PL166810B1 - Sposób oczyszczania chymopapalny PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób oczyszczania chymopapainy polegajacy na A. a) inkubowaniu wodnego roz- tworu surowej chymopapainy z substancja podstawowa chromatografii i b) eluowaniu chymo- papainy eluentem lub B. 1 . wytracaniu wodnej mieszaniny zawierajacej surowa chymopapaine, 2. oddzielaniu wodnego roztworu surowej chymopapainy od mieszaniny i 3. zobojetnianiu i ewentualnym odsalaniu roztworu surowej chymopapainy lub C. i) wytracaniu wodnej miesza- niny zawierajacej surowa chymopapaine, ii) oddzielaniu wodnego roztworu surowej chymopa- painy od mieszaniny, iii) zobojetnianiu i ewentualnym odsalaniu roztworu surowej chymopa- painy, iv) inkubowaniu roztworu otrzymanego z etapu (iii) z substancja podstawowa i v) eluowaniu chymopapainy eluentem, znamienny tym, ze w A. a) i C. iv) jako substancje podsta- wowa chromatografii stosuje sie substancje o powinowactwie chromatograficznym ukierunko- wanym na miejsce aktywne zawierajaca kowalencyjnie sprzezone podloze substancji podstawo- wej, ewentualnie przez czynnik odleglosciowy z koncem N peptydu odwracalnie inhibitujacego chymopapaine, przy czym peptyd wiaze sie z miejscem aktywnym czasteczki chymopapainy, a w B. 1. wodna mieszanine zawierajaca surowa chymopapaine wytraca sie przy wartosci pH od 1,2 do 1,8. P L 1 6 6 8 1 0 B 1 PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania chymopapainy, która ma zastosowanie wytwarzania kompozycji farmaceutycznych zawierających chymopapainę do leczenia uszkodzonych, przepuklinowych lub inaczej nieprawidłowych kolcowych krążków międzykręgowych u ssaków. Leczenie polega na wstrzykiwaniu do dysków roztworów kompozycji zawierającej oczyszczoną chymopapainę.

Chymopapaina jest proteinazą cysteinową obecną w lateksie rośliny Carica papaya. Stwierdzono jej przydatność kliniczną, zwłaszcza w leczeniu wypadnięcia lub przepukliny dysku lub rwy kulszowej sposobem znanym jako „chemonukleoliza, L. Smith (1964), J. Amer. Med. Assoc. 187, 137-140.

Oczyszczanie i charakteryzację chymopapainy po raz pierwszy przeprowadzili Jansen i Balls (1941), J. Biol. Chem., 137, 405-417, którzy dla wytworzenia enzymu zastosowali procedurę wytrącania kwasem i wysalania. Później zastosowano metody oczyszczania bazującej na chromatografii jonowymiennej. Tak więc, na przykład w opisach patentowych GB 2098997 i GB 2156821 opisano zastosowanie żywic kationowymiennych w celu oddzielenia chymopapainy od innych znanych proteinaz cysternowych i oba te procesy zostały zastosowane na skalę przemysłową do wytwarzania chymopapainy. Stwierdzono jednakże, że otrzymywany materiał ma stosunkowo niską aktywność specyficzną w porównaniu z chymopapainą otrzymaną przez Buttle'a i Barretta (1984), Biochem. J., 223, 81-88 w wieloetapowym procesie na małą skalę obejmującym etap chromatografii kationowymiennej. Mimo, że materiał ten miał wysoką aktywność specyficzną otrzymany został z bardzo niskimi zaledwie wydajnościami, a sposób nie nadawał się do stosowania na skalę przymysłową. Obecnie Buttle i wsp., Biochem. J. (lipiec 1989) 261469-476, stwierdzili, że materiał ten jest zanieczyszczony niedawno wyodrębnioną i scharakteryzowaną proteinazą, papaya proteinazą IV, która współeluuje z chymopapainą z żywic kationowymiennych. Chromatografia kationowymienna nie pozwala na oddzielenie chymopapainy od papaya proteinazy IV w stopniu pozwalającym na otrzymanie chymopapainy praktycznie wolnej od zanieczyszczenia papaya proteinazą IV.

Literatura podaje również metody zastosowania etapów chromatografii na zasadzie powinowactwa. Polgar (1981), Biochem. Biophys. Acta, 658,262-269 opisuje oczyszczanie chymopapainy przy użyciu, wśród innych technik, powinowactwa chromatograficznego w kolumnie agarozowo166 810 rtęciowej, a Dubois i wsp., Biol. Chem. Hoppe-Seyler (1988), 369,733-740 relacjonuje oddzielenie proteinaz cysteinowych z lateksu Carica papaya przy użyciu podobnej techniki. Ten typ powinowactwa chromatograficznego polega na wzajemnym oddziaływaniu na siebie ligandów rtęciowych połączonych z obojętną substancją podstawową i grup tiolowych wystawionych na ich działanie protein. Zatem proteiny inne niż chymopapaina, zwłaszcza inne proteinazy cysteinowe, takie jak papaya proteinaza IV, może przyłączać się do takich kolumn i może następnie być współeluowana z chymopapainą.

Ostatnio doniesienia naukowe opisują zastosowanie powinowactwa chromatograficznego z zastosowaniem unieruchomionych pochodnych peptydowych do oczyszczania specyficznych proteinaz, takich jak katepepsyna ludzka B (Rich i wsp., 1986, Biochem. J., 235,731-734) i histolizyna z Entamoeba histolytica (Luaces i Barrett, 1988, Biochem. J., 250,903-909). Tego podejścia dotychczas nie stosowano do oczyszczania chymopapainy i potrzeba udoskonalonego sposobu oczyszczania chymopapainy odpowiedniego do stosowania w skali przemysłowej pozostaje oczywista.

Obecnie znaleziono nowy sposób oczyszczania i wyodrębniania wysoce aktywnej chymopapainy wolnej od zanieczyszczeń, a zwłaszcza wolnej od innych proteinaz cysteinowych obecnych w lateksie papaya, łącznie z proteinazą papaya IV.

Sposobem według wynalazku otrzymuje się chymopapainę, która jest praktycznie czysta i zawiera wysoki udział aktywnej postaci enzymu.

Chymopapaina otrzymana sposobem według wynalazku jest praktycznie wolna od odległych immunologicznie proteinaz występujących w lateksie papaya, mianowicie papainy, proteinazy papaya III (PPIII), opisanych przez Buttle'a i Barretta (1984) Biochem. J., 223, 81-88, a w szczególności ostatnio odkrytej proteinazy papaya IV (PPIV). Stosowane tu określenie „praktycznie czysta może być dalej definiowane jako „praktycznie immunologicznie czysta i dotyczy braku jakiejkolwiek znaczącej reakcji między chymopapainą oczyszczoną sposobem według wynalazku a specyficznymi przeciwciałami wyhodowanymi przeciw czystej PPIV, wyodrębnionej i charakteryzowanej przez Buttle'a i wsp., Biochem. J. (lipiec 1989), 261,469-476 i pokrótce opisanej poniżej, jak również braku jakiejkolwiek znaczącej reakcji ze specyficznymi przeciwciałami wyhodowanymi przeciw papainie i PPIII, uprzednio opisanej przez Buttle'a i Barretta (1984) loc cit. Należy zwrócieć szczególną uwagę, że tak zwana czysta chymopapaina otrzymana metodą Buttle'a i Barretta zawiera, jak stwierdzono, znaczne ilości (około 14%) PPIV i stąd preparat przeciwciała przeciw chymopapainie pierwotnie przez nich wyhodowany był specyficzny zarówno dla chymopapainy oczyszczonej sposobem według wynalazku i dla oczyszczonej PPIV. Korzystnie chymopapaina otrzymana sposobem według wynalazku zawiera mniej niż 1% wagowy, korzystniej mniej niż 0,2% wagowych, najkorzystniej nie więcej niż 0,1% każdego z PPIV, PPIII i papainy.

Reakcja między antygenem i przeciwciałem może być określona dobrze znanymi metodami tradycyjnymi. Metody takie obejmują stapianie pod wpływem immunoelektroforezy i podwójna immunodyfuzja [opisane przez Buttle'a i Baretta (1984), loc. cit.], pojedyncza radialna próba immunologiczna, próba radioimmunologiczna (RIA) i wiążąca enzym próba immunosorbentowa (ELISA).

Ilość enzymu aktywnego obecnego w każdym preparacie enzymatycznym wykazywana jest na ogół jako jego aktywność specyficzna wobec specyficznego podłoża w specyficznych warunkach próby. Określenie „specyficzna aktywność przeciw ΒΑΡΝΑ, stosowane tutaj, oznacza aktywność proteinazy w pikomolach p-nitroaniliny utworzonej na sekundę na mg suchej masy produktu (pmol/sek/mg) podczas oznaczania na syntetycznym podłożu p-nitroanilinowym N-a-benzoiloDL-argininy (ΒΑΡΝΑ) w standardowych warunkach próby. Warunki standardowej próby stosowane dla znanych preparatów farmaceutycznych chymopapainy szczegółowo opisano poniżej jako „Metoda nr 1 próby ΒΑΡΝΑ lub „próba Smitha, a pochodzące stąd specyficzne aktywności określane są jako specyficzne aktywności przeciw ΒΑΡΝΑ (1 mM) w temperaturze 37°C i pH 6,0. Chymopapaina oczyszczona sposobem według wynalazku określana jest jako mająca specyficzną aktywność przeciw ΒΑΡΝΑ (1 mM) w temepraturze 37°C i pH 6,0 co najmniej 750jednostek na mg. Na ogół chymopapaina oczyszczona sposobem według wynalazku ma specyficzną aktywność

166 810 przeciw ΒΑΡΝΑ (1 mM) między 800 a 1700 jednostek na mg, korzystnie między 1000 a 1700 jednostek na mg, na przykład 1200 do 1500 jednostek na mg, gdy pomiar przeprowadza się w temperaturze 37°C i pH 6,0. Korzystnie otrzymuje się sposobem według wynalazku oczyszczoną chymopapainę mającą specyficzną aktywność przeciw ΒΑΡΝΑ (1 mM) w temperaturze 37°C i pH 6,0, wynoszącą co najmniej 1300 jednostek na mg.

Mimo, że aktywność proteinazy jest bardzo szeroko definiowana w całej literaturze dotyczącej chymopapainy i innych proteinaz cysteinowych przez uwalnianie p-nitroaniliny z syntetycznego podłoża ΒΑΡΝΑ, powstają problemy gdy dochodzi do bezpośredniego porównania między cytowanymi liczbami specyficznej aktywności. Otrzymane precyzyjne wartości zależą od wielu czynników dotyczących zwłaszcza szczegółowych warunków, na przykład pH, temperatury, składu buforu i stężenia podłoża stosowanego w próbie. Buttle i Barrett (1984), loc. cit. w swoich pracach podali, że sporządzona przez nich chymopapaina ma specyficzną aktywność przeciw ΒΑΡΝΑ 0,154μιη/min/kg, co równa się 2567 pmol/sek/mg. Jednakże warunki oznaczenia przez Buttle'a i Barretta różniły się od znanych oznaczeń farmaceutycznych jakości chymopapainy i dlatego nie można bezpośrednio porównywać aktywności specyficznych.

Ponieważ materiał sporządzony przez Buttle'a i Barretta jak sądzono, jest preparatem chymopapainy mającym najwyższą dotychczas podawaną aktywność specyficzną, początkowe prace dotyczące sposobu według wynalazku były prowadzone w warunkach wyszczególnionych w ich pracach. Metoda ta jest nazywana tutaj Metodą nr 2 próby ΒΑΡΝΑ, a pochodzące od niej aktywności specyficzne przeciw ΒΑΡΝΑ (2,5 mM) w temperaturze 40°C i pH 6,8 zostały oznaczone w warunkach próby wyraźnie różnych niż stosowane przy preparatach farmaceutycznych chymopapainy. pokazano, że wyniki otrzymane przy użyciu tej próby są dwu do trzykrotnie wyższe niż wyniki otrzymane tradycyjną farmaceutyczną Metodą nr 1 próby ΒΑΡΝΑ, chociaż z naukowego punktu widzienia nie jest prawidłowe użycie pojedynczego czynnika dla przekształcenia wyników otrzymanych z jednej metody oznaczenia na inną. Tym niemniej wczesne prace dotyczące sposobu według wynalazku wykazały specyficzną aktywność przeciw ΒΑΡΝΑ (2,5 mM), w temperaturze 40°C przy pH 6,8 czystej chymopapainy otrzymanej sposobem według wynalazku, że aktywność może być określona jako co najmniej 2500 jednostek/mg, korzystnie między 3000 a 4500 jednostek/mg. W korzystnym przypadku otrzymuje się chymopapainę mającą specyficzną aktywność przeciw ΒΑΡΝΑ (2,5 mM), 40°C i pH 6,8 co najmniej 3000 jednostek/mg.

Twórcy wynalazku w ostatnio opublikowanej pracy (lipiec 1989, loc. cit.) w skrócie opisanej poniżej, opisali usuwanie i scharakteryzowanie uprzednio nieznanego zanieczyszczenia chymopapainy wytworzonej znanymi sposobami, mianowicie proteinazę papaya IV (PPIV). Mimo, że PPIV jest nieaktywna przeciw ΒΑΡΝΑ, to ma ona aktywność proteinazową przeciw azokazeinie. Ponadto, stwierdzono, że aktywność PPIV przeciw azokazeinie w zasadzie nie jest inhibitowana przez cystatynę kurcząt w stężeniu do 1μΜ. Aktywność przeciw azokazeinie chymopapainy oczyszczonej sposobem według wynalazku jest co najmniej w 95% inhibitowana przez stężenia cystatyny kurcząt. Wyrażenie „aktywność przeciw azokazeinie stosowane tutaj oznacza aktywność proteinazy w rozumieniu peptydów rozpuszczalnych przez kwas trójchlorooctowy, utworzonych na jednostkę czasu na jednostkę suchej masy produktu, gdy oznaczenie prowadzi się z derywatyzowanym, białkowym substratem azokazeinowym w standardowych warunkach próby opisanych poniżej. Korzystnie, chymopapaina oczyszczona sposobem według wynalazku ma aktywność przeciw azokazeinie, która wynosi co najmniej 97%, a zwłaszcza 98-100% inhibitowaną przez cystatynę kurcząt w stężeniach do 1 μΜ.

Sposób oczyszczania chymopapainy polegający na A. a) inkubowaniu wodnego roztworu surowej chymopapainy z substancją podstawową chromatografii i b) eluowaniu chymopapainy eluentem lub B. 1. wytrącaniu wodnej mieszaniny zawierającej surową chymopapainę, 2. oddzielaniu wodnego roztworu surowej chymopapainy od mieszaniny i 3. zobojętnianiu i ewentualnym odsalaniu roztworu surowej chymopapainy lub C. i) wytrącaniu wodnej mieszaniny zawierającej surową chymopapainę, ii) oddzielaniu wodnego roztworu surowej chymopapainy od mieszaniny, iii) zobojętnianiu i ewentualnym odsalaniu roztworu surowej chymopapainy, iv) inkubowaniu roztworu otrzymanego z etapu (iii) z substancją podstawową i v) eluowaniu chymopapainy

166 810 eluentem, zgodnie z wynalazkiem polega na tym, że w A. a) i C. iv) jako substancję podstawową chromatografii stosuje się substancję o powinowactwie chromatograficznym ukierunkowanym na miejsce aktywne zawierającą kowalencyjnie sprzężone podłoże substancji podstawowej, ewntualnie przez czynnik odległościowy z końcem N peptydu odwracalnie inhibitującego chymopapainę, przy czym peptyd wiąże się z miejscem aktywnym cząsteczki chymopapainy, a eluent w b) przerywa wiązanie między unieruchomionym peptydem inhibitującym i związaną z nim chymopapainą, w B. 1. wodną mieszaninę zawierającą surową chymopapainę wytrąca się przy wartości pH od 1,2 do 1,8.

Korzystnie, zgodnie ze sposobem według wynalazku stosuje się co najmniej jeden etap chromatografii kationo wymiennej.

Chymopapaina oczyszczona sposobem według wynalazku jest praktycznie czystą chymopapainą otrzymaną po raz pierwszy bez zanieczyszczających białek i zawierającą wysoki udział aktywnej formy enzymu. Ten wyłom mógł być osiągnięty jedynie dzięki odkryciu, że zanieczyszczające białko było dotychczas wspólnie „oczyszczane wraz z chymopapainą, na przykład na kolumnach działających na zasadzie wymieniaczy jonowych i znanego powinowactwa. Dalsze prace prowadziły do wyodrębnienia i scharakteryzowania takiego zanieczyszczenia jak PPIV. Sposób stosowany do otrzymywania PPIV nie nadawał się do wytwarzania czystej chymopapainy, ale wytworzenie PPIV zapewniło dwa ważne parametry, dzięki którym można scharakteryzować czystą chymopapainę, a mianowicie 1) brak reaktywności czystej chymopapainy z przeciwciałami specyficznymi wobec PPIV i 2) zróżnicowanie aktywności czystej chymopapainy i PPIV wobec azokazeiny w obecności cysteiny kurczęcej. Te dwie charakterystyczne cechy stanowiły podstawowe narzędzia potrzebne do opracowania sposobu odpowiedniego do oczyszczania chymopapainy.

Łatwo zauważyć, że chymopapaina przez oczyszczanie według wynalazku będzie chymopapainą z wyboru prawie we wszystkich wyobrażanych dziedzinach aktywności. Czyste preparaty enzymu mają życiowe znaczenie tam, gdzie chodzi o pełne scharakteryzowanie enzymów, na przykład w odniesieniu do ich katalitycznej specyficzności i budowy.

Oczyszczona chymopapaina ma specyficzną aktywność przeciw BAPNA (1 mM) w temperaturze 37°C ipH 6,0, co najmniej 750 jednostek na mg. Kompozycje zawierające jako substancję czynną oczyszczoną chymopapainę mogą mieć postać oddzielnych jednostek o odpowiedniej masie, na przykład w postaci działek chymopapainy zamkniętych w bezwodnych warunkach, takich jak odpowietrzone fiolki lub ampułki. Kompozycje takie mogą poza tym zawierać środek redukujący, taki jak dwutiotreitol, wolną zasadę cysternową lub jej sól addycyjną z kwasem, w celu istotnego zapobieżenia dezaktywacji enzymu przez utlenienie. Alternatywnie kompozycje mogą ponadto zawierać odwracalny inhibitor proteinazy cysteinowej w postaci soli, takiej jak na przykład tetrationian sodu lub chlorek rtęciowy. Te odwracalne inhibitory blokują aktywne miejsce enzymu, zapobiegając tym sposobem jego dezaktywacji przez utlenienie, aż do zastąpienia przez na przykład środek redukujący, który reaktywuje enzym. Mogą być ewentualnie dodane inne tradycyjne dodatki, na przykład środki konserwujące, takie jak siarczyn sodu, środki chelatujące takie jak EDTA i nośniki, takie jak chlorek sodu.

