HU211746A9 - Therapeutic agent - Google Patents

Therapeutic agent Download PDF

Info

Publication number
HU211746A9
HU211746A9 HU95P/P00687P HU9500687P HU211746A9 HU 211746 A9 HU211746 A9 HU 211746A9 HU 9500687 P HU9500687 P HU 9500687P HU 211746 A9 HU211746 A9 HU 211746A9
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
solution
chymopamine
minutes
ppiv
added
Prior art date
Application number
HU95P/P00687P
Other languages
English (en)
Inventor
Daniel Hulbert Rich
Alan John Barrett
David John Buttle
Original Assignee
Boots Co Plc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boots Co Plc filed Critical Boots Co Plc
Publication of HU211746A9 publication Critical patent/HU211746A9/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

A találmány kimopapainra, kimopapaint tartalmazó javított gyógyszerkészítményekre és emlősöknél sérült, sérves vagy más okból rendellenes csigolyaközi porckorong kezelési módszereire - a javított készítmény oldatának az említett porckorongba való befecskendezésével - vonatkozik. A találmány tárgyai továbbá a találmány szerinti kimopapain előállítási eljárásai, azok a peptidek és affinitáskromatográfiához alkalmas megfelelően preparált kromatográfiás oszloptöltetek, amelyek alkalmazásával a kimopapaint előállíthatjuk, és még továbbá a kimopapain ellen termelt ellenanyagot tartalmazó preparátumok.
A kimopapaint, amely egy, a papaja (Carica papaya) tejnedvében jelenlévő cisztein proteináz, régóta alkalmazzák a klinikai gyakorlatban, elsősorban a kitüremkedett vagy sérves porckorong, illetve ülőidegzsába gyógykezelésére. A gyógyító eljárás maga „kemonukleolízis” néven ismert a szakemberek előtt [L. Smith: J. Amer. Med. Assoc. 187, 137-140 (1964)].
A kimopapain tisztítását és jellemzését első ízben Jansen és Balls [J. Bioi. Chem. 137, 405—417 (1941)] kísérelték meg, akik savas kicsapást alkalmaztak, majd kisózással próbálták a tiszta enzimet előállítani. Legújabban ioncserés kromatográfián alapuló tisztítási eljárásokat alkalmaznak, ilyeneket közölnek például a GB 209 89 97 (Smith Laboratories Inc.) és GB 215 68 21 (Simmons) számú szabadalmi leírásokban. Mindkét eljárás során kationcserélő gyanta segítségével különítik el, más, ismert cisztein proteinázoktól a kimopapaint, és mindkét eljárást alkalmazzák már ipari méretekben is kimopapain előállítására. Mindazonáltal az így kapott készítmény enzimaktivitása meglehetősen alacsonynak mutatkozik a Buttle és Barret [Biochem. J. 223, 81-88 (1984)] által előállított kimopapainhoz viszonyítva, akik egy kisléptékű, soklépéses, többek között ioncserés kromatográfiát is magában foglaló tisztítási eljárást alkalmaztak. Az enzimet azonban, bár a tömegegységre vonatkoztatott aktivitása magasnak bizonyult, nagyon rósz kitermeléssel kapták, és az eljárás sémiképpen nem tekinthető gyártásra alkalmasnak. Buttle és munkatársai [Biochem J. 261, 469^76 (1989. július)] újabban azt találták, hogy az így előállított anyagot is szennyezi egy mostanában izolált és azonosított fehérjebontó enzim, nevezetesen a papaja proteináz IV, amely kationcserélő gyantáról a kimopapainnal együtt eluálható. A kationcserés kromatográfia tehát nem megfelelő módszer a kimopapain és a papaja proteáz IV elválasztására, vagy legalábbis nem eléggé jó hatásfokú az elválasztás, hogy lehetővé tenné lényegében papaja proteináz IV szennyezéstől mentes kimopapain előállítását.
Az irodalomban találtunk utalásokat olyan eljárásokra is, amelyek affinitáskromatográfiás lépést foglalnak magukban. Polgár [Biochem. Biophys. Acta 658, 262-269 (1981)] leírja, hogy a kimopapain tisztítása során több más elválasztástechnikai módszer mellett affinitáskromatográfiát is alkalmazott, ahol az oszloptöltet agarózhoz kötött higanyvegyület volt. Dubois és munkatársai arról számoltak be [Bioi. Chem. HoppeSeyler 369, 733-740 (1988)], hogy a Carica papaya tej nedvéből a cisztein proteinázok kinyerését hasonló módszerrel végezték. Ez a típusú affinitáskromatográfia az inért hordozóhoz kötött higanyvegyület és a fehérjék merkaptocsoportjainak kölcsönhatásán alapszik, ezért a kimopapainon kívül más fehérjék is, elsősorban ciszterin proteinázok, például a papaja proteináz IV ugyanúgy kötődnek meg az oszlopon és oldhatók le az oszlopról, mint a kimopapain.
Legújabban tudományos közleményekben hordozóhoz kötött peptidszármazékok alkalmazását publikálták specifikus proteinázok, így humán katepszin B [Rich és munkatársai: Biochem. J. 235, 731-734 (1986)], valamint Entamoeba histolytica által termelt hisztolizin [Luaces és Barrett: Biochem. J. 250, 903909 (1988)] affmitáskromatográfiás tisztításra. Kimopapain esetében azonban nincs tudomásunk arról, hogy mindezideig ilyen tisztítási módszerrel kísérleteztek volna, és továbbra is valós igényként jelentkezik, hogy a kimopapain tisztítása az eddigieknél jobb, ipari méretekben is alkalmazható eljárással rendelkezik.
A WO 84/00365 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírnak bizonyos szintetikus peptidszármazékokat, amelyek a szerin proteináz kimotripszin inhibitorai.
A találmány tárgya tehát új eljárás nagy aktivitású, szennyezésektől, elsősorban a papaja növénytejben előforduló cisztein proteinázoktól - ilyen a papaja proteináz IV is - mentes kimopapain izolálására és tisztítására. A találmány szerinti kimopapain alapjában véve tiszta, és túlnyomó részben az enzim aktív formájából áll.
A találmány szerinti kimopapain lényegében mentes mindazon immunológiailag megkülönböztethető proteinázoktól, amelyek a papaja tejnedvében előfordulnak, ilyenek például a papain és a papaja proteináz III (PPIII) - mindkettőt Buttle és Barrett [Biochem J. 223, 81-88 (1984)] írták le -, és különösen lényegesnek tartjuk, hogy mentes a papaja proteináz IV (PPIV) néven ismert, nemrégen felfedezett enzimtől is.
Az „alapjában véve tiszta” kifejezést talán helyesebb lenne úgy használni, hogy „alapjában véve immunológiailag tiszta”, ami jelen esetben azt jelenti, hogy a találmány szerinti eljárással előállított kimopapain és a tiszta PPIV - ennek izolálása és jellemzése Buttle és munkatásai [Biochem. J. 261, 469^76 (1989. július)] nevéhez fűződik - ellen termelt specifikus antitestek között nem mutatható ki számottevő keresztreakció, továbbá nem mutatható ki számottevő keresztreakció a Buttle és Barrett által a már idézett 1984-es cikkben korábban leírt, a papain és a PPIII ellen termelt specifikus antitestekkel sem. Szükségesnek tartjuk megjegyezni, hogy a Buttle és Barrett eljárásával előállított, úgynevezett „tiszta” kimopapainban tekintélyes mennyiségű, mintegy 14% PPIV szennyezést lehetett kimutatni, ennélfogva az ellenanyag, amelyet ilyen kimopapain felhasználásával állítottak elő, és eredetileg úgy vélték, hogy kimopapainra specifikus, mind a találmány szerinti eljárással tisztított kimopapainnal, mind a tisztított PPIV enzimmel szemben specifikusnak bizonyult. A találmány szerinti eljárással tisztított
HU 211 746 A9 kimopapain 0,2%-nál kevesebb, előnyösen legfeljebb 0,1%-ot tartalmaz a PPIV, PPIII és papain szennyezések bármelyikéből.
Az antigén és az antitest között lejátszódó keresztreakció kimutatására a szokásos, az irodalomban leírt, jól ismert módszereket alkalmazhatjuk. Ezek közé tartozik például az úgynevezett „fused rockét” immunelektroforézis, a kettős immundiffúzió - ezt a módszert Buttle és Barrett a már idézett 1984-es közleményükben írták le - a radiális immunoassay, a RIA (radioimmunoassay) és az ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
Bármely enzimkészítményben az aktív enzim mennyiségét a készítménynek egy meghatározott szubsztráttal szemben, meghatározott körülmények között mért fajlagos aktivitásával adjuk meg. Itt a leírásban előforduló kifejezés: „BAPNA szubsztráttal szemben mutatott fajlagos aktivitás” tehát a fehérjebontó enzim 1 mg száraz tömegére vonatkoztatva, a másodpercenként keletkező p-nitro-anilin pikomólokban kifejezett mennyiségét (pmól/sec/mg) jelenti, ha az enzimaktivitást standard körülmények között, az Na-benzoil-DL-arginin-(4-nitro-anilid) szintetikus szubsztráttal (BAPNA) szemben mérjük. A standard mérési körülmények előiratát, ami szerint a kimopapaint tartalmazó, ismert gyógyászati készítmények vizsgálatát végzik, 1-es mérési módszer, vagy Smith-féle mérési módszer cím alatt a későbbiekben részletesen megadjuk. Az így kapott fajlagos aktivitást itt a leírásban BAPNA szubsztráttal (1 mM) szemben, 37 °C-on és 6,0-os pH-értéknél mért aktivitásnak nevezzük. A találmány szerinti eljárással előállított kimopapainnak tehát a BAPNA szubsztráttal (1 mM) szemben, 37 °C-on és 6,0-os pH-értéknél mért fajlagos aktivitása 800 és 1700, előnyösen 1000 és 1700 egység között van milligrammonként. Egy tipikus, a találmány szerinti eljárással kapott enzimkészítmény fajlagos aktivitása például 1200-1500 egység, 37 °C-on, 6,0-os pH-értéknél mérve. A találmány szerinti eljárás megfelel annak a feltételnek, hogy valamely előnyös kiviteli módja olyan kimopapaint eredményez, amelynek a BAPNA szubsztráttal szemben, 37 °C-on és 6,0-os pH-értéknél mért fajlagos aktivitása legalább 1300 egység.
Noha a kimopapainnal foglalkozó bőséges szakirodalomban a kimopapain és más cisztein proteinázok fehérjebontó aktivitásának számos definícióját találjuk, és bár ezek mindegyike a BAPNA szintetikus szubsztrátból felszabaduló p-nitro-anilin mennyiségének mérésén alapszik, mégis probléma merülhet fel akkor, ha ezeket a fajlagos aktivitási adatokat össze akarjuk hasonlítani. A valóságos értékeket ugyanis, amelyek a mérés során kapunk, több faktor is jelentősen befolyásolja, és ezek között említhetjük például a szigorúan meghatározott reakciókörülményeket, így a pH-t, a hőmérsékletet, a pufferoldat összetételét és a szubsztrát koncentrációját. Buttle és Barrett a már többször idézett 1984-es közleményükben az általuk előállított kimopapainnak a BAPNA szubsztráttal szemben mért fajlagos aktivitásként 0,154 gmól/perc/mg értékeket adtak meg, ami átszámítva megfelel 2567 pmól/sec/mg-nek. Csakhogy a Buttle és Barrett által végzett meghatározás körülményei különböztek attól, amelyek szerint a gyógyászati felhasználásra szánt kimopapaint minősítik, ezért a fajlagos aktivitás közvetlen összehasonlítása nem lehetséges.
Mivel a valaha is leírak közül a Buttle és Barrett által előállított anyagot tartották mindezidáig a legnagyobb fajlagos aktivitású kimopapain tartalmú készítménynek, a találmánnyal kapcsolatos vizsgálataink során, kezdetben mi is az általuk leírt mérési módszert használtuk, és azt itt a leírásban 2-es mérési eljárás címmel közöljük, míg az eszerint kapott fajlagos aktivitást BAPNA szubsztráttal (2,5 mM) szemben, 40 ’Con és 6,8-as pH-értéknél mért aktivitásként adjuk meg, ilyen módon világosan kifejezésre juttatva azt a tényt, hogy körülményeit tekintve ez a meghatározás különbözik a gyógyászati készítményként felhasználható kimopapain aktivitásának meghatározására általánosan alkalmazott mérési eljárástól. Az általuk alkalmazott meghatározásokkal kapott eredmények a szokásos, a gyógyászati készítmények minősítésére használt 1-es mérési módszerrel mért értékeknek két-háromszorosai, és úgy gondoltuk, hogy tudományosan inkorrekt eljárás lenne, ha a két adatot egyszerűen egy faktor bevezetésével számítanánk át egyikből a másikba. Egyéb módszer híján tehát itt közöljük, hogy a találmánnyal kapcsolatos vizsgálataink korai szakaszában az általunk - a találmány szerinti eljárással - előállított tiszta kimopapainnak a BAPNA szubsztráttal (2,5 mM) szemben, 40 °C-on és 6,8-as pH-értéknél mért fajlagos aktivitást egy milligrammra vonatkoztatott egységekben kifejezve a 3000-tól a 4500-ig terjedő tartományban levőnek találtuk, például 3500^1500 egység/mgnak adtuk meg.
A feltalálók egy már itt idézett, mostanában megjelent közleményükben [Buttle és munkatársai: Biochem J. 261, 469—476 (1989)] beszámolnak arról - és ezt az alábbiakban itt a leírásban is röviden összefoglaljuk hogy egy korábban ismeretlen az eddig alkalmazott eljárásokkal előállított kimopapain mellett szennyezésként mindig jelen lévő vegyületet, a papaja proteináz IV (PPIV) enzimet sikerült elkülöníteniük, megtisztítaniuk és jellemző tulajdonságait leírniuk. Amíg azonban a PPIV a BAPNA szubsztráttal szemben inaktívnak mutatkozik, azo-kazeinnel szemben igenis mutat fehérjebontó aktivitást. Azt találtuk továbbá, hogy a PPIV azo-kazeinnel szemben mutatott aktivitását a csirke cisztatin egészen 1 μΜ koncentrációig számottevően nem befolyásolja, ezzel szemben a találmány szerinti eljárással előállított kimopapain esetében az azo-kazeinnel szemben mutatott aktivitás legalább 95%-os gátlását tapasztaltuk ugyanilyen koncentrációjú csirke cisztatin jelenlétében. Az „azo-kazeinnel szemben mutatatott aktivitás” kifejezéssel egészen pontosan itt azt a fehérjebontó aktivitást jelöljük, amelyet egységnyi száraz anyagra vonatkoztatva, az egységnyi idő alatt keletkező triklór-ecetsavban oldódó peptid mennyiségével fejezünk ki, természetesen standard körülmények között - ezt később részletesen tárgyaljuk a derivatizált fehérje szuszbsztráttal kivitelezve a meghatározást.
HU 211 746 A9
A találmány szerinti eljárással előállított kimopapain egyik előnyeként tartjuk nyilván azt a tényt, hogy az azo-kazeinnel szemben mutatott aktivitását legalább 97%-ban, de kedvező' esetben inkább 98-100%-ban gátolni lehet legfeljebb 1 μΜ koncentrációban jelen lévő csirke cisztatinnal.
Úgy gondoljuk, hogy a találmány szerinti kimopapain az első alapjában véve tiszta kimopapain, amely mentes a szennyező fehérjéktől, és túlnyomó részben az enzim aktív formáját tartalmazza. Ez az áttörés csak úgy volt elérhető, hogy felismertük, miszerint mindezideig a kimopapaint a kísérő fehérjékkel együtt „tisztították” például ioncserés kromatográfiával vagy az eddig használatos affinitáskromatográfiával. Ezt követően első ízben sikerült elkülönítenünk az egyik ilyen szennyező fehérjét, amelyet PPIV néven ismerünk, és amelynek a jellemző tulajdonságait is leírtuk. Az eljárás, amellyel a PPIV elkülönítését sikerült megoldanunk, nem alkalmas tiszta kimopapain előállítására, azonban az a tény, hogy a PPIV-et tiszta állapotban megkaptuk, két szempontból is nagyon fontosnak bizonyult a kimopapain vizsgálatával kapcsolatban. Az egyik, hogy a PPIV-specifikus antitestek nem mutatnak keresztreaktivitást a tiszta kimopapainnal; a másik pedig, hogy a tiszta kimopapain és a PPIV csirke cisztatin jelenlétében az azo-kazeinnel szemben mutatott fehérjebontó aktivitás tekintetében eltérően viselkednek. Ez a két felismerés alapvetőnek bizonyult ahhoz, hogy tiszta kimopapain előállítására alkalmas eljárást lehessen kifejleszteni.
Könnyű belátni, hogy a találmány szerinti kimopapain csaknem minden alkalmazási terület igényeinek megfelel, életbevágóan fontos azonban a teljesen tiszta enzimkészítmény azok számára, akik az enzim jellegzetességeit, például a katabtikus specifitását vagy a szerkezetét akarják tanulmányozni.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti tisztított kimopapaint tartalmazó készítmények.
Ezek a készítmények tehát gyakorlatilag szintén mentesek a PPIV szennyezéstől. A kimopapainnak a ΒΑΡΝΑ szubsztráttal (1 mM) szemben 37 °C-on és 6,0-os pH-értéknél mutatott fajlagos aktivitása milligrammonként 800 és 1700 egység között van. Az ilyen kimopapainból előállított készítmény az enzim megfelelő tömegű elkülönített adagjait tartalmazhatja, vízmentes körülmények között, például vákuum alatt leforrasztott ampullában vagy fiolában. Ezek a készítmények tartalmazhatnak valamilyen redukáló szert, például ditiotreitet vagy ciszteint, bázis vagy savaddíciós só formájában, amelynek az a szerepe, hogy védje az enzimet az oxidáció következtében fellépő inaktiválódástól. Más esetben a készítmény összetevője lehet egy reverzibilis cisztein proteáz inhibitor, nyilvánvalóan valamilyen só, például nátrium-tetrationát vagy higany(II)-klorid.
Ezek a reverzibilis inhibitorok blokkolják az enzim aktív centrumát, megvédve azt az oxidációtól és az inaktiválódástól mindaddig, amíg például valamilyen redukálószer segítségével el nem távolítjuk ezt a blokádot, ily módon újra aktívvá téve az enzimet. Az egyéb szokásos adalékok közül említhetjük a tartósítószereket, ilyen például a nátrium-hidrogén-szulfit, a kelátképző reagenseket, ilyen többek között az EDTA (etilén-diamin-tetraecetsav), valamint vivőanyagként például a nátrium-kloridot, amelyek kívánt esetben szintén a készítmény összetevői lehetnek.
Az enzimkészítmény tisztasága rendkívül fontos a kimopapain gyógyászati felhasználása során, például kemonukleolízis céljára, ugyanis azt tapasztalták, hogy ilyen kezelések alkalmával a kezelt betegek mintegy 3%-ánál allergiás reakciók léptek fel. Aporrá alakított papajakivonatot széles körben alkalmazza az élelmiszeripar, ezért jogos az a feltételezés, hogy a kemonukleolízis alkalmával fellépő allergiás reakciók többségéért az ilyen módon előidézett szenzibilizálás felelős. Mindazonáltal köztudott, hogy idegen fehérjét emlősök egyedeibe fecskendezve, az ott antigénként viselkedik, és egy ilyen beavatkozás magában hordozza az anafilaxiás roham veszélyét. A józan ész tehát azt kívánja, hogy az orvosi gyakorlatban egy ilyen fehérjejellegű készítményt mindig az elérhető legtisztább és legaktívabb formában alkalmazzunk, részint az optimális hatás elérése végett, részint azért, hogy a lehető legkisebbre csökkentsük az allergiás reakció kockázatát.
A fentiek alapján tehát a találmány lényeges elemének tekintjük azon gyógyászati készítményeket, amelyek a találmány szerinti kimopapaint tartalmazzák. Ezek a gyógyászati készítmények úgyszintént mentesek a PPIV szennyeződésektől, felhasznált kimopapainnak a ΒΑΡΝΑ szubsztráttal (1 mM) szemben, 37 °C-on és 6,0-os pH-értéknél mutatott fajlagos aktivitása 800-1700 egység/mg. A gyógyászati készítmények tartalmazhatnak továbbá valamilyen gyógyszerészetileg elfogadható, nem toxikus redukálószert, például ciszteint, szabad bázis vagy savaddíciós só formájában, így L-cisztein-hidroklorid-monohidrátot. A redukálószer mennyisége 4000 egységnyi kimopapainra számítva általában 0,5 és 3 mg között lehet, amely ily módon a kimopapain tömegére vonatkoztatva 15-90%-ot tesz ki. A találmány szerinti gyógyászati készítmények azonkívül tartalmazhatnak még, szokványos adalékokat, például gyógyszerészetileg elfogadható hígító-, kötő- vagy vivőanyagokat, továbbá tartósítószereket, így nátrium-hidrogén-szulfitot, kelátképzö reagenseket, ilyen például az EDTA, vivőanyagként pedig például nátrium-kloridot adhatunk a hatóanyaghoz.
A találmány szerinti kimopapaint tartalmazó gyógyászati készítményeket alkalmazhatják a szemészetben, például szemsérülések kezelésére, vagy elvárásodon szövetek eltávolítására, például égési sebek, fekélyek, nyomásos nekrózis, felfekvés vagy egyéb sebeknél, minden olyan esetben, amikor életképtelen szövetek vannak jelen. Ilyen célra rendszerint helyi kezelésre alkalmas gyógyászati készítményeket, így például steril oldatot, zselét, szuszpenziót vagy kenőcsöt használunk, amelyeket vagy közvetlenül a sebre helyezünk, vagy valamilyen sebkötöző anyagot átitatunk a készítménnyel.
A találmány szerinti kimopapaint előnyös olyan gyógyszerformában kiszerelni, amely lehetővé teszi,
HU 211 746 A9 hogy az ortopédiában alkalmazzák. Ezek közé tartoznak az ismert, szokásos módon előállítható parenterális beadásra szánt, egységnyi dózist tartalmazó gyógyászati készítmények, például a steril, megfelelő vivőanyaggal készült, pirogénmentes oldat vagy szuszpenzió, vagy idesoroljuk például azokat a gyógyszerformákat, amelyek a hatóanyagot koncentrátumként tartalmazzák, és közvetlenül a felhasználás előtt alakíthatók vissza injekciós készítményekké. Azok az egyszeri kezeléshez szükséges adagot tartalmazó készítmények, amelyek a rendellenes vagy sérült csigolyaközi porckorongba fecskendezve a nucleus pulposus feloldására, illetve ilyen kezelésére alkalmasak, mintegy 500 és 5000 közötti ΒΑΡΝΑ egységnek (1 mM szubsztrátkoncentráció mellett, 37 °C-on, 6,0-os pH-értéknél végezve a meghatározást) megfelelő mennyiségű, a találmány szerinti kimopapaint tartalmazhatnak valamilyen redukálószerrel, például nátrium-ciszteinát-hidrokloriddal együtt, légtelenített fiolában kiszerelve. Előnyös az a kiszerelési forma, amely 2000-4000 névleges ΒΑΡΝΑ egységnek (1 mM, 37 °C, pH = 6,0) megfelelő mennyiségű kimopapaint tartalmaz. Ez a mennyiség tömegét tekintve meglehetősen tág határok között változhat, így például a légtelenített fiolában kiszerelt készítmény tartalmazhat 2-5 mg, előnyösen 2,5-3,5 mg kimopapaint és 0,2-3 mg, előnyösen 1,0-2,0 mg nátrium-ciszteinát-hidrokloridot, adott esetben valamilyen alkalmas vivőanyaggal, például nátrium-kloriddal kombinálva.
Amint azt később, a leírás kísérleti részében ismertetjük, 26 különböző szérummintában találtunk természetes úton kialakult IgE ellenanyagot, amely a ChymodactionR nevű, kereskedelmi forgalomban beszerezhető kimopapain készítménnyel - a kimopapaint a GB 20 98 997 számú szabadalmi leírásban megadott eljárással tisztították - szemben reaktívnak bizonyult. Kísérletileg igazoltuk, hogy ezek a szérumok tartalmaznak IgE ellenanyagot a találmány szerinti eljárással előállított kimopapainnal szemben, valamint három másik, a papaja tejnedvében található cisztein proteinázzal, nevezetesen a papain, a PPIII és a PPIV enzimekkel szemben. Mindazonáltal a kimopapain, a PPIII és a PPIV fehérjékkel immunkomplexet adó átlagos IgE-szintnél az arányokat megvizsgálva az is kimutatható volt, hogy a PPIII és a PPIV együttesen az összes kimutatott IgE közel 75%-áért felelős. Ez az adat világosan mutatja, hogy ezek a fehérjék kifejezetten immunogén karakterűek, és az eddig hozzáférhető kimopapainban található antigéndetermináns csoportok túlnyomó részét hordozzák, miáltal az ezekkel szennyezett enzimkészítmények megdöbbentően nagy potenciális allergén veszélyt jelentenek. Ez is egyik oka, hogy a találmány szerinti gyógyászati készítmények jelentősen felülmúlják a mindezidáig ismert, a technika állását tükröző eljárásokkal kapott készítményeket.
A találmány tárgya továbbá eljárás emlős fajok egyedeinél a sérült, sérves vagy más okból rendellenes csigolyaközi porckorong gyógykezelésére, úgynevezett kemonukleolízis útján, ami abból áll, hogy a találmány szerinti kimopapain valamilyen gyógyszerészetileg elfogadható oldatából a porckorong sérült részének feloldásához elegendő mennyiséget fecskendezünk közvetlenül a porckorongba.
Emlős fajok egyedeinél tehát a rendellenes csigolyaközi porckorong gyógykezelését a következőképpen végezzük:
i) a tűt belehelyezzük a kezelendő, csigolyák közti porckorongba;
ii) röntgenfelvétellel meggyőződünk arról, hogy a tű a megfelelő helyen van; és iii) a találmány szerinti eljárással előállított kimopapain valamely gyógyszerészetileg elfogadható oldatából olyan mennyiséget fecskendezünk a szóbanforgó porckorongba, amely elegendő a sérült részek szelektív feloldásához.
A találmány szerinti eljárás, amellyel a tiszta kimopapaint előállítjuk, a következő lépéseket foglalja magában:
a) a nyers kimopapain vizes oldatát inkubáljuk egy megfelelő, az enzim aktív centrumára irányuló affinitáskromatográfiás oszloptöltettel, amely valamilyen hordozóhoz, adott esetben valamilyen távtartó, úgynevezett „spacer” csoporton keresztül az N-terminális részével kovalensen kötött reverzibilis kimopapain inhibitor peptidből áll, amikor is az inkubálás alatt az inhibitor peptid és a kimopapain aktív centruma között létrejön a kapcsolat; és
b) alkalmas eluenssel leoldjuk a kromatográfiás töltetről a kimopapaint.
