-O,N-dimetilhidroksamatą (1,8 g) maišant kambario temperatūroje ištirpinome sausame THF (10 ml) . Po to mišinį atšaldėme iki 0°C ir per 5 min į jį pridėjome N-metilmorfoliną (0,695 g).

B) CBZ-L-Ala (1,40 g) ištirpinome sausame THF (20 ml) ir gautą tirpalą atšaldėme iki -10°C, po to toje pačioje temperatūroje butilchloroformiatą morfoliną (0,635 g) maišėme dar 10 min.

per 5 min į jį pridėjome izo(0,869 g), per 10 min N-metilir toje pat temperatūroje mišinį

C) Per 15 min, -10°C temperatūroje tirpalą A pridėjome į tirpalą B, po to leidome mišiniui sušilti iki kambario temperatūros ir maišymą tęsėme dar 18 vai. Po to mišinį atšaldėme iki 0°C, pridėjome į jį 3-dimetilaminopropilaminą (0,64 g) ir reakciją baigėme pridėdami vandenį (25 ml) ir etilacetatą (25 ml) . Vandeninę fazę atskyrėme ir ekstrahavome ją etilacetatu (2x25 ml). Apjungtas organines fazes nuosekliai praplovėme (a) vandeniu (50 ml) ir sočiu vandeniniu NaCl tirpalu (perskyrimo palengvinimui) , (b) vandeniniu KHCO₃ tirpalu (5 %, 30 ml), (c) vandeniniu HCI tirpalu (0,5 N, 30 ml) ir (d) vandeniu (3x30 ml) . Tirpiklį pašalinome rotaciniame aparate, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai, ir kietą liekaną džiovinome vakuume virš P₂O₅. Gavome CBZ-L-Ala-L-Leu-O,N-dimetilhidroksamatą.

d stadija

CBZ-L-Ala-L-Leu-O,N-dimetilhidroksamatą (1,9 g) azoto atmosferoje ištirpinome sausame THF (40 ml) ir gautą tirpalą atšaldėme iki -70°C, po to, taip pat azoto atmosferoje ir -70°C temperatūroje, per 10 min į jį pridėjome diizobutilaliuminio hidrido tirpalą THF (1 M, 29,5 ml) ir maišymą tęsėme dar 10 min.

Reakciją užbaigėme, maišant -60°C temperatūroje ir azoto atmosferoje, pridedant metanolį (50 ml) ir Segneto druskos tirpalą (50 ml) . Mišiniui leidome sušilti iki kambario temperatūros, pridėjome į jį vandenį (50 ml) ir etilacetatą (50 ml), nufiltravome, atskyrėme vandeninį sluoksnį ir ekstrahavome jį etilacetatu (2x50 ml). Apjungtas organines fazes praplovėme vandeniu (3x100 ml) ir sočiu NaCl tirpalu (atskyrimo palengvinimui). Po to tirpikli pašalinome rotaciniame išgarinimo prietaise, esant žemesnei nei 30°C temperatūrai, pridėjome šviežią etilacetatą ir jį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate. Gavome CBZ-L-Ala-L-Leu aldehidą.

e stadija

A) CBZ-L-Ala-L-Leu aldehidą (6,7 g) ištirpinome techniniame metilo spirite (50 ml) ir pašildėme iki 50°C.

B) Į karštą semikarbazido hidrochlorido (10,8 g) tirpalą vandenyje (30 ml) pridėjome karštą KHCO₃ tirpalą (9 g) vandenyje (30 ml).

C) Tirpalą B pridėjome į tirpalą A ir mišinį maišėme 50°C temperatūroje 3 vai, po to jį palikome nakčiai kambario temperatūroje. Po to kietas iškritusias nuosėdas nufiltravome, praplovėme techninio metilo spirito ir vandens mišiniu (1:1) ir džiovinome vakuume virš P₂O₅. Gavome CBZ-L-Ala-L-LeuSc.

f stadija

CBZ-L-Ala-L-LeuSc (950 mg) ištirpinome metanolyje (100 ml) ir netirpią liekaną nufiltravome. Į tirpalą pridėjome dar 50 ml metanolio ir prietaisą prapūtėme azotu, po to azoto atmosferoje į jį įdėjome katalizatorių - 10 %-nį paladį ant aktyvuotos anglies (100 mg) ir į hermetizuotą sistemą 135 min leidome vandenilį. Po to katalizatorių nufiltravome ir tirpiklį pašalinome rotaciniame išgarinimo aparate, esant žemesnei nei 30°C esant žemesnei nei 30°C temperatūrai. Kietą liekaną išdžiovinome vakuume virš P₂O₅. Gavome L-alanil-Lleucinil semikarbazoną (L-Ala-L-LeuSc).

10 PAVYZDYS. Afininės chromatografijos matricos ECHSepharose 4B su aktyviais L-Ala-L-PheSc centrais gavimas

ECH-Sepharose ''AB (3 g drėgno svorio) sukepto stiklo filtre praplovėme vandeniniu NaCl tirpalu (0,5 M, 240 ml) ir po to vandeniu (120 ml). Paruošėme 0,1 M N-etil-N'(3-dimetilaminopropil) karbodiimido hidrochlorido (EDC) tirpalą vandenyje ir, pridėdami į jį druskos rūgštį arba kietą natrio acetatą, nustatėme jo pH=4,5. L-Ala15 L-PheSc (10 mg), gautą pagal 1 pavyzdžio aprašymą, ištirpinome metanolyje (400 ml), ir paruoštą tirpalą, kartu su vandeniniu EDC tirpalu (0,1 M, 2,4 ml) pridėjome į praplautą gelį. Mišinį 20°C temperatūroje atsargiai maišėme vieną valandą, esant reikalui, kore20 gavome pH reikšmę iki aukščiau nurodyto dydžio ir maišymą tęsėme dar 23 vai 20°C temperatūroje. Po to į jį pridėjome L-gliciną iki 1 M galutinės koncentracijos ir maišymą tęsėme dar 3 vai. Gautą afininės chromatografijos gelį nuosekliai praplovėme vandeniniu meta25 nolio tirpalu (50 %, 60 ml) , vandeniu (60 ml) ir darbiniu buferiu (60 ml) ir iki naudojimo laikėme 4°C temperatūroje.

11-18 PAVYZDŽIAI. Afininės chromatografijos matricos gavimas

Kiekvieną iš dipeptidų darinių, gautų pagal 2-9 pavyzdžius, jungėme su gelio matrica tuo pačiu būdu, kaip tai aprašyta 10 pavyzdyje. Gavome afininės chroma35 tografijos gelius (atitinkamai 11-18 pavyzdžiai).

PAVYZDYS. Afininė chromatografija

Išpurškimo džiovintuve išdžiovintą papajos lateksą (0,03 g baltymo) (firma Powel and Scholefield, Didžioji

Britanija) darbiniame buferyje (natrio fosfatas (50 mM): EDTA (1 mM) ; etandiolis (33 %), pH=6,8) su ditiotreitolo (2 mM) arba cisteino (4 mM) (1,5 ml) priedais praleidome pro afininės chromatografijos matricos kolonėles (1 ml) , atitinkančias 10-18 pavyzdį. Naudojome bent vieną iš žemiau pateiktų penkių eliuentu:

Eliuentas A = hidroksietildisulfidas (100 mM) vandeniniame etandiolio (33 %) tirpale, turinčiame natrio citratą (50 mM) ir EDTA (1 mM), pH=4,5; naktį prieš eliuavimą kolonėlę pervesdavome į pusiausvyrinį būvį.

Eliuentas B = 2,2'-dipiridildisulfidas (30 mM) vandeniniame etandiolio (33 %) tirpale, turin20 čiame natrio citratą (50 mM) ir EDTA (1 mM), ph=4,5; naktį prieš eliuavimą kolonėlę pervesdavome į pusiausvyrinį būvį.

Eliuentas C = metilpiridildisulfidas (30 mM) vandeni25 niame etandiolio (33 %) tirpale, turinčiame natrio citratą (50 mM) ir EDTA (1 mM), pH=4,5; naktį prieš eliuavimą kolonėlę pervesdavome į pusiausvyrinį būvį.

Eliuentas D = mersalilo rūgštis (10 mM) vandeniniame etandiolio (33 %) tirpale, turinčiame natrio hidroksidą (50 mM) ir EDTA (25 mM) , pH=4,5, nustatomas acto rūgštimi; nepertraukiamas eliuavimas.

Eliuentas E = HgCl₂ (10 mM) vandeniniame etandiolio (33 %) tirpale, turinčiame natrio acetatą (50 mM) , pH=4,5; nepertraukiamas eliuavimas.

Eliuavimą kiekvienu eliuentu tikrinome nustatant A₂₈₀ pėdsakus eliuate po standartinės ir Mono S (Pharmacia) chromatografijos. Rezultatai pateikti žemiau pateiktoje 1 lentelėje.