Stosowanie czystego preparatu enzymu jest szczególnie ważne w klinicznych zastosowaniach chymopapainy, na przykład chemonukleolizie, gdzie podaje się, że prawie 3% leczonych pacjentów wykazuje reakcje alergiczne na takie leczenie. Sproszkowany ekstrakt papaya jest szeroko stosowany w przemyśle spożywczym i przypuszcza się, że wiele z alergicznych reakcji na chemonukleolizę wynika z uprzedniego uczulenia na takie preparaty. Jednakże wiadomo jest, że iniekcja obcych antygenów białkowych ssakom zawsze niesie za sobą ryzyko szoku anafilaktycznego. Zgodne jest z praktyką medyczną stosowanie najczystszych i najbardziej aktywnych postaci każdej takiej proteiny, która jest dostępna w celu osiągnięciu optymalnych wyników, jak również zmniejszenia do minimum ryzyka reakcji alergicznych.

166 810

Tak więc, stosując oczyszczoną chymopapainę można uzyskać kompozycje farmaceutyczne praktycznie wolne od PPIV. Korzystnie chymopapaina ma aktywność specyficzną przeciw ΒΑΡΝΑ (1 mM) w temperaturze 37°C i pH 6,0 wynoszącą co najmniej 750 jednostek na mg. Kompozycje farmaceutyczne zawierające chymopapainę korzystnie zawierają poza nią farmaceutycznie dopuszczalny, nietoksyczny środek redukujący, taki jak cysteina w postaci wolnej zasady lub jej soli addycyjnej z kwasem, na przykład jednowodzian chlorowodorku L-cysteiny. Na ogół środek redukujący stanowi na przykład 15-90% wagowych chymopapainy i jest obecny w ilości około 0,5-3 mg na 4000 jednostek chymopapainy. Jednakże kompozycje farmaceutyczne mogą ponadto zawierać, w razie potrzeby, dowolny, tradycyjny, farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik, zaróbkę lub nośnik, na przykład środki konserwujące, takie jak siarczyn sodu, środki chelatujące, takie jak EDTA i nośniki, takie jak chlorek sodu.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające chymopapainę oczyszczoną sposobem według wynalazku mogą być stosowane w oftalmologii, na przykład w leczeniu uszkodzeń oka lub usuwania obumarłej tkanki ze strupów, na przykład z oparzeń, wrzodów, martwic ciśnieniowych, odleżyn i innych zranień i ran, w których obecne są obumarłe tkanki. Takie kompozycje na ogół sporządza się w postaci odpowiedniej do zastosowań zewnętrznych, na przykład roztworów sterylnych, żelów, zawiesin lub maści, które mogą być stosowane bezpośrednio na ranę lub mogą być stosowane w postaci opatrunków impregnowanych kompozycją.

Korzystnie chymopapaina oczyszczona sposobem według wynalazku jest przeznaczona do zastosowań ortopedycznych. Takie kompozycje farmaceutyczne mogą być dogodnie sporządzone w postaci pojedynczych dawek do podawania pozajelitowego, na przykład w postaci sterylnych, wolnych od ciał pirogennych roztworów lub zawiesin w odpowiednim nośniku lub w postaci skoncentrowanej, odpowiedniej do rozdrobnienia przed użyciem. Postacie pojedynczych dawek odpowiednich do rozpuszczenia lub leczenia jądrowego miąższu nieprawidłowego lub uszkodzonego międzykręgowego dysku poprzez iniekcję do niego kompozycji mogą zawierać między 500 a 5000 jednostek ΒΑΡΝΑ (oznaczenie ΒΑΡΝΑ z 1 mM, w 37°C i pH 6,0) chymopapainy oczyszczonej sposobem według wynalazku i środek redukujący, taki jak chlorowodorek cysteinianu sodu opakowane w odpowietrzone fiolki. Korzystne postacie pojedynczych dawek nominalnie zawierają 2000 lub 4000 jednostek ΒΑΡΝΑ (1 mM ΒΑΡΝΑ, temperatura 37°C, pH 6,0) chymopapainy. Szerzej, forma pojedynczej dawki może składać się na przykład z 2-5 mg, korzystnie 2,5-3,5 mg chymopapainy i 0,2-3 mg, korzystnie 1,0-2,0 mg chlorowodorku cysteinianu sodu opakowanych w odpowietrzony pojemnik, ewentualnie w mieszaninie z odpowiednim nośnikiem, takim jak chlorek sodu.

W próbkach opisanych poniżej stwierdzono, że 26 indywidualnych próbek surowicy ma naturalnie nabyte przeciwciała IgE przeciw dostępnemu w handlu preparatowi chymopapainy Chymodiactm , produkowanemu zgodnie ze sposobem opisanym w GB 2098997. Doświadczalnie wykazano tu, że te surowice zawierają przeciwciała IgE wobec chymopapainy oczyszczonej sposobem według wynalazku i trzech innych proteinaz cysteinowych znalezionych w lateksie papaya, mianowicie papainy, PPIII i PPIV. Jednakowoż uśredniono poziomy IgE dla chymopapainy, PPIII i PPIV wykazały, że na PPIII i PPIV razem przypada prawie 75% wykrytej IgE. Wyniki te jasno wskazują, że białka te mają zasadniczy charakter immunologiczny i mogą reprezentować główny udział antygenicznych determinantów zawartych w dotychczas dostępnych postaciach chymopapainy i stanowić nieoczekiwanie duże potencjalne ryzyko antygenowe. Zatem kompozycje farmaceutyczne z chymopapainą oczyszczoną sposobem według wynalazku są znacznie korzystniejsze od znanych kompozycji.

Leczenie za pomocą chemonukleolizy uszkodzonych, przepuklinowych lub inaczej nieprawidłowych kolcowych dysków międzykręgowych u ssaków obejmuje wstrzyknięcie do tego dysku farmaceutycznie dopuszczalnego roztworu oczyszczonej chymopapainy w ilości wystarczającej do selektywnego rozpuszczenia części tego dysku.

166 810

Ί

Sposób leczenia nieprawidłowych dysków rdzeniowych u ssaków obejmuje:

i) wprowadzenie igły do tego dysku, ii) potwierdzenie umieszczenia tej igły za pomocą promieni X i iii) wstrzyknięcie do dysku farmaceutycznie dopuszczalnego roztworu chymopapainy w ilości wystarczającej do selektywnego rozpuszczenia części tego dysku.

Jak wspomniano, sposób oczyszczania chymopapainy według wynalazku obejmuje:

a) inkubowanie roztworu wodnego surowej chymopapainy z substancją podstawową o powinowactwie chromatograficznym ukierunkowanym na miejsce aktywne zawierającą kowalencyjnie sprzężone podłoże substancji podstawowej, ewentualnie poprzez czynnik odległościowy, z końcem N peptydu odwracalnie inhibitującego chymopapainę, tak żeby peptyd ten przyłączył się do miejsca aktywnego cząsteczki chymopapainy i

b) eluowanie chymopapainy odpowiednim eluentem.

Jako surową chymopapainę stosowaną jako materiał wyjściowy do oczyszczania chymopapainy sposobem według wynalazku stosuje się ekstrakt ze świeżego lateksu papaya, roztwór otrzymany z dostępnego w handlu preparatu lateksu suszonego przez rozpylanie, koncentrat papainowy lub częściowo oczyszczoną chymopapainę lub roztwór handlowego preparatu tak zwanej czystej chymopapainy. Jednakże należy zauważyć, że stosunkowo kompletne ekstrakty papaya, takie jak lateks papaya, będą zawierały bardzo znaczne ilości innych, występujących w naturze składników, które pragnie się usunąć. Korzystnie istotny udział takich komponentów usuwa się przed poddaniem inkubacji surowego roztworu chymopapainy z substancją podstawową o powinowactwie chromatograficznym, na przykład przee fili^^ację luu oowirowaniew celuusuuięcia materiału nierozpuuzcznlnero. Stwierdzono jednakże, że uyhyeróloie korzystny jest etap wytrącania kwasem, w trakcie którego wytrąca się zonczoą cz-ść edoiecekuzczeń.

Procedury wytrącnnin kwasem, w których pH wodnego roztworu surowej chymopapainy było obniżane do zaledwie pH 2, a roztwór pozostawiono do odstania, a onutępoie wydzielanie roztworu chymoocociny, były stosowane do oczyszczania chymopapdmk przez prawie 50 lat. Nieoczekiwanie zauważono, że dokłane pH stosowane w takich procedurach wpływa decydująco na zdniecyyszczenie otrzymanego roztworu chymooapainy PPIV. Staranne monitorowanie i regulowanie tego postępowania uważano dotychczas za wstępny z grubsza etap przy oczyszczaniu chymopaoaioy, okazało si- tymczasem bardzo ważnym etapem, który wyraźnie redukuje zanieczyszczenie PPIV, białka, które jak stwierdzono, przechodzi proces oczyszczania prowadzonego tradycyjnie razem z crymooαoαioą. Zgodnie z tym sposób oczyszczania chymopdOdiny obejmuje:

i) wytrącenie wodnej mieszanmy zawierającej surową chymoodpainę przy wartości pH od 1,2 do 1,8, ii) oddzielenie wodnego roztworu surowej crymopaoainy od mieszaniny orae iii) zobojętnienie i ewentualnie odsalanie roztworu surowej chkmooapaiok.

Korzystne jest usunięcie każdego pozostałego białka z preparatu przez włączenie co najmniej jednego tradycyjnego etapu chromatografii kationowymieooej w trakcie procesu oczyszczania, na przykład takiego jak opisany przez Buttle'a i Barretta (1984), loc. cit. Szczególnie korzystne jest zastosowanie jako końcowego etapu wysokowydajnej chromatografii, na przykład FPLC^R na żywicy kαtiooowymienoej, takiej jak sprzedawana pod nazwą Mono-S lub SepharoseR HP (Prarmacia).

Sposób oczyszczania chymopaocioy obejmuje zgodnie z wynalazkiem:

C. i) wytrącenie kwasem wodnej mieseαomk zawierającej surową chkmooαoaioę, korzystnie przy wartości pH od 1,2 do 1,8, ii) oddzielenie wodnego roztworu surowej chymopaoαioy od mieszanmy, iii) zobojętnianie i ewentualnie odsalanie roztworu surowej chkmopaoaioy, iv)

166 810 inkubowanie roztworu otrzymanego z etapu (iii) z substancją podstawową o powinowactwie chromatograficznym ukierunkowanym na miejsce aktywne zawierającą kowalencyjnie sprzężone podłoże substancji podstawowej, ewentualnie przez czynnik odległościowy, z końcem N peptydu odwracalnie inhibitującego chymopapainę, przy czym peptyd wiąże się z miejscem aktywnym cząsteczki chymopapainy i

v) eluowanie chymopapainy eluentem.

Dla fachowca będzie oczywiste, że korzystny etap chromatografii kationowymiennej może być alternatywnie albo dodatkowo stosowany, w razie potrzeby, przed lub po etapie chromatografii bazującej na powinowactwie.

Wodna mieszanina zwierająca surową chymopapainę może zawierać na przykład świeży lateks papaya, lateks papaya suszony rozpyłowo lub koncentrat papaino wy (na przykład lateks suszony rozpyłowo dostępny z firmy Powell i Scholefield, W. B., lub Siebels St. Zj. Am.) zawieszony w wodzie lub wodnym buforze, takim jak bufor fosforanowy lub octowy. Korzystnie materiał nierozpuszczalny usuwa się w sposób tradycyjny, na przykład przez filtrację lub odwirowanie, przed wytrąceniem mieszaniny na kwaśno. Mieszaninę można zakwaszać przez stopniowe dodawanie kwasu organicznego lub nieorganicznego, korzystnie wodnego kwasu nieorganicznego takiego jak kwas solnym w celu obniżenia pH mieszaniny do pomiędzy 1,2 i 1,8, korzystniej do pH około 1,5. Wytrącony materiał można usunąć w sposób tradycyjny, na przykład przez odsączenie lub odwirowanie. Otrzymany kwaśny roztwór surowej chymopapainy, jest jak stwierdzono zubożony w PPIV, papainę i w mniejszym zakresie w PPIII.

Przed poddaniem kwaśnego roztworu surowej chymopapainy jakiemukolwiek dalszemu etapowi chromatografii istnieje potrzeba zobojętnienia roztworu reagentem alkalicznym, takim jak wodny roztwór wodorotlenku sodu i korzystnie usunięcia nadmiaru soli z roztworu w znany sposób, na przykład przez filtrację na żelu lub dializę. Każdy dalszy wytrącony materiał może być usunięty przez odsączenie lub odwirowanie.

W odniesieniu do proteinaz cysternowych wiadomo, że aktywność takich enzymów może być znacznie zwiększona przez aktywowanie środkiem redukującym, takim jak dwutiotreitol lub cysteina i przez usunięcie śladów metali ciężkich, takich jak rtęć, środkiem chelatującym, takim jak EDTA lub żywica chelatująca, jak żywica sprzedawana pod nazwą handlową Chelax (Bio-Rad, W. Bryt.). Takie wielkości optymalizuje obecność wolnych grup tiolowych, o których wiadomo, że są istotnymi cechami aktywnych miejsc proteinaz cysternowych i są wymagane dla aktywności. Korzystnie, usunięcie metali ciężkich osiąga się przez dializę wobec buforu zawierającego EDTA. Alternatywnie, tam gdzie stosuje się etap chromatografii kationowymiennej, metale ciężkie można usunąć przez aktywowanie chymopapainy środkiem redukującym, podczas gdy jest ona związana w kolumnie kationowymiennej i następnie przemycie kolumny.

Korzystnie roztwór surowej chymopapainy otrzymany po zobojętnieniu zadaje się środkiem redukującym, takim jak cysteina, dla zapewnienia maksymalnego wystawienia miejsc aktywnych i rozcieńcza się do odpowiedniej zawartości białka, na przykład 30 mg/ml. Zobojętniony roztwór surowej chymopapainy inkubuje się następnie z substancją podstawową o powinowactwie chromatograficznym skierowanym na miejsce aktywne taką, że chymopapaina zostaje specyficznie związana, poprzez miejsce aktywne z przyłączonym do niego peptydem inhibitującym. Roztwór chymopapainy można stosować do kolumny substancji podstawowej o powinowactwie chromatograficznym z szybkością na przykład 35-40 ml/godzinę/cm². Na litr substancji podstawowej o powinowactwie chromatograficznym może być związane 1-4 g chymopapainy.

Substancja podstawowa o powinowactwie chromatograficznym zawiera substancję podstawową podłoża, taką jak żel lub substancję podstawową membranową, z którą inhibitujący peptyd jest sprzężony kowalencyjnie i w ten sposób unieruchomiony. Korzystną substancją podstawową jest żel agarozowy, taki jak sprzedawany pod nazwą Sepharose^R (Pharmacia), chociaż mogą być również stosowane substancje podstawowe pochodzące od membran celulozowych, takie jak sprzedawane pod nazwą Zeta (Anachem). Peptyd z końcowym N może być przyłączony do podłoża substancji podstawowej bądź bezpośrednio bądź pośrednio przez czynnik odległościowy, na przykład czynnik odległościowy o dziewięciu atomach węgla, taki jak przewidziany przez korzystną,

166 810 żelową substancję podstawową sprzedawaną pod nazwą handlową ECH Sepharose” 4B (Pharmacia). Sprzężenie między wolnymi grupami karboksylowymi tej żelowej substancji podstawowej i wolnymi grupami aminowymi peptydu inhibitującego, powodujące tworzenie się wiązania peptydowego, można uzyskać w posób tradycyjny, na przykład przez katalizowaną kwasem kondensację promowaną rozpuszczalnym w wodzie karbodwuimidem, takim jak chlorowodorek N-etylo-N'-(3dwumetyloaminopropylo)karbodwuimid (EDC). Na ogół sprzężenie uzyskuje się przez łagodne mieszanie żelowej substancji podstawowej z roztworem peptydu inhibitującego w obecności EDC, na przykład w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Odpowiednim stosunkiem sprzęgania peptydu z żelową substancją podstawową jest na przykład 3-4 g peptydu na litr żelu.

Substancja podstawowa o powinowactwie chromatograficznym może być wcześniej, przed użyciem upakowana do kolumny. Jednakże, gdy podstawową substancją chromatograficzną jest żelowa substancja podstawowa, możliwe jest również stosowanie periodycznego etapu inkubowania następnie, ewentualnie upakowania substancji podstawowej w kolumnie dla następnej elucji enzymu. Korzystnie, substancję podstawową dobrze przemywa się wodnym buforem przed użyciem w celu usunięcia śladów niezwiązanego peptydu i katalizatora kondensacji. Dla użytku produkcyjnego kolumna z substancją podstawową o powinowactwie chromatograficznym korzystnie powinna wytrzymać doprowadzenie do odpowiedniego stanu sanitarnego in situ, na przykład wodnym etanolem i w ten sposób nadawać się do ponownego użycia.

Odwracalne peptydy inhibitujące chymopapainę są peptydami, które po unieruchomieniu na substancji podłoża są zdolne do wiązania miejsc aktywnych chymopapainy mocniej niż miejsca aktywne innych proteinaz cysternowych znalezionych w preparatach surowej chymopapainy, zwłaszcza PPIV, które z kolei mogą być w nich wyparte. W korzystnej grupie peptydów inhibitujących aminokwasy zakończone C znajdują się pochodne aldehydowe, takie jak semokarbazon, metoksyimina lub oksym fenyloalaniny lub analogów fenyloalaniny. Bardziej szczegółowo aminokwasem z terminalnym C może być pochodna fenyloalaniny, taka jak semikarbazon D lub L-fenyloalanina (FenSc), metoksyimina D lub L-fenyloalanina (FenMo) lub oksym D lub Lfenyloalaniny (FenOks) lub analogowe pochodne fenyloalaniny, takie jak semikarbazon D lub L-alaniny (AlaSc), semikarbazon D lub L-cykloheksyloalaniny (ChaSc) lub semikarbazon D lub L-leucyny (LeuSc). Stwierdzono, że następujące peptydy z terminalnym C są korzystnymi peptydami inhibitującymi chymopapainę, mianowicie L-Ala-L-FenSc, L-Ala-D-FenSc, L-Fen-d-FenSc, L-Fen-L-FenSc, L-Fen-L-FenMo, L-Fen-L-FenOks, L-Tyr-L-FenSc, L-Ala-L-ChaSc i L-Ala-LLeuSc. Dwupeptyd L-Fen-L-FenSc został opisany przez Luacesa i Barretta (1988), 250, 903-909. Szczególnie korzystnymi peptydami są dwupeptydy zwłaszcza L-Ala-L-FenSc, L-Ala-D-FenSc i L-Fen-D-FenSc.

Przed elucją chymopapainy z substancji podstawowej o powinowactwie chromatograficznym korzystne jest przemycie substancji podstawowej w celu usunięcia niespecyficznie związanego materiału, na przykład wodnym buforem, takim jak bufor cytrynianowy lub octowy o pH 4-5. Stwierdzono, że jest szczególnie korzystne dodanie reagentów do buforu przemywającego i do buforu eluującego, który obniża wywieranie wzajemne na siebie działania hydrofobowego i innych niespecyficznych reakcji wiążących między substancją podstawową a składnikami surowej chymopapainy. Reagenty takie obejmują na przykład EDTA, izopropanol i etanodiol.