A tisztítási művelethez kiindulási anyagként felhasználható, nyers kimopapain a találmány értelmében lehet papaja frissen préselt tejnedvéből kapott extraktum; a kereskedelemben kapható, porlasztva szárított latex oldata; papain sűrítmény vagy részlegesen tisztított kimopapain, illetve a kereskedelemben kapható készítmény, az úgynevezett „tiszta” kimopapain oldata. Nyilvánvaló azonban, elsősorban a szakemberek előtt, hogy a gyakorlatilag teljes növényi kivonat, mint például a préseléssel nyert tejnedv, nagyon jelentős mennyiségű, a természetben előforduló komponenst tartalmaz, amelyeket célszerű először más úton eltávolítani. Akkor járunk el tehát megfelelően, ha ezeknek a komponenseknek egy jelentős részétől megszabadulunk, például szűréssel vagy centrifugálással a nem oldódó részeket elkülönítve, mielőtt az affinitáskromatográfiás töltettel inkubálnánk a nyers kimopapain oldatát. Ezen túlmenően azonban kidolgoztunk egy savas kicsapásos módszert is, aminek segítségével a szennyezések tetemes részét eltávolíthatjuk, és amely különösen előnyös előtisztítási lépésnek bizonyult.
A savas kicsapásos eljárást, amelynek során a nyers kimopapain vizes oldatának pH-ját 2-esre állítják, majd állni hagyják az elegyet, aminek következtében elkülönül a kimopapain oldata, csaknem 50 esztendeje használják kimopapain tisztítására. Meglepő módon azt találtuk, hogy a pH pontos beállítása a kicsapásos eljárás folyamán döntő mértékben befolyásolja a kapott kimopapainoldat PPIV enzimmel való szennyezettségét. Gondosan követve a folyamatot és megfelelően irányítva a kicsapást, a mindeddig csupán durva előtisztí5
HU 211 746 A9 tásnak tartott lépéshez pontosan annak a szennyezésnek, nevezetesen a PPIV-nek a mennyiségét sikerült hihetetlen mértékben lecsökkentenünk a termékben, amely fehérjéről korábban megállapítottuk, hogy a szokásos tisztítási eljárások során mindvégig szennyező kísérője marad a kimopapainnak. Mindezek alapján tehát a találmány szerinti eljárás magában foglalja a kimopapain előtisztítását is, amely a következő műveletekből áll:
1. a nyers kimopapaint tartalmazó vizes elegyből 1,2 és 1,8 közötti pH-értéknél kicsapjuk a szennyezéseket;
2. elkülönítjük a fenti elegyből a nyers kimopapain vizes oldatát; és
3. semlegesítjük, valamint adott esetben sótalanítjuk a nyers kimopapain fenti módon kapott oldatát. Ajánlatos azonkívül beiktatni legalább egy hagyományos, kationcserés kromatográfiás lépést, például a Buttle és Barrett által megadott eljárást [Biochem. J. 223, 81-88 (1984)] követve, hogy a visszamaradó fehérjeszerű szennyezésektől megszabaduljunk. Különösen célszerűnek látszik utolsó lépésként nagy teljesítőképességű kromatográfiát alkalmazni, például Mono-S vagy S-SepharoseR HP (Pharmacia) márkanéven forgalmazott kationcserélő gyantán végezni az elválasztást.
A találmány szerinti eljárás egyik különösen előnyös kiviteli módjának felel meg tehát, ha a kimopapain tisztítását a következőképpen végezzük:
i) a nyers kimopapaint tartalmazó vizes elegyből 2,0-nél kisebb pH-értéknél kicsapjuk a szennyezéseket;
ii) elkülönítjük a fenti elegyből a nyers kimopapain vizes oldatát;
iii) semlegesítjük, és adott esetben sótalanítjuk a nyers kimopapain fenti módon kapott vizes oldatát;
iv) inkubáljuk a iii) pont szerinti oldatot egy megfelelő, az enzim aktív centrumára irányuló affinitáskromatográfiás oszloptöltettel, amely valamilyen hordozóhoz, adott esetben valamilyen távtartó, úgynevezett „spacer” csoporton keresztül az N-terminális részével kovalensen kötött reverzibilis kimopapain inhibitor pepiidből áll, amikor is létrejön a kapcsolat az inhibitor peptid és a kimopapain aktív centruma között; és
v) alkalmas eluenssel leoldjuk a kromatográfiás töltetről a kimopapaint.
A szakemberek számára teljesen nyilvánvaló, hogy az imént tárgyalt és célszerűnek ítélt kationcserés kromatográfiás tisztítási lépés következhet közvetlenül az affinitáskromatográfiás tisztítás előtt vagy után, illetve előtte is és utána is, ha úgy kívánjuk.
A tisztítandó nyers kimopapaint tartalmazó vizes elegy lehet frissen préselt papaja tejnedv, porlasztva szárított latex vagy papain koncentrátum (például porlasztva szárított latex kereskedelmi áruként beszerezhető a Powell and Scholefield egyesült királyságbeli, vagy a Siebels márkanevű amerikai egyesült államokbeli cégektől), amelyek vízben vagy vizes pufferoldatban szuszpenziót képeznek. A nem oldódó anyagot célszerű a szokásos módon, például szűréssel vagy centrifugálással, a savas kicsapást megelőzően eltávolítani. Ezután részletekben szerves vagy szervetlen savat, előnyösen valamilyen szervetlen sav, például hidrogén-klorid vizes oldatát adva az elegyhez, annak pH-ját 1,0 és 2,0 közé, előnyösen 1,2 és 1,8 közé, illetve még előnyösebben mintegy 1,5 körüli értékre állítjuk. A kicsapódott anyagot megint csak a szokásos módon, szűréssel vagy centrifugálással választjuk el az elegytől. A visszamaradó savas kimopapainoldatban ily módon a PPIV és a papain szennyezések mennyiségét erősen, míg a PPIII mennyiségét valamivel kevésbé sikerült lecsökkenteni.
Mielőtt a savas kimopapainoldattal bármilyen további kromatográfiás tisztítási műveletet végeznénk szakemberek számára ez teljesen magától értetődik valamilyen bázisos reagenssel, például vizes nátriumhidroxid-oldattal semlegesíteni kell az oldatot, és célszerű a felseleges sóktól is megszabadítani a szokásos eljárások valamelyikével, például gélszűréssel vagy dialízissel. Ha ezen műveletek során bármiféle további csapadék képződne, annak eltávolítása megint csak szűréssel vagy centrifugálással történhet.
A szakterület művelői és a szakirodalmat jól ismerők jól tudják, hogy a cisztein proteinázok aktivitása számottevően fokozható, ha az enzimet valamilyen redukálószerrel, például ditiotreittel vagy ciszteinnel aktiválják, illetve ha valamilyen kelátképző reagens ilyen például az EDTA - vagy valamilyen kelátképző gyanta - többek között ilyen a Bio-Rad (UK) Chelex márkanéven forgalmazott terméke - alkalmazásával a nehézfémek, például a higany nyomaitól is megszabadítják. Ezek a beavatkozások biztosítják a szabad merkaptocsoportok optimális számát, amely - mint köztudott - elengedhetetlenül fontos a cisztein proteinázok aktív centrumának a működéséhez, vagyis ahhoz, hogy az enzim aktív formában legyen. A nehézfémek eltávolítását előnyösen dialízissel, például EDTA-tartalmú pufferoldattal szemben folytatott dialízissel végezhetjük. Egy másik eljárásváltozatnak megfelelően, ha kationcserés kromatográfiás lépést is közbeiktatunk, akkor a nehézfémek nyomaitól úgy szabadulhatunk meg, hogy valamilyen redukálószerrel aktiváljuk a kimopapaint, miközben az felkötődik a kationcserélő oszlopra, majd ezt követően az oszlopot mossuk.
Célszerű például oly módon eljárni, hogy a nyers kimopapaint tartalmazó oldatot a semlegesítés után valamilyen redukáló szerrel, például ciszteinnel kezeljük, miáltal biztosítjuk az enzim aktív kötőhelyeinek a maximális mértékű szabaddá tételét, majd meghígitjuk az oldatot, hogy fehérjetartalma éppen a megfelelő', például 30 mg/ml legyen. Ezután ezt az oldatot inkubáljuk az enzim aktív centrumára irányuló affinitáskromatográfiás oszloptöltettel, amely a hozzákapcsolt inhibitor peptid által, az aktív centrum közreműködésével specifikusan megköti a kimopapaint. A kimopapain oldatát az affinitásoszlopra például 35—40 ml/óra/cm2 sebességgel vihetjük fel, a töltet literenként hozzávetőlegesen 14 g kimopapaint képes specifikusan megkötni.
Az affinitástöltet vagy kromatográfiás töltet valamilyen szilárd hordozóból, például valamilyen gélből vagy membránból áll, amelyhez az inhibitor peptidek
HU 211 746 A9 kovalensen vannak kötve, és ezáltal rögzítve. A szilárd hordozó előnyösen például agarózgél, többek között a Pharmacia SepharoseR márkanéven forgalomba hozott terméke lehet, de a célnak megfelelő például valamilyen derivatizált cellulóz membrán, ilyen például a Zeta (Anachem) márkanéven kapható termék. A szilárd hordozóhoz a peptid N-terminális végét akár közvetlenül, akár közvetve, egy távtartó, úgynevezett „spacer” csoporton keresztül köthetjük. Rendkívül előnyösen használható, egy 9 szénatomos spacer-csoportot tartalmazó gélt forgalmaz például a Pharmacia ECH SepharoseR 4B márkanév alatt. A hordozóként szolgáló gél szabad karboxicsoportjait az inhibitor peptid szabad aminocsoportjaival a szokásos módon, a peptidkötések kialakítására általánosan alkalmazott eljárások valamelyikével, például valamilyen vízben oldható karbodiimid, így N-[3-(dimetil-amino)-propil]-N’-etil-karbodiimid-hidroklorid mint kondenzálószer jelenlétében végezhetjük. A kapcsolást általában úgy hajtjuk végre, hogy a gélt az inhibitor peptid oldatával N-[3-(dimetilamino)-propil]-N’-etil-karbodiimid-hidroklorid jelenlétében kíméletesen keverjük 24 órán át, szobahőmérsékleten. A kapcsoláshoz a hordozó gél és a peptid arányát úgy választjuk meg, hogy például 3^1 g peptidet veszünk 1 liter gélre számítva.
Az affinitástöltetet alkalmazhatjuk oly módon, hogy a felhasználást megelőzően oszlopot készítünk belőle, de eljárhatunk úgy is, hogy a fenti módon előkészített gélt adagonként inkubáljuk az enzimmel, majd az inkubációs lépést követően, ha úgy kívánjuk, oszlopot formálunk a gélből, és az oszlopról eluáljuk az enzimet. Felhasználás előtt az affinitástöltetet célszerű alaposan kimosni vizes pufferoldattal, hogy eltávolítsuk a meg nem kötött peptid vagy a kondenzálószer legkisebb nyomait is. A termelésbe állított affinitásoszlop töltetét - előnyösen in situ - higiéniai szempontok diktálta kezelésnek kell alávetni például vizes alkohollal, így ismét felhasználhatóvá válik.
A reverzibilis inhibitor peptidek olyan peptidek, amelyek ha szilárd hordozóhoz vannak kötve, és így rögzítettek, képesek a kimopapain aktív centrumával kölcsönhatásba lépni, vagyis megkötni a kimopapaint és ez a kölcsönhatás sokkal erősebb, mint amilyen a nyers kimopapain készítményekben található egyéb proteinázok, elsősorban a PPIV aktív centrumával létrejöhet, mindazonáltal az így megkötött kimopapain egy későbbi fázisban erről az úgynevezett affinitásszorbensről eluálható. Előnyös, ha az inhibitor pepiidben a C-terminális aminosav helyén fenil-alaninnak vagy egy fenil-alanin analógnak megfelelő aldehidszármazék, például szemikarbazon, oxim vagy oximO-metil-éter - it a leírásban az egyszerűség kedvéért ezt metoxi-iminnek nevezzük - helyezkedik el. Közelebbről meghatározva, a C-terminális aminosav helyén D- vagy L-fenil-alaninnak megfelelő aldehidszármazék, vagyis szemikarbazon, metoxi-imin vagy oxim az egyszerűség kedvéért itt a leírásban ezeket a vegyületeket, hasonló elvet követve az egyéb analógoknál is, D- vagy L-fenil-alanin-szemikarbazonnak (rövidítve: PheSc), D- vagy L-fenil-alanin-(metoxi-imin)-nek (rövidítve: PheMo) és D- vagy L-fenil-alanin-oximnak (rövidítve: PheOx) nevezzük - illetve a fenil-alanin valamely analógja, így D- vagy L-alanin-szemikarbazon (AlaSc), D- vagy L-ciklohexil-alanin-szemikarbazon (CHASc), illetve D- vagy L-leucin-szemikarbazon (LeuSc) állhat. Név szerint felsorolva, a következő C-terminális dipeptideket találtuk előnyösnek kimopapain inhibitorként: L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-D-PheSc, L-Phe-L-PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-L-PheOx, L-Tyr-L-PheSc, L-Ala-L-PheSc és L-Ala-L-LeuSc. Az L-Phe-L-PheSc dipeptidszármazékot Luaces és Barrett 1988-ban már leírták [Biochem. J., 250, 903-909 (1988)]. A többiek közül különösen előnyösek az alábbiak: L-Ala-L-PheSc, L-AlaD-PheSc és L-Phe-D-PheSc. Az új inhibitor hatású peptidek önmagukban is, továbbá az affinitáskromatográfiához használható, ezekkel a peptidekkel készült affinitásszorbensek a találmány lényeges elemének tekintendők.
A kimopapain eluálása előtt az affinitásoszlopot célszerű átmosni, például a vizes pufferoldattal, így 4 és 5 közötti pH-jú citrát- vagy acetátpufferrel, a nem specifikusan kötött anyagok eltávolítása végett. Azt találtuk, hogy különösen előnyös a mosó és eluáló pufferoldathoz bizonyos reagenseket hozzáadni, amelyek csökkentik a hidrofób kölcsönhatások és az egyéb, nem specifikus kötések erősségét az affinitásszorbens és a nyers kimopapaint kísérő szennyező anyagok molekulái között. Ilyen reagensek többek között az EDTA, az izopropil-alkohol és az etilénglikol.
A mosást követően következhet a kimopapain leoldása az oszlopról, illetve az affinitásgélről, valamilyen alkalmas eluenssel. Ez a bizonyos alkalmas eluens megbontja a rögzített inhibitor peptid és a hozzákötődött kimopapain között létrejött kapcsolatot, akár azáltal, hogy csökkenti az inhibitor peptidek affinitását az enzim aktív kötőhelyeihez, akár oly módon, hogy szelektíven leszorítja a peptidet az enzim aktív kötőhelyeiről. A kimopapainnak az inhibitor peptidekkel szemben megnyilvánuló affinitását csökkenthetjük például úgy, hogy valamilyen denaturáló hatású reagenssel, ilyen például az izopropil-alkohol, vagy valamely az enzim aktív pH-tartományán kívül eső, tehát a feletti vagy alatti pH-jú eluenssel megváltoztatjuk az aktív centrum jellemző tulajdonságait. Tekintettel kell azonban lenni arra, és azt a szakterület művelői jól tudják, hogy csak olyan eluenst alkalmazhatunk, amely nem okozza az eluált enzim irreverzibilis inaktiválódását.
Egy eltérő megoldás szerint a hordozóhoz rögzített inhibitor peptidek által megkötött kimopapaint szelektíven leszoríthatjuk az affinitástöltetről olyan eluenst alkalmazva, amely egy, az inhibitor peptidekhez szorosan kötődő komponens, például egy másik cisztein proteináz feleslegét tartalmazza.
Mindazonáltal a találmány szerinti eljárásnál azt a megoldást részesítjük előnyben, amikor az eluens valamilyen reverzibilis cisztein proteináz inhibitor komponenst tartalmaz, és amely azáltal, hogy kompetitív módon kötődik a kimopapain aktív kötőhelyeihez, egyúttal hozzájárul ahhoz, hogy az leoldódjék a hordo7
HU 211 746 A9 zóhoz rögzített inhibitor peptidekből álló affinitásszorbensről. Az ismert és általánosan alkalmazott inhibitorok közül említhetjük például a 2,2’-dipiridil-diszulfidot, a bisz(hidroxi-etil)-diszulfidot, a metil-(2-piridil)diszulfidot, a nátrium-tetrationátot és a higanytartalmú reagenseket, köztük a higany(II)-kloridot a 4-(klór-higany)-benzoátokat és a merzelilt [2-[{[3-(hidroxi-higany)-2-metoxi-propil]-karbamoil} -fenoxi] -ecetsavnátriumsó].
Teljesen nyilvánvaló kell legyen azok számára, akik a szakterület ismeró'i, hogy a kimopapain affinitását a rögzített inhibitor peptidhez több tényezó' is befolyásolja, így a kötésben résztvevő' peptid maga, a pH, az ioneró'sség, az eluensként használt pufferoldat öszszetétele, valamint a hó'mérséklet. Következésképpen, a kimopapain eluálásához megfelelő' inhibitort is annak jellege szerint kell megválasztanunk, és természetesen annak koncentrációja is különböző' lehet.
Gondolnunk kell továbbá arra is, hogy a higanytartalmú reagensek és a kötött kimopapain között az egyensúly általában sokkal gyorsabban beáll, mint a diszulfid típusú vegyületekkel, azért az előbbieket folyamatos eluáláshoz is alkalmazhatjuk. Azok az inhibitorok viszont, amelyek a kötött kimopapainnal csak lassan képesek egyensúlyba jutni, esetleg csak olyan módon alkalmazhatók, hogy a gélt egy bizonyos ideig, esetleg 1-2 óráig vagy még tovább inkubáljuk az oldattal az eluálást megeló'zó'en. Mindazonáltal a fehérjetartalmat és a proteináz aktivitást az eluált frakciókban rutinszerűen nyomon követhetjük, és ennek alapján megváltoztathatjuk akár az ioneró'sséget, akár magát az eluenst, illetve az inkubálás idejét, azzal a céllal, hogy hatékonyan és szelektíven tudjuk a kimopapaint az affinitásgélrol leoldani. Azokat a frakciókat, amelyek fehérjetartalma kicsi, vagy a bennük található kimopapain alacsony aktivitású, általában elöntjük.
Előnyös az eluens pH-ját megfeleló'en alacsony értéknek, például 4 és 5 közöttinek, illetve még inkább 4,5-nek választani, hogy ezáltal is gyengítsük a kölcsönhatást a kimopapain és az inhibitor peptid között. Megfelelő' eluensnek találtuk például az alábbi összetételű oldatokat: 33%-os vizes etilénglikollal készült 100 mM bisz(hidroxi-etil)-diszulfid-oldat, amely nátriumcitrátot (50 mM) és EDTA-t (1 mM) is tartalmaz, a pH-ja 4,5; 33%-os vizes etilénglikollal készült 30 mM dipiridil-diszulfid-oldat, amely nátrium-citrátot (50 mM) és EDTA-t is tartalmaz, a pH-ja 4,5; 33%-os etilénglikollal készült 30 mM metil-piridil-diszulfid-oldat, amely nátrium-citrátot (50 mm) és EDTA-t (1 mM) is tartalmaz, a pH-ja 4,5; 33%-os vizes etilénglikollal készült 10 mM merzalilsavoldat, amely nátrium-hidroxidot (50 mM) és EDTA-t (25 mM) is tartalmaz, és pH-ját ecetsavval 4,5-re állítjuk; 33%-os vizes etilénglikollal készült 10 mM higany(Il)-klorid-oldat, amely még nátrium-acetátot (50 mM) is tartalmaz, a pH-ja 4,5. A higany(II)-klorid különösen kedves reverzibilis cisztein proteináz inhibitor.
A találmány szerinti eljárás kivitelezése során az affinitáskromatográfiás lépés jelentó'sen megnöveli az így tisztított kimopapainnak mind a ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mért, mind az aktív centrum titrálásával - ezt E-64 reagenssel vagy jód-ecetsavval végezzük kapott fajlagos aktivitását. A kimopapain aktív formájának mind a megkötó'dése, mind az eluálása kedvezményezettebb az affinitáskromatográfiás tisztítás folyamán, ezért azt ilyen módon el lehet különíteni az enzim egyéb, inaktív formáitól, valamint a többi, a nyers kimopapain készítményben megtalálható cisztein proteinázoktól. A találmány szerinti eljárással frissen előállított, tehát az itt leírt affinitáskromatográfiával tisztított kimopapain általában legalább 70%-os arányban, de eló'nyösen legalább 80%-os, illetve még eló'nyösebben legalább 90%-os arányban tartalmazza az enzim aktív formáját.
A tisztított kimopapaint vagy tároljuk, vagy felhasználjuk, eló'tte azonban általában ki kell nyerni az eluátumból. Célszerű az affinitásoszlopról eluált kimopapaint további tisztításnak alávetni, avégett, hogy eltávolítsuk az enzim aktív kötó'helyeiró'l a cisztein proteináz inhibitort. Az inhibitor eltávolítása történhet feleslegben alkalmazott redukálószerekkel, például ciszteinnel, illetve kívánt esetben a szokásos technikai megoldásokkal, így gélszűréssel vagy dialízissel szabadíthatjuk meg az enzimet az inhibitortól. Egy még további lehetó'ségként említjük azt a megoldást, amikor az inhibitort valamilyen speciális gyantára adszorbeáltatjuk, a kis molekulatömegű diszulfidok például glutation affinitásoszlopon, a higanytartalmú vegyületek pedig kelátképzó' gyantán köthetó'k meg. Az inhibitor eltávolítására, és ezáltal az enzim aktiválására azonban mégis csak a redukálószereket, elsó'sorban a ciszteint tartjuk eló'nyösnek, mivel azt kationcseréló' oszloptölteten megköthetjük, majd azután az oszlopról lemoshatjuk. A fentiek szerint visszanyert, tisztított kimopapaint célszerű liofilizált formában tárolni, vagyis az oldatot általában liofilizáljuk.
A találmány szerinti kimopapaint további, a szakemberek eló'tt jól ismert vizsgálatoknak vethetjük alá, ilyen például az N-terminális aminosav-analízis, az aktív centrum titrálása E-64 reagenssel vagy jód-ecetsavval, illetve az inaktiválódás mértékének a meghatározása, a nátriumdodecil-szulfát (SDS) vagy többzónás katódos poliakrilamid-gélelektroforézis, valamint a különböző' proteináz szubsztrátokkal szemben mutatott aktivitás mérése.
A találmány szerint az új inhibitor peptideket önmagukban ismert, a szakirodalomban leírt eljárásokat követve állíthatjuk elő. Például valamely kiválasztott dipeptidszármazékot az alábbi, egymás követó' lépések foganatosításával szintetizálhatjuk:
a) A dipeptid C-terminális aminosavjának - más szavakkal az elsó' aminosavnak - szánt, megfelelő' aminosav karboxicsoportját védó'csoporttal látjuk el, például oly módon, hogy az aminosavat izobutil-(klór-formiát) és N-metil-morfolin jelenlétében O,N-dimetilhidroxil-ammónium-kloriddal reagáltatjuk, aminek eredményeképpen a megfelelő hidroxámsavszármazék keletkezik. Célszerű úgy eljárnunk, hogy az úgynevezett elsó' aminosavnak előbb az N-terminális részét védjük, például terc-butoxi-karbonil-csoporttal.
b) A védett elsó' aminosavat, például a fenti hidro1
HU 211 746 A9 xámsavszármazékot a következő lépésben valamilyen erős savval, például trifluor-ecetsavval reagáltatva, kvaterner ammóniumsóvá alakítjuk.
c) A védett első aminosav kvatemer ammóniumsóját ezután a második aminosav valamely származékával, például N-(benzil-oxi-karbonil)-származékával reagáltatjuk, amikor is a megfelelő dipeptidszármazékot kapjuk.
d) A fenti módon előállított dipeptidszármazékot ezt követően valamilyen kíméletes redukálószerrel, például diizobutil-alumínium-hidriddel vagy lítium-(tetrahidrido-aluminát)-tal redukáljuk, aminek eredményeképpen a dipeptidnek egy olyan származéka keletkezik, amely a Cterminális részen szabad aldehidcsoportot visel.
e) Az aldehidet a megfelelő származékká alakítjuk, például szemikarbaziddal reagáltatva szemikarbazonná, O-metil-hidroxil-ammónium-kloriddal reagáltatva metoxi-iminné, illetve hidroxil-aminnal reagáltatva oximmá.
f) Végül a dipeptidszármazék védett N-terminális részéről lehasítjuk a védőcsoportot, például a benziloxi-karbonil-csoportot 10%-os csontszenes palládiumkatalizátor jelenlétében katalitikus hidrogénezéssel távolíthatjuk el.
Az alábbiakban ismertetjük az alkalmazott analitikai módszereket:
A fehérjetartalom meghatározása
Ahol az lehetséges volt, a fehérjetartalmat a 280 nmnél mutatott elnyelés alapján határoztuk meg, az A280 i% = 20,0 képlet alapján végezve a számításokat a papaja-latex esetében, és az A280 i% = 18,3 képlettel számolva a tisztított vagy részlegesen tisztított kimopapain készítmények esetében [Robinson: Biochemistry 14, 3695-3700 (1975)]. A merkaptocsoportot tartalmazó reagensek közül némelyik, továbbá a diszulfidok hajlamosak 280 nmnál abszorbeálni, ezért amikor ilyen reagensek jelenlétével kellett számolni, a Bio-Rad dye-binding assay (BioRad Laboratories, U.K.) segítségével, vagyis egy festési eljárás alapján határoztuk meg a fehérjekoncentrációt. Standardként a porlasztva szárított papaja-latex szűrt oldata (A280 1% = 20,0) szolgált. Ez a módszer kevésbé érzékeny a zavaró körülményekre, mint a 280 nm-nél mért elnyelésen alapuló eljárás. A tisztított enzimkészítmények esetében a fehérjetartalmat a termék teljes száraz tömegéből állapítottuk meg.
A kimopapain aktivitásának meghatározása
a) ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitás - 1-es Smith-féle mérési módszer
A mérendő mintákat az úgynevezett 1-es puff erő 1dathoz adjuk amely 6,0-os pH-jú, EDTA-t (1 mM) és cisztein-hidroklorid-monohidrátot (10 mM) tartalmazó, 0,1 M vizes nátrium-foszfát-puffer, a végtérfogat 1,0 ml. Az enzimet, már ahol jelen van a mintában, előbb 37 °C-on hagyjuk aktiválódni 5 percig, majd 4 ml 37 °C-ra előmelegített, 1,25 mM Na-benzoil-DLarginin-(4-nitro-anilid)-oldat, azaz ΒΑΡΝΑ szubsztrátoldat hozzáadásával elindítjuk a reakciót.
Megjegyzés:
A szubsztrátoldatot úgy állítjuk elő, hogy 300 mg ΒΑΡΝΑ meleg dimetil-szulfoxiddal készült oldatához apránként, lassú ütemben 450 ml 37 °C-ra előmelegített 1-es pufferoldatot adunk, majd további 1-es pufferoldattal pontosan 500 ml-re egészítjük ki az oldat térfogatát. Az így készített szubsztrátoldatot 30 °C-on tároljuk, hogy elkerüljük a ΒΑΡΝΑ kiválását.
A reakcióelegyet 37 °C-on inkubáljuk 30 percen át, majd 1 ml 4 N ecetsavat adva hozzá, leállítjuk a reakciót. A felszabadult 4-nitro-anilin mennyiségét a 410 nm-nél mért elnyelés alapján (AA410) határozzuk meg. Egy egységnyi aktivitás megfelel másodpercenként 1 pikomól 4-nitro-anilin (ε = 8800 M_1 . cm-1) szabaddá válásának a fenti körülmények között.
Az itt ismertetett mérési módszer minden részletében azonos a Smith Laboratories Inc. tulajdonát képező GB 2 098 977 számú szabadalmi leírásban megadottal, amelyet szerte a világon a kereskedelmi forgalomban kapható kimopapain készítmények vizsgálatára alkalmaznak. Ilyen készítmény például a The Boots Company PLC, UK által, Chymodiactin márkanéven forgalmazott kimopapain, valamint a Disken márkanevű készítmény, amely a Sinpoong terméke Dél-Koreában. A fenti mérési módzser szerint kapott aktivitási egységet nemzetközileg elismerik, és rendszerint „Smith ΒΑΡΝΑ Assay Units” néven hivatkoznak rá, amit magyarra úgy fordíthatnánk, hogy a Smith-féle mérési módszerrel kapott BAPNA-egység.
b) ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitás
- 2-es mérési módszer