1 lentelė

Chimopapaino surišimas ir eliuavimas

Inhibuoj antis	Matrica		Eliuentas
peptidas	Pavyzdžio Nr.	A	B C D	E

L-Ala-L-PheSc	10	-	N	+	+	+
L-Phe-L-PheSc	11	-	+	+	+	+
L-Phe-L-PheMo	12	-	+	N	N	N
L-Phe-D-PheSc	13	-	N	+	+	+
L-Phe-L-PheOx	14	+	+	N	N	N
L-Ala-D-PheSc	15	+	N	N	+	N
L-Tyr-L-PheSc	16	+	N	N	+	N
L-Ala-L-ChaSc	17	+	N	N	N	+
L-Ala-L-LeuSc	18	+	N	N	N	+
+ suriša ir eliuuoja	chimopapainą

- nesuriša ir/arba neeliuoja chimopapaino

N - nenustatinėjome

PAVYZDYS. Chimopapaino valymas (I) Prekyboje esanti, išpurškimo džiovintuve išdžiovintą Carica papaya lateksą (1 g) (gaminamą firmos Powell and Scholefield, Didžioji Britanija) vieną valandą maišėme su distiliuotu vandeniu (5 ml). Neištirpusią liekaną atskyrėme centrifuguoj ant 30 min esant 9000 x g ir 4°C. Virš nuosėdų buvusio skysčio pH=l,8 reikšmę nustatėme per 20 min pridėdami druskos rūgštį (1 M) . Maišymą 4°C temperatūroje tęsėme dar 60 min ir, esant reikalui, koregavome pH dydį iki nurodytos reikšmės.

(II) Mišinį centrifugavome 30 min, esant 9000xg ir 4°C, ir granules atmetėme.

(III) (a) Virš nuosėdų buvusio skysčio pH=6,8 nustatėme per 10 min pridėdami lašais į jį NaOH (5 M). Tirpalas nusidažydavo mėlynai-violetine spalva.

(b) Gautą mėlynai-violetinį tirpalą dializavome su 10 tūrių darbinio buferio (natrio fosfatas (50 mM); EDTA (1 mM); etandiolis (33%), pH=6,8, triskart keisdami buferį. Dializatą centrifugavome 10 min, esant 4000 x g, nudekantavus virš nuosėdų buvusį skystį, turintį chimopapainą, jame nustatėme baltymų kieki apie 30 mg/1. Chimopapaino tirpalą aktyvavome pridėdami į jį cisteiną iki 4 mM koncentraci jos ir palikome stovėti 15 min 0°C temperatūroj e.

(IV) Aktyvuotą chimopapaino tirpalą praleidome pro 8 ml kolonėlę su ECH-Sepharose , kuri buvo surišta su L-AlaL-PheSc, kuri buvo gauta, kaip tai aprašyta 10 pavyzdyje) ; kolonėlė prieš tai buvo pervesta į pusiausvyrini būvi su darbiniu buferiu, greitis 36 ml/cm /vai. Po to kolonėlę nuosekliai praplovėme darbiniu buferiu (jo kiekis buvo lygus dvigubam gelio tūriui kolonėlėje), vandeniniu natrio citrato (50 mM) tirpalu etandiolyje (33%), pH=4,5 (kiekis buvo lygus dvigubam gelio kiekiui kolonėlėje) ir vandeniniu natrio acetato (50 mM), EDTA (25 mM) , mersalilo (10 mM) tirpalu etandiole (33%), pH=4,5 (kiekis buvo lygus dvigubam gelio tūriui kolonėlėje) ir po to laikėme 2 vai kambario temperatūroje.

(V) Chimopapainą eliuavome vandeniniu natrio acetato (50 mM) tirpalu, turinčiu mersalilą (10 mM) (kiekis lygus trigubam gelio tūriui kolonėlėje), atrinkome frakcijas po 4 ml, fermentinį aktyvumą atrinktose eliuato frakcijose nustatinėj ome matuojant išdžiovintų pavyzdžių specifinį aktyvumą ΒΑΡΝΑ atžvilgiu.

Aktyvias frakcijas apjungėme ir toliau valėme katijonitinės chromatografijos pagalba kolonėlėje, kuri buvo R užpildyta Mono-S HR 10/10 (Pharmacia). Eliuavimą atlikome panaudodami pradinį fosfatinį buferį (Na (50 mM) ; EDTA (1 mM) , NaN₃ (0,01%), pH=7,2, ir galutinį fosfatinį buferį (Na⁺ (800 mM) , EDTA (1 mM), NaN₃ (0,01%) ir pH=7,2). Eliuavimą vykdėme esant druskos gradientui

2,7 mM/ml ir tekėjimo greičiui 2 ml/min. Atrinkome frakcijas po 4 ml ir baltymų koncentraciją jose nustatėme pagal sugėrimą prie 280 nm, o fermentinį aktyvumą - pagal ΒΑΡΝΑ hidrolizę.

Frakcijas, turinčias chimopapainą, apjungėme ir dializavome distiliuotame ir dejonizuotame vandenyje arba vandeniniame EDTA tirpale (1 mM) . Po to atlikome sublimacinį džiovinimą ir produktą laikėme tokiame pavidale .

PAVYZDYS. Chimopapaino valymas - ΒΑΡΝΑ analizės rezultatai (I) Prekyboje esantį išpurškimo džiovintuve išdžiovintą Carica papaya (1 g) lateksą (gaminamą formos Powell and

Scholefield, Didžioji Britanija) 60 min maišėme su vandeniu (5 ml) . Neištirpusią liekaną atskyrėme centrifuguojant 30 min, esant 900 x g ir 4°C, ir atmetėme. Virš nuosėdų buvusio skysčio pH=l,8, nustatėme per 20 min pridėdami druskos rūgšti, (1 M) . Maišymą 4°C temperatūroje tęsėme 15 min, kas 5 min tikrindami pH reikšmę ir, esant reikalui, ją koreguodami.

(II) Iškritusias nuosėdas atskyrėme centrifuguojant 30 min, esant 9000 x g ir 4°C.

(III) (a) Virš nuosėdų buvusio skysčio pH=7,0 nustatėme maišant ir lašais pridedant vandenini, natrio hidroksido tirpalą (5 M). Iškritusias nuosėdas atskyrėme centrifuguojant 30 min, esant 9000 x g ir 4°C.

(b) Virš nuosėdų buvusi, skystą praleidome pro kolonėlę, užpildytą katijonitinę derva Mono S HR 10/10 (Pharmacia) , kuri prieš tai buvo pervesta i pusiausvyrini būvą vandeniniu Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (50 mM Na^T) tirpalu, turinčiu EDTA (1 mM) , kurio pH=7,2 (buferis A) . Po to kolonėlę plovėme buferiu A (tekėjimo greitis 2 ml/min) iki tol, kol A₂₈₀ dydis pasidarė lygus 0. Po to pro kolonėlę praleidome Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ iki 0,80 M Na⁺ koncentracijos, esant gradientui 2,7 mM Na⁺/ml ir atrinkome frakcijas po 4 ml. Buvo tikrinamas frakcijų aktyvumas ΒΑΡΝΑ atžvilgiu. Didysis chimopapaino pikas, nustatytas imunologiškai, eliuavosi esant 0,17-0,28 Na⁺. Aktyvias ΒΑΡΝΑ atžvilgiu frakcijas atrinkome ir apjungėme bei pridėjome toką etandiolio kieką, kad jo koncentracija būtų 33 tūrio %. Visas kitas frakcijas, iškaitant aktyvias ΒΑΡΝΑ atžvilgiu, kurios buvo surinktos paskutinėse eliuavimo stadijose (0,47-0,59 M Na⁺) su proteinazės III piku, atmetėme.

(IV) Kolonėlę (sluoksnio tūris 15 ml) su ECH-SepR harose , kuri buvo sujungta su L-Ala-L-PheSc (kai buvo gauta, kaip tai aprašyta 10 pavyzdyje) praplovėme vandeniniu NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ tirpalu, turinčiu EDTA (1 mM) etandiolyje (33 tūrio %), kurio pH=6,8 (darbinis buferis). Tekėjimo greitis buvo 39 ml/val/cm². Apjungtas chimopapainą turinčias (žr. aukščiau) frakcijas aktyvavome pridėdami cisteiną laisvos bazės formoje (galutinė koncentracija 4 mM) ir palikome stovėti 15 min 0°C temperatūroje. Po to tirpalą praleidome pro kolonėlę, o vėliau pro kolonėlę praleidome 60 ml darbinio buferio.

(V) Po to pro kolonėlę praleidome natrio acetato buferį (50 mM) , pH=4,5, turintį HgCl₂ (10 mM, 45 ml) . Atrinkome frakcijas po 5 ml. Atrinktose frakcijose nustatėme aktyvumą ΒΑΡΝΑ atžvilgiu.

Frakcijas su aktyvumo piku, kurios buvo sulaikomos kolonėlėje ir eliuuojamos su buferiu, turinčiu HgCl₂, apjungėme ir vėl praleidome pro Mono-S užpildytą kolonėlę. Po to kolonėlę praplovėme buferiu A, po to pro ją praleidome buferį A, turintį cisteiną laisvos bazės formoje (4 mM) (tūris buvo lygus septyngubam smalos sluoksnio tūriui). Praleidimą nutraukėme 30 min, kad susidarytų sąlygos išstumti gyvsidabrį iš fermento. Po to praleidimą tęsėme ir dar kartą praplovėme buferiu A (prieš tai pro kolonėlę praleidome NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ gradientą iki 0,80 M Na⁺, kaip tai aprašyta aukščiau) . Aktyvias ΒΑΡΝΑ atžvilgiu frakcijas apjungėme, pridėjome į jas cisteiną laisvos bazės formoje (galutinė koncentracija 4 mM) ir palikome stovėti 15 min 0°C temperatūroje .

Į kolonėlę įdėjome Chelex smalą (Bio-Rad, Didžioji

Britanija; 0,5 g) ir praplovėme ją buferiu A. Apjungtas chimopapainą turinčias frakcijas praleidome pro Chelex užpildytą kolonėlę ir iš kolonėlės išėjusi tirpalą dializavome vandeniniame EDTA (1 mM) tirpale. Džiovinome sublimacinio džiovinimo būdu.