Chymopapaina może być następnie eluowana z substancji podstawowej eluentem. Odpowiednie eluenty przerywają wiązanie między unieruchomionym peptydem inhibitującym i przyłączoną do niego chymopapainą, bądź przez zmniejszenie powinowactwa miejsca aktywnego w stosunku do peptydu inhibitującego bądź przez selektywne wyparcie peptydu z miejsca aktywnego. Powinowactwo chymopapainy do peptydu inhibitującego może być obniżone, na przykład przez zmianą charakterystyki miejsca aktywnego środkiem denaturującym, takim jak izopropanol lub eluentem mającym pH powyżej lub poniżej aktywnego zakresu pH chymopapainy. Jednakowoż muszą to być takie eluenty, żeby nie zachodziła nieodwracalna dezaktywacja eluowanego enzymu. Alternatywnie, chymopapaina może być selektywnie wypierana z unieruchomionego inhibitującego peptydu przez eluent zawierający nadmiar składnika, który wiąże się ściśle z inhibitującym peptydem, na przykład inną proteinazą cysteinową.

166 810

Korzystnie eluent zawiera odwracalny inhibitor proteinazy cysternowej, który konkurencyjnie wiąże się miejscem aktywnym chymopapainy i tym sposobem wypiera ją z unieruchomionego peptydu inhibitującego. Tradycyjne inhibitory obejmują, na przykład dwusiarczki o niskim ciężarze cząsteczkowym, takie jak dwusiaczek 2,2'-dwupirydylowy, dwusiaczek hydroksyetylowy, dwusiarczek metylo-2-pirydylowy i tetrationian sodu oraz reagenty rtęciowe, takie jak chlorek rtęciowy, p-chlorobenzoesan rtęciowy i kwas mersalilowy, czyli o-[(3-hydroksymerkurio-2-metoksypropylo)karbamoilo]-fenoksyoctan sodu. Powinowactwo pomiędzy chymopapainą i unieruchomionym peptydem inhibitującym będzie się różnić zgodnie z tym jaki konkretny peptyd się stosuje, jakie pH, siłą jonową i skład buforu eluującego oraz jaką temperaturę, co jest oczywiste dla fachowca. Zgodnie z tym, dokładny charakter i stężenie inhibitora proteinazy wymagane do eluowania chymopapainy również będzie różne. Ponadto, reagenty rtęciowe równoważą się z przyłączoną chymopapainą szybciej niż reagenty dwusiarczkowe i z takimi inhibitorami można stosować ciągłą elucję. Inhibitory, które tylko powoli równoważą się z przyłączoną chymopapainą mogą wymagać inkubowania substancji podstawowej z inhibitorem, na przykład przez okres 1-2 godzin lub więcej, przed eluowaniem chymopapainy. Można jednakże rutynowo śledzić zawartość białka i aktywność proteinazy eluowanych frakcji oraz siłę jonową lub charakter eluenta i czas inkubowania substancji podstawowej z inhibitorem można zmieniać w taki sposób, żeby skutecznie i selektywnie wypierać chymopapainę z substancji podsta wo wej. Eluowane frakcje zawierające mniejszą ilość białka lub mniejsze aktywności chymopapainy mogą następnie być odrzucone.

Korzystnie pH eluenta jest wystarczająco niskie, żeby osłabić wzajemne oddziaływanie na siebie chymopapainy i peptydu inhibitującego, na przykład pH 4-5 zwłaszcza pH 4,5. Stwierdzono, że odpowiednimi eluentami są na przykład hydroksyetylodwusiarczek (100 mM) w wodnym etanodiolu (33%) zawierającym cytrynian sodu (50 mM) i EDTA (1 mM), pH 4,5; dwupirydylodwusiarczek (30 mM) w wodnym etanodiolu (33%) zawierającym cytrynian sodu (50 mM) i EDTA (1 mM), pH 4,5; metylopirydylodwusiarczek (30 mM) w wodnym etanodiolu (33%) zawierającym cytrynian sodu (50 mM) i EDTA (1 mM), pH 4,5; kwas mersalilowy (10 mM) (znaczenie podano wyżej) w wodnym etanodiolu (33%) zawierającym wodorotlenek sodu (50 mM) i EDTA (25 mM) doprowadzone do pH 4,5 za pomocą kwasu octowego; oraz chlorek rtęciowy (10 mM) w wodnym etanodiolu (33%) zawierającym cytrynian sodu (50 mM), pH 4,5. Chlorek rtęciowy jest szczególnie korzystnym, odwracalnym inhibitorem proteinazy cysteinowej.

Etap powinowactwa chromatograficznego w korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku wyraźnie zwiększa specyficzną aktywność oczyszczonej chymopapainy w warunkach pomiaru aktywności przeciw BAPNA lub miareczkowanie miejsca aktywnego za pomocą E-64 lub kwasem jodooctowym. Aktywna postać chymopapainy jest preferencyjnie wiązana i eluowana i w ten sposób jest odróżniana od nieaktywnych form chymopapainy oraz od niektórych innych proteinaz cysteinowych obecnych w surowym preparacie. Świeżo sporządzona chymopapaina oczyszczona za pomocą powinowactwa chromatograficznego zawiera co najmniej 70%, korzystnie co najmniej 80%, a zwłaszcza co najmniej 90% enzymu aktywnego.

Na ogół chymopapainę odzyskuje się z eluentu przed zmagazynowaniem lub użyciem. Korzystnie eluowaną chymopapainę oczyszcza się dalej w celu wyparcia inhibitora proteinazy cysteinowej z miejsca aktywnego enzymu. Inhibitor może być wyparty przez dodanie nadmiaru środka redukującego, takiego jak cysteina i ewentualnie, w razie potrzeby, usuwa się inhibitor tradycyjnymi technikami, takimi jak filtracja na żelu lub dializa. Alternatywnie, inhibitor może być usunięty przez absorpcję na specyficznej żywicy, na przykład dwusiarczku o niskim ciężarze cząsteczkowym mogą być absorbowane w kolumnie pracującej na zasadzie powinowactwa glutationu, a reagenty rtęciowe mogą być adsorbowane na żywicy chelatowej. Korzystnie, inhibitor usuwa się przez aktywację enzymu za pomocą środka redukującego, takiego jak cysteina, podczas gdy jest związany z kolumną kationowymienną i następnie inhibitor wymywa się z kolumny. Odzyskana, oczyszczona chymopapaina, korzystnie przed zmagazynowaniem, zostaje poddana liofilizacji, na przykład osuszona przez wymrożenie.

Chymopapaina oczyszczona sposobem według wynalazku może być dalej charakteryzowana znanymi sposobami. Metody takie obejmują na przykład analizę aminokwasów z N terminalnym,

166 81® miareczkowanie miejsc aktywnych za pomocą E-64 lub kwasu jodooctowego i uzyskiwanego z nimi stopnia dezaktywacji, sodową dodecylosiarczanową lub wielostrefową, katodalną, poliakryloamidową elektroforezę żelową i aktywności przeciw różnym substratom proteinazowym.

Nowe peptydy inhibitujące używane w sposobie według wynalazku mogą być sporządzone w sposób analogiczny do znanych sposobów. Na przykład pochodne dwupeptydowe mogą być syntetyzowane w szeregu etapach jak następuje:

a) C-terminalny aminokwas, z którego zamierza się sporządzić C-terminalny peptyd inhibitujący (pierwszy aminokwas) można chronić, na przykład przez reakcję z chlorowodorkiem O,Ndwumetylohydroksyaloaminy, w obecności chloromrówczanu izobutylu i N-metylomorfoliny, otrzymując pochodną dwumetylohydroksyamidową. Korzystnie koniec N pierwszego aminokwasu początkowo chroni się , na przykład trzeciorzędowym butoksykarbonylem.

b) Ochroniony pierwszy aminokwas, na przykład pochodną dwumetylohydroksyamidową, poddaje się następnie reakcji z mocnym kwasem, na przykład kwasem trójfluorooctowym, tworząc czwartorzędową sól amoniową.

c) Czwartorzędową sól amoniową ochronionego, pierwszego aminokwasu można następnie poddać reakcji z pochodną drugiego aminokwasu, na przykład pochodną N-karbobenzoksy, tworząc pochodną dwupeptydową.

d) Utworzoną powyżej pochodną dwupeptydową można poddać redukcji łagodnym środkiem redukującym, na przykład wodorkiem dwuizobutyloglinu lub wodorkiem litowo-glinowym, otrzymując wolną grupę aldehydową przy końcowym C dwupeptydu.

e) Utworzony powyżej aldehyd można przekształcić w pochodną, na przykład w semikarbazon przez reakcję z semikarbazydem, w metoksyiminę przez reakcję z chlorowodorkiem metoksyaminy, lub w oksym przez reakcję z hydroksyloaminą.

f) Z chronionego końca N można usunąć grupę ochronną, na przykład grupę N-karbobenzoksylową można usunąć przez katalityczną redukcję przy użyciu 10% palladu na węglu.

W sposobie według wynalazku posługiwano się następującymi metodami analitycznymi:

Oznaczanie białka: Gdzie możliwe stężenie białka oznaczano przy A280 przyjmując A280,i%⁼ 20,0 dla preparatów lateksu papaya i A280,1%⁼⁼ 18,3 dla preparatów oczyszczonej lub częściowo oczyszczonej chymopapainy (Robinson, 1975, Biochemistry, 14, 3695-3700). Niektóre reagenty zawierające tiol i dwusiarczki wykazują tendencję absorpcji przy 280 nm. W ich obecności do oznaczania stężenia białka stosuje się próbę Bio-Rad więżącą barwnik (Bio-Rad Laboratories, W. Bryt.). Jako standardy stosuje się filtrowane roztwory lateksu papaya suszone rozpyłowo (A280,1%= 20,0). Metoda ta ma mniejsze skłonności do zakłócień niż A280· W oczyszczonych preparatach enzymatycznych zawartość białka podaje się w przeliczeniu na całkowitą masę suchego produktu.

Oznaczanie aktywności chymopapainy

a) Aktywnyść ośzeciw BwPNA (Metoda oznaczenia nr 1)- próba SmitSa. Każdą próbkę dodawano do „Buforu 1“, wodnego buforu fosforanu sodu (0,1 M), pH 6,0 zawierającego EDTA (1 mM) i jadeowodzine chlorowodorku cysteiny (10 mM) do końcowej objętości 1,0 ml. Przed rozpoczęciem reakcji pozwolono na aktywację enzymu (gdy był obecny w próbce) przez 5 minut w temperaturze 37°C, po czym dodawano 4 ml roztworu substratu p-eitrcaeilidu N-a-benzoilo-DLargininy (BAPNA) ogrzanego uprzednio do temperatury 37°C.

N. B. Roztwór substratu sporządzono przez rozpuszczenie 300 mg BAPNA w ciepłym sulfotlenku dwumetylu, dodając roztwór powoli do 450 ml Buforu 1 ogrzanego uprzednio do temperatury 37°C i następnie uzupełniając do 500 ml dalszym Buforem 1. Roztwór substratu utrzymywano w temperaturze ponad 30°C aby zapobiec wytrącaniu się BAPNA.

Inkubowanie kontynuowano w temperaturze 37°C przez 30 minut, a następnie reakcję zatrzymano przez dodanie 1 ml kwasu octowego (4n). Uwalnianie 4-eitrcaniliny oznaczano przez pomiar Δ A 410· Jedna jednostka aktywności odpowiadała uwolnieniu 1 pikomola 4-eitroαniliey (ε = 8800 M^_1 · cm^_1) na sekundę w tych warunkach.

166 810

Te warunki próby odpowiadają warunkom opisanym w GB 2098997 na rzecz Smith Laboratories Inc. i są stosowane do oznaczania preparatów farmaceutycznych chymopapainy sprzedawanych na całym świecie, na przykład chymopapainy sprzedawanej pod nazwą Chymodiactin przez The Boots Company PLC, W. Bryt. i chymopapainy sprzedawanej pod nazwą Disken przez Sinpoong, Pfd. Korea. Te jednostki są znane w skali międzynarodowej i oznaczane są „Jednostki próby BAPNA Smitha.

b) Aktywność przeciw BAPNA (Metoda oznaczenia nr 2).

Każdą próbkę dodawano do wodnego buforu fosforanu sodu (0,1 M), pH 6,8, zawierającego EDTA (1 mM) i albo ditiotreitol (2mM) albo cysteinę (4mM) do końcowej objętości 0,975 ml. Przed reakcją pozwolono na aktywację enzymu (gdzie był obecny w próbce) przez 5 minut w temperaturze 40°C przez dodanie 25 μΐ p-nitroanilidu N-a-benzoilu-DL-argininy (BAPNA) (100 mM) w sulfotlenku dwumetylu. Inkubowanie kontynuowano w temperaturze 40°C przez 10 minut, a następnie reakcję zatrzymano przez dodanie 1 ml buforu wodnego chlorooctanu sodu (6,10 M), octanu sodu (0,20 M), pH 4,3. Uwolnioną 4-nitroanilinę oznaczano przez pomiar Δ A410. Jedna jednostka aktywności w tych warunkach odpowiada uwolnieniu 1 pikomola 4-nitroaniliny (ε = 8800 M^_1 cm^-1) na sekundę.

Te warunki próby odpowiadają dokładnie warunkom opisanym przez Buttle'a i Barretta (1984) loc, cit. i były stosowane we wstępnych badaniach opisanych w przykładach XXI, XXIII i XXVI.

Absolutne wartości otrzymane dla aktywności chymopapainy przy użyciu oznaczeń BAPNA Metodą nr 1i nr 2 różnią się, przy czym wartości otrzymane w Metodzie nr 2 są w przybliżeniu dwu do trzykrotnie wyższe niż wartości otrzymane przy użyciu Metody nr 1 (patrz przykład XXXI).

c) Miareczkowanie miejsca aktywnego kwasem jodooctowym.

Miareczkowanie miejsca aktywnego chymopapainy za pomocą kwasu jodooctowego prowadzono w sposób analogiczny do miareczkowania miejsca aktywnego za pomocą E-64 opisanego przez Zuckera i wsp. w Biochim. Biophys. Acta 828 (1985), 196-204. Roztwór chymopapainy rozcieńczono Buforem 1 jak opisany powyżej w (a) otrzymując roztwór zawierający 60 μ M białka (ε280 = 4,3284 X 10⁴ M1 cm’1 przeliczone z A280,i%= 18,3, Robinson (1975), loc. cit. i MW = 23656 obliczone z sekwencji aminokwasu Jacquet i wsp. (May 1989) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 370,425434). 20pl porcje roztworu chymopapainy umieszczono w probówkach do miareczkowania i inkubowano przez 5 minut w temperaturze 37°C z 20μ\ Buforu 1 (40pl w próbie kontrolnej). 20μΐ wodnego kwasu jodooctowego (10, 20, 30, 40, 50 i 60pM odpowiednio) dodano do każdej probówki do miareczkowania i mieszaninę inkubowano wstępnie przez 10-20 minut w temepraturze 37°C. Reakcję rozpoczęto przez dodanie 4 ml roztworu substratu BAPNA jak opisano powyżej w (a), który uprzednio ogrzano do temperatury 37°C. Inkubowanie kontynuowano w temperaturze 37°C i reakcję przerywano po 30 minutach jak opisano powyżej w (a) i oznaczono uwolnioną

4-nitroanilinę za pomocą Δ A410· Tak otrzymane molowe stężenie aktywnej chymopapainy porównano z molowym stężeniem białka na podstawie molowego współczynnika ekstynkcji 4,3284 X 104 M ¹ cm1 dla chymopapainy. Ilość aktywnego białka wyrażono następnie jako % całej ilości białka.

d) aktywność przeciw azokazeinie.

Aktywność przeciw azokazeinie oznaczano uprzednio opisaną metodą przez Rowana i wsp. (1988) Arch. Biochem. Biophys, 267,262-270 przy użyciu mniej niż 1 μΜ enzymu (w przeliczeniu na ciężar molowy 24.000) i gdzie pożądane 1 μM cystatyny kurczęcej. Wszystkie stężenia enzymów i inhibitora dotyczą stężenia cząsteczek aktywnych.

Próba immunologiczna przez pojedynczą radialną immunodyfuzję

Próby pojedynczej radialnej immunodyfuzji bazowały na metodzie Mancini i wsp., 1965, Immunochem 2, 235-254 jak następuje. Agarozę (1% wag/obj/ w wodnym fosforanie sodu (10 mM) zawierającą NaCl (0,14 M), pH 7,3 zawierającą mono-specyficzny preparat IgG przelano na Gel Bond ^R (FMC Corporation, Maine, St. Zjedn.) i wycięto wgłębienia w układzie prostokątnym w odległości od siebie 1,5 cm (r=l mm). Próbki porównawcze i nieznane rozmieszczono

166 810 przypadkowo między wgłębienia w celu obniżenia do minimum błędów wynikających z efektu brzegowego. Po nałożeniu do wgłębień antygenu, płytki trzymano przez 24 godziny dla rozwinięcia się pierścienia przeciwciała precypitującego. Następnie przemyto je, osuszono i zabarwiono. Dla wytworzenia standardowych krzywych stosowano czysty, łagodnie karboksymetylowany antygen. Krzywe wykreślono w układzie antygen wobec kwadratu średnicy pierścienia. Użyteczny zakres próby wynosił 25-300 ng antygenu na wgłębienie.

Sporządzenie PPIV i przeciwciała dla niego

a) Sporządzenie kolumny pracującej na zasadzie powinowactwa.

Ester p-nitrofenylowy butoksykarbonylo-L-Fen (10 mmoli) dodano do mieszanej mieszaniny -NH 2CH 2CN · HCL (20 mmoli) i dwuizopropyloetyloaminy (20 mmoli) w dwumetyloformammidzie (20 ml). Mieszaninę mieszano w temperaturze 20°C przez 2 godziny, a następnie rozcieńczono octanem etylu (100 ml), przemyto wodą (2x), wodną trójetyloaminą (5x), wodą (3x), wodnym wodorosiarczanem potasu (2x), wodą (3x), osuszono i odparowano. Pozostałość krystalizowano z octanu etylu: heksanu otrzymując Boc-L-Fen-NHCH^N o temperaturze topnienia 134,5-135°C.

Lodowato zimny wodny kwas trójfluorooctowy (10 ml) dodano do roztworu Boc-L-FenNHCH 2CN (5 mmoli) w dwuchlorometanie (10 ml). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 20°C przez 30 minut, a następnie odparowano rozpuszczalnik w temepraturze 40°C. Pozostałość rozpuszczono w chloroformie, odparowano i postępowanie powtórzono dwukrotnie. Otrzymaną surową sól trójfluorooctową rozpuszczono w roztworze dwuizopropyloetyloaminy (7,5 mmola) w dwumetyloformamidzie (10 ml) i dodano ester Boc-Gli-p-nitrofenylowy (6,25 mmola) i jednowodzian N-hydroksybenzotriazolu (6,25 mmola). Następnie wkroplono wystarczającą ilość dwuizopropyloetyloaminy do wytworzenia p-nitrofenolu (złoty kolor) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Dodano N,N-dwuetyloetylenodwuaminę (1,5 ml) a 15 minut później octan etylu (60 ml) i mieszaninę przemyto wodą, wodną trójetyloaminą, wodą, wodnym kwaśnym siarczanem potasu, wodą, osuszono i odparowano. Pozostałość oczyszczano chromatograficznie na krzemionce eluując octanem etylu : heksanem 22011) otrzymując Boc-Gli-L-Fen-NHCH2CN w postaci piany.