A vizsgálandó mintákat 6,8-as pH-jú, EDTA-t (1 mM) és ditiotreitet (2 mM) vagy ciszteint (4 mM) tartalmazó 1,10 mM vizes nátrium-foszfát-pufferhez adjuk, a végtérfogat 0,975 ml. Az enzimet, már ahol a mintában jelen van, 40 °C-on 5 percig hagyjuk aktiválódni, majd 25 μΐ, 100 mM dimetil-szulfoxidos Na-benzoil-DL-arginin-(4-nitro-anilid)-oldat (BAPNA-oldat) hozzáadásával elindítjuk a reakciót. 10 percig 40 °C-on inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 1 ml 4,3 pH-jú, 0,10M nátrium-(klóracetát) és 0,20 M nátrium-acetát összetételű, vizes pufferoldattal a reakciót leállítjuk.
A szabaddá vált 4-nitro-anilin mennyiségét a AA410 értéke alapján határozzuk meg. Az ilyen körülmények között mért aktivitás 1 egységének megfelelő, szabaddá vált 4-nitro-anilin (ε = 8800 M_1) mennyisége másodpercenként 1 pikomól.
Az itt között mérési módszer pontosan megegyezik a Buttle és Barrett által 1984-ben [Biochem. J. 223, 81-8 (1984)] leírttal, és elóTdsérleteinknél, például a 21., 23. és 26. példában megadott kísérleteknél magunk is ezt a mérési módszert alkalmaztuk.
A kimopapainnak a ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitását az 1-es és 2-es mérési módszerrel meghatározva, abszolút értékben különböző számokat kapunk, éspedig a 2-es mérési módszerrel kapott értékek két-háromszorosai az 1-es mérési módszerrel kapottaknak (lásd a 31. példában leírtakat).
c) Az aktív centrum titrálása jód-ecetsavval
A kimopapain aktív centrumának jód-ecetsavas titrálását pontosan úgy végeztük, amint a módszert Zuck9
HU 211 746 A9 er és munkatársai [Biophys. Acta 828, 196-204 (1985)] az E-64 reagenssel leírták.
A kimopapainoldatot az a) pont alatt leírt 1-es pufferoldattal meghígítjuk, hogy a fehérjekoncentráció mintegy 60 μΜ-nak megfelelő legyen [ε280 = 4,3284 x 104 M_1 az A28q i % = 18,3 képlettel számolva [lásd Robinson: Biochemistry 14, 3695-3700(1975]; ésarelatívmolekulatömeg = 2356, Jacquet és munkatársai [Bioi. Chem. Hoppe-Sayler 370, 425^)34 (1989)] szerint az aminosavszekvenciából számítva. Ebből az oldatból pontosan kimért 20 μΐ-nyi mennyiséget titrálócsövekbe helyezünk, és 37 °C-on, 5 percig 20 μΐ 1-es pufferoldattal inkubáljuk (a kontroll kísérletben a cső 40 μΐ pufferoldatot tartalmaz). Ezután az egyes csövekhez 20 μΐ 10, 20, 30,40,50 és 60 μΜ vizes jód-ecetsav-oldatot adunk, és az elegyet 10-20 percig 37 °C-on előinkubáljuk. A reakciót ml, az a) pontban megadottak szerint készült, 37 °C-ra előmelegített ΒΑΡΝΑ szubsztrátoldattal indítjuk el, majd 30 percnyi 37 °C-on folytatott inkubálás után az a) pontban megadottak szerint leállítjuk, és a AA410 érték alapján meghatározzuk a szabaddá vált 4-nitro-anilin mennyiségét. A kimopapainoldat ily módon kapott moláris koncenttációját összevetjük a 4,3284 x 104 M_1 cm-1 moláris extinciós koefficiens alapján számított értékkel. Az aktív fehérje mennyiségét az összes fehérje százalékában fejezzük ki.
d) Azo-kazeinnel szemben mutatott aktivitás
Az azo-kazeinnel szemben mutatott aktivitás meghatározását Rowan és munkatársai korábban közölt eljárásával [Arch. Biochem. Biophys. 267, 262-270 (1988)] végeztük 1 μΜ-nál kisebb enzimkoncentráció mellett (a számítás alapjául a relatív molekulatömeget 24 000-nek vettük), adott esetben 1 μΜ koncenttációnak megfelelő mennyiségű csirke cisztatin jelenlétében. Az itt megadott koncentrációk mind az enzim, mind az inhibitor esetében az aktív molekulára vonatkoznak.
Immunológiai vizsgálat radiális immundiffúzióval
A radiábs immundiffúziós vizsgálatok során a Mancini és munkatársai által leírt módszert [Immunochem 2, 235-254 (1965)] követtük. Az eljárás a következő: 7,3 pH-jú nátrium-kloridot (0,14 M) és monospecifikus IgG preparátumot tartalmazó, 10 nM vizes nátrium-foszfát-oldathoz 1% (tömeg/térfogat) agarózt adunk, és az elegyet Gél BondR (FMC Corporation, Maine, USA) lemezekre öntjük. A gél felületére merőlegesen, egymástól 1,5 cm távolságra 1 mm sugarú lyukakat mélyítünk, majd véletlenszerű eloszlásban - a peremhatás által okozott hiba minimalizálása végett - a lyukakba helyezzük a referens anyag, illetve az ismeretlen anyag mintáit. Az antigénnek a lyukakban történt elhelyezése után a lemezeket 24 órányi időtartamra félretesszük, hogy a precipitációs gyűrűk kialakuljanak, majd mossuk, szárítjuk és megfestjük. Tiszta, kíméletesen karboximetilezett antigént alkalmazunk a standard görbék megszerkesztéséhez, ami úgy történik, hogy az antigén mennyiségének függvényében a gyürűátmérők négyzetének az értékeit ábrázoljuk. A lyukanként 25-300 ng antigénnek megfelelő tartomány bizonyult felhasználhatónak az értékeléshez.
PPIV és vele szemben specifikus ellenanyag előállítása
a) Affinitásoszlop készítése ml Ν,Ν-dimetil-formamidban feloldunk 20 mmól amino-acetonitril-hidrokloridot és 20 mmól Ν,Ν-diizopropil-etil-amint, majd keverés közben 10 mmól butoxi-karbonil-L-Phe-(4-nitro-fenil)-észtert adunk az oldathoz. Az elegyet további 2 óra hosszat keverjük 20 °C-on, majd 100 ml etil-acetáttal meghígítjuk, és mossuk kétszer vízzel, ötször vizes trietil-aminoldattal, ismét háromszor vízzel, kétszer vizes káliumhidrogén-szulfát-oldattal, valamint ismét háromszor vízzel, végül szárítjuk és bepároljuk. A maradék etilacetát és hexán elegyéből kristályosítva, a BOC-LPhe-NH-CH2-CN képletű vegyületet kapjuk, amelynek az olvadáspontja 134,5-135 °C.
ml jéghideg, vizes trifluor-ecetsavat adunk 5 mmól BOC-L-Phe-NH-CH2-CN 10 ml metilén-dikloriddal készített oldatához. Az elegyet 30 percig 20°C-on állni hagyjuk, majd az oldószert 40 °C-on elpárologtatjuk. A maradékot feloldjuk kloroformban és bepároljuk, majd ezt a műveletet még kétszer megismételjük. Ezután a párlási maradékként visszamaradó nyers trifluor-ecetsavas só 10 ml N,N-dimetil-formamid és 7,5 mmól N,N-diizopropil-etil-amin elegyében feloldjuk, és 6,25 mmól BOC-Gly(4-nitro-fenil)-észtert, valamint 6,25 mmól N-hidroxi-benzo-triazol-monohidrátot adunk az oldathoz. Cseppenként, a 4-nitrofenol keletkezéséig, amit az aranysárga szín jelez, további Ν,Ν-diizopropil-etil-amint adunk az elegyhez, majd szobahőmérsékleten keverjük 2 órán át. Ezt követően előbb 1,5 ml N,N-dietil-etilén-diamint, 15 perccel később pedig 60 ml etil-acetátot adva a reakcióelegyhez, azt egymás után mossuk vízzel, vizes trietil-aminnal, vízzel, vizes kábum-hidrogén-szulfát oldattal és ismét vízzel, végül szárítjuk és bepároljuk. A párlási maradékot kromatográfiás eljárással szilikagélen tisztítjuk, etil-acetát és hexán 20:1 arányú elegyével eluálva az oszlopot, aminek eredményeképpen hab formájában kapjuk a BOC-Gly-L-Phe-NH-CH2-CN képletű vegyületet.
ml 25:65:10 arányú ttifluor-ecetsav-metilén-diklorid-anizol elegyben feloldunk 30 mg BOC-Gly-LPhe-NH-CH2-CN képletű vegyületet, az oldatot 0 ’Con 30 percig állni hagyjuk, majd rotációs bepárlókészüléken 34 °C-on szárazra pároljuk. A maradékot 1,5 ml metanol és 1,5 ml 8,0-as pH-jú, 0,1 M vizes nátrium-hidrogén-karbonát elegyében feloldva a ligandumoldatot kapjuk.
A száraz tömegét tekintve 3 g aktivált CH-SpeharoseR 4B (Pharmacia) gélt éjszakán át 75 ml 4 °C-os, 1 mM vizes sósavban áztatunk, majd előbb 600 ml 1 mM sósavval, azután 300 ml 8,0 pH-jú, 0,1 M nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal mossuk. Ezt követően az így előkészített gélt 30 ml 8,0-as pH-jú, 0,1 M vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldatban szuszpendáljuk, hozzáadjuk a fenti bgandumoldatot, és az elegyet éjszakán át, 20 °C-on
HU 211 746 A9 finoman kevergetjük. Másnap a gélt zsugorított üvegszűrőre gyűjtjük, 180 ml 50%-os térfogatarányú vizes metanollal, valamint 180 ml vízzel mossuk, felszuszpendáljuk 30 ml 0,1 M vizes 2-amino-etanolban, majd a szuszpenzió pH-ját sósavval 9,0-re állítjuk. 4 órán át 20 °C-on rázatjuk a szuszpenziót, majd szűrjük, 500 ml vízzel mossuk, végül úgynevezett applikációs pufferoldatban, amely 6,8 pH-jú, 33%-os etilénglikollal készült, 50 mM nátrium-foszfát- és 1 mM EDTA-oldat, felhasználásig 4 °C-on tároljuk a gélt.
b) A PPIV tisztítása ml SepharoseR-Ahx-Gly-L-Phe-NH-CH2-CN gélből oszlopot készítünk és átmossuk 12 ml úgynevezett elúciós pufferoldattal - ez 4,5 pH-jú, 33%-os etilénglikollal készült, 50 mM nátrium-citrát-oldat - majd 12 ml applikációs pufferoldattal.
0,5 g porlasztva szárított papaja-latex 10 ml applikációs pufferoldattal készített oldatát egy 0,22 pm pórusméretű szűrőn megszűrjük. A szűrlet fehérjetartalmát Bio-Rad dye-dinging assay (Bio-Rad Laboratories, UK) segítségével meghatározzuk, majd annyi ditiotreitet adunk az oldathoz, hogy a végkoncentrációja 2 mM-nak megfelelő legyen, és az elegyet 20 percig 0 °C-on inkubáljuk. 80 mg fehérjének megfelelő mennyiséget viszünk az oldatból az oszlopra (38 ml/óra/cm2), és 20 °C-on előbb 8 ml applikációs pufferoldatot, majd 8 ml elúciós pufferoldatot engedünk át rajta. Ezután 4 ml bisz(hidroxi-etil-diszulfidot (50 mM) tartalmazó elúciós pufferoldatot engedünk rá az oszlopra, majd leállítjuk a folyadékáramot, és éjszakán át 20 °C-on tartjuk. Másnap az eluálást 10 ml bisz(hidroxi-etil)-diszulfidot tartalmazó elúciós pufferoldattal folytatjuk, 1 mles frakciókat szedve, majd a ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben aktívnak bizonyult frakciókat egyesítjük, és közvetlenül felvisszük egy előzőleg 5,0 pH-jú, EDTA-t (1 mM) tartalmazó 50 mM vizes nátrium-acetát/ecetsav-oldattal egyensúlyba hozott, Mono S HR 5/5R kationcserélő oszlopra. Az oszlopot ugyanezzel az oldattal, percenként 1 ml átfolyási sebességgel mossuk, amíg az A28o nm értéke nullára áll vissza. Ekkor az oszlop eluálásához grádienst (21,5 mM nátriumion/ml) hozunk létre, 1 M nátrium-acetátnak megfelelő koncentrációig [Buttle és Barrett: Biochem. J. 223, 81-88 (1984)] és 1 ml-es frakciókat szedünk. Ily módon két jelentősebb fehérjecsúcsot kapunk, az első, amely hozzávetőlegesen 0,17 M nátriumion-koncentrációnál eluálódik, megfelel a kimopapainnak, a második csúcs, mintegy 0,38 M nátriumion-koncentrációnál pedig a PPIV. A frakciókat, amelyekben a PPIV található, egyesítjük és 1 mM vizes EDTA-oldattal szemben dializáljuk, majd liofilizáljuk, és az enzimet -20 °C-on tároljuk. A tiszta PPIV nem mutat mérhető aktivitást ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben, viszont aktívan bontja az azo-kazeint, és ezt az aktivitást 1 μΜ-nak megfelelő koncentrációban a csirke cisztatin nem gátolja.
c) PPIV specifikus ellenanyag előállítása
Tiszt PPIV antigént a Zucker és munkatársai által leírtaknak megfelelően [Biochim. Biophys. Acta 828,
196-204 (1985)] kíméletesen karboximetilezünk. A PPIV elleni antiszérumot nyulakkal termeltetjük, amelyek izomba fecskendezve 360 gg karboximetilezett fehérjét kapnak komplett Freund-adjuvánsban, majd két hét elteltével később 100 gg-ot inkomplett adjuvánsban a bőr alá fecskendezve. Az IgG-t ammóniumszulfátos frakcionálással [lásd Heide és Schwick: in „Handbook of Experimental Immunology”, szerkesztő: D. M. Weir, 1. kötet, 7.1-7.11, Blackweel, Oxford, 1978] részlegesen tisztítjuk, majd ezt követi a dialízis
7,3 pH-jú, nátrium-kloridot (0,14 M) tartalmazó, 10 mM vizes nátrium-foszfát-oldattal.
A PPIV specifikus IgG preparátumot a PPIV radiális immundiffúzióval történő meghatározásához használjuk, az előzőekben leírtaknak megfelelően. Az itt következő részben a találmány lényeges elemeit példákkal illusztráljuk, amelynek célja csupán, hogy minél teljesebb képet alkothassunk az eljárásról, és az itt leírtak semmiképpen nem tekinthetők a találmány oltalmi körére nézve korlátozó érvényűnek.
Az alábbiakban megadjuk néhány, a leírásban és a példaként közölt előiratokban használt rövidítés jelentését.
ABTS = 2,2’-azino-bisz(3-etil-benzo-tiazolin-6szulfonsav); Ahx = 6-amino-hexanoil-csoport; ΒΑΡΝΑ = Na-benzoil-DL-arginin-(4-nitro-anilid); BOC = tercbutoxi-karbonil-csoport; Alá = alanin; Cbz = benziloxi-karbonil-csoport; CHA = ciklohexil-alanin; DMF = Ν,Ν-dimetil-formamid; E-64 = {[(transz-2,3-epoxi-3karboxi-propionil)-L-leucil]-amino}-4-guanidino-bután; EDC = N-[3-(dimetil-amino)-propil]-N’-etil-karbodiimid-hidroklorid; EDTA = etilén-diamin-tetraecetsav vagy a dinátriumsója; Gly = glicin; Leu = leucin; Mo = metoxi-imin; OBz = O-benzil-csoport; Ox = oxim; Phe = fenil-alanin; Se = szemikarbazon; THF = tetrahidrofurán; és Tyr = tirozin.
A leírásban szintén előforduló alábbi megjelölések:
Bio-Rad, Chelex, Chymodiactin, CH-Sepharose 4B, Chymofast, Disken, ECH-Sepharose, Enzfitter, FPLC, Gél Bond, Mono S HR, S-Sepharose HP, Tween, Zeta és Zetaffinity mind kereskedelmi márkanevek.
A kísérleteket, amennyiben az adott helyen másképpen nincs megadva, szobahőmérsékleten hajtottuk végre.
1. példa
L-Alanil-L-feml-alanin-szemikarbazon
1. lépés
A) 100 ml vízmentes Ν,Ν-dimetil-formamidhoz szobahőmérsékleten, keverés közben 10,23 g O,N-dimetilhidroxil-ammónium-kloridot adunk, majd 5 perc alatt beadagolunk 10,6 g N-metil-morfolint, miközben a reakcióelegy hőmérsékletét 30 °C alatt tartjuk. Az elegyet, amelyben fehér csapadék képződik, lehűtjük 0 °C-ra.
B) 26,5 g N-(t-BOC)-L-Phe 200 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát lehűtjük -10 °C-ra, és ezen a hőmérsékleten, 5 perc alatt beadagolunk 14,38 g izobutil-(klór-formiát)-ot, valamint további 10 perc alatt 10,6 g N-metil-morfolint, majd még 10 percig keverjük az elegyet.
HU 211 746 A9
C) Az A szuszpenziót -10 °C-on 15 perc alatt a B szuszpenzióhoz adjuk, majd hagyjuk a reakcióelegyet szobahőmérsékletre melegedni, és 3 óra hosszáig keverjük. Ezután visszahűtjük 0 °C-ra az elegyet és 5 perc alatt hozzáadunk 10,2 g 3-(dimetil-amino)-propilamint, majd 200 ml vízzel és 200 ml etil-acetáttal összerázzuk, a felül elhelyezkedő szerves fázist elválasztjuk és egymás után mossuk 200 ml vízzel, 200 ml 5%-os kálium-hidrogén-karbonát-oldattal, 200 ml 0,5 N vizes sósavval, valamint további háromszor 200 ml vízzel, majd az oldószert rotációs bepárlókészüléken, 30 °C alatti hőmérsékleten vákuumban elpárologtatjuk. A párlási maradék az N-(t-BOC)-L-Phe-(N-metil-Nmetoxi-amid).
2. lépés
2,9 g N-(t-BOC)-L-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid) és 8 ml trifluor-ecetsav elegyét 4 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük, majd rotációs bepárlókészülékben, 30 °C alatti hőmérsékleten, vákuumban ledesztilláljuk a trifluor-ecetsav feleslegét. A maradékot feloldjuk 30 ml dietil-éterben, majd az oldatot vákuumban ismét bepároljuk, és ezt a műveletet mindaddig ismételjük, amíg kristályos anyagot nem kapunk. Ekkor a kristályokat kiszűrjük, mossuk dietil-éterrel, majd foszfor(V)-oxid felett, vákuumban megszárítjuk. Az így kapott termék az L-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid) trifluor-acetátsója.
3. lépés
A) 7,15 g L-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid)-(trifluor-acetát)-ot szobahőmérsékleten, keverés közben feloldunk 30 ml vízmentes Ν,Ν-dimetil-formamidban. Az oldathoz 5 perc alatt 2,35 g N-metil-morfolint adunk, ügyelve arra, hogy a hőmérséklet 30 °C alatt maradjon az adagolás közben, majd ezt követően lehűtjük az elegyet 0 °C-ra.
B) 4,96 g Cbz-L-Ala 55 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát keverés közben lehűtjük -10 °C-ra, és ezen a hőmérsékleten 5 perc alatt beadagolunk 3,05 g izobutil-(klór-formiát)-ot, további 10 perc alatt 2,35 g N-metil-morfolint, majd még 10 percig -10 °C-on keverjük az elegyet.
C) Az A oldatot -10 °C-on, 15 perc alatt a B oldathoz adjuk, majd a reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, és folytatjuk a kevertetést 3 óra hosszat. Ezután 0 °C-ra hűtjük az elegyet, 5 perc alatt hozzáadunk 2,27 g 3-(dimetil-amino)-propilamint, még 5 percig keverjük, majd 50 ml vízzel és 50 ml etil-acetáttal összerázzuk. A felül elhelyezkedő szerves fázist elválasztjuk, majd egymás után mossuk 50 ml vízzel, amelyhez 5 ml telített, vizes nátrium-klorid-oldatot is adunk, 50 ml 5%-os vizes kálium-hidrogén-karbonát-oldattal, 50 ml 0,5 N vizes sósavval, valamint további háromszor 50 ml vízzel. Az oldatot 30 °C alatti hőmérsékleten vákuumban bepároljuk egy rotációs bepárlókészüléken, majd a maradékhoz 50 ml tiszta etil-acetátot adunk, és ismételten bepároljuk. Az így kapott termék a Cbz-L-Ala-L-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid).
4. lépés
27,8 g Cbz-L-Ala-L-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid)ot feloldunk 280 ml vízmentes tetrahidrofuránban, és az oldatot nitrogéngáz alatt lehűtjük -70 °C-ra. Továbbra is nitrogénatmoszférában dolgozva, -70 °C-on, 60 perc alatt beadagolunk 372 ml 1 M tetrahidrofurános diizobutil-alumínium-hidrid-oldatot, és változatlan hőmérsékleten folytatjuk a kevertetést további 60 percen át. Ezután állandó keverés közben, nitrogéngáz alatt, 0 °C-on 400 ml telített, vizes nátrium-klorid-oldatot és 600 ml Rochell-sóoldatot adunk a reakcióelegyhez, ily módon megbontva azt, majd megszűrjük, és a szűrletből elvált vizes fázist kétszer 200 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves fázist háromszor egymás után 600 ml vízzel meghígított 400 ml telített, vizes nátrium-klorid-oldattal mossuk, majd rotációs bepárlókészüléken, 30 °C alatti hőmérsékleten, vákuumban elpárologtatjuk az oldószert. A maradékot toluolból átkristályosítva, és a kristályokat foszfor(V)-oxid felett megszárítva kapjuk a Cbz-L-AlaL-Phe-aldehidet.
5. lépés
A) 20 ml ipari, metanollal denaturált etanolban feloldunk 3 g Cbz-L-Ala-L-Phe-aldehidet, az oldatot felmelegítjük 50 °C-ra és kiszűrjük a nem oldódó anyagot.
B) 1,3 g szemikarbazid-hidroklorid 10 ml vizes oldatát 1,1 g kálium-hidrogén-karbonát 10 ml vízzel készült oldatához adjuk.
C) A B oldatot hozzáadjuk az A oldathoz, és a kapott elegyet 2 óra hosszat 50 °C-on keverjük, majd 50 ml etil-acetátot és 100 ml vizet adva hozzá összerázzuk, elválasztjuk a vizes részt, és azt még kétszer 20 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves fázist egymás után mossuk 50 ml 5%-os vizes káliumhidrogén-karbonát-oldattal, 50 ml 0,5 N vizes sósavval, valamint háromszor 70 ml, 50:20 arányban vízzel hígított, telített nátrium-klorid-oldattal, majd rotációs bepárlókészüléken, 30 °C alatti hőmérsékleten elpárologtatjuk az oldószert. Az így kapott termék a Cbz-LAla-L-PheSc.
6. lépés ml metanolban feloldunk 680 mg Cbz-L-Ala-LPheSc-t, az oldatot a nem oldódó részektől megszűrjük, majd átöblítjük a készüléket nitrogéngázzal, és 100 mg 10%-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk hozzá. Ezután a zárt rendszerhez folyamatosan hidrogéngázt vezetünk 75 percen át, majd kiszűrjük a katalizátort, és rotációs bepárlókészüléken, 30 °C alatti hőmérsékleten elpárologtatjuk a metanolt. A maradék állás közben kristályosodik, ezeket a kristályokat foszfor(V)-oxid felett megszárítva az L-alanil-L-fenil-alanin-szemikarbazont (L-Ala-L-PheSc) kapjuk.
2. példa
F-Fenil-alanil-F-fenil-alanin-szemikarbazon
1. és 2. lépés
Az L-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid)-(trifluor-acetát)-ot az első példa 1. és 2. lépésének megfelelően állítjuk elő.
HU 211 746 A9
3. lépés
A) Szobahőmérsékleten, keverés közben, 8 ml vízmentes Ν,Ν-dimetil-formamidban feloldunk 1,932 g L-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid)-(trifluor-acetát)-ot, majd 30 °C alatt tartva a hőmérsékletet, 5 perc alatt 0,606 g N-metil-morfolint adunk az oldathoz, azután lehűtjük 0 °C-ra.
B) 1,794 g Cbz-L-Phe 15 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát keverés közben lehűtjük -10 °C-ra, és ezen a hőmérsékleten, 5 perc alatt beadagolunk előbb 0,822 g izobutil-(-klór-formiát)-ot, majd további 10 perc alatt 0,606 g N-metil-morfolint, azután -10 °C-on még 10 percig keverjük az elegyet.
C) Az A oldatot -10 °C-on, 15 perc alatt a B oldathoz adjuk, majd hagyjuk az elegyet szobahőmérsékletre melegedni, és folytatjuk a kevertetést 3 óra hosszat. Ezt követően lehűtjük a reakcióelegyet 0 ’Cra, 5 perc alatt beadagolunk 0,612 g 3-(dimetil-amino)propil-amint, majd további 5 percnyi keverés után 20 ml etil-acetátot és 30 ml vizet adunk hozzá, összerázzuk, elválasztjuk a szerves fázist és egymás után 20 ml 5%-os vizes kálium-hidrogén-karbonát-oldattal, 20 ml 0,5 N vizes sósavval, valamint kétszer 30 ml vízzel mossuk. Rotációs bepárolókészüléken, 35 °C alatti hőmérsékleten, vákuumban elpárologtatva az oldószert, majd a maradékot izopropil-alkoholból átkristályosítva, a Cbz-L-Phe-L-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid)-ot kapjuk.
4. lépés
4,89 g Cbz-L-Phe-L-Phe-(N-metil-N-metoxiamid)-ot feloldunk 40 ml vízmentes tetrahidrofuránban. Egy száraz lombikba bemérünk 0,493 g lítium(tetrahidro-aluminát)-ot és 20 ml vízmentes tetrahidrofuránt, és az elegyet 10 percig szobahőmérsékleten, nitrogéngáz alatt keverjük, majd lehűtjük -50 °C-ra. Ezután ezen a hőmérsékleten, nitrogénatmoszférában, 10 perc alatt beadagoljuk a fenti oldatot, majd 20 percig 0 és +5 °C közötti hőmérsékleten keverjük az elegyet. Ismét visszahűtjük a reakcióelegyet -50 °C-ra, nitrogénatmoszférában tartva 60 ml telített Rochell-sóoldatot adunk hozzá, majd hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, a pH-ját 10 ml tömény sósavval 3-ra állítjuk, és a nem oldódó részeket kiszűrjük. A szűrletet 50 ml etil-acetáttal összerázzuk, elválasztjuk a szerves fázist, majd egymás után 50 ml vízzel, 50 ml 5%-os vizes kálium-hidrogén-karbonát-oldattal, 50 ml 0,5 N vizes sósavval, valamint további háromszor 50 ml vízzel mossuk. Ezt követően rotációs bepárlókészüléken, 30 °C alatti hőmérsékleten, vákuumban elpárologtatjuk az etil-acetátot, és a maradékot éjszakán át vákuumban foszfor(V)-oxid felett állni hagyjuk. Végül ezt a maradékot toluolból kristályosítjuk, aminek eredményeképpen a Cbz-L-Phe-L-Phe-aldehidet kapjuk.
5. lépés
A) 0,645 g Cbz-L-Phe-L-Phe-aldehidet 70 °C-on feloldunk 10 ml ipari denaturált etanolban.
B) 0,183 g szemikarbazid-hidroklorid 3 ml vízzel készült oldatához 0,224 g nátrium-acetát-trihidrátot, valamint 2 ml ipari denaturált etanolt adunk, és az elegyet felmelegítjük 60 °C-ra.
C) Az A oldatot a B oldathoz adjuk, majd az A oldatot tartalmazó lombikot még 3 ml etanollal átmossuk, és a mosófolyadékot is hozzáadva, felmelegítjük az elegyet 60-70 °C-ra, és ezen a hőmérsékleten keverjük 30 percig. A reakcióidő leteltével lassan, 1 óra alatt hagyjuk lehűlni az elegyet, majd jégfiirdőben tartjuk további 1 óra hoszszat, végül éjszakán át 4 °C-on állni hagyjuk. Másnap a szilárd anyagot kiszűrjük, ipari denaturált etanolból vízzel 4:1 arányú elegyet készítünk, és ennek az elegynek 3 ml-jével mossuk a kiszűrt terméket, majd vákuumban, foszfor(V)-oxid felett megszárítjuk. Az így kapott anyag a Cbz-L-phe-L-PheSc.
6. lépés
2,1 g Cbz-L-Phe-L-PheSc-t 30 °C-on feloldunk 315 ml metanolban, kszűrjük a nem oldódó részeket, majd átöblítjük a készüléket nitrogéngázzal, és 0,35 g 10%os csontszenes palládiumkatalizátort adva az oldathoz, 30 percen át hidrogéngázt vezetünk a zárt rendszerbe. Ezután a katalizátor eltávolítása végett az oldatot szűrjük, és rotációs bepárlókészüléken, 30 ’C alatti hőmérsékleten, vákuumban bepároljuk. A párlási maradékot vákuumban, foszfor(V)-oxid felett megszárítva kapjuk az L-fenil-alanil-L-fenil-alanin-szemikarbazont (LPhe-L-PheSc).
3. példa
I,Tenil-iihinil-I,-fenil-iihintá-ínieloxi-iniin)
1-4. lépés
A Cbz-L-Phe-L-Phe-aldehidet a 2. példa 1—4. lépéseinél megadottak szerint állítjuk elő.
5. lépés
A) 0,645 g Cbz-L-Phe-L-Phe-aldehidet 60-65 ’Con feloldunk 35 ml ipari, denaturált etanolban, majd a nem oldódó részektől az oldatot megszűrjük.
B) 0,138 g O-metil-hidroxil-ammónium-klorid 25 ml vízzel készült oldatához 60 ’C-on 0,224 g nátriumacetát-trihidrátot adunk.
C) Az A oldathoz hozzáadjuk a B oldatot, majd a lombikot átmossuk még 10 ml 60 ’C-os vízzel, és ezt is az elegyhez adva, 30 percig 60 ’C-on tartjuk a reakcióelegyet, azután hagyjuk 2 óra alatt szobahőmérsékletre hülni. A kivált szilárd terméket szűrőre gyűjtjük, 6 ml etanol-víz eleggyel mossuk, és vákuumban, foszfor(V)-oxid felett megszárítjuk. Az így kapott anyag a Cbz-L-Phe-PheMo.
6. lépés
550 mg Cbz-L-Phe-L-Phe-(metoxi-imin) 300 ml metanollal készült oldatát az oldhatatlan részektől megszűrjük, majd a készüléket nitrogéngázzal átöblítjük 100 mg 10%-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk az oldathoz, és hidrogéngázt vezetünk a zárt rendszerbe 4,5 órán át, szükség szerint mindig utánatöltve. Ezután a katalizátor eltávolítása végett szűrjük az oldatot, és rotációs bepárlókészüléken, 30 ’C alatti hőmérsékleten, vákuumban elpárologtatjuk az oldó13