Chimopapaino išvalymo efektyvumą iliustruoja 2 lentelės 5 duomenys.

lentelė

CM

O	to
e	-H
►>1	C
i—i	CO
ti	Pa
>	-H
>V)	ti
1—i	«—1

-K *

(0

1)

M

CL.

m < h m c

-H + 24 m >1 (0 -p e

C 3 rū > W >1

-P •H tn

Ή •H >

>N

-P ti tn ε

•Ή ti

-P (P

P (D

-P >

H

m

U) rū e

>1

I—t ti CQ tn

B o

o rP

cn	kO	LO	CO	00
LD	O	kO	kO	kO
«t	K.	K.
o	CN	co	co	co

’šT r- co

C\] CN cn σ>, ω

o

-m ti ίΧ ti

Pa

P • H o

c

H (Ū

CL d

CL

o	kO	O	CN		ti
CM	?—1	o	CTi	kO	CN	-P
i—1	kO	co	o	O	t—1	• H
	kO				v	ti
5—H		CN		*šT		P

ot

-i-T

CM	kO	00	LT)
i—1	co		Γ-
r-	kO	n-
K.	K.	K.
co	00	co	CN
ΟΊ	co	co	rP
	CN	«-1	rP

OO o

LD (Ό < K.

τ co sr sr tn •H (D >ot

-H

-H tn i—i -P > >N 42 3 n

id

I i—I

n) >

O c

H «J

CL id

CL

O e

•P

Λ

U (D >

C

-H >

O

-H >N

Ό

O

S

-H >ot

Pi

CL >ot <

CM

C

(—	,—I kO co	00 LO	LT) r- CM	t—1 ϊ—1	LO o t—I	CM	0 e
								P	3	x—-
								2	>	nr
									>.	42
								(d	42	3
								24	24	P
								•P	3	42
				U				Ti		OT
		1		w	1			o	3	2a
co		0		d)	o			42	P	3
ti	-P	42		25	4-1			d)	5p	OT
co	e	3		04	<d			2
P	-P	£		1	ε				3	1—1
(U	42	0		hJ	o			K.	tn	1—1
-P	>OT	P		1	P			-CU	P	1—1
ti	tn	25		(d	25			N	(U
«-1	'3	U		»~P	υ			-H	>co	OT
	3							i—I	P	•d)
ω		•d)		1	-<p			3		N
<d	ot	c		h5	c			C	ti	3
42	3	-H		1	•P			(d	-P	C
C	e	42		d)	4-1				p	-P
•P	Ή	•P		ω	•P			<	•P	d)
>	•m	c	ti	0	c	ti		2	(U	42
o	O	0	•ΓΊ	P	o	•ΓΊ	X	CM	P	0
-P	P	-r-i	•P	id	TI	•P	d)	<	ti	P
>N	O	•P	MP	25	• P	MP	1-1	m	Pa	CL
T5	Ti	42	ti	CL	4-J	ti	d)
>co	CL	3	P	GJ	<d	P	25		-k
•H	<	2	tn	w	2	tn	U	-k	-K

PAVYZDYS. Specifinių chimopapaino atžvilgiu IgG antikūnų, inicijuotų triušiuose, gavimas

Švarų chimopapainą, gautą pagal 21 pavyzdžio aprašymą, prieš jo panaudojimą metode, aprašytame Zucker ir kt. (1985) (žr. aukščiau cituotą darbą), karboksimetilinome švelniomis sąlygomis. Chimopapaino antiserumą triušyje inicijavome įvesdami į raumenis 360 ųg karbometilinto baltymo pilname Freund'o adjuvante, dvi savaitės prieš tai po oda buvome įvedę 100 ųg nepilname adjuvante. IgG iš dalies valėme nuo serumo frakcionuoj ant su amonio sulfatu, kaip tai aprašyta Heide ir Schwick (1978) (žr. aukščiau cituotą darbą), o po to dializavome vandeniniame natrio fosfato tirpale (10 mM), turinčiame NaCl (0,14 M), pH=7,3.

PAVYZDYS. Chimopapaino valymas ir kiekybinė imunologinė chimopapaino ir PPIV analizė (I-III) Prekyboje esantį išpurškimo džiovykloje išdžiovintą Carica Papaya lateksą (gaminamą firmos Powell and Scholefield, Didžioji Britanija) gaminome ir apdirbome prie pH=l,8 pagal 21 pavyzdžio aprašymą (I-IIIa).

(IV) Kolonėlę (sluoksnio tūris 15 ml) , užpildytą ECHSepharose , kuri surišta su L-Ala-L-PheSc (paruošta pagal 10 pavyzdyje aprašytą metodiką) praplovėme pagal 21 pavyzdžio aprašymą (IV). Po apdirbimo prie pH=l,8 virš nuosėdų gautą skystį dializavome vandeniniame NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (50 mM Na⁺) tirpale, turinčiame EDTA (1 mM) etandiolyje (33 tūrio %), kurio pH=6,8 (darbinis buferis), 10 min centrifugavome, esant 4000x g) ir aktyvavome per 20 min pridėdami ditiotreitolą (galutinė koncentracija 2 mM) 20°C temperatūroje. Po to praleidome pro afininės chromatografijos kolonėlę (39 ml/val/cm²) ir vėliau praleidome dar 60 ml darbinio buferio. Po to pro kolonėlę praleidome natrio citrato buferį (50 mM) , kurio pH=4,5 ir kuris turi EDTA (1 mM) ir metilpiridilsulfidą (30 mM, 15 ml) (gautą pagal metodiką, kuri aprašyta Salih ir kt. Biochem. J. (1987), 247, 181-193). Tirpalo praleidimą sustabdėme ir disulfidą turintis buferis buvo paliktas kolonėlėje per naktį (18 vai) 20°C temperatūroj e.

(V) Praleidimą pro kolonėlę tęsėme, leisdami pro ją 45 ml to paties buferio, turinčio metilpiridildisulfidą, o po to 30 ml darbinio buferio, atrinkdami frakcijas po 5 ml.

Analizavome atrinktų frakcijų aktyvumą ΒΑΡΝΑ atžvilgiu. Frakcija su aktyvumo piku, kurios sulaikomos kolonėlėje ir eliuuojamos metilpiridildisulfidą turinčių buferiu, apjungėme ir praleidome pro Sephadex^R LH-20 (Pharmacia) kolonėlę (40 ml/val/cm ), kuri prieš tai buvo pervesta į pusiausvyrinį būvį vandeniniu EDTA (1 mM) tirpalu etandiolyje (33 tūrio %) . Chromatografinį perskyrimą tęsėme leisdami pro kolonėlę 300 ml to paties buferio, atrinkdami frakcijas po 8 ml, kurias kontroliavome pagal ΔΑ₂₇₁ ir nustatinėjome jų aktyvumą ΒΑΡΝΑ atžvilgiu .

Frakcijas, turinčias aktyvumo piką ΒΑΡΝΑ atžvilgiu (po kurio eina dar vienas pikas su A₂₇₁) , apjungėme ir praleidome pro katijonitinę kolonėlę, užpildytą Mono S HR 10/10 derva, tolesnį apdirbimą atlikome taip pat, kaip tai aprašyta 21 pavyzdyje (III b) . Frakcijas, pasižymėjusias aktyvumu ΒΑΡΝΑ atžvilgiu, apjungėme.

Išpurškimo džiovykloje išdžiovintą lateksą ir medžiagą, gautą po apdirbimo prie pH=l,8 bei afininės chromatografijos ir katijonitinės chromatografijos, analizavome, norėdami nustatyti PPIV buvimą, paprastos radialinės imunodifuzijos metodu (žr. aukščiau). Tą patį metodą naudojome nustatant chimopapainą monospecifiniuose chimopapaino atžvilgiu antikūniuose, inicijuoLT 3827 B tuose triušiuose, kurie buvo gauti pagal 22 pavyzdyje aprašytą metodiką. Kalibracinio grafiko sudarymui naudojome chimopapainą, išvalytą pagal aukščiau aprašytus metodus ir neturintį (pagal paprastos radialinės imunodifuzijos duomenis) PPIV ir PPIII. Gauti rezultatai pateikti 3 lentelėje.

r- <-1 •k co o ι-H V

Chimopapaino valymas ir chimopapaino ir PPIV kiekybinė imunologinė analizė «ύ c

•H «d

O, fd α

o ε

Cn ε

CsJ CO cn

-C o

fd

e	+
p	3
>	H
>.	Cn	Cn
4-4	l—1	e
Λί	-H
rt)	>	H
	>N	fd
CO	-P	-P
-H	rt)	Φ
C		c
•H	<C	Φ
4-J	2	•H
-H	cm	>
O	C
(D	m
CU
ω

W ffl ε — >1 tP •p ε fd

CQ

o	co	o	co
o	co	o	co
o	KT	o	LO
K	K	»»	k.
rH	t—1		co

co r-~ <O LO

M¹ rH lo (N rH

CM m Ui

-ΓΊ •H

M-l (Ū oj λ:

	o	P	-H
(D			cn	Cn		d
•i—1	cn		Φ	0		o
O	rt)	ω	d	4-)		4->
t—i	ω	rt!	CM	rt)		d)
λ:	λ:	£	1	£		S
>1	ω	Ή	i-q	O
>	4-)	X)	1	P		K.
o	m	P	co	-C	rt)	-d)
Ή	1—1	-<H	l-1	u	4-)	N
>N		d	<		>1	•H
d	w	et	1	•d)	4-4	i—1
	rt)	te		C	rt!	rt)
O	4->		1	•H	4->	C
£	c	cn	d)	4-)	cn	rt)
•H	H	-H	N	-H	3
λ;	>	C	O	C	C
>cn	O	Ή	n	O	Φ	s
P	-H	4-)	rt)	•i—i	C	et
3	>N	>cn	r:	-H		c
Ct	d	Cn	et	4-1	II	(Π
>cn	>cn	α	d)	rt)
l-l	-H	Oi	cn		1	4c