Boc-Gli-L-Fen-NHCH2CN (30 mg) rozpuszczono w kwasie trójfluorooctowym : dwuchlorometanie : arnzolu (25:65:10, 1 m)) ) inkubowano w temperatura 0°C praż 30 minut . Miezzanin) osuszono przez odparowanie w wyparce obrotowej w temperaturze 34°C, a pozostałość rozpuszczono w metanolu (1,5 ml) otrzymując roztwór ligandu.

Aktywowany CH-Sepharose^R4B (Pharmacia, 3 g suchej masy) uwodniano przez noc w wodnym kwasie solnym (1 mM, 75 ml) w temperaturze 4°C, a następnie przemyto kwasem solnym (1 mM, 600 ml) i wodnym NaHCOe (0,1M, pH 8,0, 300 ml). Żel zawieszono w wodnym NaHCO 3 (0,1 M, pH 8,0, 30 ml), dodano roztwór liganda (powyższy) i mieszaninę łagodnie mieszano przez noc w temperaturze 20°C. Żel odebrano na filtrze ze spiekanego szkła, przemyto wodnym metanolem (50% obj/obj, 180 ml), a następnie wodą (180 ml) i zawieszono w wodnej etanoloaminie (0,1 M, 30 ml) doprowadzonej do pH za pomocą kwasu solnego. Mieszaninę wytrząsano przez 4 godziny w temperaturze 20°C, a następnie odebrano żel, przemyto wodą (500 ml) i magazynowano w buforze, w którym jest stosowany /fosforan sodu (50 mM), EDTA (1 mM), etanodiol (33%), pH 6,8) w temperaturze 4°C.

b) Oczyszczanie PPIV.

Kolumnę ze złożem o objętości 4 ml StpharostR-Ahx-Gli-L-Fen-NHCH 2CN przemyto buforem eluującym /cytrynian sodu (50 mM), etanodiol (33%), pH 4,5, 12 ml), a następnie buforem zastosowania (patrz powyżej, 12 ml).

Lateks papaya suszony rozpyłowo (0,5 g) rozpuszczono w buforze zastosowania (10 ml) i przesączono (0,22 μm wielkość porów). Stężenie białka w przesączu oznaczono przy użyciu próby Bio-Rad wiążącej barwnik (Bio-Rad Laboratories, W. Bryt.). Do mieszaniny dodano ditiotreitol do końcowego stężenia 2 mM i mieszaninę inkubowano w temperaturze 0°C przez 20 minut. 80 mg białka lateksu naniesiono na kolumnę (38 ml/godzinę/cmj w temperaturze 20°C następnie bufor zastosowania (8 ml), a następnie bufor eluowania (8 ml). Wówczas zastosowano bufor eluowania (4 ml) zawierający hydroksyetylodwusiarczee (50 mM), przepływ zatrzymano i kolumnę pozosta14

166 810 wiono na noc w temperaturze 20°C. Podjęto na nowo elucję buforem eluowania zawierającym dwusiarczek hydroksyetylu (10 ml) i zbierano eluowane frakcje (1 ml). Frakcje wykazujące aktywność przeciw ΒΑΡΝΑ zebrano razem i bezpośrednio stosowano na kolumnę Mono S HR 5'/5 (kationowymienną), którą zrównoważono uprzednio wodnym octanem sodu/kwasem octowym (50 mM), pH 5,0 zawierającym EDTA (1 mM), a następnie kolumnę przemyto tym samym buforem (1 ml/min) aż A280nm powróciło do zera. Następnie do kolumny zastosowano gradient (21,5 mM Na/ml) do 1M octanu sodu (Buttle i Barrett, 1984 loc. cit.) i zbierano frakcje (1 ml). Wyeluowano dwa główne piki białkowe, pierwszy pik eluujący przy około 0,17 M Na+ odpowiadający papainie i drugi pik eluujący przy około 0,38 M Na+ odpowiadający PPIV. Frakcje piku PPIV zebrano, dializowano wobec wodnej EDTA (1 mM), osuszono przez wymrożenie i magazynowano w temperaturze -20°C. Czysty PPIV nie posiadał wykrywalnej aktywności przeciw ΒΑΡΝΑ, ale był zasocjowany z aktywnością trwającą azokazeinę, która nie jest inhibitowana przez cystatynę kurczącą w stężeniu 1 μΜ.

c/ Wytwarzanie przeciwciała specyficznego dla PPIV.

Czysty antygen dla PPIV łagodnie karboksymetylowano przed użyciem metodą opisaną przez Zuckera i wsp., 1985, Biochim. Biophys. Acta, 828, 196-204. Wówczas wyhodowano surowicę odpornościową wobec PPIV u królika przez domięśniową iniekcję 360μg karboksymetylowanego białka w kompletnym środku wspomagającym Freunda, po czym po dwóch tygodniach przez podskórną iniekcję 100pg niekompletnego środka wspomagającego. IgG częściowo oczyszczono od surowicy odpornościowej przez frakcjonowanie z siarczanem amonu jak opisali Heide i Schwick (1978) w Handbook of Experimental Immunology (Weir, D. M.,) tom 1, 7.1-7.11, Blackwell, Oxford, a następnie przez dializę do wodnego fosforanu sodu (10 mM) zawierającego NaCl (0,14 M), pH 7,3.

Preparat IgG specyficzny wobec PPIV stosowano do oznaczania PPIV za pomocą opisanej powyżej pojedynczej radialnej immunodyfuzji.

Poniższe przykłady ilustrują pełniej wynalazek i służą do lepszego przedstawienia wynalazku, a nie zawężenia jego zakresu.

Stosowane tu skróty oznaczają ABTS - kwas 2,2'-azynobis/3-etylobenzotiazolinosulfonowy, Ahx - 6-aminoheksanoil, Ala - alaninę, ΒΑΡΝΑ - p-nitroamilid Ν-α-benzoilo-DL-argininy, Boc -butyloksykarbonyl, CBZ - karbobenzoksy, Cha - cykloheksyloalaninę, DMF - N,N-dwumetyloformamid, E-64 - L-3-karboksy-2,3-trans-epoksypropionyloleucyloamido-(4-guanidyno)butan, EDC - chlorowodorek N-etylo-N'-(3-dwumetyloaminopropylo)karbodwuimidu, EDTA - kwas etylenodwuaminoczterooctowy (sól dwusodowa) Gli - glicyna, Leu - leucyna, Mo - metoksyimina, OBZ - oksybenzyl, Ox - oksym, Fen - fenyloalanina, Sc - semikarbazon, THF - tetrahydrofuran i Tyr - tyrozyna.

Bio-Rad, Chelex, Chymodiactin, CH-Sepharose 4B, Chymofast, Disken, ECH-Sepharose, Enzfitter, FPLC, Gel Bond, Mono S HR, S-Sepharose HR, Tween, Zeta i Zetaffinity - są nazwami handlowymi.

Wszystkie etapy prowadzono w temperaturze pokojowej o ile nie zaznaczono inaczej.

Przykład I. L-alaniny-L-fenyloalanylosemikarbazon.

Etap a.

A/ Chlorowodorek Ο,Ν-dwumetylohydroksyaminy (10,23 g) mieszając dodano do suchego Ν,Ν-dwumetyloformamidu (DMF) (100 ml) w temperaturze pokojowej. W przeciągu 5 minut dodano (10,6 g) N-metylomorfoliny utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Wytrącił się biały osad i mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C.

B/ N-t-Boc-L- Fen (26,5 g) rozpuszczono w suchym tetrahydrofuranie (THF) (200 ml) i ochłodzono do temperatury -10°C. Do roztworu dodano w ciągu 5 minut chloromrówczan izobutylu, podczas gdy temperaturę utrzymywano przy -10°C. W przeciągu 10 minut dodano N-metylomorfolinę (10,6 g) utrzymując temperaturę -10°C i kontynuowano mieszanie przez dalsze 10 minut.

C/ Zawiesinę A dodano do zawiesiny B w przeciągu 15 w temperaturze -10°C. Pozostawiono mieszaninę do ogrzania się do temperatury pokojowej i następnie mieszano przez 3 godziny.

166 810

Otrzymaną mieszaninę ochłodzono następnie do temperatury 0°C i dodano-3-dwumetyloaminopropyloaminę (10,2 g) w ciągu 5 minut. Dodano wodę (200 ml) i octan etylu (200 ml), oddzielono górną warstwę organiczną i kolejno przemyto (a) wodą (200 ml), (b) wodnym KHCO 3 (5%, 200 ml), (c) wodnym HCl (0,5 N, 200 ml) i (d) wodą (3 X 200 ml). Rozpuszczalnik odparowano w obrotowej wyparce próżniowej przy temperaturze utrzymywanej poniżej 30°C otrzymując O,N-dwumetylohydroksymian N-t-Boc-L-Fen.

Etap b. N-dwumetylohydroksamian N-t-Boc-L-Fen (2,9 g) i kwas trójfluorooctowy (8 ml) mieszano razem w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Nadmiar kwasu trójfluorooctowego usunięto następnie w próżniowej wyparce obrotowej w temperaturze poniżej 30°C. Do pozostałość dodano eter etylowy (30 ml) do utworzenia roztworu po czym eter usunięto pod próżnią. Traktowanie eterem powtarzano aż do rozpoczęcia się krystalizacji. Ciało stałe odsączono, przemyto eterem, a następnie osuszono pod próżnią nad P2O5 otrzymując trójfluorooctan L-Fen-0,N-dwumetylohydroksamianu.

Etap c.

A/ Sól trójfluorooctanową L-Fen-O,N-dwumetylohydroksamianu (7,15 g) rozpuszczono w suchym DMF (30 ml) mieszając w temperaturze pokojowej. W ciągu 5 minut dodano Nmetylomorfolinę (2,35 g) utrzymując temperaturę poniżej 30°C i ochłodzono otrzymaną mieszaninę do 0°C.

B/ CBZ-L-Ala (4,96 g) rozpuszczono mieszając w suchym THF (55 ml) i mieszaninę ochłodzono do -10°C. Dodano chloromrówczan izobutylu (3,05 g) w ciągu 5 minut w temperaturze -10°C, N-metylomorfolinę (2,35 g) w ciągu 10 minut mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -10°C przez dalsze 10 minut.

C/ Roztwór A dodano do roztworu B w przeciągu 15 minut w temperaturze -10°C, a następnie pozwolono, aby temperatura mieszaniny wzrosła do pokojowej i mieszanie kontynuowano przez 3 godziny. Mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C, dodano 3-dwumetyloaminopropyloaminy (2,27 · g) w ciągu 5 minut i mieszanie kontynuowano przez dalsze 5 minut. Wówczas dodano wodę (50 ml) i octan etylu (50 ml), oddzielono górną warstwą organiczną i kolejno przemyto (a) wodą (50 ml), nasyconym widnym NaCl (5 ml) (b) wodnym KHCO 3 (5%, 50 ml), (c) wodnym HCl (0,5 N, 50 ml) i (d) wodą (3 X 50 ml). Rozpuszczalnik odparowano pod próżnią w wyparce obrotowej w temperaturze utrzymywanej poniżej 30°C. Dodano świeżego octanu etylu (50 ml), a następnie usunięto przez odparowanie otrzymując O,N-dwumetylohydroksamian CBZ-L-Ala-L-Fen.

Etap d. O,N-dwumetylohydroksamian CBZ-L-Ala-L-Fen (27,8 g) rozpuszczono w suchym THF (280 ml) i ochłodzono do temperatury -70°C w atmosferze azotu. Dodano wodorek dwuizobutyloglinu w THF (1 M, 372ml) w atmosferze N 2 w ciągli 60 minut w temperaturze -70°C i mieszanie kontynuowano przez dalsze 60 minut w temperaturze -70°C. Reakcję przerwano przez zalanie nasyconym wodnym NaCl (400 ml) i roztworem soli Rochella (600 ml) mieszając w temperaturze 0°C w atmosferze N 2 i pozostawiono mieszaninę do ogrzania się do temperatury pokojowej. Dodano octan etylu (600 ml) mieszaninę przesączono, warstwę wodną oddzielono i wyekstrahowano octanem etylu (200 ml). Połączone fazy organiczne przemyto wodą (600 ml) (nasyconym wodnym NaCl /400 ml X 3). Rozpuszczalnik odparowano pod próżnią w wyparce obrotowej przy utrzymywaniu temperatury poniżej 30°C. Pozostałość rekrystalizowano z toluenu i ciało stałe osuszono pod próżnią nad P2O5 otrzymując aldehyd CBZ-L-Ala-L-Fen.

Etap e.

A/ Aldehyd CBZ-L-Ala-L-Fen (3 g) rozpuszczono w technicznym spirytusie metylowanym (20 ml). Roztwór ogrzano do temperatury 50°C i przesączono, aby usunąć substancje nierozpuszczalne.

B/ Roztwór chlorowodorku samikarbazydu (1,3 g) w wodzie (10 ml) dodano do roztworu KHCO3 (1,1 g) w wodzie (10ml).

C/ Roztwór B dodano do roztworu A i otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze 50°C przez 2 godziny. Dodano octan etylu (50 ml) i wodę (100 ml) warstwę wodną oddzielono i wyekstrahowano octanem etylu (2 X 20 ml) i połączone fazy organiczne przemyto kolejno (a) wodnym KHCO 3 (5%, 50 ml), (b) wodnym HCl (0,5 N, 50 ml) i (c) wodą (nasyconym roztworem NaCl /50 ml/20 ml X 3). Rozpuszczalnik odparowano pod próżnią w wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C i otrzymując CBZ-L-Ala-L-FenSc.

166 810

Etap f. CBZ-L-Ala-L-FeoSc (680 mg) rozpuszczono w metanolu (90 ml) i odsączono substancje nierozpuszczalne. Aparat zawierający metanolowy roztwór CBZ-L-Ala-L-FenSc przemyto azotem i dodano katalizator, 10% pallad na węglu (100 mg). H2 przeprowadzano do zamkniętego układu przez 75 minut. Katalizator usunięto przez odsączenie, a metanol odparowano pod próżnią w wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Pozostałość wykrystalizowała po odstawieniu, ciało stałe wysuszono pod próżnią nad P2O5 otrzymując L-alanylo-L-fenyloalanyloseIaikαzbαzon (L-Ala-L-FenSe).

Przykładu!. L-feoyloalanylo-L-fenyloalanylo uemikarbayoo.

Etapy a i b. Sól trójlluorooctanową L-Fen-O,N-dwumetylorydroksαmianu sporządzono zgodnie z etapami a i b przykładu I.

Etap c.

A/ Sól trójfluorooctaoową L-Fen-O,N-dwumetylohydroksdmiαnu (1,932 g) rozpuszczono w suchym DMF (8 ml) mieszając w temperaturze pokojowej. W ciągu 5 minut dodano Nmetylomorfolinę (0,606 g) utrzymując temperaturę poniżej 30°C, a uzyskaną mieszdnio- ochłodzono do temperatury 0°C.

B/ CBZ-L-Fen (1,794 g) rozpuszczono w suchym THF (15 ml) mieszając i mieszaniną ochłodzono do temperatury -10°C. W ciągu 5 minut dodano chloromrówcean izobutylu (0,822 g) w temperaturze -10°C, dodano N-metylomorfolinę (0,606 g) w ciągu 10 minut i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -10°C przez dalsze 10 minut.

C/ Roztwór A dodano do roztworu B w przeciągu 15 minut w temperaturze -10°C po czym pozostawiono mieszaninę aby jej temperatura wzrosła do temperatury pokojowej i mieszanie kontynuowano przez 3 godziny. Mieszaninę ochłodzono do 0°C, dodano w ciągu ponad 5 minut 3-dwumetyloaminoprooyloamio- (0,612 g) i mieszanie kontynuowano przez dalsze 5 minut. Dodano wodę (20 ml) i octan etylu (30 ml), fazę organiczną oddzielono i przemyto kolejno (a) wodnym KHCO 3 (5%, 20 ml), (b) wodnym HCl (0,5 N, 20 ml) i (c) wodą (2 X 30 ml). Rozpuszczalnik odparowano pod próżnią w wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 35°C i rekrystalieowaoo pozostałość z alkoholu izopropylowego otrzymując O,N-dwumetylohydroksamian CBZ-L-Fen-L-Fen.

Etap d. O,N-dwumetylohydroksαmiαo OBZ^-Fen-L-Fen (4,89 g) rozpuszczono w suchym THF (40 ml). Suchą kolbę załadowano wodorkiem litowoglinowym (0,493 g) i suchym THF (20 ml) w atmosferze azotu i mieszano w temperaturze pokojowej przez 10 minut, przed ochłodzeniem do -50°C, po czym dodano roztwór rydroksαmianu w suchym THF w przeciągu 10 minut w temperaturze -50°C w atmosferze azotu i mieszanie kontynuowano przez dalsze 20 minut w temperaturze 0-5°C.

Mieseaoioę reakcyjną ochłodzono do temperatury -50°C i w atmosferze azotu dodano nasycony roztwór soli Rochella (60 ml). Mieszaoioę pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej, dodano HCl (stężony, 10ml) dla doprowadzenia fazy wodnej do pH 3, i substancje nierozpuszczalne odparowano. Dodano octan etylu (50 ml) i fazę organiczną oddzielono i przemyto kolejno (a) wodą (50 ml), (b) wodnym KHCO3 (5%, 50 ml), (c) wodnym HCl (0,5 N, 50 ml) i (d) (3 X 50 ml). Octan etylu odparowano pod próżnią w wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Pozostałość odstawiono na noc, osuszono pod próżnią nad P2O5 i w końcu krystalizowano z toluenu otrzymując aldehyd CBZ-L-Fen-L-Fen.

Etap e.

A/ OBZ^-Fen-L-Fen aldehyd (0,645 g) rozpuszczono w technicznym spirytusie metylowym (10 ml) w temperaturze 70°C.

B/ Trójwodeiao octanu sodu (0,224 g) dodano do roztworu chlorowodorku semikarbazydu (6,183 g) w wodzie (3 ml), dodano metylowaoy spirytus techniczny (2 ml) i mieszaoioę ogrzano do temperatury 60°C.

C/ Roztwór A dodano do roztworu B i kolbę zawierającą A przemyto dalszym metylowanym spirytusem technicznym (3 ml) i popłuczyny dodano do mieszaniny, którą mieszano w temepzatuzee 60-70°C orzee 30 minut. Mieszaninę pozostawiono do powolnego ochłodzenia się na 1 godzinę, postawiono na lodzie przez dalszą godzinę i w końcu pozostawiono na noc w temperaturze' 4°C.

166 810 17

Ciało stałe odsączono, przemyto metylowanym spirytusem technicznym i wodą (411,3 mil l wysuszono pod próżnią nad P2O5 otrzymując CBZ-L-Fen-L-FenSc.