HU 211 746 A9 szert, aminek eredményeképpen az L-fenil-alanil-L-fenil-alanin-(metoxi-imin)-t (L-Phe-L-PheMo) kapjuk.
4. példa
L-Fenil-alanil-D-fenil-alanin-szemikarbazon
1. lépés
A) 40 ml vízmentes Ν,Ν-dimetil-formamidban szobahőmérsékleten felszuszpendálunk 3,891 g O,N-dimetil-hidroxil-ammónium-kloridot. 30 °C alatti hőmérsékleten, 5 perc alatt 4,032 g N-metil-morfolint adunk az oldathoz, majd állandó keverés közben 0 °C-ra hűtjük az elegyet.
B) 10,08 g N-(t-Boc)-D-Phe 8 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát lehűtjük -10 °C-ra, és ezen a hőmérsékleten beadagolunk előbb 5 perc alatt 5,47 g izobutil-(klór-formiát)-ot, majd további 10 perc alatt 4,032 g N-metil-morfolint, azután még 10 percig -10 °C-on folytatjuk a keverést.
C) Az A szuszpenziót -10 °C-on 15 perc elteltével hozzáadjuk a B szuszpenzióhoz, majd hagyjuk az elegyet szobahőmérsékletre melegedni, és 3 óra hosszáig keverjük. Ezt követően 0 °C-ra hűtjük a reakcióelegyet, 5 perc alatt beadagolunk 3,88 g 3-(dimetil-amino)-propil-amint, majd további 5 percnyi kevertetés után 60 ml vizet és 60 ml etil-acetátot adunk hozzá, elválasztjuk a szerves fázist, és mossuk az alábbi sorrendben 60 ml vízzel 60 ml 5%-os vizes kálium-hidrogén-karbonát-oldattal, 60 ml 0,5 N vizes sósavval, valamint további háromszor 60 ml vízzel. Rotációs bepárlókészüléken, 30 °C alatti hőmérsékleten vákuumban elpárologtatjuk ezután az oldószert, aminek eredményeképpen az N-(t-BOC)-D-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid)-ot kapjuk.
2. lépés
11,3 g N-(t-BOC)-D-Phe-(N-metil-N-metoxiamid)-hoz jeges hűtés közben 30 ml trifluor-ecetsavat adunk, és az elegyet 3 óra hosszáig szobahőmérsékleten keverjük. Ezután rotációs bepárló készüléken, vákuumban ledesztilláljuk, a trifluor-ecetsav feleslegét, ügyelve arra, hogy a hőmérséklet 30 °C alatt maradjon, és a maradékot feloldjuk 100 ml dietil-éterben. Az oldatot vákuumban ismét bepároljuk, és ezt a műveletet addig ismételjük, amíg a maradék kristályosodik. Ekkor a kristályokat kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk, és vákuumban, foszfor(V)-oxid felett megszárítjuk. Az így kapott termék a D-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid) trifluor-acetát- sój a.
3. lépés
A) 10,1 g D-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid)-(trifluor-acetát)-ot szobahőmérsékleten, keverés közben feloldunk 41 ml vízmentes Ν,Ν-dimetil-formamidban. 30 °C alatt tartva a hőmérsékletet 5 perc alatt beadagolunk 3,155 g N-metil-morfolint, majd az elegyet 0 ’Cra hűtjük.
B) 9,4 g Cbz-L-Phe 80 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát keverés közben lehűtjük -10 ’Cra, és ezen a hőmérsékleten 5 perc alatt előbb 4,307 g izobutil-(klór-formiát)-ot, majd további 10 perc alatt
3,155 g N-metil-morfolint adunk az elegyhez, és még 10 percig -10 ’C-on keverjük.
C) Az A oldatot -10 ’C-on, 15 perc alatt a B oldathoz adjuk, az elegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni és folytatjuk a keverést 3 órán át. Ezután lehűtjük a reakcióelegyet 0 ’C-ra, 5 perc alatt beadagolunk 3,20 g 3-(dimetil-amino)-propil-amint, és újabb 5 percnyi keverés után 60 ml etil-acetáttal, valamint 60 ml vízzel összerázzuk. A szerves fázist elválasztjuk és sorban egymás után 60 ml vízzel, 60 ml telített, vizes nátrium-klorid-oldattal, 60 ml 5%-os kábum-hidrogén-karbonát-oldattal, 60 ml 0,5 N vizes sósavval, valamint még háromszor 60 ml vízzel mossuk. Ezt követően rotációs bepárlókészüléken 30 ’C alatti hőmérsékleten, vákuumban elpárologtatjuk az oldószert, a maradékhoz friss etil-acetátot adunk és ismét bepároljuk. A visszamaradó anyagot izopropil-alkoholból átkristályosítva kapjuk a Cbz-L-Phe-D-Phe-(Nmetil-N-metoxi-amid)-ot.
4. lépés
Egy nitrogéngázzal átöblített lombikba bemérünk 10 ml 1 M metilén-dikloridos diizobutil-alumíniumhidrid-oldatot. A lombikot felmelegítjük 50 ’C-ra és ezen a hőmérsékleten tartjuk, amíg a metilén-diklorid elpárolog, majd ismét átöblítjük nitrogéngázzal, 10 ml vízmentes tetrahidrofuránt adunk a maradékhoz, végül lehűtjük -70 ’C-ra. 0,978 g Cbz-L-Phe-D-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid)-ot feldolgozunk 10 ml vízmentes tetrahidrofuránban, és ezt az oldatot 10 perc alatt 70 ’C-on tartott diizobutil-alumínium-hidrid-oldathoz adjuk, majd további 10 percig -70 ’C-on keverjük az elegyet. Ezt követően 30 ml metanollal és 30 ml telített Rochell-sóoldattal -60 ’C-on megbontjuk a reakcióelegyet, majd szobahőmérsékletre hagyjuk felmelegedni és 50-50 ml vízzel, valamint etil-acetáttal összerázzuk. Elválasztjuk a szerves fázist, és a vizes részt 50 ml etil-acetáttal extraháljuk, majd az egyesített szerves fázist kétszer 200 ml vízzel mossuk, megszűrjük és rotációs bepárlókészüléken 30 ’C alatti hőmérsékleten vákuumban bepároljuk. A maradékhoz friss etil-acetátot adunk és ismételten bepároljuk, aminek eredményeképpen a Cbz-L-Phe-D-Phe-aldehidet kapjuk.
5. lépés
A) 400 mg Cbz-L-Phe-D-Phe-aldehidet feloldunk 10 ml 60 °C-os ipari denaturált etanolban.
B) 0,298 g nátrium-acetát-víz (1/3) 3 ml vízzel készített és 60 ’C-ra melegített oldatát 0,244 g szemikarbazid-hidroklorid 3 ml vizes, 60 °C-os oldatához adjuk.
C) Az A és a B oldatokat összeöntjük, az elegyet 60 ’C-on 5 óra hosszat keverjük, majd éjszakán át 4 ’C-on állni hagyjuk. Másnap a kivált szilárd terméket szűrőre gyűtjve és vákuumban, foszfor(V)-oxid felett megszárítva, a Cbz-L-Phe-D-PheSc-t kapjuk.
6. lépés
600 mg Cbz-L-Phe-D-PheSc 90 ml metanollal készített oldatát az oldhatatlan részektől megszűrjük, majd a készüléket nitrogéngázzal átöblítjük. 100 mg
HU 211 746 A9
10%-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk az oldathoz, és 2 órán át hidrogéngázt vezetünk a lezárt reakcióedénybe, majd kiszűrjük a katalizátort, és a metanolt rotációs bepárlókészüléken, 30 °C alatti hőmérsékleten vákuumban elpárologtatjuk. A visszamaradó termék az L-fenil-alanil-D-fenil-alanin-szemikarbazon (L-Phe-D-PheSc).
5. példa
L-Fenil-alanil-L-fenil-alanin-oxim
1-4. lépés
A Cbz-L-Phe-L-Phe-aldehidet a 2. példában az 1^1. lépésnél leírtaknak megfelelően állítjuk eló'.
5. lépés
A) 0,645 g, a fenti módon előállított Cbz-L-Phe-LPhe-aldehidet 60-65 °C-on 35 ml ipari denaturált etanolban oldunk, majd az oldatot a nem oldódó részek eltávolítása végett szűrjük.
B) 0,114 g hidroxil-ammónium-hidroklorid 25 ml vizes, 60 °C-os oldatához 0,224 g nátrium-acetát-trihidrátot adunk.
C) A B oldatot hozzáadjuk az A oldathoz, a lombikot 10 ml vízzel bemossuk, majd az elegyet 45 percig 60-65 °C-on keverjük, azután 2-3 órán át 4 °C-on tartjuk. A kivált kristályokat szűrjük, 5 ml 1:1 arányú etanol-víz eleggyel mossuk, és foszfor(V)-oxid felett, vákuumban megszárítjuk. Az így kapott Cbz-L-Phe-LPheOx szín- és anti-izomerek keveréke.
6. lépés
500 mg Cbtz-L-Phe-L-PheOx 130 ml metanollal készült oldatát az oldhatatlan részektől megszűrjük, majd az oldatot egy készülékbe helyezzük, amelyet nitrogéngázzal átöblítünk. Ezt követően 83 mg 10%-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk az oldathoz, és a lezárt készülékbe 30 percen át hidrogéngázt vezetünk. A katalizátor kiszűrése után rotációs bepárlókészüléken, 30 °C alatti hőmérsékleten, vákuumban bepároljuk az oldatot, majd nagyvákuumban állandó szívatással eltávolítjuk az oldószerek nyomait is, végül ugyancsak vákuumban foszfor(V)-oxid felett megszárítjuk a maradékot. Az így kapott termék az L-fenil-alanil-L-fenil-alanin-oxim (L-Phe-L-PheOx).
6. példa
DAlanil-D-fenil-alanin-szemikarbazon
1. és 2. lépés
A D-fenil-alanin-(N-metil-N-metoxi-amid) trifluorecetsavas sójának az előállítását a 4. példa 1. és 2. lépésénél megadottak szerint végezzük.
3. lépés
A) 5,000 g D-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid)-ot feloldunk 20 ml vízmentes tetrahidrofuránban, az oldat hőmérsékletét 30 °C alatt tartva 1,578 g N-metil-morfolint adunk hozzá, majd lehűtjük az elegyet 0 °C-ra.
B) 3,463 g Cbz-L-Ala 40 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készített oldatát keverés közben -10 °C-ra hűtjük, majd ezen a hőmérsékleten beadagolunk 5 perc alatt 2,158 g izobutil-(klór-formiát)-ot és további 10 perc alatt 1,578 g N-metil-morfolint, azután még 10 percig -10 °C-on keverjük az elegyet.
C) A fenti két oldatot -10 °C-on 10 perc alatt összeöntjtik, az elegyet hagyjuk felmelegedni szobahőmérsékletre és 3 óra hosszáig keverjük. Ezután 0 °C-ra hűtjük a reakcióelegyet, beadagolunk 1,585 g 3-(dimetil-amino)-propil-amint, majd 50 ml víz hozzáadásával leállítjuk a reakciót. 50 ml etil-acetáttal összerázzuk az elegyet, a szerves fázist elválasztjuk, a vizes részt kétszer 30 ml etil-acetáttal extraháljuk, majd az egyesített szerves fázist sorjában 50 ml víz és 10 ml telített vizes nátrium-klorid keverékével, 50 ml 5%-os kálium-hidrogén-karbonát-oldattal, 50 ml 0,5 N vizes sósavval, valamint további háromszor 50 ml vízzel mossuk. Az oldószert rotációs bepárlókészüléken, 30 °C alatti hőmérsékleten, vákuumban elpárologtatva szilárd maradékot kapunk, amelyet etil-acetátból kristályosítunk át. A kristályos termék a Cbz-L-Ala-D-Phe-(N-metil-Nmetoxi-amid).
4. lépés ml vízmentes tetrahidrofuránban feloldunk 2,9 g Cbz-L-Ala-D-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid)-ot és az oldatot nitrogénatmoszférában lehűtjük -70 °C-ra. Ezen a hőmérsékleten 10 perc alatt beadagolunk 37 ml 1 M tetrahidrofurános diizobutil-alumínium-hidrid-oldatot, és folytatjuk a kevertetést -70 °C-on még 10 percig. Ezután 125 ml telített Rochell-sóoldat és 125 ml tetrahidrofurán hozzáadásával -30 °C-on leállítjuk a reakciót, továbbra is nitrogéngáz alatt végezve a műveleteket, majd hagyjuk az elegyet szobahőmérsékletre melegedni. 100 ml etil-acetáttal összerázzuk a reakcióelegyet, a szerves fázist elválasztjuk, és a vizes részt kétszer 30 ml etil-acetáttal extraháljuk. Egyesítjük a szerves fázist és mossuk háromszor 100 ml vízzel, majd szűrjük, és a szűrletet rotációs bepárlókészüléken 30 °C alatti hőmérsékleten vákuumban bepároljuk. Friss etil-acetátot adva a maradékhoz és ismételten bepárolva a Cbz-L-Ala-D-Phe-aldehidet kapjuk.
5. lépés
A) 1,2 g Cbz-L-Ala-D-Phe-aldehidet feloldunk 20 ml tetrahidrofurán és 20 ml ipari denaturált etanol elegyében, majd az oldatot felmelegítjük 50 °C-ra.
B) 1,8 g szemikarbazid-hidroklorid 15 ml forró vizes oldatát 1,5 g, 15 ml forró vízben oldott káliumhidrogén-karbonáthoz adjuk.
C) A B oldatot hozzáadjuk az A oldathoz és az elegyet 50 °C-on keverjük 4 óra hosszat, majd rotációs bepárlókészüléken 30 °C alatti hőmérsékleten vákuumban elpárologtatjuk az oldószert. A maradékhoz 50 ml vizet adunk, a szilárd anyagot kiszűrjük és etanol-víz 1:1 arányú elegyével mossuk, végül foszfor) V)-oxid felett, vákuumban megszárítjuk. Az így kapott termék a Cbz-L-Ala-D-PheSc.
6. lépés
750 mg Cbz-L-Ala-D-PheSc 50 ml metanolos oldatát a nem oldódó részektől megszűrjük, majd átvisszük
HU 211 746 A9 egy hidráié készülékbe. A készüléket nitrogéngázzal öblítjük, majd 100 mg 10%-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk az oldathoz és a zárt rendszert hidrogéngázzal folyamatosan utántöltjük 90 percen át. Ezután megszűrjük az oldatot a katalizátor eltávolítása végett, a szűrletet rotációs készülékben 30 °C alatti hőmérsékleten vákuumban bepároljuk, majd a maradékot foszfor(V)-oxid felett vákuumban megszárítjuk. Az így kapott termék az L-alanil-D-fenil-alanin-szemikarbazon (L-Ala-D-PhSc).
7. példa
L-TiroziíL-fenil-alanin-szemikarbazon
1. és 2. lépés
Az L-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid) trifluor-ecetsavas sóját a 4. példában az 1. és 2. lépéseknél leírtak szerint állítjuk elő.
3. lépés
A) 30 ml Ν,Ν-dimetil-formamidban szobahőmérsékleten keverés közben feloldunk 7,95 g L-Phe-(Nmetil-N-metoxi-amid)-ot. 5 perc alatt a hőmérsékletet 30 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten tartva beadagolunk 2,49 g N-metil-morfolint, majd lehűtjük az elegyet 0 °C-ra.
B) 10 g Cbz-OBz-L-Tyr 60 ml vízmentes N,N-dimetil-formamiddal készített oldatát keverés közben lehűtjük -10 °C-ra és ezen a hőmérsékleten 5 perc alatt beadagolunk 3,39 g izobutil-(klór-formiát)-ot, majd további 10 perc alatt 2,49 g N-metil-morfolint, azután az elegyet még 10 percig -10 °C-on keveijük.
C) Az A oldatot -10 °C-on 15 perc alatt hozzáadjuk a B oldathoz, majd hagyjuk az elegyet szobahőmérsékletre melegedni, és 3 órán át keverjük. Ekkor 0 °C-on 5 perc alatt beadagolunk 2,52 g 3-(dimetil-amino)-propil-amint, majd 50 ml víz és 50 ml etil-acetát hozzáadása után elválasztjuk a felül elhelyezkedő szerves fázist, és egymást követően mossuk 50 ml vízzel, 50 ml 5%-os vizes kálium-hidrogén-karbonát-oldattal, 50 ml 0,5 N vizes sósavval, végül további háromszor 50 ml vízzel. Az oldószert rotációs készülékben 30 °C alatti hőmérsékleten, vákuumban elpárologtatjuk és a maradékot izopropil-alkoholból átkristályosítjuk. Az így kapott termék a Cbz-OBz-L-Tyr-L-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid).
4. lépés
1,012 g Cbz-OBz-L-Tyr-L-Phe-(N-metil-N-metoxi-amid) 10 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatához nitrogéngáz atmoszférában, -70 °c-on, 10 perc alatt 8,5 ml 1 M tetrahidrofurános diizobutil-alumínium-hidrid-oldatot adunk, majd 10 percig keverjük az elegyet. Ezt követően 20 ml metanolt és 30 ml Rochell-sóoldatot adva -60 °C-on, keverés közben nitrogéngáz alatt az elegyhez, leállítjuk a reakciót ,majd hagyjuk, hogy felmelegedjék szobahőmérsékletre. Az elegyet 50 ml vízzel és 50 ml etil-acetáttal összerázzuk, a szerves fázist elválasztjuk, kétszer 100 ml vízzel mossuk, majd rotációs készülékben 30 °C alatti hőmérsékleten vákuumban bepároljuk. Friss etil-acetátban felvéve a maradékot, majd ismételten bepárolva szilárd anyag marad vissza, amelyet foszfor(V)-oxid felett, vákuumban megszárítunk. Az így kapott termék a CbzOBz-L-Tyr-L-Phe-aldehid.
5. lépés
A) 400 mg Cbz-OBz-L-Tyr-L-Phe-aldehidet 20 ml ipari, denaturált etanol és 10 ml tetrahidrofurán elegyében oldunk, majd 60 °C-ra melegítjük az oldatot.
B) 600 mg szemikarbazid-hidroklorid 5 ml forró vizes oldatát hozzáadjuk 500 mg kálium-hidrogén-karbonát 5 ml forró vízzel készült oldatához.
C) A B oldatot az A oldathoz adjuk, majd az elegyet 60 °C-on keverjük 2 óra hosszat. Ezt követően rotációs bepárlókészüléken, 30 °C alatti hőmérsékleten, vákuumban elpárologtatjuk az oldószert, a maradékhoz vizet adunk, és a szilárd anyagot kiszűrjük. Vízzel és ipari etanollal mosva, majd vákuumban foszfor(V)oxid felett szárítva, a kapott termék a Cbz-OBz-L-TyrL-PheSc.
6. lépés
770 mg Cbz-OBz-L-Tyr-L-PhSc 70 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát megszűrjük, és a szűrlethez 20 ml metanolt adunk. A készüléket átöblítjük nitrogéngázzal, 100 mg 10%-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk az oldathoz, majd néhány órán át a zárt rendszert hidrogéngázzal mindig utánatöltjük. A hidrogénezés befejeztével kiszűrjük a katalizátort, és az oldatot bepároljuk, aminek eredményeképpen kapjuk az L-tirozil-L-fenil-alanin-szemikarbazont (L-TyrL-PheSc).
8. példa
L-Alanil-L-ciklohexil-alanin-szemikarbazon
1. lépés
A) 75 ml vízmentes Ν,Ν-dimetil-formamidhoz keverés közben előbb 8,51 g O,N-dimetil-hidroxil-ammónium-kloridot, majd 5 perc alatt 30 °C-nál alacsonyabban tartva az elegy hőmérsékletét 8,8 g N-metilmorfolint adunk. A reakcióelegyet, amelyből fehér csapadék válik ki, lehűtjük 0 °C-ra.
B) 22,5 g N-(t-BOC)-L-CHA 200 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát lehűtjük -10 °C-ra, majd ezen a hőmérsékleten 5 perc alatt beadagolunk 11,94 g izobutil-(klór-formiát)-ot, valamint további 10 perc alatt 8,8 g N-metil-morfolint, azután az elegyet még 10 percig -10 °C-on keverjük.
C) Az A szuszpenziót -10 °C-on 15 perc alatt a B szuszpenzióhoz adjuk, majd a reakcióelegyet először hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, és 4 óra hosszáig keverjük, azután lehűtjük 0 °C-ra, 5 perc alatt beadagolunk 8,6 g 3-(dimetil-amino)-propil-amint és folytatjuk a kevertetést további 5 percig. 200 ml víz és 100 1 etil-acetát hozzáadása után elválasztjuk a vizes réteget és extraháljuk kétszer 100 ml etil-acetáttal, majd az egyesített szerves fázist egymást követően 100 ml vízből és 20 ml telített, vizes nátrium-kloridból készült oldattal, 100 ml 5%-os vizes kálium-hidrogénkarbonát-oldattal, 100 ml 0,5 N vizes sósavval, vala16
HU 211 746 A9 mint háromszor 100 ml vízzel mossuk. Rotációs bepárlókészüléken, 30 °C alatti hó'mérsékleten, vákuumban elpárologtatva az oldószert, az N-(t-BOC)-L-CHA-(Nmetil-N-metoxi-amid)-ot kapjuk.
2. lépés g N-(t-BOC)-L-CHA-(N-metil-N-metoxi-amid) és 65 ml trifluor-ecetsav elegyét előbb 0 °C-on 5 percig, majd szobahó'mérsékleten 3 óra hosszat keverjük. Ezután a trifluor-ecetsav feleslegét rotációs készüléken, 30 °C alatti hó'mérsékleten, vákuumban ledesztilláljuk, a maradékot feloldjuk dietil-éterben, majd az oldatot vákuumban ismét bepároljuk. A dietil-éterben való feloldást és bepárlást még egyszer megismételve sárga olaj formájában kapjuk az L-CHA-(N-metil-Nmetoxi-amid) trifluor-acetát-sóját.
3. lépés
A) 17 g L-CHA-(N-metil-N-metoxi-amid)-(trifluor-acetát)-ot feloldunk 50 ml vízmentes tetrahidrofuránban, majd 30 °C-nál alacsonyabb hó'mérsékleten tartva az oldatot, 5 perc alatt beadagolunk 3,95 g Nmetil-morfolint és az elegyet lehűtjük 0 °C-ra.
B) 9,25 g Cbz-L-Ala 100 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát keverés közben lehűtjük -10 °C-ra, majd ezen a hó'mérsékleten 5 perc alatt előbb
5,35 g izobutil-(klór-formiát)-ot, további 10 perc alatt pedig 3,95 g N-metil-morfolint adunk hozzá, azután még 10 percig -10 °C-on keverjük az elegyet.
C) 15 perc alatt, -10 °C-on az A oldatot a B oldathoz adagoljuk, majd hagyjuk az elegy hőmérsékletét szobahőmérsékletre melegedni. 3 óra hosszat keverjük a reakcióelegyet, azután lehűtjük 0 °C-ra, 5 perc alatt 3,98 g 3(dimetil-amino)-propil-amint adunk hozzá és még 5 percig folytatjuk a keverést. Ezután 150 ml vízzel és 150 ml etil-acetáttal összerázzuk az elegyet, elválasztjuk a vizes réteget és extraháljuk kétszer 75 ml etil-acetáttal. Az egyesített szerves fázist ezután sorjában 125 ml vízzel, 125 ml 5%-os vizes kálium-hidrogén-karbonát-oldattal, 125 ml 0,5 N vizes sósavval, valamint további háromszor 100 ml vízzel mossuk. Rotációs bepárlókészülékben, 30 °C alatti hó'mérsékleten, vákuumban elpárologtatva az oldószert, majd friss etil-acetáttal még egyszer bepárolva a maradékot, a Cbz-L-Ala-L-CHA-(N-metil-N-metoxiamid)-ot kapjuk.
4. lépés
7,22 g Cbz-L-Ala-L-CHA-(N-metil-N-metoxiamid) 160 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát nitrogénatmoszférában lehűtjük -70 °C-ra. Keverés közben továbbra is nitrogénatmoszférában és -70 °C-on tartva a reakcióelegyet, 20 perc alatt beadagolunk 86 ml 1 M tetrahidrofurános diizobutil-alumínium-hidrid-oldatot, és további 20 percig folytatjuk a kevertetést. A reakciót ezután 0 °C-on, nitrogénatmoszférában 400 ml Rochell-sóoldat hozzáadásával leállítjuk, majd szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni az elegyet, 150 ml etil-acetátot adunk hozzá, még 5 percig keverjük, azután szűrjük. A szűrletet két fázisra választjuk szét, a vizes réteget extraháljuk kétszer 50 ml etil-acetáttal, majd az egyesített szerves fázist háromszor 200 ml vízzel mossuk, az utolsó mosófolyadékhoz telített nátrium-klorid-oldatot adva. Rotációs bepárlókészüléken, 30 °C alatti hó'mérsékleten elpárologtatva az oldószert, olaj formájában kapjuk a Cbz-L-Ala-L-CHA-aldehidet.
5. lépés
A) 8 g Cbz-L-Ala-L-CHA-aldehidet feloldunk 50 ml ipari, denaturált etanolban, majd az oldatot felmelegítjük 50 °C-ra.
B) 3,0 szemikarbazid-hidroklorid 25 ml vízzel készült oldatát forrón hozzáadjuk 2,67 g kálium-hidrogén-karbonát 25 ml forró vizes oldatához.
C) A B oldatot az A oldathoz adjuk, majd a kapott elegyet 3 óra hosszáig 50 °C-on keverjük, azután lehűtjük 4 °C-ra és éjszakán át állni hagyjuk. Az etanol nagyobb részét rotációs készüléken, 30 °C alatti hó'mérsékleten elpárologtatjuk, a maradékhoz 50 ml etilacetátot adunk, és egymást követően mossuk 30 ml vízzel, 30 ml 5%-os vizes kálium-hidrogén-karbonátoldattal, 30 ml 0,5 N vizes sósavval, valamint további kétszer 50 ml vízzel, amelyhez telített nátrium-kloridoldatot is adunk, ha az elválás javítása végett ez szükséges. Rotációs készüléken, 30 °C alatti hó'mérsékleten elpárologtatjuk az oldószert, majd a visszamaradó szilárd anyagot izopropil-alkohol és dietil-éter elegyéből átkristályosítjuk. Az így kapott termék a Cbz-L-Ala-LCHASc.
6. lépés
900 mg Cbz-L-Ala-L-CHASc 30 ml metanollal készült oldatához nitrogéngáz alatt 100 mg 10%-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk, majd a zárt készülékbe 6 órán át folyamatosan hidrogéngázt vezetünk. A katalizátor kiszűrése után az oldószert 30 °C alatti hó'mérsékleten, rotációs készüléken elpárologtatjuk, a visszamaradó szilárd anyagot pedig dietil-éterrel mossuk, majd vákuumban foszfor(V)-oxid felett megszárítjuk. Az így kapott termék az L-alanil-L-ciklohexil-alanin-szemikarbazon (L-Ala-L-CHASc).
9. példa
DAlanil-L-leucin-szemikarbazon
1. lépés
A) 110 ml vízmentes Ν,Ν-dimetil-formamidhoz szobahó'mérsékleten keverés közben előbb 9,17 g O,Ndimetil-hidroxil-ammónium-kloridot adunk, majd 30 °C-nál alacsonyabban tartva az oldat hőmérsékletét, 5 perc alatt beadagolunk 9,51 g N-metil-morfolint. Ezután az elegyet, amelyből fehér csapadék válik ki, lehűtjük 0 °C-ra.
B) 23,3 N-(t-BOC)-L-Leu 200 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát lehűtjük -10 °C-ra és ezen a hó'mérsékleten beadagolunk előbb 5 perc alatt
12,90 g izobutil-(klór-formiát)-ot, majd további 10 perc alatt 9,51 g N-metil-morfolint, azután még 10 percig folytatjuk a kevertetést -10 °C-on.
C) Az A szuszpenziót -10 °C-on 15 perc alatt a B szuszpenzióhoz adjuk, az elegyet előbb hagyjuk szoba17
HU 211 746 A9 hőmérsékletre melegedni és 3 órán át keverjük, majd lehűtjük 0 °C-ra, és 5 perc alatt beadagolunk 9,13 g
3-(dimetil-amino)-propil-amint. Újabb 5 percnyi keverés után 110 ml etil-acetátot és 110 ml vizet adunk az elegyhez, majd elválasztjuk a szerves fázist, és egymást követó'en mossuk kétszer 100 ml vízzel, 100 ml 5%-os vizes kálium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml 0,5 N vizes sósavval, valamint további háromszor 100 ml vízzel. Az oldószert rotációs készüléken, 30 °C alatti hó'mérsékleten elpárologtatva, az N-(t-BOC)-LLeu-(N-metil-N-metoxi-amid)-ot kapjuk.
2. lépés
23,4 g N-(t-BOC)-L-Leu-(N-metil-N-metoxi-amid) és 165 ml 0 °C-ra hűtött trifluor-ecetsav elegyét szobahőmérsékleten keverjük 18 óra hosszáig, majd rotációs készüléken, 30 °C alatti hó'mérsékleten elpárologtatjuk a trifluor-ecetsav feleslegét. A párlási maradékhoz annyi dietil-étert adunk, hogy feloldódjék, majd az oldatot vákuumban bepároljuk, és ezt a műveletet addig ismételjük, amíg a maradék 4 °C-on kristályosodik. Az így kapott termék az L-Leu-(N-metil-N-metoxiamid) trifluor-ecetsavas sója.
3. lépés
A) 10 ml vízmentes tetrahidrofuránban szobahőmérsékleten, keverés közben feldolgozunk 1,8 g LLeu-(N-metil-N-metoxi-amid)-(trifluor-acetát)-ot, majd az oldatot lehűtjük 0 °C-ra és 5 perc alatt hozzáadunk 0,635 g N-metil-morfolint.
B) 1,40 g Cbz-L-Ala 20 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát lehűtjük -10 °C-ra, és ezen a hó'mérsékleten beadagolunk 5 perc alatt 0,869 g izobutil-(klór-formiát)-ot, valamint további 10 perc alatt 0,635 g N-metil-morfolint, azután még 10 percig -10 °C-on keverjük az elegyet.
C) Az A oldatot -10 °C-on 15 perc alatt a B oldathoz adjuk, az elegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, és folytatjuk a keverését 18 óra hosszáig. Ezt követó'en a reakcióelegyet lehűtjük 0 °C-ra, 0,64 g