PAVYZDYS. Chimopapaino alergiško veikimo tyrimas

Iš 3M Diagnostic Systems, JAV gavome 40 žmogaus serumo pavyzdžių, su kuriais buvo atlikti komerciniai bandy5 mai, žinomi Chymofost pavadinimu, su IgE, norint nustatyti prekyboje esančios chimopapaino formos Chymodiactin poveikį. Iš 40 pavyzdžių, išbandytų šiuo metodu, 20 buvo teigiami, o 20 - neigiami. Visi gauti pavyzdžiai buvo akli ir išbandyti natūralaus IgG antikunio prieš Chymodiactin , PPIII, PPIV ir išvalytą chimopapainą įgavimo atžvilgiu (chimopapainas buvo išvalytas šiame išradime aprašytu būdu ir, pagal paprastos radialinės imunodifuzijos duomenis, neturėjo PPIV ir PPIII) . Išbandymą atlikome modifikuotos kietais fazės imunofermentinės analizės metodu (ELISA), panaudojant šios schemos biotino-avidino sistemą:

Mikrotitravimo plokštelės padengtos Bandomu antigenu bandomu serumu monokloniniu antižmogišku IgE

Φ biotinilintu triušių anti-pelių Ig

M avidino-peroksidazės kompleksu

M substratu (ABTS) sustabdymas ir A₄₁₀ matavimas

Naudojome Chymodiactin^R su nepasibaigusiu galiojimo terminu, PPIV valėme šioje paraiškoje aprašytu metodu, o PPIII-metodu, aprašytu Buttle ir Barrett (1984) (žr. aukščiau cituotą darbą). Visi antigenai prieš vartojimą buvo inaktyvuoti švelniai karbosimetilinant jodacto rūgštimi (10 mM) pagal metodą, aprašytą Buttle ir Barrett (1984) (žr. aukščiau cituotą darbą).

Ant mikrotitravimo plokštelių figūrų užnešėme bandomo antigeno dangą, tai buvo atliekama inkubuojant kiekvieną figūrą su 100 μΐ antigeno (10 mg/ml) ir natrio karbonato buferiu (0,05 M, pH=9,6). Nespecifinio surišimo sumažinimui vėlesnėse stadijose naudojome donorini arklių serumą (4%). Po 4 vai inkubacijos 37°C temperatūroje su tiriamu serumo tirpalu (skiedimas 1/20) ir PBS (0,1% Tween, 2% arklių serumo, 10 mM EDTA, 50 ųg/ml heparino, pH=7,2 (100 μΙ/figūrai), figūras laikėme dar 3 vai 37°C temperatūroje su monokloniniu žmogaus IgE (gautu pagal metodiką, aprašytą Kemeny and Richards, J. Immunol. Methods (1988), 108, 105; 1 ųg/ml,

100 μΙ/figūrai), o po to per naktį kambario temperatūroje su biotilintu triušių antipelių imunoglobulinu (išleidžiamu firmos Dakopatts, Danija; 1 ųg/ml, 100 μΙ/figūrai). Po to figūras inkubavome 30 min 37°C temperatūroje su avidinperoksidaze (10 μΙ/ml, 100 μΙ/figūrai), pridėjome /2,2'-azinobis(3-etilbenztiazolino sulfoninės rūgšties)/, ABTS, 0,5 mg/ml/ buferyje (100 mM citrinos rūgšties, 200 mM Na₂HPO₄, pH=4,2, aktyvavimas 1 μΙ/ml H₂O) ir 30 min laikėme kambario temperatūroje. Reakciją baigėme pridėdami 100 μΙ/figūrai 100 mM citrinos rūgšties, 0,01% NaNO₃. Matavome kiekvienos figūros absorbciją prie 410 nm, pasinaudodami Micro ELISA reader (Dynatech) . Tuo pat metu analizavome IgE standartus 0,075-4,8 ng/ml koncentraciją intervale (2,4 ng IgE koncentracija ekvivalentiška tarptautiniam IgE vienetui) . IgE koncentracijų kiekvienos iš keturių antigeninių kompozicijų (Chimodiactin^R, PPIII, PPIV ir chiLT 3827 B mopapainas, gautas pagal 23 pavyzdžio būdą) atžvilgiu skaičiavimui naudojome Enzfitter programą (Leatherbarrow, R.J., 1985, Enzfitter for IBM PC, Elsevier-Biosift, 68 Hills Road, Cambrige CB2. 1LA, Didžioji Britanija).

iš 40 išbandytų serumo pavyzdžių turėjo IgE Chimodiactin^R antikūnius. Reikšmės, gautos 12 pavyzdžių su PPIII, PPIV ir chimopapainu, kurie pasižymėjo didžiausiu aktyvumu Chymodiactin^R atžvilgiu, pateiktos 4 lentelėje. Vidutinės reikšmės ir standartinės paklaidos apskaičiuotos 9 nustatymams.

Iš pateiktų duomenų matome, kad tik dviejuose iš šių 12 pavyzdžių, turinčių chimopapaino antikūnių, chimopapainas duoda pagrindinę IgE reakciją, ir kad PPIII ir PPIV antikūniai yra atsakingi už maždaug 75% rasto IgE.

PAVYZDYS. Chimopapaino ir PPIII mišinių inhibavimas vištų cistatinu

Chimopapainą valėme 23 pavyzdyje aprašytu būdu ir standartizavome titruodami aktyvius centrus reagentu E-64, substratu naudodami ΒΑΡΝΑ (Zucker ir kt. , 1985, Biochem. Biophys. Actą, 828, 196-204). Aukščiau aprašytu būdu valytą PPIV taip pat titravome reagentu E-64 (pagal modifikuotą metodiką, naudojant substratu azokazeiną).

formos vištų cisteiną valėme pagal metodiką, aprašytą Anastasi ir kt. , 1983, Biochem. J., 211, 129-138, ir standartizavome titruojant papainu, kurį prieš tai nufiltravome reagentu E-64.

Azokazeino hidrolizės analizę vykdėme Rowan ir kt. ,

1988 (žr. aukščiau cituotą darbą) metodu su tuo skirtumu, kad, prieš pridėdami fermento substratą ir inhibitorių, tirpalą 15 min laikėme 40°C temperatūroje.

•rl +>

(J (0 •H

Ό

O š,

X!

Φ n

O

P •rl >0

C •rl

M

P

Φ n

o α

•rl >N

Ό

N r

n) cu o

ε n

M φ

0]

O •n •rl

O n>

M

P c

Φ o

c o

	44 CO •d) C •rl M-l	CO
•Φ	rl	d
r-1	O	•rl
Φ	CU	C
P	CU	l3
c	co	44
Φ		•rl
rd	H	-P
	CO	C
Z1	H	ed

o c

•cd <0 cu (0 z

o e

•H

JZ

U oV>

OO kO

CM

CM

CN

CM

CO

CM

CO

OO i—1 o cn co oo CM

CM «-<

o rco <T$

M

Ό c

d)

CQ (0 •H

d) •H ω

fū c

H

Π3 z

<d z

o ε

•H z

o m

•H c

•H

4-1

U <0

Ό

C

4-1

C0

CO •H

M

T5 •H >

Hd h-I I—i Cu CL

CO •H

CL >.

5d

O

C co

co to •H

Jd □

T5 •H >

CO

Cu c/) CL

CO «H

Λί

Lt

O

Ό

-H >

CO

Ό

N >1 >

rO

CL

CN	co	oo	00	o	Γ-	c—1		UO	CO	r-	co
kO vr	CM C-1	V	K	v			*h.	K.
CN	UO		ro	uo	'tr	CO	c—1	uo	co
co		CO	c—t	oo	m o	CM	CM	CM	i—1	r- O	CM
1-	O	O	O	o	o	O	O	O	o	o	o
CM	CM	CM	r-	kO	m	CN	CO	r-	uo	r-	co
·».		K.	K.		K.			K.		K.	V
co	CO	c—1	I—1	c—1	o	O	τ—1	rd	o	o	CM

r-	I-i	tn K.	CM	OJ *k	i—1 O	OJ K	i—1 K.	Γ o	CTi O	CM	CN O
I—	o	o	O	o	«k o	o	o	o	O	O	K o
co	o	Γ	CO	o	co	kO	i—1	co	tn		Ό1
00 i—	«Κ		·».			K.		K	K.
	CM	CM	CM	o	<—1	t—1	o	o	rH	o

r-	co		i—1	OJ	OJ	CM	t—1	CM	rd		rd
			K.	K.	K.	«Κ		K.	K.		K.
<—1	o	o	o	o	o	o	o	o	O	o	O

i—1	CN	co		i—1	kO	O	U0	O	kO	kO
K	K	K	K.	K.		K	K			<
UO	uo	rd	co	CO	CM	CM	i—1	t—t	co	o

CM

CO

UO kO

CN

CM

Bendras 50,5 35,2 23,6 109,3 Vidurkis 22

Ėmėme dvi serijas mėgintuvėlių, po 9 mėgintuvėlius kiekvienoje serijoje, ir i kiekvieną mėgintuvėli pridėjome po 125 μΐ 0,40 M fosfatinio buferio, turinčio 4 mM EDTA ir 16 mM cisteino laisvos bazės formoje, kurio pH=6,8. Po to i mėgintuvėlius pridėjome Įvairiais santykiais chimopapainą ir PPIV tokiu kiekiu, kad galų gale proteinazės koncentracija būtų 100 nM. Į vienos serijos mėgintuvėlius dėjome vištų cistatiną iki 1 μΜ koncentracijos, o į kitos serijos mėgintuvėlius - tokį patį tūrį vandens. Po to mėgintuvėlius inkubavome ir analizavome juose azokazeino hidrolizės rezultatus.