Etap f. CBZ-L-Fen-L-FenSc (2,1 g) rozpuszczono w metanolu (315 ml) w temperaturze 30°C i substancje nierozpuszczalne odsączono. Aparat zawierający metanolowy roztwór semikarbazonu przemyto azotem, dodano katalizator 10% pallad na węglu (0,35 g) i wprowadzono H 2 do zamkniętego układu przez 30 minut. Katalizator odsączono, a rozpuszczalnik odparowano pod próżnią w wyparce obrotowej w temperaturze utrzymywanej poniżej 30°C. Pozostałość suszono pod próżnią nad P2O5 otrzymując L-fenyloalanylo-L-fenyloalanylo semikarbazon (L-Fen-L-FenSc).

Przykład III. L-fenyloalanylo-L-fenyloalanylometoksyimina.

Etapy a-d. CBZ-L-Fen-L-Fen aldehyd sporządzono tak jak opisano w przykładzie II, etapy a-d.

Etap e.

A/ Aldehyd CBZ-L-Fen-L-Fen (0,645 g) rozpuszczono w metolowanym spirytusie technicznym (35 ml) w temperaturze 60-65°C i przesączono w celu usunięcia substancji nierozpuszczalnych.

B/ Trójwodzian octanu sodu (0,224 g) dodano do roztworu chlorowodorku metoksyloaminy (0,138 g) w wodzie (25 ml) w temperaturze 60°C.

C/ Roztwór B dodano do roztworu A, kolbę zawierającą B przemyto wodą (10 ml) w temepraturze 60°C, popłuczyny połączono z mieszaniną i ogrzewano w temperaturze 60°C przez 1/2 godziny, po czym pozostawiono do ochłodzenia się do temperatury pokojowej na 2 godziny. Ciało stałe odsączono, przemyto przemysłowym spirytusem metylowanym : wodą (I1I , 6rr^ł) i osuszono pod próżnią nad P2O5 otrzymując CBZ-L-Fen-L-Fen-metoksyiminę.

Etap f. CBZ-L-Fen-L-Fen-metoksyimina (550 mg) rozpuszczono w ' metanolu (300 ml) i odsączono substancje nierozpuszczalne. Aparat zawierającą metanolową metoksyiminę przemyto azotem i dodano następnie 1Q%o pallad na węglu (100 mg) jako katalizator. H2 doprowadzano do zamkniętego naczynia i ponownie załadowano w razie potrzebny na 4 i pół godziny. Katalizator odsączono, a rozpuszczalnik odparowano pod próżnią w wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C i otrzymując L-fenyloalanylo-L-fenyloalanylo-metoksyiminę (L-Fen-L-FenMo).

Przykład IV. L-fenyloalanylo-D-fenyloalanylo semikarbazon.

Etap a.

A/ Chlorowodorek O,N-dwumetylohydroksylaminy (3,891 g) zawieszono w suchym DMF (40 ml) w temperaturze pokojowej. Dodano N-metylomorfolinę (4,032 g) w ciągu 5 minut utrzymując temperaturę poniżej 30°C, po czym mieszaninę ochłodzono mieszając do 0°C.

B/ N-t-Boc-D-Fen (10,08 g) rozpuszczono w suchym THF (80 ml) i ochłodzono do temperatury -10°C. Do roztworu dodano chloromrówczan izobutylu (5,47 g) w przeciągu 5 minut utrzymując temperaturę -10°C. Dodano N-metylomorfolinę (4,032 g) w ciągu 10 minut utrzymując temperaturę -10°C i kontynuowano mieszanie przez dalsze 10 minut.

C/ Zawiesinę A dodano do zawiesiny B w ciągu 15 minut w temperaturze -10°C, mieszaninę pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszano przez 3 godziny. Mieszaninę następnie ochłodzono do 0°C, dodano ^^^'^i^i^^t^ll^^r^ii^c^j^^opyloaminę (3,88 g) w przeciągu 5 minut i mieszanie kontynuowano przez dalsze 5 minut. Dodano wodę (60 ml) i octan etylu (60 ml), warstwę organiczną oddzielono i kolejno przemyto (a) wodą (60 ml), (b) wodnym KHCO^5%, 60 ml), (c) wodnym HCl (0,5 M, 60 ml) i (d) wodą (3 X 60 ml). Rozpuszczalnik odparowano pod próżnią w wyparce obrotowej utrzymujące temperaturę poniżej 30°C. Otrzymano N-t-Boc-D-Fen O lN-dwumetylohydroksamian.

Etap b. O,N-dwumetylohydroksamian N-t-Boc-D-Fen (11,3 g) ochłodzono na lodzie, dodano kwas trójfluorooctowy (30 ml) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Nadmiar kwasu trójfluorooctowego odparowano pod próżnią w wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C i do pozostałości dodano eter etylowy (100 ml) do utworzenia roztworu. Rozpuszczalnik odparowano i proces powtórzono aż pojawiła się krystalizacja. Ciało stałe odsączono, przemyto eterem etylowym i osuszono pod próżnią nad P2O5 otrzymując sól trójfluorooctanową D-Fen-O^-dwumetylohydroksamianu.

166 810

Etap c.

A/ Trójfluorccctaeową sól D-Fen-O,N-dwumetylohydroksamianu (10,1 g) rozpuszczono w suchym DMF (41 ml) mieszając w temperaturze pokojowej. Dodano N-metylomorfoIinę (3,155 g) w ciągu 5 minut utrzymując temperaturę poniżej 30°C i ochłodzono uzyskaną mieszaninę do temperatury 0°C.

B/ CBZ-L-Fen (9,4 ml) rozpuszczono w suchym THF (80 ml) mieszając i mieszaninę ochłodzono do temaa-atury -10°C. Chloromrówczae izobutylu (4,307 g) dodano w ciągu 5 minut w temaaratu-za -10°C, N-matylomo-folieę (3,155 g) dodano wciągu 10 minut i mieszaninę reakcyjną mieszano w tamaa-αturze -10°C przez dalsze 10 minut.

C/ Roztwór A dodano do roztworu B w przeciągu 15 minut w temperaturze -10°C i pozwolono następnie wzrosnąć temperaturze mieszaniny do temperatury pokojowej i mieszając kontynuowano przez 3 godziny. Mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C, 3-dwumetylo-aminoa-cayloamieę dodano w ciągu 5 minut i kontynuowano mieszanie przez 5 minut. Wówczas dodano wodę (60 ml) i octan etylu (60 ml), fazę organiczną oddzielono i przemyto kolejno (a) wodą (60 ml) i nasyconym wodnym NaCl (60 ml), (b) wodnym KHCO3 (5%, 60 ml), (c) wodnym HCl (0,5 N, 60 ml) i (d) wodą (3 X 60 ml). Rozpuszczalnik odparowano pod próżnią na wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Dodano świeży octan etylu, po czym usunięto przez odparowanie. Pozostałość rekrystalizowano z izoproaanolu otrzymując CBZ-L-Fen-D-Fen-O,N-dwumatylohydroksαmiae.

Etap d. Do kolby przemytej azotem dodano wodorek Zwuizobutyloglinu (1 M, 19 ml). Kolbę ogrzewano w temperaturze 50°C aż cały dwuchlorometae wyparował i ponownie przemyto układ N 2, dodano suchy THF (10 ml) i mieszaninę ochłodzono do temperatury -70°C. O,N-dwumetylohydroksamian CBZ-L-Fen-D-Fan (0,978 g) rozpuszczony w suchym THF (10 ml) dodano w ciągu 10 minut w temaa-atu-ze -70°C do roztworu wodorku Zwuizobutylcglinu i mieszanie kontynuowano przez dalsze 10 minut w temperaturze -70°C. Mieszaninę reakcyjną wlano do metanolu (30 ml) i nasyconego roztworu soli Rochella (30 ml) w tamaaraturza -60°C dla przerwania reakcji, i pozostawiono mieszaninę do ogrzania się do temperatury pokojowej. Dodano wodę (50 ml) i octan etylu (50 ml), i oddzielono fazę organiczną, a fazę wodną wyekstrahowano octanem etylu (50 ml). Połączone fazy organiczne przemyto wodą (2 X 200 ml) i przesączono. Fazę organiczną oddzielono i rozpuszczalnik usunięto w wyparce obrotowej pod próżnią utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Dodano świeżego octanu etylu, po czym go usunięto otrzymując aldehyd CNZ-L-Fee-D-Fee.

Etap e.

A/ Aldehyd CNZ-L-Fen-D-Fan (400 mg) rozpuszczono w metylowanym spirytusie technicznym (10 ml) w temperaturze 60°C.

B/ Trójwodzian octanu sodu (0,298 g) w wodzie (3 ml) w temperaturze 60°C dodano do roztworu chlorowodorku semikarbazydu (0,244 g) w wodzie (3 ml) w temperaturze 60°C.

C/ Roztwory A i B połączono i uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze 60°C przez 5 godzin, po czym pozostawiono na noc w temperaturze 4°C. Ciało stałe odsączono i osuszono nad P2O5 otrzymując CBZ-L-Fen-D-FenSc.

Etap f. CNZ-L-Fae-D-FanSc (600 mg) rozpuszczono w metanolu (90 ml) i substancje nierozpuszczalne usunięto przez odsączenie. Aparat zawierający metanolowy roztwór semikarbazonu przemyto N2 i dodano katalizator 10% pallad na węglu (100 mg). Przez 2 godziny do zamkniętego naczynia doprowadzano H 2. Katalizator odsączono, a metanol odparowano pod próżnią w wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C i otrzymano L-fenyloalanylo-Dfenyloalanylo semikarbazon (L-Fen-D-FenSc^

Przykład V. Oksym L-fanyloalanylo-L-faeyloalaeylcwy.

Etapy a-d. Aldehyd CNZ-L-Fen-L-Fan sporządzono tak jak opisano w przykładzie II, etapy a-d.

Etap e.

A/ Aldehyd ('BZ-L-Fen-L-Fen sporządzony jak opisany powyżej (0,645 g) rozpuszczono w metylowanym spirytusie techicznym (35 ml) w temperaturze 60-65°C i roztwór przesączono w celu usunięcia substancji nierozpuszczalnych.

166 810 19

B/ Trójwodzian octanu sodu (0,224 g) dodano do roztworu chlorowodorku hydroksyloaminy (0,114 g) w wodzie (25 ml) w temperaturze 60°C.

C/ Roztwór B dodano do roztworu A i kolbę zawierającą B przemyto wodą (10 ml) i popłuczyny dodano do mieszaniny, którą mieszano następnie w temperaturze 60-65°C przez 3/4 godziny, po czym chłodzono przez 2-3 godziny w temperaturze 4°C. Ciało stałe odsączono przemyto metylowanym spirytusem technicznym/wodą (1:1,5 ml) i osuszono pod próżnią nad P2O5 otrzymując CBZ-L-Fen-L-FenOx w postaci mieszaniny izomerów syn i anti.

Etap f. CBZ-L-Fen-L-FenOx (500 mg) rozpuszczono w metanolu (130 ml) i odsączono substancje nierozpuszczalne. Aparat zawierający metanolowy roztwór oksymu przepłukano N2 i dodano katalizator 10% pallad na węglu (83 mg). Następnie do zamkniętego naczynia wprowadzano H 2 przez 30 minut. Katalizator odsączono, a rozpuszczalnik odparowano w próżniowej wyparce obrotowej przy temperaturze utrzymywanej poniżej 30°C. Dalszy rozpuszczalnik usunięto za pomocą pompy do wysokiej próżni i pozostałość osuszono pod próżnią nad P2O5 otrzymując L-fenyloalanylo-L-fenyloalanylooksym (L-Fen-L-FenOx).

Przykład VI. L-alanylo-D-fenyloalanylo semikarbazon.

Etapy a i b. Sól trójfluorooctanową D-Fen-ON-dwumetylohydroksamianową sporządzono zgodnie z etapami a i b przykładu IV.

Etap c.

A/ Sól trójfluorooctanową D-Fen-O,N-dwumetylohydroksamianową (5,000 g) rozpuszczono w suchym THF (20 ml). Powoli dodano N-metylomorfolinę (1,578 g) utrzymując temperaturę poniżej 30°C i uzyskaną mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C.

B/ CBZ-L-Ala (3,463 g) rozpuszczono w suchym THF (40 ml) mieszając i mieszaninę ochłodzono do temperatury -10°C. Dodano chloromrówczan izobutylu (2,158 g) w przeciągu 5 minut w temperaturze -10°C, dodano N-metylomorfolinę (1,578 g) w ciągu 10 minut i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -10°C przez dalsze 10 minut.

C/ Dwa roztwory A i B mieszano w temperaturze -10°C przez ponad 10 minut, po czym pozwolono aby temperatura mieszaniny wzrosła do temperatury pokojowej i mieszanie kontynuowano przez 3 godziny. Mieszaninę ochłodzono do 0°C, dodano 3-dwumetyloaminopropyloaminę (1,585 g) i reakcję przerwano przez zalanie wodą (50 ml). Dodano octan etylu (50 ml), fazę organiczną oddzielono i fazę wodną wyekstrahowano octanem etylu (2 X 30 ml). Warstwy organiczne połączono i przemyto kolejno (a) wodą (50 ml) i nasyconym wodnym NaCl (10 ml), (b) wodnym KHCO 3 (5%, 50 ml), (c) wodnym HCl (0,5 N, 50 ml) i (d) wodą (3 X 50 ml). Rozpuszczalnik odparowano w próżniowej wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Ciało stałe rekrystalizowano z octanu etylu otrzymując O,N-dwumetylohydroksamian CBZ-LAla-D-Fen.

Etap d. O,N-dwumetylohydr°ksamian CBZ-L-Ala-D-Fen (2,9 g) rozpuszczono w suchym THF (25 ml). Roztwór ochłodzono do temperatury -70°C w atmosferze azotu. Dodano wodorek dwuizobutyloglinu w THF (1 M, 37 ml) w przeciągu 10 minut w temperaturze -70°C i mieszanie kontynuowano przez dalsze 10 minut.

Reakcję przerwano przez zalanie nasyconym roztworem soli Rochella (125 ml) i THF (125 ml) mieszając w temperaturze -30°C przy przemywaniu N2 i mieszaninę odstawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej. Dodano octan etylu (100 ml) i fazę organiczną oddzielono. Warstwę wodną wyekstrahowano octanem etylu (2 X 30 ml) i warstwy organiczne połączono i przemyto wodą (3 X 100 ml). Mieszaninę reakcyjną przesączono i rozpuszczalnik odparowano w próżniowej wyparce obrotowej w temperaturze utrzymywanej poniżej 30°C. Dodano, a następnie usunięto octan etylu otrzymując aldehyd CBZ-L-Ala-D-Fen.

Etap e.

A/ Aldehyd CBZ-L-Ala-D-Fen (1,2 g) rozpuszczono w THF (20 ml) i metylowanym spirytusie technicznym (20 ml) i ogrzewano w temperaturze 50°C.

B/ Gorący roztwór chlorowodorku semikarbazydu (1,8 g) w wodzie (15 ml) dodano do gorącego roztworu KHCO3 (1,5 g) w wodzie (15 ml).

166 810

C/ Roztwór B dodano do roztworu A i uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze 50°C przez 4 godziny. Rozpuszczalnik odparowano w próżniowej wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Do pozostałości dodano wodę (50 ml), ciało stałe odsączono, przemyto wodą : meZylowanym sp^y^em 11:1) ż osuszono pod póóżmą nad P2O5 otrzymując

CBZ-L-Ala-D-FenSc.

Etap f. CBZ-L-Ala-D-FenSc (750 mg) rozpuszczono w metanolu (50 ml) i substancje nierozpuszczalne odsączono. Aparat zawierający roztwór metanolowy przemyto N 2 i dodano katalizator 10% pallad na węglu (100 mg). Do zamkniętego układu wprowadzano H 2 przez 30 minut. Katalizator odsączono, a rozpuszczalnik odparowano w próżniowej wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C i osuszono pod próżnią nad P2O5 otrzymując L-alanzlo-D-ftnyloalanylosemikarbaron (L-Ala-D-FenSc).

Przykład VII. L-tyrocznylo-L-fenyloalanylo semikarbazon.

Etapy a i b. Trójfluorooctanową sól O,N-dwlmetylohydroksamianu L-fenyloalaniny sporządzono zgodnie z etapami a i b przykładu IV.

Etap c.

A/ Sól trójfluorooctanową O,N-dwumetylohydroksamianu L-Fen (7,95 g) rozpuszczono w suchym DMF (30 ml) mieszając w temperaturze pokojowej. Dodano N-metylomorfolinę (2,49 g) w ciągu ponad 5 minut utrzymując temperaturę poniżej 30°C, a uzyskaną mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C.

B/ CBZ-OBZ-L-Tyr (10 g) rozpuszczono w suchym DMF (60 ml) mieszając i mieszaninę ochłodzono do temperatury -10°C. Dodano chloromrówccan izobutylu (3,39 g) w ciągu ponad 5 minut w temperaturze -10°C. Dodano N-dwumetylomorfolinę (2,49 g) w ciągu ponad 10 minut i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -10°C przez dalsze 10 minut.

C/ Roztwór A dodano do roztworu B w przeciągu ponad 15 minut w temperaturze -10°C, a następnie pozwolono, aby temperatura mieszaniny wzrosła do temperatury pokojowej i mieszanie kontynuowano przez dalsze 3 godziny. Mieszaninę ochłodzono do 0°C i dodano 3-dwumetyloaminopropyloaminę (2,52 g) w ciągu 5 minut. Wówczas dodano wodę (50 ml) i octan etylu (50 ml), górną warstwę organiczną oddzielono i przemyto kolejno (a) wodą (50 ml), (b) wodnym KHCO3 (5%, 50 ml), (c) wodnym HCl (0,5 M, 50 ml) i (d) wodą (3 X 50 ml). Rozpuszczalnik usunięto przez odparowanie w próżniowej wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C, a pozostałość rekrystalizowano z alkoholu izopropylowego otrzymując CBZ-0BZ-L-Tyr-L-Fen-O,N-dwumetylohydroksamian.

Etap d. O,N-dwumetylohydroksamian CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Fen (1,012 g) rozpuszczono w suchym THF (10 ml). Wodorek dwuicobutzloglinu w THF dodano w atmosferze N2 w przeciągu ponad 10 minut w temperaturze -70°C i mieszanie kontynuowano przez dalsze 10 minut.

Reakcję przerwano przez przelanie do metanolu (20 ml) i roztworu soli Rochella (30 ml) mieszając w temperaturze -60°C w atmosferze N2 i pozwolono aby temperatura mieszaniny wzrosła do temperatury pokojowej. Dodano wodę (50 ml) i octan etylu (50 ml) i oddzielono fazę organiczną, którą przemyto wodą (200 ml). Mieszaninę reakcyjną przesączono i rozpuszczalnik usunięto z przesączu przez odparowanie w próżniowej wyparce obrotowej przy temperaturze utrzymywanej poniżej 30°C. Wówczas dodano świeży octan etylu i odparowano w wyparce obrotowej. Otrzymane ciało stałe osuszono pod próżnią nad P2O5 otrzymując aldehyd CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Fen.

Etap e.

A/ Aldehyd CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Fen (400 mg) rozpuszczono w metylowanym spirytusie technicznym (20 ml) i THF (10 ml) i ogrzewano do temperatury 60°C.