3-(dimetil-amino)-propil-amint adunk hozzá, majd 25 ml vízzel és 25 ml etil-acetáttal megbontjuk. A vizes réteget elválasztjuk és kétszer 25 ml etil-acetáttal extraháljuk, majd az egyesített szerves fázist egymás után 50 ml vízzel, esetleg telített nátrium-kloridot adva hozzá az elválás javítása végett, 30 ml 5%-os kálium-hidrogén-karbonát-oldattal, 30 ml 0,5 N vizes sósavval, valamint további háromszor 30 ml vízzel mossuk. Az oldószert rotációs bepárlókészüléken, 30 °C alatti hó'mérsékleten elpárologtatjuk, majd a visszamaradó szilárd anyagot foszfor(V)-oxid felett vákuumban megszárítjuk. Az így kapott termék a Cbz-L-Ala-L-Leu-(Nmetil-N-metoxi-amid).
4. lépés
1,9 g Cbz-L-Ala-L-Leu-(N-metil-N-metoxi-amid) 40 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát nitrogénatmoszférában lehűtjük -70 °C-ra, és ezen a hó'mérsékleten továbbra is nitrogénatmoszférában tartva az elegyet, 10 perc alatt beadagolunk 29,5 ml 1 M tetrahidrofurános diizobutil-alumínium-hidrid-oldatot. A reakcióelegyet még 10 percig -70 °C-on keverjük, majd -60 °C-on, nitrogéngáz alatt 50 ml metanolt és 50 ml Rochell-sóoldatot adva hozzá, a reakciót leállítjuk, azután hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni. Ezt követó'en 50-50 ml vizet és etil-acetátot adunk az elegyhez, megszűrjük, elválasztjuk a vizes fázist és extraháljuk kétszer 50 ml etil-acetáttal. A szerves fázisokat egyesítjük, mossuk háromszor 100 ml vízzel, amelyhez az elválás elősegítése végett telített nátrium-klorid-oldatot adunk, majd az oldószert rotációs készüléken 30 °C alatti hó'mérsékleten elpárologtatjuk. A maradékot friss etil-acetátban felvéve és ismételten bepárolva kapjuk a Cbz-L-Ala-L-Leu-aldehidet.
5. lépés
A) 6,7 g Cbz-L-Ala-L-Leu-aldehidet ipari metanollal, denaturált etanolban oldunk és az oldatot 50 °C-ra melegítjük.
B) 9 g kálium-hidrogén-karbonát 30 ml forró vízzel készült oldatát 10,8 g szemikarbazid-hidroklorid 30 ml vizes, forrásig melegített oldatához adjuk.
C) A B oldatot hozzáadjuk az A oldathoz, az elegyet 50 °C-on keverjük 3 óra hosszat, majd éjszakán át szobahó'mérsékleten állni hagyjuk. Másnap a kristályokat kiszűrjük, denaturált etanol és víz 1:1 arányú elegyével, összesen 20 ml-rel mossuk, majd vákuumban foszfor(V)-oxid felett megszárítjuk. Az így kapott termék a Cbz-L-Ala-L-LeuSc.
6. lépés
950 mg Cbz-L-Ala-L-LeuSc 100 ml metanollal készült oldatát a nem oldódó részektől megszűrjük, majd további 50 ml metanollal együtt hidrálókészülékbe töltjük, és a készüléket nitrogéngázzal átöblítjük, 100 mg 10%-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk az oldathoz, azután a lezárt készülékbe 135 percen át hidrogéngázt vezetünk, majd kiszűrjük a katalizátort és az oldatot rotációs bepárló készüléken, 30 °C alatti hó'mérsékleten bepároljuk. A visszamaradó szilárd anyagot vákuumban, foszfor(V)-oxid felett megszárítva, az L-alanil-L-leucin-szemikarbazont (L-Ala-L-LeuSc) kapjuk.
10. példa
Az enzim aktív centrumára irányuló affinitáskromatográfiás oszloptöltet előállítása - ECH-Sepharose
4B-L-Ala-L-PheSc
Nedves tömegét tekintve 3 g ECH-SepharoseR 4B gélt zsugorított üvegszűrőn 240 ml 0,5 M nátrium-klorid-oldattal, azután 120 ml vízzel mossuk. N-[3-(dimetil-amino)-propil]-N’-etil-karbodiimid-hidrokloridból 0,1 M vizes oldatot készítünk, amelynek a pH-ját sósav vagy nátrium-acetát hozzáadásával pontosan 4,5-re állítjuk. 10 mg, az 1. példában leírtak szerint előállított L-Ala-L-PheSc 400 μΐ metanollal készült oldatát 2,4 ml 0,1 M vizes N-[3-(dimetil-amino)-propil]-N’-etilkarbodiimid-hidroklorid-oldattal együtt hozzáadjuk a kimosott gélhez, és a szuszpenziót 1 óra hosszáig 20
HU 211 746 A9 °C-on kíméletesen kevergetjük. Ezután, ha szükséges a pH-t ismét beállítjuk pontosan 4,5-re, majd folytatjuk a kíméletes kevertetést 20 °C-on további 23 órán át. Az affinitásgélt egymást követően mossuk 60 ml 50%-os vizes metanollal, 60 ml vízzel és 60 ml applikációs pufferoldattal, majd felhasználásig 4 °C-on tároljuk.
11-18. példa
Affinitáskromatográfiához oszloptöltetek előállítása A 2-9. példában leírtak szerint előállított dipeptidszármazékok mindegyikét a hordozó gélhez kapcsoljuk, követve a 10. példában megadottakat. Az így kapott affinitásgélekre a későbbiekben mint a 11-18. példa szerinti kromatográfiás töltetekre hivatkozunk.
19. példa
Affinitáskromato gráfia
0,03 g fehérjének megfelelő mennyiségű porlasztva szárított papaja-latex (a Powell and Scholefield, UK terméke) mintákat 1,5 ml applikációs pufferoldatban, amelynek az összetétele a következő: 33%-os etilénglikol, nátrium-foszfát (50 nM), EDTA (1 mM), pH = 6,8 ; és amelyhez még 2 mM koncentrációnak megfelelő mennyiségű ditiotreitet vagy 4 mM koncentrációnak megfelelő' mennyiségű ciszteint is adunk, felvisszük a 10-18. példák szerinti affinitáskromatográfiás töltetekből készített, 1 ml térfogatú oszlopokra, majd azokat az alábbi öt különböző eluens legalább egyikével eluáljuk:
A eluens: 33%-os vizest etilénglikollal készített 100 mM bisz(hidroxi-etil)-diszulfid-oldat, amely nátrium-citrátot (50 mM) és EDTA-t (ImM) is tartalmaz, pH = 4,5; az oszlopot az eluálást megeló'zó'en éjszakán át inkubáljuk.
B eluens: 33%-os vizes etilénglikollal készített 30 mM 2,2’-dipiridil-diszulfid-oldat, amely nátrium-citrátot (50 mM) és EDTA-t (1 mM) is tartalmaz, pH = 4,5; az oszlopot az eluálást megeló'zó'en éjszakán át inkubáljuk.
C eluens: 33%-os vizes etilénglikollal készített 30 mM metil-piridil-diszulfid-oldat, amely nátrium-citrátot (50 mM) és EDTA-t (1 mM) is tartalmaz, pH = 4,5; az oszlopot az eluálást megeló'zó'en éjszakán át inkubáljuk.
D eluens: 33%-os vizes etilénglikollal készített 10 mM merzalilsavoldat, amely nátrium-hidroxidot (50 mM) és EDTA-t (25 mM) is tartalmaz, és amelynek pH-ját ecetsavval 4,5-re állítjuk; az eluálást folyamatosan végezzük.
E eluens: 33%-os vizes etilénglikollal készített 10 mM higany(II)-klorid-oldat, amely nátrium-acetátot (50 mM) is tartalmaz, pH = 4,5; az eluálást folyamatosan végezzük.
Minden egyes eluátumot további tisztításnak vetettünk alá Mono S oszlopon (Pharmacia) a szokásos módon kromatografálva, majd a minták fehérjetartalmát a 280 nm-nél mért abszorbencia alapján állapítottuk meg. Az eredményeket összefoglalását az 1. táblázat tartalmazza.
1. táblázat
Kimopapain kötődése és elúciója
Inhibitor peptid Kromatográfiás töltet (a példa száma) Eluens
A B C D E
L-Ala-L- PheSc 10 - NA + + +
L-Phe-L- PheSc 11 - + + + +
L-Phe-L- PheMo 12 - + NA’ NA NA
L-Phe-D- PheSc 13 - NA + + +
L-Ph-L- PheOx 14 + + NA NA NA
L-Ala-D- PheSc 15 + NA NA + NA
L-Tyr-L- PheSc 16 + NA NA + NA
L-Ala-L- ChaSc 17 + NA NA NA +
L-Ala-L- LeuSc 18 + NA NA NA +
+ A kimopapain felkötó'dött és eluálható volt
- A kimopapain nem kötődött fel és/vagy nem volt eluálható NA Nincs adat
20. példa
Kimopapain tisztítása
i) 1 g a Powell and Scholefield (UK) cégtód vásárolt, kereskedelmi áruként forgalmazott, a Carica papaya tejnedvébód porlasztva szárítással nyert latexet 5 ml desztillált vízben 1 óra hosszat keverünk, majd 4 °C-on 30 percig 9000 g-vel centrifugálva elkülönítjük a nem oldódó részeket.
A pelletet eldobjuk és a felülúszó pH-ját 1 M sósavval, mintegy 20 perc alatt 1,8-ra állítjuk. További 1 óra hosszáig folytatjuk 4 °C-on a keverést, és ha szükséges a pH-t ismét beállítjuk pontosan 1,8-ra.
ii) Az elegyet 4 °C-on 30 percig 9000 g-vel centrifugáljuk, és a kiülepedett anyagot, vagyis a pelletet eldobjuk.
iii) a) A felülúszó pH-ját cseppenként adagolt 5 M nátrium-hidroxid-oldattal, mintegy 10 perc alatt 6,9-re állítjuk. Kékeslila elszíneződés megjelenése figyelhető meg az oldatban.
b) A kapott kékeslila oldatot alapos dialízisnek vetjük alá tízszeres térfogatú applikációs pufferoldattal szemben, amelynek az összetétele: 33%-os etilénglikol, nátrium-foszfát (50 mM), EDTA (1 mM), pH =
6,8. A dialízis folyamán a pufferoldatot háromszor cseréljük. A dializátumot ezután 10 percig 4000 g-vel centrifugáljuk, majd a kimopapaint tartalmazó felülúszó fehérjetartalmát hozzávetódegesen 30 mg/ml koncentrációnak megfelelő értékre állítjuk be. A kimopa19
HU 211 746 A9 pain aktiválása végett annyi ciszteint adunk az oldathoz, hogy annak végkoncentrációja 4 mM-nek megfelelő legyen, majd az oldatot 15 percig 0 °C-on állni hagyjuk.
iv) Az aktivált kimopapainoldatot 36 ml/cm2/óra átfolyási sebességgel felvisszük egy 8 ml-es, a 10. példában leírtak szerint ECH-SepharoseR gélhez kapcsolt L-Ala-L-PheSc dipeptidszármazék affinitástöltetet tartalmazó, előzőleg applikációs pufferoldattal egyensúlyba hozott oszlopra, majd az oszlopot egymást követően mossuk kétszeres oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségű applikációs pufferoldattal, kétszeres oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségű, 4,5 pH-jú, 33%-os etilénglikollal készített 50 mM nátriumcitrát-oldattal és kétszeres oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségű, 4,5 pH-jú, 33%-os etilénglikollal készült 50 mM nátrium-acetát-, 25 mM EDTA-, valamint 10 mM merzalil-oldattal, végül az oszlopot szobahőmérsékleten 2 óra hosszáig inkubáljuk.
v) A kimopapaint 4 ml-es frakciókat szedve, háromszoros oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségű, 10 mM koncentrációnak megfelelő mennyiségben merzalilt tartalmazó, 50 mM vizes nátrium-acetát-oldattal eluáljuk. Az oszlopról lejövő frakciók enzimaktivitását a korábban már között eljárással, ΒΑΡΝΑ szubsztráton mérjük.
Az aktívnak bizonyult frakciókat összeöntjük és további tisztításnak vetjük alá Mono-S HRr 10/10 (Pharmacia) kationcserélő oszlopon. Az eluálást foszfátpufferrel végezzük, amelynek az induló összetétele: nátriumion = 50 mM, EDTA = 1 mM, nátrium-azid = 1,10%, pH = 7,2; és a végösszetétele: nátriuminon = 800 mM, EDTA = 1 mM, nátrium-aid 0,01%, pH = 7,2. A koncentráció grádiens 2,7 mM/ml, az átfolyási sebesség 2 ml/perc. 4 ml-es frakciókat szedünk, amelyek fehérjetartalmát a 280 nm-nél mért abszorbancia alapján, az enzimaktivitását pedig a ΒΑΡΝΑ szubsztrát hidrolízis alapján határozzuk meg.
A kimopapaint tartalmazó frakciókat egyesítjük és desztillált, ionmentes vízzel vagy 1 nM vizes EDTAoldattal szemben dializáljuk, majd végül tárolás céljára liofi lizáljuk.
21. példa
Kimopapain tisztítása - ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitás
i) A Powell and Scholefield (UK) cégtől vásárolt, kereskedelmi áruként beszerezhető, a Carica papaya tejnedvéből porlasztva szárítással nyert 1 g latexet 5 ml vízben 20 °C-on keverünk 1 óra hosszáig, majd 4 °C-on 30 percig 9000 g-vel centrifugálva megszabadítjuk az oldatot az oldhatatlan részektől. A pelletet eldobjuk, és a felülúszó pH-ját cseppenként adagolt 1 M sósavval, mintegy 20 perc alatt 1,8-ra állítjuk. Az oldatot 15 percig 4 °C-on hagyjuk keveredni, azonban 5 perc után a pH-t ellenőrizzük és szükség szerint utánaállítjuk.
ii) A kivált csapadéktól 4 °C-on 30 percig 9000 g-vel centrifugálva megszabadítjuk az oldatot.
iii) a) A felülúszó pH-ját keverés közben cseppenként adagolt 5 M vizes nátrium-hidroxid-oldattal 7,0-ra állítjuk, majd az elegyet a kivált csapadék eltávolítása végett 4 °C-on 30 percig 9000 g-vel centrifugáljuk.
b) Az utóbbi centrifugálással kapott felülúszót felvisszük egy eló'zőleg úgynevezett A pufferoldattal - a pufferoldat a nátriumion-koncentrációt tekintve 50 mM dinátrium-hidrogén-foszfát/nátrium-dihi drogén-foszfátoldat, amely EDTA-t (1 mM) is tartalmaz, a pH-ja 7,2 - egyensúlyba hozott Mono S HR 10/10 (Pharmacia) kationcserélő oszlopra. A minta felvitele után az oszlopot 2 ml/perc átfolyási sebesség mellett A pufferoldattal mossuk, amíg a 280 nm-nél mért abszorbancia értéke nullára áll vissza. Ezt követően az oszlop eluálásához dinátrium-hidrogén-foszfát/nátrium-dihidrogénfoszfát-oldattal grádienst (2,7 mM nátriumion/ml) hozunk létre, 0,80 M nátriumion-koncentrációig. 4 ml-es frakciókat szedünk, és meghatározzuk a frakciók ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitását. 0,170,28 M nátriumion-koncentrációnál az immunológiai meghatározás szerint egy széles kimopapaincsúcs jön le az oszlopról. Az itt szedett frakciók közül azokat, amelyek ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben aktívnak bizonyultak, egyesítjük, és annyi etilénglikolt adunk az oldathoz, hogy térfogatarányát tekintve 33%-os legyen. Az összes többi frakciót, beleértve azokat is, amelyek ugyan ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben aktívak, de később 0,47-0,59 M nátriumion-koncentrációnál eluálhatók, és a papaja proteináz III enzimet tartalmazzák, elöntjük.
iv) Egy 15 ml térfogatú, 10. példában megadottak szerint ECG-SepharoseR gélhez kapcsolt L-Ala-LPheSc dipeptidszármazék affinitástöltetet tartalmazó oszlopot 39 ml/óra/cm2 átfolyási sebesség mellett applikációs pufferoldattal - 33%-os térfogatarányú, vizes etilénglikollal készült, nátriumionra nézve 50 mM koncentrációjú nátrium-dihidrogén-foszfát/dinátrium-hidrogén-foszfát-oldat, amely EDTA-t (1 mM) is tartalmaz, a pH-ja 6,8 - átmossuk. A fenti, egyesített kimopapain frakció enzimtartalmát 4 mM végkoncentrációnak megfelelő mennyiségű ciszteinbázis hozzáadásával aktiváljuk, 15 percig 0 °C-on állni hagyjuk az oldatot, majd felvisszük az előkészített oszlopra, és 60 ml applikáció pufferoldattal utánamossuk.
v) 45 ml, 4,5 ml pH-jú, 10 mM-nak megfelelő koncentrációban higany(II)-kloridot tartalmazó 50 nM nátrium-acetát-puffert viszünk az oszlopra, miközben 5 ml-es frakciókat szedünk, és mérjük a frakciók ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitását.
Az aktív enzimet magában foglaló, az oszlop által visszatartott, majd higany(II)-kloridot tartalmazó pufferoldattal eluált frakciókat egyesítjük, és ismét felvisszük egy Mono S oszlopra. Az oszlopot előbb átmossuk A pufferoldattal, majd az oszloptérfogat hétszeresének megfelelő mennyiségű, ciszteinbázist (4 mM) tartalmazó A pufferoldatot engedünk át rajta. Ekkor leállítjuk a folyadékáramot, és 30 percet várunk, amíg a higanyvegyület leszorítja az enzimet. Ezután ismét megindítjuk a folyadékáramot, az oszlopot megint átmossuk A pufferoldattal, majd a fentebb már ismertetett módon 0,80 M nátrium-koncentrációig nátrium-dihidrogén-foszfát/dinátrium-hidrogén-foszfát20
HU 211 746 A9 oldattal grádienselúciót végzünk. A ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben aktívnak talált frakciókat egyesítjük, annyi ciszteinbázist adunk hozzá, hogy annak végkoncentrációja 4 mM-nak megfelelő legyen, majd 15 percig 0 °C-on állni hagyjuk az oldatot.
Egy 0,5 g Chelex gyantával (Bio-Rad, UK) töltött oszlopot A pufferoldattal átmosunk, majd átengedjük az oszlopon a kimopapaint tartalmazó frakciókból kapott oldatot. Ezt aztán 1 mM vizes EDTA-oldattal dializáljuk, majd liofilizáljuk.
A kimopapain tisztulásának folyamatát a 2. táblázatban foglaltuk össze.
2. Táblázat Kimopapain tisztítása
Fehérje (mg) ΒΑΡΝΑ aktivitás (egység*) ΒΑΡΝΑ fajlagos aktivitás (egység*/mg) Kiter- me- lés** (%) A tisztulás mértéke (szeres)
Porlasztva szárított 441 493 712 1120 100 1
Savas kicsapás 361 238 636 661 48 0,59
Kationcserés kromatográfia 58 133 748 2306 27 2,06
Sepharose- L-Ala-L- PheSc 27,5 112 475 4090 23 3,65
Kationcserés kromatográfia 11 44 687 4062 9 3,63
Chelex 10,5 43 301 4124 9 3,68
* ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitás a 2-es mérési módszerrel meghatározva ** A megadott érték a ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitásra vonatkoztatott kitermelés. A ΒΑΡΝΑ szubsztrátja a papainnak és a papaja proteináz III enzimnek is.
22. példa
Nyulak által termelt, kimopapainnal szemben specifikus IgG ellenanyag előállítása A 21. példában leírtak szerint tisztított kimopapaint a felhasználás előtt Zucker és munkatársai szerint [Biochem. Biophys. Acta 828, 196-204 (1985)] kíméletesen karboximetilezünk. A kimopapainnal szemben specifikus antiszérumot nyulakkal termeltetjük, amelyek először izomba fecskendezve komplett Freund-adjuvánsban 360 pg karboximetilezett fehérjét kapnak, majd két héttel később, inkomplett adjuvánsban, bőr alá fecskendezve még 100 pg-ot. Az antiszérumban található IgG-t ammónium-szulfátos frakcionálással, Heide és Schwick eljárást követve [in „Handbook of Experimental Immunology”, szerkesztő: D. M. Weir, 1.
kötet, 7.1-7.11, Blackwell, Oxford, 1978] részlegesen tisztítjuk, majd 7,3 pH-jú nátrium-kloridot (0,14 M) tartalmazó 10 mM vizes nátrium-foszfát-oldattal dializáljuk.
23. példa
Kimopapain tisztítása és a kimopapain, valamint a
PPIVkvantitatív meghatározása immunológiai módszerrel i-iii) A Powell és Scholefield (UK) cégtől vásárolt, kereskedelmi áruként kapható a Carica papaya tejnedvéből porlasztva szárítással előállított 1 g latexet a 21. példa i-iii) a) pontjaiban megadottak szerint feldolgozunk, illetve savas kezelésnek vetünk alá.
iv) 15 ml, a 10. példában leírtak szerint előállított ECH-SepharoseR gélhez kapcsolt L-Ala-L-PheSc dipeptidszármazék affinitáskromatográfiás oszloptöltetet a 21. példa iv) pontjában leírtaknak megfelelően átmosunk. Az 1,8-as pH-ra állítást követő utolsó centrifugálás felülúszóját applikációs pufferoldattal - az applikációs pufferoldat jelentése itt 33%-os térfogatarányú etilénglikol-víz eleggyel készült, a nátriumionokat tekintve 50 mM náttium-dihidrogén-foszfát/dináttium-hidrogén-foszfát-oldat, amely EDTA-t (1 mM) is tartalmaz, és a pH-ja 6,8 - dializáljuk, majd 4000 g-vel 10 percig centrifugáljuk. Az itt kapott felülúszót, annyi ditiotreitet adva hozzá, hogy a végkoncentrációja 2 mM-nak megfelelő legyen, 15 percig 20 °C-on aktiváljuk. Az oldatot ezután 39 ml/óra/cm2 sebességgel felvisszük az affinitásoszlopra és 60 ml applikációs pufferoldattal utánamossuk. Ezután 15 ml 4,5 pH-jú EDTA-t (1 mM) és metil-piridil-diszulfidot (30 mM) [szintézisét lásd Salih és munkatársai: Biochem. J. 247, 181-193 (1987)] tartalmazó, 50 mM náttium-citrát-puffert engedünk rá az oszlopra, leállítjuk a folyadékáramot és éjszakán át (18 óra) 20 °C-on tartva, rajta hagyjuk a diszulfidtartalmú pufferoldatot az oszlopon.
v) Másnap további 45 ml, fentebb már tárgyalt metil-piridil-diszulfidot tartalmazó pufferoldattal, valamint 30 ml applikációs pufferoldattal eluáljuk az oszlopot, miközben 5 ml-es frakciókat szedünk. Meghatározzuk az egyes frakciók ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitását és az oszlop által visszatartott, majd a metil-piridil-diszulfidot tartalmazó pufferoldattal eluált aktív enzimcsúcsot magukban foglaló frakciókat egyesítjük, azután 40 ml/óra/cm2 sebességgel felvisszük az oldatot egy 80 ml gélt tartalmazó SephadexR LH-20 (Pharmacia) oszlopra, amelyet előzőleg 33%-os térfogatarányú vizes-etilénglikolos 1 mM EDTA-oldattal hozunk egyensúlyba. Ugyanezen oldat összesen 300 ml-nyi mennyiségével folytatjuk az eluálást 8 mles frakciókat szedve. A AA271 értéket folyamatosan követjük, illetve minden frakciónak meghatározzuk a ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitását. Egyesítjük azokat a frakciókat, amelyek a ΒΑΡΝΑ szubszttáttal szemben mutatott aktivitás alapján az enzimcsúcsot tartalmazzák - utána a 271 nm-nél mért abszorbencia alapján még egy további csúcsot is eluálunk az oszlopról - és a 21. példa iii/b) pontjában leírtaknak megfelelően az oldatot egy Mono S HR
HU 211 746 A9
10/10 kationcserélő oszlopon is átengedjük, majd a ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben aktívnak bizonyult frakciókat összeöntjük.
A porlasztva szárított latex, valamint a tisztítás különböző' fázisaiban, így az 1,8-as pH-nál alkalmazott kicsapás után, az affinitáskromatográfiás tisztítás után, továbbá a kationcserés kromatográfiás tisztítás után kapott anyagokban található PPIV mennyiségét az előzó'ekben leírtak szerint, radiális immundiffúzióval meghatároztuk. Ugyanilyen eljárást alkalmaztunk a kimopapain kvantitatív meghatározására, amelyhez a kimopapainnal szemben specifikus ellenanyagot a 22. példában megadottakat követve, nyulakban termeltettük. A standardgörbe megrajzolásához a találmány szerinti eljárással tisztított, és radiális immundiffúzióval mind a PPIV, mind a PPIII enzimtől mentesnek talált kimopapaint használtuk. Az eredmények a 3. táblázatban láthatók.
3. táblázat
A kimopapain tisztulásának folyamata immunológiai módszerrel mérve a kimopapain, illetve a PPIV mennyiségét
Fehéije (mg) Fajlagos aktivitás (ΒΑΡΝΑ egy- ség*/mg) Kimopapain (mg) PPIV az összes fehérje %ában
Porlasztva szárított latex 468 1000 144 18,7
Savas kezelés 157 1433 92 <0,1
Sepharose-L- Ala-L-PheSc 24 4000 28 +
Kationkro- matográfia 15 3533 14 -1-
+ = nem volt detektálható * ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitás a 2-es mérési módszerrel meghatározva
24. példa
Kimopapain allergén tulajdonságainak vizsgálata A 3M Diagnostic Systems (USA) által rendelkezésünkre bocsátott 40 szérummintát vontuk be a vizsgálatba. Ezeket a mintákat korábban a forgalomban lévő Chymofast márkanéven ismert tesztben már megvizsgálták arra nézve, hogy tartalmaznak-e IgE ellenanyagot azzal a kimopapainnal szemben, amely a ChymodiactionR néven kereskedelmi áruként beszerezhető' készítmény hatóanyaga. A vizsgálat során 20 bizonyult pozitívnak és 20 negatívnak. A 40 szérummintát ezután „vakon”, azaz a Chymofast tesztben kapott eredmények ismerete nélkül további vizsgálatnak vetettük alá, hogy megállapítsuk, vajon található-e természetes úton szerzett IgE ellenanyag ezekben a szérumokban ChymodaictinR, PPIII, PPIV és a találmány szerinti eljárással tisztított, tehát radiális immundiffúzióval megállapíthatóan mind a PPIV, mind a PPIII enzimektől mentes kimopapainnal szemben. Saját vizsgálatainkat módosított, szilárd fázisú ELISA (enzyme-linked immunsorbent assay) módszerrel, biotin-avidin rendszert alkalmazva, az alábbi folyamatábrának megfelelően végeztük:
A vizsgálandó antigénnel bevont mikrotitráló lemezre vittük fel a következőket: vizsgálandó szérum —> monoklonális anti-humán IgE —> bionilizett nyúl anti-egér lg —> avidin-peroxidáz komplex —> szubsztrát (ABTS) —> majd a reakciót leállítottuk és mértük 410 nm-nél az abszorbanciát.
A kísérletekhez használt ChymodiactinR a lejárati időn belüli volt. A PPIV enzim tisztítását itt a leírásban megadott módon, a PPIII enzim tisztítását pedig a Buttle és Barrett [Biochem J. 223, 81-88 (1984)] által megadottak szerint végeztük, és ugyancsak az ott leírtak szerint, Buttle és Barrett eljárásával inaktiváltuk az antigéneket, 10 mM jód-ecetsavval kíméletesen karboxilezve azok mindegyikét a felhasználás előtt.
A vizsgálat menete a következő:
A mikrotitráló lemezen található bemélyesztések falán az antigén bevonatot 10 pg/ml koncentrációban a megfelelő antigént tartalmazó 9,6-os pH-jú nátriumkarbonát-puffer 100 μΐ-nyi mennyiségével inkubálva hozzuk létre. Lószérumot (4%) alkalmazunk avégett, hogy a következő lépések során a nem specifikus kötődés mértékét csökkentsük. A vizsgálandó szérumot a lemezre - minden kísérleti helyre összesen 100 μΐ oldatot számítva - 1:20 arányú hígításban, PBS-ben (nátrium-kloridot tartalmazó foszfátpuffer, az angol rövidítésből származó betűszó) visszük fel, amelynek összetétele a következő:
0,1% Tween, 2% lószérum, 10 mM EDTA, 50 μg/ml heparin, pH = 7,2. A lemezeket ezután 4 óra hosszáig 37 °C-on inkubáljuk, majd lyukanként 100 μΐ, 1 μΙ/ml koncentrációjú monoklonális anti-humán IgE-t [előállítását lásd Kémény és Richards: J. Immunoi. Methods 108, 105 (1988)] viszünk rá, folytatjuk az inkubálást 37 °C-on újabb 3 órán át, ezt követően pedig mintánként 100 μΐ (1 μΙ/ml) biotinilezett nyúl anti-egér immunglobulinnal (Dakopatts, Denmark) kezeljük a lemezt, és éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Lyukanként 100 μΐ (10 μΙ/ml) avidin-peroxidázzal 37 °C-on 30 percig inkubáljuk a lemezt, majd 0,5 mg/ml koncenttációban ABTS szubsztrátot [2,2’-azino-bisz(3-etil-benzo-tiazolin-szulfonsav)] tartalmazó pufferoldatot (100 mM citromsav, 200 mM dinátriumhidrogén-foszfát, pH = 4,2; 1 μΙ/ml hidrogén-peroxiddal aktiválva) viszünk az egyes lyukakba, és szobahőmérsékleten még 30 percig folytatjuk az inkubálást. Mintánként 100 μΐ, 0,01% nátrium-azidot tartalmazó, 100 mM citromsavoldat hozzáadásával leállítjuk a reakciót, majd egy Micro ELISA leolvasókészülék (Dynatech) segítségével minden egyes kísérleti helynek meghatározzuk az abszorbanciáját 410 nM-nél. Az IgE standardokat a 0,075-től 4,8 ng/ml tartományban vizsgáltuk (2,4 ng IgE = 1 internacionális egység, rövidítve: I. G. IgE). A négy antigénnel - ezek a ChymodiactinR, és PPIII és PPIV, valamint a 23. példában megadottak szerint előállított kimopapain - szemben