Vištų cistatino įtaką azokazeino hidrolizei, kurią sukelia nurodytų fermentų mišiniai, išreiškėme aktyvumo inhibavimo procentais, lyginant su tų pačių fermentų mišinių aktyvumu nesant cisteinui. Gauti rezultatai pateikti 5 lentelėje.

lentelė

Chimopapaino ir PPIV mišinių inhibavimo vištų cistatinu procentas

PPIV (nM)	Chimopapainas (nM)	λ·366 - cistatinas	^366 + cistatinas	Inhibavimo o, o
100	0	0, 092	0, 094	0
80	20	0,158	0, 102	35,4
70	30	0,191	0, 088	54,0
60	40	0,316	0,06	80,0
50	50	0,347	0, 058	83, 3
40	60	0,428	0,066	84,5
30	70	0,543	0, 028	94,5
20	80	0,588	0,033	94,4
0	100	0,733	0, 008	98,9

Iš pateiktų rezultatų matome, kad inhibavimo vištų cistatinu laipsnis yra atvirkščiai proporcingas PPIV koncentracijai.

PAVYZDYS. Chimopapaino valymas rūgštinio nusodinimo prie pH 2,2-1,2 būdu

I) Komercinį džiovinimo išpurškiant būdu išdžiovintą Carica papaya lateksą (išleidžiamą firmos Powell and Scholfield, Didžioji Britanija) skiedėme distiliuotu vandeniu iki 20 svorio % koncentracijos ir maišėme valandą. Netirpią liekaną pašalinome centrifuguoj ant 30 min 4°C temperatūroje, esant 9000 x g, o virš nuosėdų buvusio skysčio pH mažinome 4°C temperatūroje maišant ir lašais pridedant druskos rūgštį (1 M), pridėjimo greitis - 40 μΐ/min/ml. Mišinio pH nepertraukiamai sekėme su kombinuotu elektrodu (tipas GK 2401C), kuris buvo nukalibruotas su standartiniais buferiniais tirpalais, kurių pH=4,01 ir 1,09 (Radiometer, 25°C) . Nuo pH=2,2 iki pH=l,2 kas 0,2 pH vienetus rūgšties pridėjimą nutraukdavome ir atitinkamą pH reikšmę 4°C temperatūroje palaikydavome pastovia, tęsdami maišymą. Alikvotinę tirpalo dalį (ekvivalentiškų 10 ml pradinio tirpalo) paimdavome ir laikydavome atskirai, o į likusią tirpalo dalį pridėdavome rūgštį iki sekančios pH reikšmės sumažėjimo.

II) Visus atrinktus bandymus 30 min centrifugavome 4°C temperatūroje, esant 9000 x g, ir netirpią liekaną atmesdavome.

III) Visų virš nuosėdų buvusių skysčių pH reikšmes nustatėme lygias 6,8, lašais pridėdami į šiuos bandinius NaOH tirpalą (1 M), greitis 400 μΐ/min. Nuosėdų pašalinimui visus bandinius vėl 30 min centrifugavome, esant 9000 x g.

Kitame bandyme rūgštinį nusodinimą prie pH=l,8 atlikome 25°C temperatūroje.

Galų gale gautus virš nuosėdų buvusio skysčio bandinius analizavome, norėdami nustatyti aktyvumą ΒΑΡΝΑ atžvilgiu bei PPIV ir šį išradimą atitinkančio chimopapaino kiekius aukščiau aprašytu paprastos radialinės imunodifuzijos metodu). 6 lentelėje pateikti duomenys liudija, kad rūgštinis nusodinimas prie pH=l,8 ir 4°C temperatūroje leidžia sumažinti PPIV kiekį iki mažiau nei 0, 1% nuo bendro baltymo kiekio, o nusodinimas prie pH=l,8 ir 25°C temperatūroje - iki mažiau nei 0,5%.

PAVYZDYS. Monospecifinių IgG antikūnų, inicijuotų avyse, gavimas

Švarų chimopapainą, gautą pagal 21 pavyzdyje aprašytą metodą, prieš naudojimą karboksimetilinome švelniomis sąlygomis pagal metodą, aprašytą Zucker ir kt., 1985 (žr. aukščiau cituotą darbą) ir dializavome vandeniniame natrio fosfato (10 mM) tirpale, kurio pH=7,3 ir kuriame buvo NaCI (0,14 M). Chimopapaino antiserumą avyje inicijavome atlikdami 100 ųg karboksimetilinto baltymo pilname Freund adjuvante injekciją į raumenis, ir po to po mėnesio atlikdami tokią pačią 50 ųg injekciją. IgG iš dalies valėme frakcionuodami su amonio sulfatu, kaip tai aprašė Heide ir Schwick (1978) (žr. aukščiau cituotą darbą), o po to dializuodami vandeniniame natrio fosfato tirpale (10 mM) , turinčiame NaCI (0,14 M), pH=7,3.

Papaino (papajos), proteinazės III, ir papajos proteinazės IV IgG antikūnius ruošėme tokiu pačiu būdu.

Kiekvieną atskirą individualų karboksimetilintą antigeną imobilizavome pagal pridedamas instrukcijas kolonėlėse, kurias su Zetaffiniti pavadinimu išleidžia firma Anachem. Prieš tai kolonėlės buvo pervestos į pusiausvyrinę padėtį apdorojant vandeniniu natrio fosfato tirpalu (10 mM) , turinčiu NaCl (0,14 M), pH=7,3.

Sąlygos Temperatūra Baltymas Aktyvumas ΒΑΡΝΑ Specifinis Chimopapainas PPIV (% nuo (°C) (mg) atžvilgiu* aktyvumas ΒΑΡΝΑ (mg) bendro baltymo (vienetaixl0⁵) atžvilgiu* kiekio)

O CO	kO	o	C5>	kO	LO	σι	m
LO	CN	O	o	o	o	tr
O CN		v.	h.	K.			K.
θ'	t—1	O	o	o	o	o

co	,—1	O		tr	to	kO	σ>
o	(O	CO	<Τϊ	CN	CN	kO	kO
CN	CN	CN	t—l	CN	CN	,—1	CN

O	O	CN	<—1
r-	CN	LO	CO
kO	I—1	O	t—1
r—i	t—1	—i	i—1

O	00	kO	r-
ro	σ\	o
σ>	co	σ\	co

co	LO	1-(	o	r~	co	1-1	m
1 f*!	K	K	K.
LJ ) ,—1	cn	Oi	CTi			r-	00

kO	kO	LO	kO	co	cn		LO
	tr	kO	ΟΊ	CN	kO	co	CN
ΟΊ	00	co	o-	co	00	o-	<71

tr tr tr n tr to to H fO

G	i—1	CN	o	00	kO	tr	CN	00
-H	(Ū		K.	K.			K.
Ό	cr	CN	CN	»—1	1-1	t—1	i—1	r-H
(Ū	G	II	II	II	II	II	II	II
G	•H	X	X	XI	X!	XI	X	X
CU	+J	a		a	a	a	{X	04

* ΒΑΡΝΑ analizė, Metodas Nr.

Galimus užteršimus ir antikūnus, kurie gali duoti kryžmines reakcijas, iš IgG preparatų atskyrėme absorbcijos būdu, tam tikslui preparatus praleidome pro kolonėlę. Gauti IgG preparatai davė nusodinimo reakciją su savo atitinkamu antigenu ir, tuo pat metu, nedavė kryžminės reakcijos su kitais antigenais. Kolonėlės su joje nusodintu antigenu regeneraciją, norint pakartotinai naudoti kolonėlę, vykdėme vandeniniu dietilamino tirpalu (0,05 M), pH=ll,5, po to ją iš karto pervesdavome į pusiausvyrinę padėtį, apdorodami fosfatiniu buferiu.

Gavome chimopapaino, PPIII, PPIV ir papaino monospecifinius IgG preparatus, kuriuos galima naudoti kiekybiniam kiekvieno antigeno nustatymui aukščiau aprašytu paprastos radialinės imunodifuzijos metodu.

PAVYZDYS. Chimopapaino valymas rūgštiniu nusodinimu prie pH=l,5

I) Komercinį džiovinimo išpurškimu metodu išdžiovintą Carica papaya lateksą (20 g) , kurį išleidžia firma Siebels, JAV, 0°C temperatūroje 60 min maišėme dejonizuotame vandenyje (prieš tai atšaldytame iki 4°C; 250 ml) . 10 μΐ/min/ml greičiu pridėdami HCI (1 N) nustatėme pH reikšmę, lygią 1,5. pH reikšmę nepertraukiamai kontroliavome kombinuotu Radiometer elektrodu (tipas GK 2401C), kuris buvo nukalibruotas standartiniais buferiniais tirpalais pH=4,01 ir pH=l,09 (Radiometer, 25°C) . Pasiekus pH=l,5, tirpalą laikėme 10 min, norėdami stabilizuoti pH, ir, esant reikalui, koreguodami jo reikšmę.

II) 4°C temperatūroje mišinį centrifugavome 30 min, esant 12000xg, ir liekaną atmetėme.