B/ Gorący roztwór chlorowodorku semikarbazydu (600 mg) w wodzie (5 ml) dodano do gorącego roztworu KHCO 3 (500 mg) w wodzie (5 ml).

C/ Roztwór B dodano do roztworu A i uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze 60°C przez 2 godziny. Rozpuszczalnik odparowano w próżniowej wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C i pozostałość zalewając wodą. Ciało stałe odsączono, przemyto wodą i metylowanym spirytusem technicznym i osuszono nad P2O5 otrzymując CBZ-OBZ-LTyr-L-FenSc.

166 810

Etap f. CBZ-OBZ-L-Tyr-L-FenSc (770 mg) rozpuszczono w suchym THF (70 mg), przesączono, a następnie do przesączu dodano metanolu (20 ml). Aparat zawierający roztwór semikarbazonu przepłukano N2 i dodano katalizator 10% pallad na węglu (100 mg). Przez kilka godzin do zamkniętego układu doprowadzano H2. Katalizator odsączono, a rozpuszczalnik odparowano otrzymując L-tyrozynylo-L-fenyloalanylo semikarbazon (L-Tyr-L-FenSc).

Przykład VIII. L-alanylo-L-cykloheksyloalanylo semikarbazon.

Etap a.

A/ Chlorowodorek O,N-dwumetylohydroksyloaminy (8,51 g) mieszając dodano do suchego DMF (75 ml) i dodano N-metylomorfolinę (8,8 g) w ciągu ponad 5 minut utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Wytrącił się biały osad i mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C.

B/ N-t-Boc-L-Cha (22,5 g) rozpuszczono w suchym THF (200 ml) i ochłodzono do -10°C. Chloromrówczan izobutylu (11,94g) dodano w ciągu ponad 5 minut utrzymując w tym czasie temperaturę -10°C. Dodano N-metylomorfolinę (8,8 g) w ciągu ponad 10 minut utrzymując temperaturę -10°C i mieszanie kontynuowano przez dalsze 10 minut.

C/ Zawiesinę A dodano do zawiesiny B w przeciągu 15 minut w temperaturze -10°C po czym pozostawiono mieszaninę do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszanie kontynuowano przez 4 godziny. Mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C i dodano 3-dwumetyloaminopropyloaminę (8,6 g) w ciągu 5 minut i mieszanie kontynuowano przez dalsze 5 minut. Dodano wodę (200 ml) i octan etylu (100 ml) i warstwę wodną wyekstrahowano po oddzieleniu za pomocą octanu etylu (2X 100 ml). Połączone fazy organiczne kolejno przemyto (a) wodą (100 ml) i nasyconym wodnym NaCl (20 ml), (b) wodnym KHCO3 (5%, 100 ml), (c) wodnym HCl (0,5 N, 100 ml) i (d) wodą (3 X 100 ml). Rozpuszczalnik odparowano pod próżnią w wyparce obrotowej w temperaturze utrzymywanej poniżej 30°C otrzymując O,N-dwumetylohydroksamian N-t-Boc-L-Cha.

Etap b. O,N-dwumetylohydroksamian N-t-Boc-L-Cha (26 g) i kwas trójfluorooctowy (65 ml) mieszano w temperaturze 0°C przez 5 minut po czym pozwolono, aby temperatura wzrosła do temperatury pokojowej i mieszanie kontynuowano przez 3 godziny. Nadmiar kwasu trójfluorooctowego odparowano następnie pod próżnią w wyparce obrotowej przy utrzymywaniu temperatury poniżej 30°C. Do pozostałości dodano eter etylowy tworząc roztwór, po czym eter usunięto pod próżnią. Obróbkę eterem powtórzono do otrzymania żółtego oleju soli trójfluorooctanowej O,Ndwumetylohydroksamianu L-Cha.

Etap c.

A/ Sól trójfluorooctanową O,N-dwumetylohydroksamianu L-Ch (17g) rozpuszczono w suchym THF (50 ml). Dodano N-metylomorfolinę (3,95 g) w ciągu 5 minut utrzymując temperaturę poniżej 30°C i mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C.

B/ CBZ-L-Ala (9,25 g) rozpuszczono w suchym THF (100 ml) mieszając i mieszaninę ochłodzono do temperatury -10°C. Chloromrówczan izobutylu (5,35 g) dodano w ciągu 5 minut w temperaturze -10°C, N-metylomorfolinę (3,95 g) dodano w ciągu 10 minut i mieszaninę mieszano w temperaturze -10°C przez dalsze 10 minut.

C/ Roztwór A dodano do roztworu B w ciągu 15 minut w temperaturze -10°C, po czym pozwolono, aby temperatura mieszaniny wzrosła do temperatury pokojowej i mieszanie kontynuowano przez 3 godziny. Mieszaninę ochłodzono do 0°C dodano 3-dwumetyloaminopropyloaminę (3,98 g) w ciągu 5 minut i mieszanie kontynuowano przez dalsze 5 minut. Wówczas dodano wodę (150 ml) i octan etylu (150 ml), oddzielono fazę wodną i wyekstrahowano ją octanem etylu (2 X 75 ml). Połączone fazy organiczne kolejno przemyto (a) wodą (125 ml), (b) wodnym KHCO3 (5%, 125 ml), (c) wodnym HCl (0,5 N, 125 ml) i (d) wodą 3 X 125 ml. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Świeży octan etylu dodano i usunięto przez odparowanie otrzymując O,N-dwumetylohydroksamian CBZ-L-Ala-L-Cha.

Etap d. O,N-dwumetylohydroksamian CBZ-L-Ala-L-Cha (7,22 g) rozpuszczono w suchym THF (160 ml) i ochłodzono do temperatury -70°C w atmosferze N2. Dodano wodorek dwuizobutyloglinu w THF (1 M, 86 ml) w atmosferze azotu w ciągu 20 minut w temperaturze -70°C i mieszanie kontynuowano przez dalsze 20 minut.

166 810

Reakcję zatrzymano przez przelanie na roztwór soli Rochella (400 ml) mieszając w temperaturze 0°C w atmosferze N2 i pozostawiono mieszaninę aby ogrzała się do temperatury pokojowej. Dodano octan etylu (150 ml) i mieszaninę mieszano przez 5 minut. Mieszaninę reakcyjną przesączono, warstwę organiczną oddzielono i fazę wodną wyekstrahowano octanem etylu (2 X 50 ml). Połączone fazy organiczne przemyto wodą (3 X 200 ml), nasyconym wodnym NaCl dodanym do końcowych popłuczyn. Rozpuszczalnik odparowano w wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C otrzymując olej - aldehyd CBZ-L-Ala-L-Cha.

Etap e.

A/ Aldehyd CBZ-L-Ala-L-Cha (8 g) rozpuszczono w metylowanym spirytusie technicznym (50 ml) i ogrzano do temperatury 50°C.

B/ Gorący roztwór chlorowodorku semikarbazydu (3,0 g) w wodzie (25 ml) dodano do gorącego roztworu KHCO 3 (2,67 g) w wodzie (25 ml).

C/ Roztwór B dodano do roztworu A i uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze 50°C przez 3 godziny. Pozwolono na ochłodzenie mieszaniny i odstawiono ją na noc w temperaturze 4°C. Wiąkszość metylowanego spirytusu technicznego usunięto przez odparowanie w wyparce obrotowej utrzymując temperaturę ponieważ 30°C i dodano octan etylu (50 ml) do pozostałości. Fazę organiczną oddzielono przemyto kolejno (a) wodą (30 ml), (b) wodnym KHCO 3 (5%, 30 ml), (c) wodnym HCl (0,5 N, 30 ml) i (d) wodą (2 X 50 ml) z nasyconym wodnym NaCl dodanym w celu ułatwienia rozdziału. Rozpuszczalnik odparowano w wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Ciało stałe wykrystalizowane z izopropanolu i eteru dało CBZ-L-Ala-L-ChaSc.

Etap f. CBZ-L-Ala-L-ChaSc (900 mg) rozpuszczono w metanolu (30 ml) i dodano katalizator, 10% pallad na węglu w atmosferze N2. Do zamkniętego układu wprowadzano H 2 przez 6 godzin, po czym katalizator odsączono. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce obrotowej w temperaturze utrzymywanej poniżej 30°C i osuszono pod próżnią nad P2O5 otrzymując L-alanylo-L-cykloheksaloalanino semikarbazon (L-Ala-L-ChaSc).

Przykład IX. L-alanylo-L-leucynylo semikarbazon.

Etap a.

A/ Chlorowodorek O,N-dwumetylohydroksylaminy (9,17 g) mieszając dodano do suchego THF (110 ml) w temperaturze pokojowej. Utrzymując temperaturę poniżej 30°C dodano Nmetylomorfolinę (9,51 g) w przeciągu 5 minut. Wytrącił się osad i mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C.

B/ N-t-Boc-L-Leu (23,3 g) rozpuszczono w suchym THF (220 ml) i ochłodzono do temperatury -10°C. Dodano chloromrówczan izobutylu (12,90 g) w ciągu 5 minut utrzymując temperaturę -10°C. Dodano N-metylomorfolinę (9,51 g) utrzymując temperaturę -10°C, i kontynuując mieszanie przez dalsze 10 minut.

C/ Zawiesinę A dodano do zawiesiny B w ciągu 15 minut w temperaturze -10°C. Mieszaninę pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszano przez 3 godziny. Mieszaninę ochłodzono następnie do temperatury 0°C, dodano 3-dwumetyloaminopropyloaminę (9,13 g) w ciągu 5 minut i mieszanie kontynuowano przez dalsze 5 minut. Dodano octan etylu (110 ml) i wodę (110 ml) i warstwę organiczną oddzielono i przemyto kolejno (a) wodą (2 X 100 ml), (b) wodnym KHC03 (5%, 100 ml), (c) wodnym HCl (0,5 N, 100 ml) i (d) wodą (3X 100 ml). Rozpuszczalnik odparowano w wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C i otrzymano O,Ndwumetylohydroksamian N-t-Boc-L-Leu.

Etap b. O,N-dwumetylohydroksamian N-t-Boc-L-Leu (23,4g) i kwas trójfluorooctowy (165 ml, ochłodzony do 0°C) mieszano razem przez 18 godzin. Nadmiar kwasu trójfluorooctowego usunięto następnie przez odparowanie w wyparce obrotowej w temperaturze poniżej 30°C. Do pozostałości dodano eter etylowy tworząc roztwór, po czym eter usunięto pod próżnią. Powtarzano to dopóty, aż pojawiła się krystalizacja w temperaturze 4°C dając trójfluorooctową sól O,N-dwumetylohydroksamianu L-Leu.

Etap c.

A/ Trójfluorooctową sól O,N-dwumetylohydroksamianu L-Leu (1,8 g) rozpuszczono w suchym THF (10 ml) mieszając w temperaturze pokojowej. Mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C i w ciągu 5 minut dodano N-metylomorfolinę (0,635 g).

166 810

BZ CBZ-L-Ala (1,40 g) rozpuszczono w suchym THF (20 ml) i ochłodzono do temperatury -10°C. Crloromrówcean izobutylu (0,869 g) dodano w ciągu 5 minut w temperaturze -10°C, dodano N-metylomorfolin- (0,635 g) w ciągu 10 minut i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -10°C przez dalsze 10 minut.

C/ Roztwór A dodano do roztworu B w ciągu 15 minut w temperaturze -10°C, po czym pozwolono aby temperatura wzrosła do temperatury pokojowej i mieszanie kontynuowano przez 18 godzin. Mieseαnio- ochłodzono do temperatury 0°C, dodano 3-dwumetyloaminoprooyloaminę (0,64 g), po czym reakcję przerwano zalewając wodą (25 ml) i octanem etylu (25 ml). Fazę wodną oddzielono i wyekstrahowano octanem etylu (2 X 25 ml). Połączone fazy organiczne przemyto kolejno (a) wodą (50 ml) i nasyconym wodnym NaCl (aby wspomóc rozdzielenie), (b) wodnym (KHCoe/5%, 30 ml), (c) wodnym HCl (0,5 N, 30 ml) i (d) wodą (3X30 ml). Rozpuszczalnik odparowano w wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C i ciało stałe osuszono pod próżnią nad P2O5. Otrzymano O,N-dwumetylohydroksamian CBZ-L-Ala-L-Leu.

Etap d. O,N-dwumetylohydrokudmian CBZ-L-Ala-L-Leu (1,9 g) rozpuszczono w suchym THF (40 ml) i ochłodzono do temperatury -70°C w atmosferze N 2. Wodorek dwuizobutyloglinu w THF (1M, 29,5 ml) dodano do N 2 w ciągu 10 minut w temperaturze -70°C i mieszanie kontynuowano przez dalsze 10 minut.

Reakcję przerwano zalewając metanolem (50 ml) i roztworem soli Rochella (50 ml) mieszając w temperaturze -60°C w atmosferze N2, po czym mieszaninę pozostawiono, aby się ogrzała do temperatury pokojowej. Dodano wodę (50 ml) i octan etylu (50 ml) mieszaninę przesączono i warstwę wodną oddzielono i wyekstrahowano octanem etylu (2 X 50 ml). Połączone fazy organiczne przemyto wodą (3 X100 ml) i nasyconym wodnym NaCl dla lepszego rozdziału faz. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce obrotowej w temperaturze utrzymywanej poniżej 30°C, dodano świeży octan etylu po czym usunięto go w wyparce obrotowej otrzymując aldehyd CBZ-LAla-L-Leu.

Etap e.

A/ Aldehyd CBZ-L-Ala-L-Leu (6,7 g) rozpuszczono w metylowanym spirytusie przemysłowym (50 ml) i ogrzano do temperatury 50°C.

BZ Gorący roztwór KHCO 3 (9 g) w wodzie (30 ml) dodano do gorącego roztworu chlorowodorku semikarbazydu (10,8 g) w wodnie (30 ml).

C/ Roztwór B dodano do roztworu A i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej. Ciało stałe odsączono, przemyto metylowanym spirytusem technicznym : wodą (1:1 , 20 ml) i osuszono pod próżnią nad P2O5 otrzymując CBZ-L-Ala-L-LeuSc.

Etap f. CBZ-L-Ala-L-LeuSc (950 mg) rozpuszczono w metanolu (100 ml) i odsączono substancje nierozpuszczalne. Dodano dalszy metanol (50 ml) i aparat przemyto N2. Katalizator 10% pallad oc węglu (100 ml) dodano w atmosferze N 2 po czym przez 135 minut do zamkniętego układu wprowadzano H2. Katalizator odsączono, a rozpuszczalnik odparowano w wyparce obrotowej utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Ciało stałe osuszono pod próżnią nad P2O5 otrzymując L-alanklo-L-Leucynylo semikarbazon (L-Ala-L-LeuSc).

Przykład X. Wytwarzanie substancji podstawowej o powinowactwie chromatograficznym ukierunkowanym na miejsce aktywne - ECH-Sepharose 4B - L-Ala-L-FenSc.

ECH-SepharoseR 4 B (3 g wagi wilgotnej) przemyto na filtrze ze spiekanego szkła, wodnym NaCl (0,5 M, 240 ml), c następnie wodą (120 ml). Chlorowodorek N-etylo-N'-(3-dwumetyloaminoOzopylo)karbodwuimidu (EDC) rozpuszczono w wodzie do otrzymania 0,1 M roztworu EDC i pH roztworu EDC ustabilizowano na pH 4,5 przez dodanie kwasu solnego lub stałego octanu sodu. L-Ala-L-FenSc (10 mg) sporządzony tak jak opisano w przykładzie I rozpuszczono w metanolu (400 pl) i dodano do przemytego żelu wraz z wodnym EDC (0,1 M, 2,4 ml). Mieszaninę łagodnie mieszano w temperaturze 20°C przez 1 godzinę, pH doprowadzono do pH 4,5 w razie potrzeby i mieszanie kontynuowano w temperaturze 20°C przez 23 godziny. Następnie dodano L-glicyną do końcowego stężenia 1 M i mieszanie w temperaturze 20°C kontynuowano przez dalsze 3 godziny. Żel o powinowactwie chromatograficznym przemyto kolejno wodnym metanolem (50%, 60 ml), wodą (60 ml), , i buforem zastosowania (60 ml) i magazynowano w temperaturze 4°C.

166 810

Przykłady XI-XVIII. Wytwarzanie substancji podstawowych o powinowactwie chromatograficznym.

Każdą pochodną dwupeptydową sporządzoną tak jak opisano w przykładach II do IX sprzężono z żelową substancją podstawową w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie X otrzymując żele o powinowactwie chromatograficznym z przykładów XI - XVIII odpowiednio.

Przykład XIX. Chromatografia na zasadzie powinowactwa.

Suszony rozpyłowo lateks papaya (0,03 g białka) z firmy Powell i Scholefield, W. Bryt. w buforze zastosowania /fosforan sodu (50 mM), EDTA (1 mM), etanodiol (33%), pH 6,8/ plus dwutiotreitol (2 mM) lub cysteina (4mM) (1,5 ml) wprowadzono na 1 ml kolumnę każdej z substancji podstawowych o powinowactwie chromatograficznym z przykładów X - XVIII. Co najmniej jeden z pięciu różnych eluentów stosowano jak następuje:

Eluent A: Dwusiaczek hydroksyetylu (100 mM) w wodnym etanodiolu (33%) zawierającym cytrynian sodu (50 mM) i EDTA (1 mM), pH 4,5; kolumna przez noc równoważona przed elucją.

Eluent B: Dwusiarczek 2,2'-dwupirydylu (30 mM) w wodnym etanodiolu (33%) zawierającym cytrynian sodu (50 mM) i EDTA (1 mM), pH 4,5; kolumna równoważona przez noc przed elucją.

Eluent C: Dwusiarczek metylopirydylu (30 mM) w wodnym etanodiolu (33%) zawierającym cytrynian sodu (50 mM) i EDTA (1 mM), pH 4,5; kolumna równoważona przez noc przed elucją.

Eluent D: Kwas Marsalil (10 mM) w wodnym etanodiolu (33%) zawierającym wodorotlenek sodu (50 mM) i EDTA (25 mM), doprowadzony do pH 4,5 za pomocą kwasu octowego. Elucja ciągła.

Eluent E: HgCl2 (10 mM) w wodnym etanodiolu (33%) zawierającym octan sodu (50 mM), pH 4,5; elucja ciągła.

Elucję każdym eluentem oceniano przez kontrolę za pomocą A280 śladów eluowanego materiału po standardowej Mono S (Pharmacia) chromatografii. Wyniki zsumowano w tabeli 1 poniżej.

Tabela 1

Wiązanie i elucja chymopapainy

Peptyd inhibitujący	Substancja podstawowa (przykład nr)	A	B	Eluent C	D	E
L-Ala-L-FenSc	X	-	ND	+	+	+
L-Fen-L-FenSc	XI	-	+	+	+	+
L-Fen-L-FenMo	XII	-	+	ND	ND	ND
L-Fen-D-FenSc	XIII	-	ND	+	+	+
L-FenL-FenOx	XIV	+	+	ND	ND	ND
L-Ala-D-FenSc	XV	+	ND	ND	+	ND
L-Tyr-L-FenSc	XVI	+	ND	ND	+	ND
L-Ala-L-ChaSc	XVII	+	ND	ND	ND	+
L-Ala-L-LeuSc	XVIII	+	ND	ND	ND	+

+ Chymopapaina wiązana i eluowana — Chymopapaina nie wiązana i/lub nie eluowana

ND nie oznaczona

Przykład XX. Oczyszczanie chymopapainy.