HU 211 746 A9 reszponzív IgE koncentrációk számítására az úgynevezett Enzfitter programot [Leatherbarrow, R. J., 1985, Enzfitter fór IBM PC, Elsevier-Biosoft, 68 Hills Road, Cambridge CB2 ILA, UK] alkalmaztuk. A megvizsgált 40 szérummintából 26-nál azt találtuk, hogy a ChymodiactinR márkanevű készítménnyel immunreakciót adó IgE ellenanyagot tartalmaznak. Ezek közül a 12 legreaktívabbnak bizonyult szérumminta esetében a PPIII-ra, a PPIV-re és a tiszta kimopapainra kapott értékeket a 4. táblázatban tüntettük fel. Az átlagértékeket, valamint a statisztikai szórást 9 mérés eredményéből számítottuk.
4. táblázat
A ChymodiactionR-nal szemben IgE ellenanyagot tartalmazó szérumminták specifikus IgE koncentrációja (I. E./ml)
A minta száma PPIV PPIII Kimopapa- in Ősz - szes Aki- mo- papa- inra esó %
átlag szó- rás átlag szó- rás átlag szó- rás
1 19,9 1,7 18,8 1,7 8,2 1,3 46,9 18
2 5,1 0,3 4,0 0,1 3,2 0,4 12,3 26
3 5,9 0,4 2,7 0,3 1,2 0,3 9,8 12
4 1,8 0,1 2,3 0,2 1,7 0,1 5,8 29
5 3,4 0,2 2,0 0,2 1,6 0,3 7,0 23
6 3,1 0,2 0,3 0,01 0,3 0,03 3,7 8
7 2,6 0,2 1,6 0,2 0,9 0,2 5,1 18
8 2,0 0,1 1,1 0,1 1,3 0,2 4,4 30
9 1,5 0,2 0,3 0,07 1,7 0,2 3,5 49
10 1,0 0,1 0,3 0,09 0,5 0,1 1,8 28
11 3,6 0,4 1,4 0,2 0,7 0,07 5,7 12
12 0,6 0,1 0,4 0,09 2,3 0,2 3,3 70
Összes 50,5 35,2 23,6 109,3 Ave. 22
Amint azt a táblázatban feltüntetett adatok mutatják, az anti-Chymodiactin ellenanyagot tartalmazó 12 szérummintából mindössze kettőnél állapítható meg, hogy az anti-kimopapain IgE nagyobb részben feleló's az immunválaszért, és a PPIII, valamint a PPIV enzimekkel szemben reszponzív ellenanyag, a vonatkozó összes detektált IgE ellenanyagnak hozzávetőlegesen 75%-át teszi ki.
25. példa
Csirke cisztatin inhibitor hatásának megnyilvánulása kimopapain és PPIV keverékeinek esetében A kimopapaint a 23. példában megadottak szerint tisztítottuk, majd ΒΑΡΝΑ szubsztrátot alkalmazva, Zucker és munkatársai [Biochim. Biophys. Acta 828, 196-204 (1985)] szerint, az aktív kötólielyeket E-64 reagenssel titráltuk, ily módon ellenőrizve, hogy a minta megfelel-e a kívánt minó'ségnek. A PPIV tisztítása az eló'zó'ekben leírt módon történt, és a tisztított enzimet bevizsgálás céljából szintén E-64 reagenssel titráltuk, azokazein szubsztrátra átdolgozva az említett módszert.
Csirke cisztatin 2-es formáját Anastasi és munkatársai [Biochem. J. 211, 129-138 (1983)] eljárást követve tisztítottuk, és a tiszta preparátumot papainnel titráltuk, amelynek a titrálása viszont előzőleg ugyancsak E-64 reagenssel történt.
Az azo-kazein hidrolízisén alapuló méréseket a Róván és munkatársai [Arch. Biochem. Biophys, 267, 262-270 (1988)] által leírt módszerrel végeztük, annyi változtatással csupán, hogy a szubsztrát hozzáadása eló'tt az enzimmel és az inhibitorral 40 °C-on 15 percig eló'inkubáltuk a mintákat. Kétszer 9 csövet készítettünk elő, ezek mindegyikébe bemértünk 125 μΐ 6,8 pH-jú, 0,40 M nátrium-foszfát-puffert, amely még EDTA-t (4 mM) és ciszteinbázist (16 mM) is tartalmazott. Ezt követó'en különböző' arányban kimopapaint és PPIV-et adunk a csövek tartalmához olyan mennyiségben, hogy a két enzim együttes koncentrációja 100 nM-nak megfelelő' legyen. Az egyik sorozatnál minden egyes mintához 1 μΜ végsó' koncentrációnak megfelelő' mennyiségű csirke cisztatint adtunk, míg a másik sorozathoz tartozó csövekbe azonos térfogatú vizet töltöttünk. Ezután következett az eló'inkubációs periódus, majd szubsztrátként azo-kazeint alkalmazva meghatároztuk a minták fehérjebontó aktivitását.
A gátló hatást, amelyet a csirke cisztatin az azo-kazeinnek az enzimkeverékek által kiváltott hidrolízisére gyakorol, az ugyanazon enzimkeveréknek csirke cisztatin távollétében mutatott aktivitása százalékában fejeztük ki, és a kapott eredményeket az 5. táblázatban összefoglalva mutatjuk be.
5. táblázat
A csirke cisztatinnak a kimopapain és PPIV keverékeire gyakorolt, százalékosan kifejezett hatása
PPIV (mM) Kimopapain (nM) A366 cisztatin nélkül A366 cisztatin jelenlétében Gátlás (%)
100 0 0,092 0,094 0
80 20 0,158 0,102 35,4
70 30 0,191 0,088 54,0
60 40 0,316 0,06 80,0
50 50 0,347 0,058 83,3
40 60 0,428 0,066 84,5
30 70 0,543 0,028 94,8
20 80 0,588 0,033 94,4
0 100 0,733 0,008 98,9
Az adatokból világosan kitűnik, hogy csirke cisztatin által kifejtett gátló hatás mértéke fordított arányban áll a PPIV koncentrációjával.
26. példa
A kimopapain tisztulása savas kicsapás alkalmával a 2,2-től 1,2-ig terjedő pH tartományban
i) A Powell and Scholefield (UK) cégtől kapott,
HU 211 746 A9 kereskedelmi áruként forgalmazott, a Carica papaya tejnedvéből porlasztva szárítással előállított latexhez annyi desztillált vizet adunk, hogy az elegy 20%-os (tömeg/térfogat) legyen, majd a szuszpenziót 1 óra hosszat keverjük. Az oldhatatlan részeket 4 °C-on 30 percig 9000 g-vel folytatott centrifugálással kiülepítjük, a pelletet eldobjuk, és a felülúszó pH-ját állandó keverés közben, 4 °C-on cseppenként 40 μΐ/perc/ml sebességgel adagolt 1 M sósavval a kívánt értékre állítjuk be. Az elegy pH-ját folyamatosan mérjük egy Radiometer kombinált elektród (típus: GK 2401C) segítségével, amelyet előzőleg 4,01 és 1,09 pH-értékeken standard pufferoldatokkal (Radiometer, 25 °C) kalibráltunk. 2,2-es pH-értéknél, valamint ezen érték alatt 0,2 egységenként a sav adagolását leállítjuk, és az elegy pH-ját állandó értéken tartva, 4 °C-on folytatjuk a keverést. Kis idő múlva a kiindulási térfogatra számítva 10 ml-nek megfelelő, pontosan mért mintát veszünk az elegyből, majd folytatjuk a sav adagolását a maradékhoz mindaddig, amíg a következő' pH-intervallumot el nem érjük.
ii) Minden egyes mintát 4 °C-on 30 percig 9000 g-vel centrifugálunk, a kiülepedett anyagot eldobjuk.
iii) Az egyes minták centrifugálása során kapott feltilúszók pH-ját cseppenként, 400 μΐ/perc sebességgel adagolt 1 M nátrium-hidroxid-oldattal 6,8-ra állítjuk, majd az oldatot ismételten centrifugáljuk 9000 g-vel 30 percig, hogy az esetleg képződött további csapadékot kiülepítsük. Egy másik, teljesen külön kísérletben a savas kicsapást 1,8-as pH-értéknél, 25 ’Con végeztük.
A fenti módon kapott oldatoknak ezután külön-külön meghatároztuk a ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitását, valamint itt a leírásban már ismertetett módon, radiális immundiffúzióval az oldatokban lévő kimopapain és PPIV mennyiségét. Az eredmények a 6. táblázatban láthatók, és világosan mutatják, hogy az összes fehérjére vonatkoztatva 0,1% alá csökken a PPIV mennyisége, ha a kicsapást 4 °C-on, 1,8-as vagy annál alacsonyabb pH-értéknél végezzük, és 0,5% alatti értéket kapunk, ha a kicsapás 1,8-as pH-értéknél, 25 °C-on történik.
27. példa
Birka által termelt monospecifikus IgG ellenanyag előállítása
A 21. példában leírtak szerint előállított kimopapaint felhasználás előtt Zucker és munkatársai [Biochim. Piophys. Acta 828, 196-204 (1985)] eljárását követve kíméletesen karboximetilezzük, majd a kapott terméket
7,3-as pH-jú, nátrium-kloridot (0,14 M) tartalmazó, 10 mM vizes nátrium-foszfát-oldattal dializáljuk. A birkát úgy késztetjük antiszérum-termelésre, hogy izomba fecskendezve komplett Freund-adjuvánsban 100 μg fehérjét adunk neki, majd 1 hónap múlva 50 μg fehérjével megismételjük a kezelést. Az antiszérumból származó IgG-t ammónium-szulfáttal frakcionálva Heide és Schwick módszerével [in „Handbook of Experimental Immunology”, szerkesztő: D. M. Weir, 1. kötet, 7.1-7.11, Blackwell, Oxford, 1978] részlegesen tisztítjuk, majd ezt követően 7,3 pH-jú, nátrium-kloridot (0,14 M) tartalmazó, 10 mM vizes nátrium-foszfát-oldattal dializáljuk.
Hasonló módon állítunk elő papain, papaja proteináz III és papaja proteináz IV enzimekkel szemben specifikus IgG ellenanyagokat.
Az egyes karboximetilezett antigéneket külön-külön a gyártó cég előírásait követve Zetaffinty márkanéven beszerezhető (Anachem), 7,3 pH-jú, nátrium-kloridot (0,14 M) tartalmazó, 10 mM vizes nátrium-foszfát-oldattal egyensúlyba hozott oszloptöltethez kapcsoljuk. Az IgG preparátumokból az esetleges szennyező vagy keresztreakciót adó ellenanyagokat abszorpciós úton távolítjuk el úgy, hogy átengedjük ezeken az oszlopokon, amikor is végül az egyes IgG preparátumok csak a saját, megfelelő antigénjükkel adnak precipitációs reakciót, azonban az eltérő antigénekkel nem képeznek immunkomplexet, azaz nem mutatnak keresztreaktivitást. Az oszlopokat, amelyek a töltethez kapcsolva hordozzák az antigéneket, oly módon regenerálhatjuk, vagyis tehetjük ismét felhasználásra alkalmassá, hogy 0,05 M vizes dietil-amin-oldattal (pH = 11,5) átmossuk, majd azonnal foszfátpufferrel hozzuk egyensúlyba.
Az itt közölt eljárással olyan monospecifikus IgG ellenanyagokat állítottunk elő, amelyek a már korábban ismertetett, közvetlen radiális immundiffúzió néven ismert módszert alkalmazva, kimopapain, PPIII, vagy PPIV és papain kvantitatív meghatározására használhatók.
28. példa
Kimopapain tisztítása - savas kicsapás 1,5-ös pHértéknél
i) A Siebels (USA) cégtől vásárolt, kereskedelmi forgalomban kapható a Carica papaya tejnedvéből porlasztva szárítással előállított 20 g latexet 250 ml, 4 °C-ra előhűtött ionmentesített és desztillált vízzel hagyunk keveredni 0 °C-on 60 percig. Ezután az elegy pH-ját 10 μΐ/perc/ml sebességgel adagolt 1 N sósavval 1,5-re állítjuk, miközben a pH-t egy Radiometer kombinált elektród (típus: GK 2401C) segítségével - folyamatosan mérjük. Az elektródot előzőleg 4,01 és 1,09 pH-jú standard pufferoldatokkal (Radiometer, 25 °C) kalibráljuk. Amikor az oldat pH-ja elérte az 1,5-ös értéket, még 10 percig folytatjuk a keverést, hogy a pH stabilizálódjon, és alkalmunk legyen a pontos beállításra, ha szükséges.
ii) Az elegyet 12 000 g-vel 30 percig 4 °C-on centrifugáljuk, és a pelletet eldobjuk.
iii) a) A felülúszó pH-ját 10 μΐ/perc/ml sebességgel adagolt 1M nátrium-hidroxid-oldattal pontosan 7,0-ra állítjuk, aminek a technikai kivitelezése úgy történik, hogy egy 7,01 pH-jú standard pufferoldattal (Radiometer, 25 °C) kalibrált Radiometer elektród segítségével a pH-t folyamatosan mérjük. Amikor az elegye pH-ja elérte a 7,0-es értéket, ismét hagyjuk 10 percig keveredni a pH stabilizálódása végett, szükség szerint elvégezve az esetleges utánállítást. Ezután 12 000 g-vel 30 percig 4 °C-on centrifugáljuk az elegyet, és a pelletet ismét eldobjuk.
b) A felülúszót 4 °C-on dializáljuk 30-szoros térfogatú ionmentesített és desztillált vízzel szemben, amelyet két alkalommal, 12 órás időközönként cserélünk.
HU 211 746 A9
A dializált oldat további tisztítását S-Sepharose High Performance 35/100 (Pharmacia) oszlopon kationcserés kromatográfiával végezzük. Egy-egy alkalommal legfeljebb 3 g fehérjét - a fehérjetartalmat a 280 nm-nél mért abszorbancia alapján határozzuk meg - viszünk fel az oszlopra, amelyet előzőleg 4 °C-on 1 mM vizes EDTA-oldattal hozunk egyensúlyba. A minta felvitele után az oszlopot 10 ml/perc átfolyási sebesség mellett addig mossuk 1 mM vizes EDTA-oldattal, amíg a 280 nm-nél mért abszorbancia értéke nullára áll vissza.
Ezt követően 0,5 M káliumion-koncentrációig terjedő grádienst (0,175 mM káliumion/ml) hozunk létre, és 25 ml-es frakciókat szedve eluáljuk az oszlopot. A csúcsot magukban foglaló frakcióknak meghatározzuk a ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitását.
Azokat a frakciókat, amelyek ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben a legnagyobb fajlagos aktivitású kimopapaint tartalmazzák - a 0,17-0,22 M káliumion-koncentráció15 nál eluált frakciókról van szó - összeöntjük, és az oldatot 4 °C-on 30-szoros térfogatú ionmentesített és desztillált vízzel szemben dializáljuk öt alkalommal, 12 órás időközönként lecserélve a külső folyadékot. A dializátumot azután liofilizáljuk, és az enzimet felhasználásig -20 °C-on tároljuk.
A teljes tisztítási folyamatot szükséges számban megismételtük. A tisztított fehérje találmány szerinti kimopapain tartalmát, valamint a szennyezésként jelen lévő papain PPIII és PPIV mennyiségét az előzőekben már részletesen ismertetett radiális immundiffúzióval határoztuk meg, amelyhez a 27. példában megadottak szerint előállított, birka által termelt ellenanyagokat használtuk. Meghatároztuk azonkívül a készítmény ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitását, valamint elvégeztük az aktív kötőhelyek titrálását jód-ecetsavval, mindkét esetben az 1-es mérési módszert alkalmazva. A tisztítási folyamatot jól szemlélteti a 7. táblázat, amely összefoglalva tartalmazza a kapott átlagértékeket.
7. táblázat
Összes fehérje (mg) ΒΑΡΝΑ fajlagos aktivitás (egység/mg) Aktív kötőhelyek (%) Kimopapain az összes fehére %-ában PPIV (az összfehérje %-ában) PPIII (összes fehérje %-ában) Papain (az összes fehére %-ában)
Kiindulási anyag 10 203 572 30 25 22 14 5
pH 1,5 8168 461 28 30 0,1 14 <0,1
Dialízis 4351 674 42 59 0,1 24 <0,1
Kationcserés kromatogr. 948 1079 72 100 0,1 <0,1 <0,1
Dialízis 767 1098 89 100 0,1 <0,1 0,1
Liofilizált anyag NA 905 NA NA NA NA NA
NA = nincs adat — = a fehérje mennyiségét a teljes száraz tömegnek vettük
29. példa
Kimopapain tisztítása - savas kicsapás 1,5-ös pHértéknél és affinitáskromatográfia i-iii) A Siebels (USA) cégtől vásárolt, kereskedelmi forgalomban kapható a Carica papaya tej nedvéből porlasztva szárítással előállított latexet a 28. példa iiii) a) pontjaiban leírtaknak megfelelően savas kezelésnek vetünk alá, 1,5-ös pH-ra savanyítva az elegyet. A felülúszót azután 4 °C-on dializáljuk 30-szoros térfogatú ionmentesített és desztillált vízzel szemben, amelyet két alkalommal, 12 órás időközönként cserélünk.
iv) 350 ml, a 10. példában közöltek szerint előállított, ECH-SepharoseR gélhez kapcsolt L-Ala-L-PheSc dipeptidszármazék töltetet tartalmazó oszlopot 4,5 pHjú, 33% térfogatarányú vizes etilénglikollal készült 50 mM nátrium-acetát-oldattal éjszakán át inkubálunk, majd a gélt applikációs pufferoldattal - az applikációs pufferoldat 6,8 pH-jú, 33 %-os térfogatarányú vizes etilénglikollal készült, a nátriumionokra nézve 50 mM nátrium-dihidrogén-foszfát/dinátrium-hidrogén-foszfát-oldat, amely 1 mM-nak megfelelő koncentrációban EDTA-t is tartalmaz - egyensúlyba hozzuk.
A fentebb leírtak szerint kapott, dializált felülúszót egy 0,2 μηι pórusméretű szűrőn megszűrjük, és annyi etilénglikolt adunk a szűrlethez, hogy 33%-os térfogatarányú elegyet kapjunk. Az oldat pH-ját ellenőrizzük, és ha szükséges, pontosan 7,0-ra beállítjuk. Ezután frissen készített 200 mM vizes L-cisztein-oldatot adunk az elegyhez olyan mennyiségben, hogy 4 mM-nak megfelelő koncentrációjú legyen. Alapos összekeverés után 15 percig 4 °C-on állni hagyjuk, végül 40 ml/óra/cm2 sebességgel felvisszük a 4 °C-ra temperált affinitásoszlopra az oldatot, majd tízszeres oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségű appbkációs pufferoldattal mossuk az oszlopot.
v) A kimopapaint háromszoros oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségű 33% térfogatarányú etilénglikollal készült 50 mM koncentrációban nátrium-acetátot tartalmazó, 4,5 pH-jú 10 mM higany(II)-klorid-oldattal eluáljuk, 25 ml-es frakciókat szedve. Azokat a frakciókat, amelyek ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben aktívnak bizonyultak, egyesítjük, majd kationcserés kromatográfiával egy S-Sepharose High Performance 35/100 oszlopon (Pharmacia) további tisztításnak vetjük alá.
HU 211 746 A9
Az oszlopot előzetesen 4 °C-on 1 mM vizes EDTAoldattal egyensúlyba hozzuk, majd a minta felvitele után 10 ml/perc sebességgel addig folyatunk át 1 mM vizes EDTA-oldatot az oszlopon, amíg a 280 nm-nél mért abszorbancia nullára áll vissza. Ekkor háromszoros oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségű, 1 mM EDTA-t és 500 mM L-ciszteint tartalmazó, 7,2 pH-jú, a káliumionokra nézve 50 mM dikálium-hidrogén-foszfát/kálium-dihidrogén-foszfát-oldatot folyatunk át az oszlopon, és 30 percre megszakítjuk a folyadékáramot. Ezután az oszloptérfogat háromszorosának megfelelő' mennyiségű, frissen készített ciszteinpuffert viszünk fel az oszlopra, ismét leállítjuk 30 percre a folyadékáramot, végül az oszlopot további hatszoros oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségű ciszteinpufferrel mossuk, majd 1 mM EDTA-t tartalmazó, 7,2 pH-jú, a káliumionokat tekintve 50 mM vizes dikálium-hidrogén-foszfát/kálium-dihidrogén-foszfát-oldattal ismét egyensúlyba hozzuk.
A következőkben 0,5 M káliumion-koncentrációig grádienst (0,175 mM káliumion/ml) hozunk létre az oszlopon, miközben 25 ml-es frakciókat szedünk, és az egyes csúcsokat magukban foglaló frakcióknak meghatározzuk a ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitását. Az első csúcs, amely 0,2 és 0,25 M közötti káliumion-koncentrációnál jön le az oszlopról, a kimopapain, a második, amelyet hozzávetőlegesen 0,45 M káliumionkoncentrációnál eluálunk, a papaja proteináz III.
A legmagasabb fajlagos aktivitású kimopapaint tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldatot 4 °C-on 30-szoros térfogatú ionmentesített és desztillált vízzel szemben dializáljuk, 12 órás időközönként, összesen ötször cserélve a külső folyadékot.
A kationcserélő oszlopról eluált kimopapain, mivel előzőleg ciszteinpufferrel aktiváltuk, ki van téve annak, hogy oxidáció következtében inaktiválódik. Az inaktiválódás megakadályozása vagy legalábbis csökkentése érdekében, az oxidálódás elkerülése végett a frakciókat olyan csövekbe szedjük, amelyekbe előzőleg 200 mM nátrium-tetrationát-oldatot helyeztünk, hogy annak végső koncentrációja minden egyes frakciónál 5 mMnak megfelelő legyen. Egy másik megoldása a problémának az lehet, ha a dialízist nitrogéngáz alatt olyan vízzel szemben végezzük, amelyből az oldott oxigént előzőleg 30 percen át 0,1 liter/perc sebességgel átbuborékoltatott nitrogéngázzal kiűztük, és az egész művelet kivitelezése zárt rendszerben, nitrogénatmoszférában történik.
A kimopapaint tartalmazó dializátumot végül liofilizáljuk, és az enzimet -20 °C-on tároljuk. A teljes tisztítási műveletsort annyiszor ismételjük, ahányszor az szükséges. Az egyes lépések után a kapott terméket a 28. példában megadottak szerint különböző vizsgálatoknak vetettük alá, így a tisztulás folyamata a 8. táblázatból, amelyben az átlagértékek alapján az eredményeket foglaltuk össze, jól kiolvasható.
8. táblázat
Összes fehérje (mg) ΒΑΡΝΑ fajlagos aktivitás (egység/mg) Aktív kötőhelyek (%) Kimopapain az összes fehéije %-ában PPIV (az összes fehéije %-ában) PPIII (az összes fehérje %-ában) Papain (az összes fehéije %-ában)
Kiindulási vegyület 25 508 572 30 25 22 14 5
pH 1,5 20 421 401 28 30 <0,1 14 <0,1
Dialízis 10 877 674 42 59 <0,1 24 <0,1
Sepharose-L- Ala-L-PheSc 1673 1446 86 66 <0,1 13 <0,1
Kationcserés kromatográfia 951 1625 100 100 <0,1 <0,1 <0,1
Dialízis 828 1743 100 NA NA NA NA
Liofilizált anyag NA 1320 NA NA NA NA NA
NA = nincs adat — = a fehérje mennyiségét a teljes száraz tömegnek vettük
3. példa
Kimopapain tisztítása - savas kicsapás 1,5-ös pHértéknél és affinitáskromatográfia i-iii) A Siebels (USA) cégtől vásárolt, kereskedelmi forgalomban kapható, a Carica papaja tej nedvéből porlasztva szárítással előállított latexet a 28. példában megadottak szerint savas kezelésnek vetettük alá 1,5ös pH-értéken, majd az oldatot dializáljuk és S-Sepharose oszlopon kationcserés kromatográfiával tisztítjuk.
iv) A ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben legmagasabb fajlagos aktivitású kimopapaint tartalmazó frakciókat összeöntjük, és annyi etilénglikolt adunk hozzá, hogy 33% térfogatarányú elegyet kapjunk. Ezután még frissen készített, 200 mM vizes L-cisztein-oldatot adunk az elegyhez olyan mennyiségben, hogy a koncentrációja 4 mM-nak megfelelő legyen, majd az oldatot felvisszük egy ECH-SepharoseR gélhez kapcsolt L-AlaPheSc dipeptidszármazék affinitástöltetet tartalmazó oszlopra, pontosan követve a 29. példa iv) pontjában megadottakat.
v) A kimopapaint háromszoros oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségű, 33% térfogatarányú vizes eti26
HU 211 746 A9 lénglikollal készült, 50 mM nátrium-acetátot tartalmazó 4,5 pH-jú 10 mM higany(II)-klorid-oldattal eluáljuk az oszlopról, 25 ml-es frakciókat szedve. A ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben aktívnak bizonyult frakciókat egyesítjük és 4 °C-on harmincszoros térfogatú ionmen- 5 tesített és desztillált vízzel szemben dializáljuk, 12 órás időközönként. összesen öt alkalommal cserélve a külső oldatot. A dializátumot végül liofilizáljuk, és az enzimet -20 °C-on tároljuk.
A tisztítás közbülső fázisai után a kapott terméket a 28. példában közölteknek megfelelően különböző vizsgálatoknak vetettük alá, így a kimopapain tisztulásának folyamata a 9. táblázat adataiból, ahol is az eredményeket az átlagértékek alapján összefoglaltuk, jól kiolvasható.
9. táblázat
Összes fehérje (mg) ΒΑΡΝΑ fajlagos aktivitás (egység/mg) Aktív kötőhelyek (%) Kimopapain az összes fehére %-ában PPIV (az összes fehéije %-ában) PPIII (az összes fehérje %-ában) Papain (az összes fehérje %-ában)
Kiindulási vegyület 28 795 632 31 27 25 16 6
pH 1,5 23 257 458 24 28 <0,1 13 <0,1
Dialízis 8319 916 57 75 0,2 24 <0,1
Kationcserés kromatográfia 3102 1103 72 91 <0,1 <0,2 <0,1
Sepharose-LAla-L-PheSc 947 1245 89 NA NA NA NA
Dialízis 858 1587 88 100 NA <0,1 <0,1
Liofilizált anyag 972 1265 A 69 NA <0,1 NA NA
NA = nincs adat = a fehérje mennyiségét a teljes száraz tömegnek vettük
31. példa
Két, a találmány szerinti eljárással tisztított kimopapain készítménynek ugyanazon a napon meghatároztuk a ΒΑΡΝΑ szubsztráttal szemben mutatott aktivitását mind az 1-es, mind a 2-es mérési módszerrel. A fajlagos aktivitás kiszámításánál a teljes száraz tömeget vettük alapul. Az A jelű preparátumot a 28. példában ismertetett eljárással, a B jelűldmopapaint pedig a 29. példában megadottak szerint (az utolsó kromatográfiálásnál a frakciókat nátrium-tetrationátot tartalmazó csövekbe szedtük) tisztítottuk. A három párhuzamos kísérletből kapott értékeket a 10. táblázatban mutatjuk be.
10. táblázat
Kimopapain készítmény Fajlagos aktivitás 1-es mérési módszerrel (BAPNA-egység/mg) 2-es mérési módszerrel
A 855 2227
B 1261 3591
32. példa
A 29. példában bemutatott eljárással tisztított, és ugyancsak az ott megadottak szerint nitrogénatmoszférában dializált kimopapaint liofilizálás után -20 °C-on tároljuk. A liofilizált termék ΒΑΡΝΑ szubsztráttal (1 mM) szemben, 37 °C-on és 6,0-os pH-értéknél mért fajlagos aktivitása 1345 egység/mg.
100 ampulla tisztított kimopapaint tartalmazó injekciós készítmény előállításához 43,75 g oldatot ké60 szítünk az alábbi előiratban megadottakat követve. Az oldatot a feldolgozás folyamán 4 és 12 °C közötti hőmérsékleten tartjuk.
166 mg L-cisztein-hidroklorid-monohidrátból mintegy 30 g injekciós minőségű vízzel oldatot készítünk, amelyben a cisztein mennyisége pontosan annak megfelelő, hogy az injekciós oldatban a végkoncentrációja 22 mM legyen. Az oldat pH-ját 1 M nátrium-hidroxiddal vagy 0,1 M sósavval 5,0 és 5,5 közötti értékre állítjuk, majd hozzáadjuk 358 mg tisztított kimopapainhoz, miáltal a végső térfogatra hígítva olyan oldatot kapunk, amelynek a fajlagos aktivitása 11 000 egység/ml. Előbb azonban az oldat pH-ját keverés közben 1 M nátrium-hidroxiddal vagy 0,1 M sósavval beállítjuk 5,9 és 6,0 közötti értékre. Ezt követően injekciós minőségű vizet adunk az oldathoz, hogy annak a tömege pontosan 43,75 legyen, majd két sorba kapcsolt, 0,2 μ in pórusméretű szűrőn átszűrve sterilizáljuk. Az így kapott steril oldatból 100 darab 5 ml-es ampullába pontosan mért 0,4 g tömegű adagokat töltünk, az oldatot megfagyasztjuk és liofilizáljuk, majd végül a liofilizált terméket tartalmazó ampullákat vákuumban leforrasztjuk.
A fenti módon eljárva minden egyes ampulla fehér, amorf por formájában 3,27 mg kimopapaint és 1,52 mg nátrium-ciszteinát-hidrokloridot tartalmaz, ami névlegesen 4000 egységnek, illetve 8 pmólnak felel meg (10% többlet megengedett). A készítményhez - általában közvetlenül a felhasználás előtt - 2 ml injekciós minőségű vizet adunk, ily módon eredeti állapotába visszaállítva, vagyis injekciós oldattá alakítva a liofili27
HU 211 746 A9 zált enzimet. Az oldat névlegesen 4000 egység kimopapaint és 4 mM L-ciszteint tartalmaz.