III) (a) 10 μΐ/min/ml greičiu pridėdami NaOH tirpalą (1 M) nustatėme virš nuosėdų buvusio tirpalo pH=7,0, pH reikšLT 3827 B mę nepertraukiamai kontroliavome Radiometer elektrodu, nukalibruotu su standartiniu buferiu pH=7,01 (Radiometer, 25°C). Tirpalo pH reikšmei pasiekus 7, tirpalą laikėme dar 10 min stabilizavimuisi, esant reikalui, koregavome jo reikšmę. Po to 30 min 4°C temperatūroje centrifugavome, esant 12000 x g, ir nuosėdas atmesdavome.

b) Virš nuosėdų buvusi tirpalą 4°C temperatūroje dializavome su 30 tūrių dejonizuoto ir distiliuoto vandens, kurį du kartus keitėme kas 12 valandų.

Dializatą valėme katijonitinės chromatografijos būdu su aukštos skiriamosios galios S-Sepharose 35/100 kolonėlėje (Pharmacia). Per vieną kartą naudojome ne daugiau 3 g baltymo (A₂₈₀ analizė) . Prieš tai kolonėlę pervesdavome į pusiausvyrinį būvį 4°C temperatūroje vandeniniu EDTA (1 mM) tirpalu. Praleidus bandinį pro kolonėlę, ją plovėme vandeniniu EDTA tirpalu (1 mM) iki tol, kol A₂₈₀ pasidarydavo vėl lygi 0.

Po to pro kolonėlę praleidome tirpalą su K⁺ gradientu nuo 0,175 mM iki 0,5 M atrinkdami frakcijas po 25 ml. Frakcija su sugėrimo piku analizavome ΒΑΡΝΑ aktyvumo atžvilgiu.

Frakcijas, turinčias chimopapainą su maksimaliu specifiniu aktyvumu ΒΑΡΝΑ atžvilgiu (besieliuuojančias esant 0,17-0,22 MK⁺ koncentracijai) apjungėme. Apjungtas frakcijas 4°C temperatūroje dializavome su dejonizuotu ir distiliuotu vandeniu, kurią keitėme 5 kartus kas 12 valandų. Dializatą džiovinome sublimacinio džiovinimo būdu ir laikėme -20°C temperatūroje.

Aprašytą valymo procedūrą kartojome keletą kartų. Šį išradimą atitinkančio chimopapaino, PPIII, PPIV kiekį nustatinėj ome aukščiau aprašytu paprastos radialinės imunodifuzijos metodu, o avyse pasigaminusių antikūnių LT 3827 B kaip tai aprašyta 27 pavyzdyje. Aktyvumą ΒΑΡΝΑ atžvilgiu ir aktyvių centrų titravimą jodacto rūgštimi atlikome pagal ΒΑΡΝΑ Metodiką Nr. 1. Išvalymo efektyvumą iliustruoja vidutinės reikšmės, pateiktos 7 lentelėje.

d) rp

d)

P

C

d) t

e o
P n c	o e	o
c φ		H
P	Λ<
•P +>	<—1	Φ
Π3	Φ	•H
iX § <fl c Oj U	P

o

o\°	p
	u c
ΡΊ	(D
P4 1—i	n
O,	o
04	3 C

O e o ·Η

P r-i (U O -H X

'tr »—I r-H CM

o\° > M	0 P Ό C d) p
04 04	0 P
	c
CO	0
(t	P
c	u
•H	c
05	(U
CU	p
03
£4	0
0	3
£	c
Ή
P	o\°
u	—

ω	•H
'3	03
>	P
>1	P
P	C
P	Φ
<	ϋ

o\°

CO •H

G •H

4-1

H υ

<D

0, ω

co

P

Ό c

φ m

O — £ O Ξ>ί -H -U

P φ Φ -H rQ

O — £ O

-H -P X r—| Q) fū Ή

I

OT	•H
rd	>
ε	>N
3	P
> >1	(Ū
P
p	2
nj	CU < 03

o

P

Φ

C , φ^4 -H ^{ tn £

CM

CM

LO o Ch

CM CO LO

O CO CM

CO CM

CM i~I ’T r- co rlo co

CM Ch o- co

cn	CO	-k
r-	cn,	LO
0	0	O
r—1	Γ—1	Ch

>

p)

I-1 •H tn co •H

Λί

Φ •H tn £

co

O

CM

O t—l <0 LO rd (O o· rV LO 2 cp> ro •H

<d	-φ c • H P Ή	1 td P tn 0	u •H U 03 £ •H	0 ε •H
•ω	tn		•(D	c	P		•O	į |	c
c	td	LO	N	0	td		N		-H
•H	Ή		•H	•n	e		•r|	3	>
Ό	>N	t—1	Γ—1	Ή	0	03	—1	co	0
(Ū	Ό	II	03	P	P	m	03		•H
M	ω	CC	•H	td	r;	•H	-H	O	>N
CU	ε	a	a	2	0	4-1	Q	tu	Ό

tn (0 e

o

4-!

(0

-P «

p

G o

>

P ω

c

I s

baltymo kiekis, nustatytas iš sausos medžiagos svorio

PAVYZDYS. Chimopapaino valymas rūgštinio nusodinimo prie pH=l,5 ir afininės chromatografijos metodais

I-III) Komercinį džiovinimo išpurškimu metodu išdžiovintą Carica papaya lateksą (50 g) , išleidžiamą firmos Siebels, JAV, preparavome ir apdorojome rūgštimi prie pH=l,5 tuo pačiu būdu, kuris aprašytas 23 pavyzdyje (I-III). Virš nuosėdų likusį skystį 4°C temperatūroje dializavome su 30 tūrių dejonizuoto ir distiliuoto vandens, kurį du kartus keitėme kas 12 valandų.

IV) Kolonėlę (sluoksnio tūris 350 ml), užpildytą ECHSepharose^R, kuri surišta su L-Ala-L-PheSc (kuri paruošta pagal 10 pavyzdžio aprašymą), pervedėme į pusiausvyrinį būvį apdorojant per naktį vandeniniu etandiolio (33 tūrio %) tirpalu, turinčiu natrio acetatą (50 mM) , ir kurio pH=4,5, o po to vandeniniu NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ tirpalu (50 mM Na⁺) , turinčiu EDTA (1 mM) etandiolyje (33 tūrio %) , ir kurio pH=6,8 (darbinis buferis) .

Dializuotą virš nuosėdų buvusį tirpalą (žr. aukščiau) filtravome per filtrą su porų diamatru 0,2 ųm ir į filtrą pridėjome etandiolį iki 33 tūrio % koncentracijos. Tikrinome tirpalo pH ir, esant reikalui, jo reikšmę nustatėme lygią 7. Po to į jį pridėjome šviežiai pagamintą L-cisteino tirpalą (200 mM) iki 4 mM koncentracijos, gerai sumaišėme, 4°C temperatūroje laikėme 15 min ir 4°C temperatūroje praleidome pro afininės chromatografijos kolonėlę 40 ml/val/cm greičiu. Kolonėlę praplovėme darbiniu buferiu, jo kiekis buvo lygus dešimteriopam adsorbento sluoksnio tūriui.

V) Chimopapainą eliuavome vandeniniu HgCl₂ (10 mM) tirpalu etandiolyje (33 tūrio %), kuriame buvo natrio acetatas (50 mM) ir pH=4. Tirpalo tūris buvo lygus trigubam adsorbento sluoksnio tūriui. Rinkome frakcijas po ml, frakcijas, pasižyminčias aktyvumu ΒΑΡΝΑ atžvilgiu, apjungėme ir toliau valėme katijonitinės chromatografijos būdu su 35/100 kolonėle, kuri buvo užpildyta didelės skiriamosios galios S-Sepharose (Pharmacia).

Kolonėlę iš anksto apdorojome 4°C temperatūroje EDTA tirpalu (1 mM) , po to pro ją praleidome tiriamą bandini ir 10 ml/min greičiu plovėme vandeniniu EDTA tirpalu (1 mM) iki tol, kol A_28O reikšmė vėl pasidarė lygi 0. Po to pro kolonėlę praleidome vandeninį K₂HPO₄/KH₂PO₄ tirpalą (50 mM K’) , pH=7,2, kuriame buvo EDTA (1 mM) ir L-cisteinas (500 mM). Tirpalo tūris buvo lygus trigubam adsorbento sluoksnio tūriui. Tirpalo praleidimą nutraukėme 30 min, po to pro kolonėlę praleidome tokį patį kiekį šviežiai pagaminto cisteininio buferio ir praleidimą nutraukėme 30 min. Po to kolonėlę praplovėme cisteininiu buferiu (jo tūris buvo lygus šešiagubam adsorbento sluoksnio tūriui). Po to kolonėlę pervedėme į pusiausvyrinį būvį, apdorodami ją vandeniniu K₂HPO₄/KH₂PO₄ tirpalu (50 mM K⁺) , pH=7,2, kuriame buvo

EDTA (1 mM).

Po to pro kolonėlę praleidome tirpalą su K⁺ koncentracijų gradientu nuo 0,175 mM iki 0,5 M ir surinkome frakcijas po 25 ml. Frakcijas su chromatografiniu piku analizavome norėdami nustatyti aktyvumą ΒΑΡΝΑ atžvilgiu. Pirmas pikas, pasirodantis esant K⁺ koncentracijai eliuente 0,2-0,25 M, atitiko chimopapainą. Antras pikas, pasirodantis esant K⁺ koncentracijai eliuente apie 0,45 M, atitiko papajos proteinazę III.