(i) Dostępny w handlu suszony rozpyłowo lateks z Carica papaya (1 g) otrzymany z firmy Powell i Scholefield, W. Bryt. mieszano przez 1 godzinę z wodą destylowaną (5 ml) i nierozpuszczony materiał usunięto przez odwirowanie przy 9000 X g przez 30 minut w temperaturze 4°C. Płytki odrzucono, a pH supernatantu doprowadzono do pH 1,8 za pomocą kwasu solnego (1 m) w przeciągu 20 minut. Mieszanie kontynuowano w temperaturze 4°C przez 60 minut i pH ponownie doprowadzono do pH 1,8, jeśli zachodziła taka potrzeba.

(ii) Mieszaninę odwirowano przy 9000 X g przez 30 minut w temperaturze 4°C i płytki odrzucono.

166 810 25 (iii) . (a) pH supernatantu doprowadzono do pH 6,8 przez wkroplenie NaOH (5 M) w przeciągu 10 minut. Zaobserwowano, że w roztworze pojawiło się purpurowo-niebieskie zabarwienie.

(b) Otrzymany purpurowo niebieski roztwór dializowano ekstensywnie wobec 10 objętości buforu zastosowania /fosforan sodu (50mM), EDTA (1 mM), etanodiol (33%), pH 6,8/ przy trzykrotnych zmianach buforu. Dializant wirowano przy 4000 Xg przez 10 minut i zawartość białka zdekantowanego supernatantu zawierającego chymopapainę doprowadzono do około 30 mg/ml. Roztwór chymopapainy aktywowany przez dodanie cysteiny do końcowego stężenia 4mM i pozostawiono do odstania przez 15 minut w temperaturze 0°C.

(iv) Aktywowany roztwór chymopapainy stosowano na 8 ml kolumnę ECH-Sepharose^R sprzężonego z L-Ala-L-FenSc (sporządzone jak opisano w przykładzie X), uprzednio zrównoważoną buforem zastosowania przy szybkości przepływu 36 ml/cm²/godzinę. Kolumnę przemyto kolejno buforem zastosowania (2 objętości złoża), wodnym cytrynianem sodu (50 mM) w etanodiolu (33%), pH 4,5 (2 objętości złoża) i wodnym octanem sodu (50 mM); EDTA (25 ml); mersalilem (10 mM) w etanodiolu (33%), pH 4,5 (2 objętości złoża), a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.

(v) Chymopapaanę eeuowano wodnym octanem sodu (50 mM) zawieer-jcym merrahi (10 mM) (3 objętości złoża) i zbierano frakcje 4 ml. Aktywność enzymu z rluowanycy frakcji oznaczano na specyficzną aktywność przeciw BAPNA jak opisano powyżej.

Frakcje aktywne zbierano i dalej oczyszczano za pomocą chromatografii kationowymiennej na kolumnie z Mono-S HRr 10/10 (Pharmacia) za pomocą początkowego fosforanowego buforu z Na+ (50 mM), EDTA (1 mM); NaNe (0,01%), pH 7,2 i „granicznego buforu fosforanowego z Na+ (800mM), EDTA (1 mM), NaN3 (0,01%), pH 7,2. Elucję prowadzono przy gradiencie soli 2,7 mM/ml i szybkości przepływu 2 ml/minutę. Frakcje (4 ml) zbierano, stężenia białka oznaczano przez pomiar absorbancji przy 280 nm, a aktywność enzymu oznaczano przez hydrolizę BAPNA.

Frakcje zawierające chymoaaaainę zebrano i dializowano wobec destylowanej i dejonizowanej wody lub wodnej EDTA (1 mM) i suszono przez wymrożmie w celu magazynowania.

Przykład XXI. Oczyszczanie chymopapainy - wyniki oznaczeń BAPNA.

(i) Dostępny w handlu suszony rpzpyłowo lateks Carica aaaaya (1 g) z firmy Powell i Scholefield, W. Bryt. mieszano w wodzie (5 ml) przez 60 minut w temperaturze 20°C. Materiał nierozpuszczalny usunięto przez odwirowanie przy 9000 X g przez 30 minut w temperaturze 4°C. Płytki odrzucono, a pH supernatantu doprowadzono do pH 1,8 przez wk^plenie kwasu solnego (1 M) w przeciągu 20 minut. Mieszaninę mieszano przez 15 minut w temperaturze 4°C i po 5 minutach sprawodaono pH i dostosowano jeśli zachodziła potrzeba do pożądanej wartości.

(ii) Wytrącony osad usunięto przez odwirowanie przy 9000 Xg przez 30 minut w temperaturze 4°C.

(iii) (a) Supernatant doprowadzono do pH 7,0 przez wk^plenie w trakcie mieszania wodnego wodorotlenku sodu (5 M). Wytrącony osad usunięto przez odwirowanie przy 9000 X g przez 30 minut w temperaturze 4°C.

(b) Otrzymany supernatant naniesiono na kationooymirnną kolumnę Mono S HR 10/10 (Pharmacia), którą zrównoważono uprzednio wodnym Na24PO(/NaH2PO( (50 mM Na+) zawierającym EDTA (1 mM), pH 7,2 (bufor A). Po nałożeniu próbki kolumnę przemyto (2 ml/min) buforem A aż A280 powróciła do zera. Następnie zastosowano w kolumnie gradient (2,7 mM Na⁺/ml) do Na2HPO4/NaH 2PO4 (0,80 M Na+) i zbierano 4 ml frakcje. Frakcje oznaczano na aktywność przeciw BAPNA. Szeroki pik chymopapainy, oznaczony immunologicznie, eluował między 0,17 - 0,28 M Na+. Zebrano frakcje aktywne przeciw BAPNA w tym regionie i dodano etanodiolu do 33% (obj/obj). Wszystkie inne frakcje, łącznie z frakcjami aktywnymi przeciw BAPNA w później eluującym (0,47 - 0,59 M Na+) piku aaaaya proteinazy III, odrzucono.

(iv) Kolumnę (objętość złoża 15 ml) z ECH-SepharoseR sprzężoną z L-Ala-L-FenSc (sporządzoną jak opisano w przykładzie X) przemyto (39 ml/godzinę/cm²) wodnym NaH2PO4/Na^^PO4 (50 mM Na+) zawierającym EDTA (1 mM) w etanodioru (33% obj/obj), pH 6,8 (bufor zastosowania). Zebraną chymopapainę (powyżej) aktywowano przez dodanie zasady cysternowej (stężenie końcowe 4mM) i pozostawiono na 15 minut w temperaturze 0°C. Nałożono to na kolumnę, po czym 60 ml buforu zastosowania.

166 810 (v) Następnie ^<005*^0 bufor z octanu sodu (odiuM), pH4,5 zawierająer HgCH (10mM, 45 ml). Zebrano 5 frakcji. Frakcje oznaczono na aktywność przeciw BAPNA.

Frakcje zawierające pik aktywności, który był opóźniony przez kolumnę i eluowany buforem zawierającym HgCh zebrano i ponownie stosowano na kolumnę Mono S. Kolumnę przemyto buforem A, a następnie 7 objętościami złoża buforem A zawierającym zasadę cysteinową (4mM). Przepływ wstrzymano na 30 minut, pozwalając aby rtęć została wyparta z enzymu. Następnie wznowiono przepływ i kolumnę z powrotem przemywano buforem A przed zastosowaniem gradientu do NaH 2PO4/Nf2HPO4 (0,80 M Na⁺) jak opisano powyżej. Frakcje aktywne przeciw BAPNA połączono, dodano zasadę cysteinową (4 mM końcowe stężenie) i zebraną całość pozostawiono na 15 minut w tamepraturze 0°C.

Kolumnę upakowano żywicą Chelex (Bio-Rad, W. Bryt., 0,5 g) i przemyto buforem A. Zebraną całość zawierającą chymopapainę przepuszczano przez kolumnę Chelex, po czym ekstensywnie dializowano do wodnego EDTA (1 mM) po czym osuszono przez w^mrożenie.

Uzyskany postęp przy oczyszczaniu chymopapainy zsumowano w tabeli 2.

Tabela 2

Oczyszczanie ghcmoaaaainy

	Białko (mg)	Aktywność BAPNA* (jede.)	Aktywność właściwa* BAPNA (jedn. mg-1)	Wydajność* (%)	Oczyszczanie (krotność)
Lateks suszony -caayłcwc	441	493.712	1.120	100	1
Obróbka kwasem	361	238.636	661	48	0,59
Chromatografia kFticncwcmiannF	58	133.748	2.306	27	2,06
SaphF-csa - L·LlFeLeFanSg	27,5	112.475	4.000	23	3,65
Chromatografia kFticnowymiannF	U	44.687	4.062	9	3,63
Chelex	10,5	43.301	4.124	9	3,68

f Podana wydajność jest wydajnością aktywności przeciw BAPNA (również substrat dla papainy i papaya a-ctaieaac III) x Oznaczanie BAPNA metodą nr 2

Przykład XXII. Wytwarzanie chymopapainy - specyficzne przeciwciała IgG wyhodowane w króliku.

Czystą chymopapainę sporządzoną jak opisano w przykładzie XXI łagodnie karboksymetylowano przed użyciem metodą opisaną przez Zuckera i wsp. (1985) loc. cit. Surowicę odpornościową wobec chymoaapαiey wyhodowano w króliku przez domięśniową iniekcję 360pg karboksymetylowanego białka w kompletnej substancji pomocniczej Freunda, a następnie po 14 dniach przez podskórną iniekcję 100pg w niekompletnej substancji pomocniczej. IgG była częściowo oczyszczona od przeciwciał za pomocą frakcjonowania siarczanem amonu jak opisali Heide i Schwick (1978) loc. cit. i następną dializę do wodnego fosforanu sodu (10 mM) zawierającego NaCl (0,14 M), pH 7,3.

Przykład XXIII. Oczyszczanie chymopapainy i immunologiczne oznaczanie ilościowe chymopapainy i PPIV.

(i-iii) Dostępny w handlu suszony roaayłowc lateks Carica papaya (1 g) z firmy Powell i Scholefield, W. Bryt. sporządzono i poddano obróbce doprowadzającej pH do 1,8 tak jak opisano w przykładzie XXI (i-iiia).

(iv) Kolumnu mobjętobc ztoća 15 m11 ECH-Sephsease^R cpaz^aoaępo z LoAla-L-FenSc (epgrzac dzonego jak opisano w przykładzie X) przemywano tak jak opisano w przykładzie XXI (iv). Końcowy szpereαtαet z obróbki pH 1,8 dializowano do wodnego NaH 2PO4/Na2HPO4 (50 mM Na+) zawierającego EDTA (1 mM) w etanodiolz (33% obj/obj) pH 6,8 (bufor zastosowania), wirowano przy 4000 X g przez 10 minut i supernatFet aktywowano przez dodanie dwutiotreitolu (2mM stężenie końcowe) przez 15 minut w tamaprFturze 20°C. Następnie wprowadzano go na kolumnę pracującą na zasadzie powinowactwa (39 ml/Lcdz/cm2), a następnie 60 ml buforu zastosowania. Następnie do kolumny stosowano bufor z cytryeiaeam sodu (50 mM), pH 4,5 zawierający

166 810

EDTA (1 mM) i dwusiarczek metylopirydylowy (30 mM, 15 ml) [zsyntezowany tak jak opisał Salif i wsp., Biochem. J. (1987), 247, 181-193]. Wstrzymano przepływ i bufor zawierający dwusiarczek pozostawiono na noc w kolumnie.

(v) PrzePfyw wznowiono z do datkiem 45 mltego samego buforu zawierająeego dwusiarczek metylopirydylu, a następnie 30 ml buforu zastosowania. Przez cały czas zbierano 5 ml frakcje.

Frakcje oznaczono na aktywność przeciw BAPNA. Frakcje zawierające pik aktywności, które opóźniane w kolumnie i eluowane buforem zawierającym dwusiarczek metylopirydylu zbierano i stosowano (40 ml/godzA^) do kolumny (objętość złoża 80 ml) zawierającej SephadexR LH-20 (Pharmacia) zrównoważony uprzednio wodnym EDTA (1 mM) w etanodiolu (33% obj/obj). Chromatografię kontynuowano przy zastosowaniu 300 ml tego buforu. Frakcje (8 ml) obserwowano za pomocą Δ A271 i oznaczono na aktywność wobec BAPNA.

Frakcje zawierające szczyt aktywności przeciw BAPNA (po których występował dalszy pik A271) zbierano i stosowano do kαtiooowymiennej kolumny Mono S HR 1^./10 prowadzonej jak opisano w przykładzie XXI (iiib). Frakcje aktywne przeciw BAPNA łączono.

Suszony rozpyłowo lateks i materiał odebrany z obróbki doprowadzającej do pH 1,8, chromatografii pracującej na zasadzie powinowactwa i chromatografii katiooowymieooej analizowano na obecność PPIV za pomocą pojedynczej radialnej immunodyfuzji jak opisano powyżej.Tę samą metodę stosowano do oznaczenia ilościowego chymopapainy, z monospecyficenym przeciwciałem dla chymopapainy wyhodowanym w króliku, spo^dzonym jak opisano w przykładzie XXII. Krzywą standardową dla chymopapainy otrzymano przez zastosowanie chymopapainy oczyszczonej opisaną tu metodą, dla której wykazano, że jest wolna zarówno od PPIV jak i PPIII za pomocą pojedynczej radialnej immunodyfueji. Wyniki przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3

Oczyszczanie chymopapainy i immunologiczne oznaczanie ilościowe chymopapainy i PPIV

	Białko (mg)	AktywnnśćX specyficzna BAPNA (jedn. mg’1)	Chymopapaina (mg)	PPIV/ % całego białka
Lateks suszony rnzpyłnwn	468	1000	144	18,7
Traktowanie kwasem	157	1.433	92	0,1
Sepharose - L-Ala-L-FenSc	24	4.000	28	ND
Chromatografia katinonwymienna	15	3.533	14	ND

ND - nie wykryte ^M/ oznaczenie BAPNA metodą nr 2

Badanie uczulenia na chymopapainę

Czterdzieści próbek surowicy ludzkiej zakupiono z Systemu Diagnostycznego 3M, Stany Zjednoczone. Próbki te podlegały już ogólnie stosowanego testu znanego pod nazwą handlową Chymofast” na IgG przeciw ogólnie dostępnej postaci chymopapainy ChymodiactinR. Dwadzieścia próbek oznaczono jako dodatnie i dwadzieścia jako ujemne wobec Chymofast. Na czterdziestu próbkach naklejono ślepe naklejki i dalej oznaczano na naturalnie nabyte przeciwciała przeciw ChymodiactinieR, PPIII, PPIV i przeciw oczyszczonej chymopapainie (oczyszczonej opisanym tu sposobem i jak wykazano wolnej zarówno od PPIV jak i PPIII za pomocą pojedynczej radialnej immunodyfuzji, przy użyciu zmodyfikowanej próby z immuoosorbentem o przyuczonym enzymem w fazie stałej (ELISA) z wykorzystaniem układu biotyna - awidyna, według poniższego zestawienia:

Płytki do mikromiarecekonania pokryto: Badanym antygenem

Badaną surowicą Monoklooaloą preeciwludzko IgE Biotynylowaoą króliczą przeciw-mysią Ig Kompleksem awidyna-peeoksydaea Substratem (ABTS)

Stop i pomiar A410

166 810

Chymodiactin* była użyta w ramach daty ważności, PPIV była oczyszczana jak opisano tutaj, a PPIII była oczyszczana zgodnie z Buttle'a i Barretta (1984), loc. cit. Wszystkie antygeny były dezaktywowane za pomocą łagodnego karboksymetylowania z kwasem jodooctowym (10 mM) jak opisali Buttle i Barrett (1984), loc. cit. zastosowanie wcześniejsze.

Wgłębienia w płytce do mikromiareczkowania pokryte były badanym antygenem przez inkubowanie każdego wgłębienia z 100 pl badanego antygenu (10 pg/ml) w buforze węglanu sodu (0,05 M, pH 9,6). Następnie zastosowano surowicę dawcy końskiego (4%) w celu zredukowania nie specyficznego wiązania w następnych etapach. Inkubowanie z badaną surowicą (rozcieńczenie 1/20) w PBS (0,1% Tween, 2% surowica końska, 10 mM EDTA, 50pg/ml heparyny; pH 7,2/100pl/wgłębienie) w temperaturze 37°C prowadzono przez 4 godziny, następnie z monoklonalną przeciwludzką IgE (sporządzoną jak opisali Kemeny i Richards w J. Immunol. Methods (1988), 108,105 -1 pl / wgłębienie) w temperaturze 37°C przez 3 godziny, po czym z biotynylowaną króliczą przeciwmysią immunoglobuliną (dostępną z Dakopatts, Dania - 1 pg/ml, 100pl / wgłębienie) w temperaturze pokojowej przez noc. Wgłębienia inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C z awidyną - peroksydazą (10pl/ml, 100 pl / wgłębienie), substratem [kwasem 2,2'azynobis(3-etylobenztiazolino sulfonowym), ABTS, 0,5 mg/ml] w buforze (100 mM kwasu cytrynowego, 200 mM Na2HPO4, pH 4,2, aktywowany 1 pg/ml H2O2) i wgłębienia inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Reakcję zatrzymano przez dodanie 100pl/wgębienie 100 mM kwasu cytrynowego, 0,01% NaN3 i oznaczono absorbancję przy 410 nm dla każdego wgłębienia przy użyciu czytnika Mikro ELISA (Dynatech). Standardy IgE oznaczano w zakresie 0,075 - 4,8 ng/ml (2,4 ng IgE = 1 międzynarodowej jednostce IgE). Stosowano program Enzfittera (Leatherbarrow, R. J., 1985, Enzfitter dla IBM PC, Elsevier-Biosolf, 68 Hills Road, Cambridge CB2 1LA, W. Bryt.) do obliczania stężeń IgE skierowanych przeciw każdemu z czterech preparatów antygenowych, Chymodiactin”, PPIII, PPIV i chymopapainie sporządzonej tak jak opisano w przykładzie XXIII.

z 40 próbek surowicy zawierało przeciwciała IgE przeciw Chymodiactin”, a wartości otrzymane dla PPIII, PPIV i chymopapainy z dwunastu najbardziej reaktywnych przeciw Chymodiactin” przedstawiono poniżej w tabeli 4. Przeciętne i standardowe wartości błędu pochodziły z dziewięciu oznaczeń.

Widać, że z 12 próbek surowicy zawierających antyciała przeciw chymopapainie tylko w dwóch anty-chymopapaina reprezentuje główną reakcję IgE. Na przeciwciała przeciw PPIII i PPIV przypada około 75% wykrytej IgE.