Claims (26)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Kimopapain, amelynek BAPNA-val (1 mM) szemben, 37 °C-on és pH 6,0-on fajlagos aktivitása 800 és 1700 egység/mg között van, és kevesebb mint 0,2%-ot tartalmaz papaja proteináz III (PPIII), papaja és papaja proteináz IV (PPIV) mindegyikébó'l, és a leírás szerint a „PPIV és vele szemben specifikus ellenanyag eló'állítása” cím alatt közöltek szerint állítható elő.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti kimopapain, amelynek BAPNA-val (1 mM) szemben, 37 °C-on és pH 6,0-on fajlagos aktivitása 1000 és 1700 egység/mg között van.
  3. 3. Kimopapain, amelynek BAPNA-val (2,5 mM) szemben, 40 °C-on és pH 6,8-on fajlagos aktivitása 3000 és 4500 egység/mg között van, és kevesebb mint 0,2%-ot tartalmaz papaja proteináz III (PPIII), papaja és papaja proteináz IV (PPIV) mindegyikébó'l, és a leírás szerint a „PPIV és vele szemben specifikus ellenanyag elóalb'tása” cím alatt közöltek szerint állítható elő.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti kimopapain, amelynek BAPNA-val (2,5 mM) szemben, 40 °C-on és pH 6,8-on fajlagos aktivitása 3500 és 4500 egység/mg között van.
  5. 5. Az eló'zó' igénypontok bármelyike szerinti kimopapain, amelynek azokazeinnel szemben aktivitása van, amely legfeljebb 1 μΜ koncentrációjú csirke cisztatinnal legalább 95%-ban gátolható.
  6. 6. Az eló'zó' igénypontok bármelyike szerinti kimopapain, amely legalább 70% aktív enzimet tartalmaz.
  7. 7. Készítmény, amely az eló'zó' igénypontok bármelyike szerinti kimopapaint tartalmaz.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti készítmény, amely hordozóanyagot is tartalmaz.
  9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti készítmény vízmentes körülmények között légmentes fiolában vagy ampullában lezárva.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti készítmény, amely egy redukálószert is tartalmaz.
  11. 11. A 7-10. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely reverzibilis cisztein proteináz inhibitort is tartalmaz.
  12. 12. Gyógyszerkészítmény, amely az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti kimopapaint tartalmaz.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amely hordozó hígító- vagy töltó'anyagot is tartalmaz.
  14. 14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény vízmentes körülmények között légmentes fiolában vagy ampullában lezárva.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amely egy gyógyszerészetileg elfogadható redukálószert is tartalmaz.
  16. 16. A 12-15. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény egységnyi adag formában parenterális beadáshoz.
  17. 17. Az 1-6. igénypontok szerinti kimopapain kemonukleózishoz való felhasználásához.
  18. 18. Az 1-6. igénypontok szerinti kimopapain kemonukleózishoz való felhasználására alkalmas gyógyszerkészítmény eló'állítására.
  19. 19. Eljárás kimopapain tisztítására, amely a következő' lépésekből áll:
    a) a nyers kimopapain vizes oldatát inkubáljuk az aktív centrumra irányuló affinitás-kromatográfiás töltettel, amely hordozóhoz, adott esetben spacer csoporton keresztül egy reverzibilis kimopapain inhibitor peptid N-terminálisa kovalensen kapcsolódik, és az említett peptid C-terminális aminosava fenil-alanin-, alanin-, ciklohexil-alanin- vagy leucinszármazék, és az említett peptid képes a kimopapain aktív centrumát erősebben megkötni, mint a PPIV aktív centrumát, így ez a peptid a kimopapain molekula aktív centrumához kapcsolódik, és
    b) a kimopapaint alkalmas eluálószerrel eluáljuk.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, ahol a C-terminális aminosav D- vagy L-fenil-alanin-szemikarbazon, D- vagy L-fenil-alanin-metoxiimin, D- vagy L-fenilalanin-oxim, D- vagy L-alanin-szemikarbazon, Dvagy L-ciklohexil-alanin-szemikarbazon vagy D- vagy L-leucin-szemikarbazon.
  21. 21. Eljárás kimopapain előállítására, amely a következő lépésekből áll:
    1. a nyers kimopapaint tartalmazó vizes elegyet 1,21,8 pH-értéken kicsapjuk;
    2. ebből az elegyből a nyers kimopapain vizes oldatát elválasztjuk; és
    3. a nyers kimopapainnak ezt az oldatát semlegesítjük és adott esetben sótalanítjuk.
  22. 22. Eljárás kimopapain eló'állítására, amely a következő lépésekből áll:
    i) a nyers kimopapaint tartalmazó vizes elegyet 2,0 pH-érték alatt kicsapjuk;
    ii) ebből az elegyből a nyers kimopapain vizes oldatát elválasztjuk;
    iii) a nyers kimopapainnak ezt az oldatát semlegesítjük és adott esetben sótalanítjuk;
    iv) a (iii) lépésben kapott oldatot inkubáljuk az aktív centrumra irányuló affinitás-kromatográfiás töltettel, amely hordozóhoz, adott esetben spacer csoporton keresztül egy reverzibilis kimopapain inhibitor peptid N-terminálisa kovalensen kapcsolódik, és az említett peptid C-terminális aminosava fenil-alanin-, alanin-, ciklohexil-alanin- vagy leucinszármazék, és az említett peptid képes a kimopapain aktív centrumát erősebben megkötni, mint a PPIV aktív centrumát, így ez a peptid a kimopapain molekula aktív centrumához kapcsolódik, és
    v) a kimopapaint alkalmas eluálószerrel eluáljuk.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, amelyben a savas lecsapást 1,2-1,8 pH értéken végezzük.
  24. 24. A 21-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amely legalább egy kation-cserélő kromatográfiás lépést foglal magában.
  25. 25. A 19., 20., 22. vagy 23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a reverzibilis kimopapain inhibitor peptid L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, LPhe-D-PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-L-PheOx, L28
    HU 211 746 A9
    Tyr-L-PheSc, L-Ala-L-ChaSc és L-Ala-L-LeuSc közül kiválasztott.
  26. 26. Kimopapain, amelynek ΒΑΡΝΑ-val (1 mM) szemben, 37 °C-on és pH 6,0-on fajlagos aktivitása legalább 1300 egység/mg és kevesebb mint 0,2%-ot 5 tartalmaz papaja proteináz III (PPIII), papaja és papaja proteináz IV (PPIV) mindegyikéből, és a leírás szerint a „PPIV és vele szemben specifikus ellenanyag előállítása” cím alatt közöltek szerint állítható elő.
HU95P/P00687P 1989-04-28 1995-06-30 Therapeutic agent HU211746A9 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB898909836A GB8909836D0 (en) 1989-04-28 1989-04-28 Therapeutic agent