Frakcijas, turinčias chimopapainą su maksimaliu specifiniu aktyvumu, apjungėme ir 4°C temperatūroje dializavome su 50 tūrių dejonizuoto ir distiliuoto vandens, kurį keitėme 5 kartus kas 12 valandų.

Chimopapainą, eliuotą iš katijonitinės kolonėlės, aktyvavome cisteininiu buferiu, ir todėl jis pasidarė jautrus inaktyvacij ai oksidacijos pasėkoje. Norėdami išvengti arba sumažinti aktyvaus fermento inaktyvacijos oksidacijos pasėkoje tikimybę, ji turinčias frakcijas supylėme ą mėgintuvėlius su natrio tetrationato suspensija (200 mM) tokiu būdu, kad galutinė Na₂S₄O₆ koncentracija frakcijoje būtų 5 mM. Pagal kitą variantą, apjungtas chimopapainą turinčias frakcijas dializavome vandenyje azoto atmosferoje. Vanduo nuo deguonies buvo išvalytas 30 min 0,1 1/min greičiu leidžiant pro ji, azotą.

Gautą dializatą džiovinome sublimacinio džiovinimo būdu ir laikėme -20°C temperatūroje.

Aprašytą valymo procedūrą kartojome kelis kartus. Išvalymo efektyvumą kontroliavome vykdydami analizę, kuri buvo atliekama pagal 28 pavyzdžio aprašymą. Išvalymo efektyvumą iliustruoja vidutinės reikšmės, pateiktos 8 lentelėje.

PAVYZDYS. Chimopapaino valymas rūgštinio nusodinimo prie pH=l,5 ir afininės chromatografijos metodais

I-III) Komercini džiovinimo išpurškimu metodu išdžiovintą Carica papaya lateksą, gaminamą firmos Siebels, JAV, preparavome, apdorojome rūgštimi prie pH=l,5, dializavome ir apdorojome katijonitinės chromatografijos su S-Sepharose metodu tokiu pat būdu, kaip tai yra aprašyta 28 pavyzdyje.

Φ r-1 Q) P C <D

o\°	o
cn	P Ό	0 E	o
<0	V-i Φ o	κ>Ί	Ή
P	P	λ:
•H	P	P	φ
D	O 3 C	fO	•H
a <o Cl	X

o o\° M c

n φ HH X I—I

CL O CL □ c o — e o

Ξ>, -H p λ: P (D D Ή X! P cA° >

l-l

O

M

Ό

C ω

o —

E o ►>Ί -P P Λί rp Φ

CL CL	o c	Π3 2	• H
D	o
rO	M
C	U
•H	C	O
rO	Φ	E	0
CL	2	>,	•H
D		4J
a	o	r- j	Φ
0		to	-P
£	c	X	2
Ή
2	o\c
υ	~~

cn	-P
	fO
>	P —
>1	P o\°
4-1	c —
λ;	Φ
	υ

co •r| c

•H

P •H

O

Φ &

ω w

rO e

n >

£>1

-P

Λί rO

I

-—i •H >

>N <0 <

Z

CL <

CQ «0 -P Φ C Φ r •H >

v •H

LD rP

O v

’ŠT ST rP rP C\l

C\J

CN O O V V

LD O <P

CN CD LD

O 03 CN cd cn

CP e

CM	i—1	D1
Γ-	O	r-
LT)		LD

D r—i

LD

LD co

LD sr

T-L o o o o i—I t—I

LD CD

CN ’šT

LD fr-1 rp

-K

O

CN

CD

W rtf

P

Ό

C

Φ

CQ

t?

£ co i—ι r' o cm γιο v oo ld o o

CM CM r—I fO r~ <o (—Į r-l CO

CM

ΟΊ CO

CO o

rū	1 21 1 ω cn	o ω d) 2	d) c •P 2 •P	-P P ro P tP ΓΊ	•P u rū ε •P	•P c •P > o
-OJ	tP		•Φ	O	2	c	4_J	•Φ	<—1	•P
C	<p	LD	N	M	1	o	dj	N	2	>N
P	•P		•P	Π3	2	•rp	6	• P	3	Ό
Ό	>N	i—i	1-J	2	1	P	o	i—1	cn
m	Ό	II	rO	a	cū	P	M	rO		O
M	d)	2	•P	d)	1-1	fO	2	•P	o	•P
CM	ε	g,	Q	ω	<		U	Q	CM	C

cn (Q ε

o

4-1 ftf

4-1 cn

G

C

O >

□

Φ

C

I baltymo kiekis, nustatytas iš sausos medžiagos svorio •Φ r-(

Φ «Ρ β

Φ

o\°	o
CO	Ό z—1	o ε	o
Φ	Lm (U n	Σ>ι	•H
C	X	X.
•H	«-H	Φ
ro	o	<Ū	H
a, <0 Cu	G C		Ai

o o\° P — TS c

M Φ H P M

P O o, p c o — ε o Σ>ί -h x x r—I Q) rū -H Λ X o\° >

HH

O

Ό

G

d)

X

O — £ O £*ι ·Η X Ai r-l φ

CL,		Π3 -H
CL	u	n
	C
W	O
Π3
C	Ό
•H	G	o —
D	Φ	ε o
CL	X	>ι Ή
<ΰ		P P
CL	O	P Q)
0	a	(C -H
ε	G	P p
Ή
P	o\°
U	---

co	•H
a	fO
>	M —
	X o\°
X A!	G Φ U

co

-H

C •H x

•H

O

0) a

ω co <0

M

Ό

C

Φ

CQ

CO	Ή
fO	>
£	>N
G	P
> Γ>Ί	(0
X	<c
X	z
fO	CL CQ

kO CO LD i—1 i—I CM i—| tn cm o v

CM o

Γ- CO LD

CM CM Γ1-1 ΓΟΟ CM LD

H fO

X

Φ

C , Φ^ •H ' >

Ή tr tr £

tr £

CM	00	LC
co	LD	Γ—1
kO		09

LD

ΓΟΟ

CM

ΓlD

CM

CO

CM i—I CO 00

CM

O

V rri

CM 09 CO r- co co ro

O

CM

O

1-1 co

X ld roo

CM LD

X

LD kO

CM r- CO CM ld r09 CO 09

	rū	O C •H p) •H	•H P rū P Cn o	1 P 1 o OT	u ω ω P	-H o rū ε •H	•H C Ή > O
•(D	Cn		-D	c	l_>	o	CL	•Φ	1—1	•H
C	(t	X	N	o	fŪ	P	1	N	P	>N
•H	Ή		-H	-m	ε	rū	P	Ή	P	Ό
Ό	>N	i—l	»—1	-H	o	P	1	t—1	m
rū	n	II	rū	P	P	CL	rū	<Ū		O
P	(D	z	•H	(d	p	Φ	i—1	•H	O	•H
CL	ε	CL	Q	Z	o	ω	<	Q	P	C

ω ro ε o

4-) rū -P ω O c o >

P Λ (D C I

Z * baltymo kiekis, nustatytas iš sausos medžiagos svorio

IV) Frakcijas, turinčias chimopapainą su maksimaliu specifiniu aktyvumu ΒΑΡΝΑ atžvilgiu, apjungėme ir pridėjome etandiolį iki 33 tūrio % koncentracijos. Po to i apjungtas frakcijas pridėjome šviežiai pagamintą vandeninį L-cisteino tirpalą (200 mM) iki 4 mM koncentracijos, ir tirpalą praleidome pro kolonėlę, užpildytą ECH-Sepharose*, surišta su L-Ala-L-PheSc, taip, kaip tai aprašyta 29 pavyzdyje (IV).

V) Chimopapainą eliuavome vandeniniu HgCl_z tirpalu (10 mM) etandiolyje (33 tūrio %), pH=4,5, turinčiame natrio acetatą (50 mM) . Tirpalo tūris buvo lygus trigubam adsorbento tūriui. Rinkome frakcijas po 25 ml. Frakcijas, pasižyminčias aktyvumu ΒΑΡΝΑ atžvilgiu, apjungėme ir

4°C temperatūroje dializavome su 30 tūrių dejonizuoto ir distiliuoto vandens, kurį keitėme 5 kartus kas 12 valandų. Dializatą džiovinome sublimacinio džiovinimo būdu ir laikėme -20°C temperatūroje.

PAVYZDYS

Du šį išradimą atitinkančio chimopapaino preparatus analizavome pasinaudodami ΒΑΡΝΑ analize pagal Metodikas Nr. 1 ir Nr. 2. Baltymo kiekį nustatinėjome iš bendro sauso bandinio svorio. Chimopapaino A preparatas buvo gautas valant pagal 28 pavyzdžio metodiką. Chimopapaino B preparatas buvo gautas valant pagal 29 pavyzdžio metodiką (paskutinės frakcijos surinktos natrio tetrationate). Kiekvieną nustatymą kartojome 3 kartus. Gauti rezultatai pateikti 10 lentelėje.

10 lentelė	86
Ch imopapa i no	Specifinis	aktyvumas (vienetai	ΒΑΡΝΑ atžvilgiu -1, mg )
preparatas	Metodika Nr. 1	Metodika Nr. 2
A	855		2227
B	1261		3591

PAVYZDYS

Chimopapainą, išvalytą pagal 29 pavyzdžio aprašymą ir dializuotą azoto atmosferoje aukščiau aprašytu būdu, džiovinome sublimacinio džiovinimo metodu ir laikėme 20°C temperatūroje.

Tuo būdu pagaminto chimopapaino specifinis aktyvumas ΒΑΡΝΑ (1 mM) atžvilgiu, esant 37°C ir pH=6, buvo 1345 vienetai miligramui.