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU211746A9 true HU211746A9 (en) 1995-12-28

Family

ID=10655944

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU903342A HUT58345A (en) 1989-04-28 1990-04-27 Process for producing pharmaceutically active material
HU95P/P00687P HU211746A9 (en) 1989-04-28 1995-06-30 Therapeutic agent

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU903342A HUT58345A (en) 1989-04-28 1990-04-27 Process for producing pharmaceutically active material

Country Status (34)

Country Link
US (2) US5380656A (hu)
EP (1) EP0470136B1 (hu)
JP (1) JPH04506003A (hu)
KR (1) KR920701241A (hu)
CN (1) CN1047340A (hu)
AT (1) ATE107660T1 (hu)
AU (1) AU631641B2 (hu)
BG (1) BG60916B1 (hu)
CA (1) CA2056402C (hu)
DD (1) DD296960A5 (hu)
DE (1) DE69010199T2 (hu)
DK (1) DK0470136T3 (hu)
EG (1) EG19583A (hu)
ES (1) ES2055427T3 (hu)
FI (1) FI914995A0 (hu)
GB (1) GB8909836D0 (hu)
GR (1) GR1001011B (hu)
HR (1) HRP930700A2 (hu)
HU (2) HUT58345A (hu)
IE (1) IE64351B1 (hu)
IL (1) IL94227A (hu)
IN (2) IN170683B (hu)
LT (1) LT3827B (hu)
LV (1) LV10200B (hu)
MX (1) MX20503A (hu)
NO (1) NO914206L (hu)
NZ (1) NZ233475A (hu)
PL (1) PL166810B1 (hu)
PT (1) PT93921B (hu)
RO (1) RO112032B1 (hu)
RU (1) RU2074891C1 (hu)
WO (1) WO1990013561A1 (hu)
YU (1) YU87090A (hu)
ZA (1) ZA903228B (hu)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8909836D0 (en) * 1989-04-28 1989-06-14 Boots Co Plc Therapeutic agent
EP0572547A1 (en) * 1991-02-22 1993-12-08 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company SUBSTITUTED $g(a)-AMINOALDEHYDES AND DERIVATIVES
CA2061861A1 (en) * 1991-03-04 1992-09-05 Jonathan Duvick Plant polypeptides with inhibitory activity towards pathogenic microorganisms
CN1060519C (zh) * 1991-05-09 2001-01-10 广西亚热带作物研究所 桄榔植物蛋白酶的提取方法
ES2112333T3 (es) * 1991-10-14 1998-04-01 Cash Eng Res Combinacion de control de admision para un sistema compresor.
US6753006B1 (en) 1993-02-22 2004-06-22 American Bioscience, Inc. Paclitaxel-containing formulations
WO1994028012A1 (en) * 1993-05-28 1994-12-08 Warner-Lambert Company Hydroxamate inhibitors of endothelin converting enzyme
JP2002538151A (ja) 1999-03-02 2002-11-12 ベーリンガー インゲルハイム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド カテプシンの可逆的インヒビターとして有用な化合物
KR100688740B1 (ko) * 1999-03-15 2007-02-28 액시스 파마슈티컬스 인코포레이티드 프로테아제 억제제로서의 ｎ-시아노메틸 아미드
US6420364B1 (en) 1999-09-13 2002-07-16 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Compound useful as reversible inhibitors of cysteine proteases
US6703040B2 (en) 2000-01-11 2004-03-09 Intralytix, Inc. Polymer blends as biodegradable matrices for preparing biocomposites
AU2003292755A1 (en) 2002-12-25 2004-07-22 Hirotaka Haro Remedy for degenerative intervertebral discs
US7169405B2 (en) * 2003-08-06 2007-01-30 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods and devices for the treatment of intervertebral discs
US20080069907A1 (en) * 2004-07-06 2008-03-20 Chikao Morimoto Compositions for Cancer Prevention, Treatment, or Amelioration Comprising Papaya Extract
CN1320111C (zh) * 2004-08-09 2007-06-06 王美岭 一种制备木瓜凝乳酶的方法
US20060241566A1 (en) * 2005-04-11 2006-10-26 Orthox, Llc Nucleus Extraction from Spine Intervertebral Disc
US7879027B2 (en) * 2006-04-24 2011-02-01 Warsaw Orthopedic, Inc. Controlled release devices for fusion of osteal structures
US7771414B2 (en) * 2006-04-24 2010-08-10 Warsaw Orthopedic, Inc. Controlled release devices for therapeutic treatments of spinal discs
US8642059B2 (en) 2006-04-24 2014-02-04 Warsaw Orthopedic, Inc. Controlled release systems and methods for intervertebral discs
US8642060B2 (en) * 2006-04-24 2014-02-04 Warsaw Orthopedic, Inc. Controlled release systems and methods for osteal growth
US20070265633A1 (en) * 2006-05-11 2007-11-15 Moon Jon K Implement and method to extract nucleus from spine intervertebral disc
US8257938B2 (en) * 2009-02-27 2012-09-04 Medical Diagnostic Laboratories, Llc Hemolysin and its protein fragments in sero-detection of Anaplasma phagocytophilum
WO2013038936A1 (ja) * 2011-09-13 2013-03-21 タカラバイオ株式会社 ペルオキシダーゼ反応の停止方法及び反応停止剤
WO2014004512A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Surmodics, Inc. Bioerodable poly(etheresteramides) and medical article uses

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE270723C (hu) *
US2313875A (en) * 1940-12-17 1943-03-16 Eugene F Jansen Proteolytic enzyme process
US3320131A (en) * 1964-10-23 1967-05-16 Baxter Laboratories Inc Method for the treatment of herniation of intervertebral discs
US3558433A (en) * 1967-11-07 1971-01-26 Baxter Laboratories Inc Process for purification of chymopapain
YU40433B (en) * 1975-02-20 1986-02-28 Lek Tovarna Farmacevtskih Process for obtaining pure, proteolytically active anzymes
DE3212846A1 (de) 1981-04-13 1982-11-04 Sintokogio, Ltd., Nagoya, Aichi Apparat und verfahren zum herstellen eines kerns
EP0065395B1 (en) * 1981-05-13 1988-08-24 BOOTS-FLINT, INC. (a Delaware corp.) Improved chymopapain and method for its production and use
US4439423A (en) * 1981-05-13 1984-03-27 Smith Laboratories, Inc. Chymopapain and method for its use
US4374926A (en) * 1981-05-13 1983-02-22 Smith Laboratories, Inc. Method for the production of improved chymopapain
US4719108A (en) * 1981-05-13 1988-01-12 Smith Laboratories, Inc. Chymopapain composition and method for its use
GB2124233B (en) * 1982-07-19 1985-09-18 Nat Res Dev Synthetic peptides and their preparation
GB2156821A (en) * 1984-04-03 1985-10-16 Simmons James W Process for purifying chymopapain
HU196624B (en) * 1986-12-08 1988-12-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Process for producing chymopapain with high specific activity
GB8909836D0 (en) * 1989-04-28 1989-06-14 Boots Co Plc Therapeutic agent

Also Published As

Publication number Publication date
GB8909836D0 (en) 1989-06-14
HU903342D0 (en) 1992-01-28
IN173230B (hu) 1994-03-12
ZA903228B (en) 1990-12-28
IL94227A0 (en) 1991-01-31
RO112032B1 (ro) 1997-04-30
US5468480A (en) 1995-11-21
CA2056402A1 (en) 1990-10-29
NO914206L (no) 1991-12-17
LT3827B (en) 1996-03-25
ATE107660T1 (de) 1994-07-15
DE69010199D1 (de) 1994-07-28
EP0470136B1 (en) 1994-06-22
DD296960A5 (de) 1991-12-19
US5380656A (en) 1995-01-10
IE64351B1 (en) 1995-07-26
MX20503A (es) 1993-12-01
CA2056402C (en) 1999-11-16
PT93921A (pt) 1990-11-20
HUT58345A (en) 1992-02-28
GR1001011B (el) 1993-03-31
DE69010199T2 (de) 1994-10-13
NZ233475A (en) 1991-10-25
KR920701241A (ko) 1992-08-11
PT93921B (pt) 1996-10-31
ES2055427T3 (es) 1994-08-16
EG19583A (en) 1995-09-30
LV10200A (lv) 1994-10-20
HRP930700A2 (en) 1995-06-30
GR900100315A (en) 1991-09-27
RU2074891C1 (ru) 1997-03-10
JPH04506003A (ja) 1992-10-22
EP0470136A1 (en) 1992-02-12
IN170683B (hu) 1992-05-02
NO914206D0 (no) 1991-10-25
AU5547290A (en) 1990-11-29
IE901538L (en) 1990-10-28
AU631641B2 (en) 1992-12-03
FI914995A0 (fi) 1991-10-23
LV10200B (en) 1995-04-20
PL166810B1 (pl) 1995-06-30
CN1047340A (zh) 1990-11-28
IL94227A (en) 1994-12-29
LTIP1645A (en) 1995-07-25
BG60916B1 (bg) 1996-06-28
YU87090A (sh) 1992-09-07
WO1990013561A1 (en) 1990-11-15
DK0470136T3 (da) 1994-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU211746A9 (en) Therapeutic agent
AU661270B2 (en) Chymotrypsin-like proteases and their inhibitors
AU593820B2 (en) Novel polypeptides with a blood coagulation-inhibiting action, processes for their preparation and isolation, their use and agents containing them
Holmes et al. The protein phosphatases involved in cellular regulation: Primary structure of inhibitor‐2 from rabbit skeletal muscle
Hunt et al. Abnormal human haemoglobins VI. The chemical difference between haemoglobins A and E
JPS6322027A (ja) セリンプロテア−ゼ阻害剤
Lenarc̆ic̆ et al. Pig leukocyte cysteine proteinase inhibitor (PLCPI), a new member of the stefin family
Bisaccia et al. Transmembrane topography of the mitochondrial oxoglutarate carrier assessed by peptide-specific antibodies and enzymic cleavage
Andreatta et al. Mechanism of action of thrombin on fibrinogen, I. Synthesis of fibrinogen-like peptides, and their proteolysis by thrombin and trypsin
MOLLAY et al. Isolation of a dipeptidyl aminopeptidase, a putative processing enzyme, from skin secretion of Xenopus laevis
Jany et al. Amino acid sequence of an insect chymotrypsin from the larvae of the hornet, Vespa orientalis
Sturrock et al. Limited proteolysis of human kidney angiotensin-converting enzyme and generation of catalytically active N-and C-terminal domains
JP2003501012A (ja) ボツリヌス菌毒素ｂ及び破傷風菌神経毒素の特異的阻害剤及び治療薬としてのプレビン類
JP2947882B2 (ja) ヘメンテリアギリアニイという南アメリカ蛭からの抗転移素、ギランテン
IL43751A (en) Des-lys29-ala30-insulins and their preparation
Majer et al. Structure-based specificity mapping of secreted aspartic proteases of Candida parapsilosis, Candida albicans, and Candida tropicalis using peptidomimetic inhibitors and homology modeling
JPH0813271B2 (ja) 線溶活性蛋白質およびその製造法
BP Athauda et al. Inhibition of cathepsin E by a2-macroglobulin and the resulting structural changes in the inhibitor
JPH0427997B2 (hu)
Desnuelle et al. ON THE TERMINAL RESIDUES OF CHYMO-TRYPSINOGEN, CHYMOTRYPSINS, TRYPSI-NOGEN AND TRYPSIN
Gingivalis et al. 76 76 Proteolysis in Cell Functions VK Hopsu-Havu et al.(Eds.) IOS Press, 1997