Norėdami paruošti 100 buteliukų su chimopapainą turinčia kompozicija, žemiau aprašytu būdu ruošėme 43,75 g pradinio tirpalo. Dirbant su šiuo tirpalu jo temperatūrą palaikėme 4-12°C ribose.

L-(+)-cisteino hidrochloridą (166 mg) pridėjome į maždaug 30 g vandens, skirto injekcijoms taip, kad gautume 22 mM koncentraciją. Pasinaudodami NaOH (1 M) arba HCI (0,1 M) nustatėme tirpalo pH reikšmę 5-5,5. Paruoštą cisteino tirpalą pridėjome prie išvalyto chimopapaino (358 mg) taip, kad galų gale gautume 10000 vienetų/ml koncentraciją. Pasinaudodami NaOH (1 M) arba HCI (0,1 M) nustatėme maišomo tirpalo pH reikšmę 5,96,1 ir vandeniu, skirtu injekcijoms, praskiedėme iki 43,75 g. Paruoštą tirpalą sterilizavome, nuosekliai praleisdami jį pro du filtrus, kurių porų diametrai buvo 0,2 ųm. Į 100 5ml tūrio stiklinių buteliukų įpylėme po 0,4 g tirpalo. Buteliukus užkimšome kamščiais, vandenį pašalinome sublimacinio džiovinimo sumažintame slėgyje būdu, ir buteliukus su liofilizuotu produktu hermetizavome vakuume.

Kiekviename buteliuke buvo balti amorfiniai milteliai, turintys 3,27 mg chimopapaino ir 1,52 mg natrio cisteinato hidrochlorido (nominalus aktyvumas 4000 vienetų, atitinkamai 8 ųm, leidžiamas 10 % viršijimas).

Betarpiškai prieš naudojimą į kompoziciją, esančią bu10 teliuke, pridėjome 2 ml vandens, skirto injekcijoms. Gavome paruoštą injekcijoms tirpalą, nominaliai turintį 4000 vienetų chimopapaino ir 4 mM L-cisteino.

Claims (3)

1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

   1. Chimopapainas, besiskiriantis tuo, kad jo aktyvumas Ν-α-benzoi1-DL-arginino p-nitroanilido (ΒΑΡΝΑ) (1 mM) atžvilgiu 37°C temperatūroje ir esant pH 6, 0, yra 800-1700 vienetų miligrame ir turi mažiau nei 0,2 % kiekvieno iš šių komponentų: papajos proteinazės III (PPIII), papaino ir papajos proteinazės IV (PPIV).

   2. Chimopapainas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo specifinis aktyvumas ΒΑΡΝΑ (1 mM) atžvilgiu 37”C temperatūroje ir esant pH 6,0 yra 10001700 vienetų miligrame.

   3. Chimopapainas, besiskiriantis tuo, kad jo specifinis aktyvumas ΒΑΡΝΑ (2,5 mM) atžvilgiu 40°C temperatūroje ir esant pH 6,8, yra 3000-4500 vienetų miligrame, ir turi mažiau nei 0,2 % kiekvieno iš šių komponentų: PPIII, papaino ir PPIV.

   4. Chimopapainas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo specifinis aktyvumas ΒΑΡΝΑ (2,5 mM) atžvilgiu 40°C temperatūroje ir esant pH 6,8, yra 35004500 vienetų miligrame.

   5. Chimopapainas pagal vieną iš prieš tai buvusių punktų, besiskiriantis tuo, kad jis yra aktyvus azokazeino atžvilgiu, ir jį bent 95 % inhibuoja mažesnės nei 1 μΜ vištų cistatino koncentracijos.

   6. Chimopapainas pagal vieną iš prieš tai buvusių punktų, besiskiriantis tuo, kad jis turi bent 70 % aktyvaus fermento.

   7. Kompozicija, besiskirianti tuo, kad į ją įeina chimopapainas pagal vieną iš prieš tai buvusių punktų.

   8. Kompozicija pagal 7 punktą, besiskirianti tuo, kad į ją įeina dar ir nešiklis.

   9. Kompozicija pagal 7 arba 8 punktą, besiskirianti tuo, kad ji yra hermetiškai išfasuota nepatenkant drėgmei į atskirus buteliukus arba ampules.

   10. Kompozicija pagal 9 punktą, besiskiriant i tuo, kad į ją įeina dar ir reduktorius.

   11. Kompozicija pagal vieną iš 7-10 punktų, besiskirianti tuo, kad i ją įeina dar ir cisteino proteinazės grįžtamas inhibitorius.

   12. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad į ją ieina chimopapainas pagal vieną iš 1-6 punktų.

   13. Farmacinė kompozicija pagal 12 punktą, besiskirianti tuo, kad į ją įeina dar ir farmaciškai priimtinas skiediklis, užpildas arba nešiklis.

   14. Farmacinė kompozicija pagal 12 arba 13 punktą, besiskirianti tuo, kad ji yra hermetiškai išfasuota nepatenkant drėgmei į atskirus buteliukus arba ampules.

   15. Farmacinė kompozicija pagal 14 punktą, besiskirianti tuo, kad į ją įeina dar ir farmaciškai priimtinas reduktorius.

   16. Farmacinė kompozicija pagal vieną iš 12-15 punktų, besiskirianti tuo, kad ji yra pagaminta kaip vienkartinė dozė, skirta parenteriniam vartojimui.

   17. Chimopapainas pagal vieną iš 1-6 punktų, besiskiriantis tuo, kad jis yra skirtas naudoti, esant chimonukleozei.

   18. Chimopapainas pagal vieną iš 1-6 punktų, besiskiriantis tuo, kad jis yra skirtas medikamento, naudojamo esant chimonukleozei, gavimui.

   19. Chimopapainas pagal vieną iš 1-6 punktų, besiskiriantis tuo, kad jis yra skirtas chimonukleczės pakenktų, išsikišusių arba kitą patologiją turinčių žinduolių tarpslankstelinių spinalinių diskų gydymui.

   20. Chimopapaino valymo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apima:

   a) vandeninio neapdoroto chimopapaino tirpalo inkubavimą su selektyvius centrus turinčia afininės chromatografijos matrica, turinčia matricą-pagrindą, kovalentiškai surištą (esant reikalui, per speiserinę grupę) su chimopapainą grįžtamai inhibuojančio peptido galiniu azoto atomu, to išdavoje nurodytas peptidas susijungia su chimopapaino molekulės aktyviu centru, ir

   b) chimopapaino eliuavimą tinkamu eliuentu.

   21. Chimopapaino valymo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apima:

   1) vandeninio mišinio, turinčio neapdorotą chimopapainą, nusodinimą, esant pH 1,2-1,8;
2. 2) neapdoroto chimopapaino vandeninio tirpalo išskyrimą iš nurodyto mišinio;
3. 3)neapdoroto chimopapaino tirpalo neutralizavimą ir, esant reikalui, nudruskinimą.

   22. Chimopapaino valymo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apima:

   I) vandeninio mišinio, turinčio neapdorotą chimopapainą, nusodinimą, esant žemesniems pH nei 2,0;

   II) neapdoroto chimopapaino vandeninio tirpalo išskyrimą iš nurodyto mišinio;

   III) neapdoroto chimopapaino tirpalo neutralizavimą ir, esant reikalui, nudruskinimą;

   IV) IlI-je stadijoje gauto tirpalo inkubavimą su selektyvius centrus turinčia afininės chromatografijos matrica, turinčia matricą-pagrindą, kovalentiškai surištą, esant reikalui per speiserinę grupę, su chimopapainą grįžtamai inhibuojančio peptido galiniu azoto atomu, to išdavoje nurodytas peptidas susijungia su chimopapaino molekulės aktyviu centru, ir

   V) chimopapaino eliuavimą tinkamu eliuentu.

   23. Būdas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad rūgštinį nusodinimą atlieka esant pH 1,2-1,8.

   24. Būdas pagal vieną iš 20-23 punktų, besiskiriantis tuo, kad jame yra bent viena katijoninės chromatografijos stadija.

   25. Chimopapainą grįžtamai inhibuoj antis peptidas, b esiskiriantis tuo, kad jį pasirenka iš L-AlaL-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-D-PheSc, L-Phe-L-PheMo,

   L-Phe-L-PheOx, L-Tyr-L-PheSc, L-Ala-L-ChaSc ir L-Ala-LLeuSc.

   26. Chimopapainą grįžtamai inhibuojantis peptidas pagal 25 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra dipeptidas, pasirinktas iš L-Ala-L-PheSc, L-Ala-DPheSc, L-Phe-D-PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-L-PheOx, LTyr-L-PheSc, L-Ala-L-ChaSc ir L-Ala-L-LeuSc.

   27. Afininės chromatografijos matrica su chimopapaino atžvilgiu aktyviais centrais, besiskirianti tuo, kad ji turi matricą-pagrindą, kovalentiškai surištą, esant reikalui per speiserinę grupę, su galiniu azoto atomu chimopapainą grįžtamai inhibuojančio peptido, turinčio fenilalanino darinius su galiniais anglies atomais arba fenilalanino analogų darinius, su sąlyga, kad tokiu inhibuojančių peptidu negali būti Lfenilalanil-L-fenilalanino semikarbazonas.

   28. Afininės chromatografijos matrica su chimopapaino atžvilgiu aktyviais centrais pagal 27 punktą, besiskirianti tuo, kad inhibuojantį peptidą pasirenka iš L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-DPheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-PheOx, L-Tyr-L-PheSc, LAla-L-ChaSc ir L-Ala-L-LeuSc.