Tabela 4

Specyficzne stężenia IgE (jedn. międzyn./ml) w próbkach surowicy zawierających przeciwciała IgE przeciw Chymodiactin

Próbka	PPIV	PPIII	Chymopapaina	. Razem	% Chymopapainy
średnio	SEM	średnio	SEM	średnio	SEM
1	19,9	1,7	18,8	1,7	8,2	1,3	46,9	18
2	5,1	0,3	4,0	0,1	3,2	0,4	12,3	26
3	5,9	0,4	2,7	0,3	1,2	0,3	9,8	12
4	1,8	0,1	2,3	0,2	1,7	0,1	5,8	29
5	3,4	0,2	2,0	0,2	1,6	0,3	7,0	23
6	3,1	0,2	0,3	0,01	0,3	0,03	3,7	8
7	2,6	0,2	1,6	0,2	0,9	0,2	5,1	18
8	2,0	0,1	1,1	0,1	1,3	0,2	4,4	30
9	1,5	0,2	0,3	0,07	1,7	0,2	3,5	49
10	1,0	0,1	0,3	0,09	0,5	0,1	1,8	28
11	3,6	0,4	1,4	0,2	0,7	0,07	5,7	12
12	0,6	0,1	0,4	0,09	2,3	0,2	3,3	70
Razem	50,5		35,2		23,6		109,3	średnio 22

166 810 29

Przykład XXIV. Inhibitowanie mieszanin chymopapainy i PPIV za pomocą cystatyny kurczęcej.

Chymopapainę oczyszczono tak jak opisano w przykładzie XXIII i standaryzowano przez miareczkowanie aktywnego miejsca za pomocą E-64 stosując BAPNA jako substrat (Zucker i wsp., 1985, Biochem. Biopyhys. Act 828, 196 - 204). PPIV oczyszczono jak opisano powyżej i również miareczkowano za pomocą E-64 przystosowując metodą, w której jako substarat stosowana jest azokaztina.

Cystatynę kurczęcą, postać 2 oczyszczono jak opisano przez Anastasi i wsp., 1983, Biochem. J. 211, 129 - 138 i standardyzowano przez miareczkowanie za pomocą papainy, którą uprzednio miareczkowano E-64.

Próby do hydrolizy azokazeinowej wykonano metodą Rowana i wsp., 1988, loc. cit., z tym wyjątkiem, enzymy inkubowano wstępnie przez 15 minut w temperaturze 40°C i przed dodaniem do substratu włączono inhibitor.

Wzięto dwa komplety po 9 probówek i w każdej probówce umieszczono 125 μl 0,40 M buforu fosforanu sodowego zawierającego 4 mM EDTA i 16 mM zasady cysternowej, pH 6,8. Chymopapainę i PPIV dodano w różnych stosunkach do końcowego stężenia proteinazy 100 nM. Do jednego kompletu probówek dodano cysteinę kurczęcą do końcowego stężenia 1 μM i do drugiego kompletu taką samą objętość wody. Następnie próbki inkubowano wstępnie i oznaczono aktywność hydrolizującą acokazeiny.

Działanie cystatyny kurczęcej na hydrolizę αcokazeiny przez mieszaninę enzymów wyrażono jako % inhibicji aktywności wytworzonej przez te same mieszaniny enzymów pod nieobecność cystatyny jak pokazano w tabeli 5.

Tabela 5 % inhibitowania cystatyną kurczęcą mieszanin chymopapainy i PPIV

PPIV (nM)	Chymopapaina (nM)	A366 -cystatyna	A366 + cystatyna	% inhibicji
100	0	0,092	0,094	0
80	20	0,158	0,102	35,4
70	30	0,191	0,088	54,0
60	40	0,316	0,06	80,0
50	50	0,347	0,058	83,3
40	60	0,428	0,066	84,5
30	70	0,543	0,028	94,8
20	80	0,588	0,033	94,4
0	100	0,733	0,008	98,9

Można zauważyć, że stopień inhibitowania przez cystatynę kurczęcą jest odwrotnie zależna od stężenia PPIV.

Przykład XXV. Oczyszczanie chymopapainy przez wytrącanie kwasem przy pH 2,2 - 1,2. /i/ Dostępny w handlu suszony rozpyłowo lateks Carica papaya otrzymany z firmy Powell i

Scholefidd, W. Bryt. uzupełniono do 20% (wagobj) wodą destylowaną i mieszano przez 1 godzinę. Nierozpuszczalny materiał usunięto przez odwirowanie przy 9000 X g przez 30 minut w temperaturze 4°C. Płytki odrzucono, a pH supernatantu obniżono przez dodanie kwasu solnego (1M) wkraplając go w temepraturre 4°C z szybkością 40pl/minutę/ml. pH mieszaniny w sposób ciągły śledzono przy użyciu Radiometru z kombinowaną elektrodą (Typ GK 2401C) kalibrowaną buforami standardowymi o pH 4,01 i pH 1,09 (Radiometr, 25°C). Przy pH 2,2 i przy przedziałach 0,2 jednostki pH w dół do pH 1,2 dodawanie kwasu wstrzymano i utrzymywano stałe pH, podczas gdy mieszanie kontynuowano w temperaturze 4°C. Części (równoważne 10 ml wyjściowego roztworu) następnie odebrano i magazynowano. Dodawanie kwasu kontynuowano do pozostałego roztworu, aż do osiągnięcia następnego przedziału pH.

/ii/ Wszystkie próbki odwirowano przy 9000 X g przez 30 minut w temperaturze 4°C i płytki odrzucono.

166 810 /\ά/ pH każdego supernatantu doprowadzono do pH 6,8 przez wkroplenie (^łOizl/min/NaOH/1 M). Każdą próbkę ponownie odwirowano przy 9000 X g przez 30 minut w celu usunięcia dodatkowego osadu.

W dalszych próbkach wytrącanie kwasem przy pH 1,8 prowadzono w temperaturze 25°C.

Każdy z końcowych supernatantów oznaczano na aktywność przeciw BAPNA oraz na obecność PPIV i chymopapainy według wynalazku za pomocą pojedynczej radialnej immunodyfuzji jak opisano dotychczas. Wyniki przedstawione w tabeli 6 wskazują, że usunięcie PPIV do poziomów <0,1 % całkowitej ilości białka osiąga się przez wytrącenie kwasem w temperaturze 4°C przy pH 1,8 i poniżej <0,5% przez wytrącenie w temperaturze 25°C przy pH 1,8.

Tabela 6

Warunki	Temperatura (°C)	Białko (mg)	Aktywność’ BAPNA (jedn. X 105)	Aktywność’7 specyficzna BAPNA (jedn. mg-1)	Chymopapaina (mg)	PPIV (% całkowitego białka)
Roztwór wyjściowy -	946	15,8	1670	208	20,30
pH 2,2	4	848	9,5	1120	231	7,56
pH 2,0	4	865	9,1	1052	230	1,20
pH 1,8	4	796	9,0	1131	199	0,09
pH 1,6	4	828	7,7	930	224	0,06
pH 1,4	4	869	7,8	898	225	0,05
pH 1,2	4	784	7,1	906	166	0,03
pH 1,8	20	925	8,3	897	269	0,43

’ Próba BAPNA metodą nr 2

Przykład XXVI. Wytwarzanie monospecyficznych przeciwciał IgG wyhodowanych w owcy.

Czystą chymopapainę sporządzoną jak opisano w przykładzie XXI łagodnie karboksymetylowano przed użyciem za pomocą metody opisanej przez Zuckera i wsp. (1985) loc. cit. i dializowano z wodnego fosforanu sodu (10 mM, pH 7,3 zawierającego NaCl/0,14M). W owcy wyhodowano surowicę odpornościową wobec chymopapainy przez domięśniową iniekcję 100 μ karboksymetylowanego białka w kompletnej substancji pomocniczej Freunda, a następnie po miesiącu 50 pg podanej w ten sam sposób. IgG częściowo oczyszczono z surowicy odpornościowej przez frakcjonowanie z siarczanem amonu jak opisał Heide i Schwick (1978) loc. cit. z następną dializą do wodnego fosforanu sodu (10 mM) zawierającego NaCl (0,14 M), pH 7,3.

W podobny sposób sporządzono preparaty przeciwciał IgG przeciw papainie, papaya proteinazie III i papaya proteinazie IV.

Indywidualne karboksymetylowane antygeny oddzielnie sprzężono zgodnie z instrukcją producenta z kolumną dostarczoną pod nazwą handlową Zetaffinity (Anachem) zrównoważono w wodnym fosforanie sosu (10 mM), pH 7,3 zawierającym NaCl (0,14 M). Potencjalnie zanieczyszczające lub reagujące przeciwciała zaabsorbowano z preparatów IgG przez przepuszczenie przez te kolumny, tak ażeby finalne preparaty IgG dały reakcje przeciwciał precypitujących z ich odpowiednimi antygenami, ale bez reakcji precypitujących różne antygeny. Kolumny z przyłączonymi antygenami reagenerowano w celu ponownego użyciu wodną dwuetyloaminą (0,05 M), pH 11,5 i niezwłocznie ponownie zrównoważono w buforze fosforanowym.

W ten sposób sporządzono mono-specyficzne preparaty przeciwciał IgG przeciw chymopapainie, PPIII, PPIV i papainie które mogły być stosowane do ilościowych oznaczeń każdego antygenu za pomocą pojedynczej radialnej immunodyfuzji jak opisano powyżej.

Przykład XXVII. Oczyszczanie chymopapainy - wytrącenie kwasem przy pH 1,5.

/i/ Dostępny w handlu suszony rozpyłowo lateks Carica Papaya (20 g) z firmy Siebels, St. Zjedn. mieszano w wodzie dejonizowanej i destylowanej (ochłodzonej wstępnie do temperatury 4°C, 250 ml) przez 60 minut w temperaturze 0°C. pH mieszaniny doprowadzono do pH 1,5 przez dodanie HC1 (1 N) z szybkością 10 μl/min/ml w czasie ciągłego monitoringu przy użyciu Radiometru z kombinowaną elektrodą (Typ GK 2401C) kalibrowanego za pomocą buforów standardowych

166 810 31 pH 4,01 i 1,09 (Radiometr, 25°C). Gdy osiągnięto pH 1,5 pozostawiono na okres 10 minut dla ustabilizowania się pH i po tym czasie skorygowano pH, jeśli zachodziła taka potrzeba.

/ii/ Mieszaninę wirowano przy 12000 Xg przez 30 minut w temperaturze 4°C i odrzucono płytki.

/iii/ (a) pH suoernatantu doprowadzono do pH 7,0 przez dodanie NaOH (1 M) z szybkością 10pl/min/ml w tym czasie monitorując w sposób ciągły pH przy użyciu Radiometru z elektrodą kalibrowaną standardowym buforem o pH 7,01 (Radiometr, 25°C). Gdy osiągnięto pH 7,0 pozostawiono na 10 minut dla ustabilizowania się pH i w tym czasie, jeśli zachodziła potrzeba korygowano pH. Mieszaninę wirowano przy 12000 X g przez 30 minut w temperaturze 4°C i płytki odrzucono.

(b) Supernatant dializowano ekstensywnie w temperaturze 4°C wobec 30 objętości dejonizowanej i destylowanej wody z dwoma zmianami dokonanymi w przedziałach 12 godzinnych.

Dializowany roztwór dalej oczyszczano za pomocą chromatografii kationowymiennej na kolumnie S-Sepharose High Performance 35/100 (Pharmahia). W każdej szarży użyto maksymalnie 3 g białka (oznaczonego przez A280). Kolumny równoważono wstępnie za pomocą wodnej EDTA (1mM) w temperaturze 4°C. Po naniesieniu próbki kolumnę przemyto wodną EDTA (1 mM) przy szybkości 10 ml/minutę aż A28O wróciła do zera.

Stosowano gradient (0,175 mM K⁺/ml) do 0,5 M K+ w kolumnie przez cały czas zbierając frakcje 25 ml. Frakcje z pikiem oznaczono na aktywność przeciw BAPNA.

Frakcje zawierające chymopdoaiy- z najwyższą aktywnością specyficzną przeciw BAPNA (eluowanie pomiędzy 0,17 a 0,22 M K+) zebrano razem. Zebraną chymooaodinę ekstensywnie dializowano w temperaturze 4°C wobec 30 objętości wody dejonizowanej i destylowanej przy pięciu zmianach w przedziałach 12 godzinnych. Dializat suszono przez wymrożenie i magazynowano w temperaturze -20°C.

Całe postępowanie przy oczyszczaniu powtórzono przy wielu okazajach. Obecność chymopapdiyy według wynalazku, papainy, PPIII i PPIV oznaczono za pomocą pojedynczej radialnej immunodyfuzji jak opisano powyżej, a przeciwciała wyhodowane w owcy jak opisano w przykładzie XXVI. Aktywność przeciw BAPNA i miareczkowanie miejsca aktywnego za pomocą kwasu jodooctowego oceniano przy użyciu BAPNA metodą nr 1 opisaną powyżej. Postępy przy oczyszczaniu zsumowano poprzez podanie średnich wartości pokazanych w tabeli 7.

Tabela 7

	Całe białko (mg)	Aktywność uoehkfihyod BAPNA (jedn. mg-1)	Miejsca aktywne (%)	hrymoodOdioą (% całego białka)	PPIV ^całego białka)	PPIII (% całego białka)	pd0diOd (% całego białka)
Materiał wyjściowy	10203	572	30	25	22	14	. 5
pH 1,5	8168	461	28	30	0,1	14	<0,1
dializa	4351	674	42	59	0,1	24	<0,1
chromatografia kdtiooowymieood	948	1079	72	100	0,1	<0,1	<0.1
dializa	767	1098	89	100	0,1	<0,1	0,1
suszenie przez wymzożeoie	ND	905/	ND	ND	ND	ND	ND

ND - nie ozodhzooe

Białko ustalone na podstawie całej suchej masy

Kolumny wstępnie równoważono wodną EDTA (1 mM) w temperaturze 4°C. Po nałożeniu próbki kolumnę przemyto wodną EDTA (1 mM) przy przepływie 10 ml/min aż A280 powróciła do zera. Do kolumny wprowadzono 3 objętości złoża wodnego K2HPO4/KH2PO4 (50 mM K⁺), pH 7,2 zawierającego EDTA (1 mM) i L-cysteinę (500 mM) i na 30 minut zatrzymano przepływ. Dalsze 3 objętości złoża świeżo sporządzonego buforu cysteinowego wprowadzono do kolumny i zatrzymano przepływ na 30 minut. Kolumnę przemyto dalszymi 6 objętościami złoża buforu cysteino32 166 810 wego, a następnie ponownie zrównoważonym wodnym K2HPO 4/KH2PO4 (50 mM K+) zawierającym EDTA (1 mM), pH 7,2.

W kolumnie zastosowano gradient (0,175 mM K+/ml) do 0,5 M K+i cały czas zbierano 25 ml frakcje. Frakcje piku oznaczono na aktywność przeciw BAPNA. Pierwszym pikiem eluowanym między 0,2 do 0,25 M K+ była chymopapaina. Drugim pikiem eluowanym przy około 0,45 M K+ była papaya proteinaza III.

Zebrano razem frakcje zawierające chymopapainę o najwyższej aktywności specyficznej przeciw BAPNA. Zebraną chymopapainę ekstensywnie dializowano w temperaturze 4°C przeciw 30 objętościom dejonizpwanej i destylowanej wody z pięcioma zmianami wody w przedziałach 12 godzinnych.

Chymopapaina eluowana z kolumny kationpwymiennej była aktywowana buforem cysternowym, a zatem była podatna na dezaktywację przez utlenianie. Ażeby zasadniczo zapobiec lub obniżyć dezaktywację aktywnego enzymu przez utlenianie, frakcje zbierano w probówkach zawierających zawiesinę trtratipneanu sodu (200 mM) do otrzymanego stężenia końcowego 5mM NaS4Oe w każdej frakcji. Alternatywnie zebraną razem chymopapainę dializowano w atmosferze azotu wobec wody, którą przemywano tlenem przez przepuszczanie pęcherzyków z azotem z szybkością 0,11/min przez 30 minut w pojemniku zamkniętym w atmosferze azotu.

W końcu dializat był suszony przez wymrożenie i magazynowany w temperaturze -20°C.

Całą procedurę oczyszczania powtórzono wielokrotnie i postęp oczyszczania (oznaczony jak opisano w przykładzie XXVIII), zsumowano za pomocą wartości średnich przedstawionych w tabeli 8.

Tabela 8

	Całe białko (mg)	Aktywność specyficzna BAPNA (jedn. mg!	Miejsca aktywne (%)	Chympaaaaena (% całego białka)	PPIV (% całego białka)	PPIII (% całego białka)	papaina (% całego białka)
Materiał wyjściowy	25508	572	30	25	22	14	5
pH 1,5	20421	401	28	30	<0,1	14	<0,1
dializa	10877	674	42	59	<0,1	24	<0,1
oepyarpor L-Ala-L-FenSc	1673	1446	86	66	<0,1	13	<0,1
chromatografia katipnpwymienna	951	1625	100	100	<0,1	<0,1	<0,1
dializa	828	1743	100	ND	ND	ND	ND
suszenie przez ^mrożenie	ND	1320-	ND	ND	ND	ND	ND

ND - nie oznaczone

- białko ustalone na podstawie całej suchej masy

Przykład XXVIII. Oczyszczanie cyymoaaaainy - wytrącanie kwasem przy pH 1,5 i chromatografia na zasadzie powinowactwa.

/i-iii/ Dostępny w handlu suszony ^pyłowo lateks Carica papaya z firmy Si^els, St. Zjedn. sporządzono i poddano obróbce do pH 1,5, dializie i chromatografii kationowymiennej na SSrpyarpse^R jak opisano w przykładzie XXVII.

/iv/ Frakcje zawierające chympaaaainę o najwyższej aktywności specyficznej przeciw BAPNA zebrano i dodano etanodioru do 33% (obj/obj). Dodano świeżo sporządzony roztwór L-cysteiny (200 mM) do stężenia 4 mM i roztwór stosowano na kolumnę EhH-SepharosrR sprzężonym z L-Ala-L-FenSc jak opisano w przykładzie XXVIII /iv/.

/v/ Chymopapainę rluowano 3 objętościami złoża wodnym HgCl2 (10 mM) w etanodiolu (33% obj/obj) zawierającym octan sodu (50 mM), pH 4,5 i 25 ml frakcje zbierano. Frakcje mające aktywność przeciw BAPNA zebrano i dializowano ekstensywnie w temperaturze 4°C wobec 30 objętości dejoniaooanej i destylowanej wody z pięcioma zmianami w przedziałach 12 godzinnych. Dializat suszono przez wymrożenie i magazynowano w temperaturze -20°C.

Postęp oczyszczania (oznaczony jak opisano w przykładzie XXVII) zestawiono w tabeli 9.

166 810

Tabela 9

	Całe białko (mg)	Aktywność specyficzna BAPNA (jedn. mg!	Miejsca aktywne (%)	Chymopapaina (% całego białka)	PPIV (% całego białka)	PPIII (% całego białka)	papaina (% całego białka)
Materiał wyjściowy	28795	632	31	27	25	16	6
pH 1,5	23257	458	24	28	<0,1	13	<0,1
dializa	8319	916	57	75	0,2	25	<0,1
chromatografia katinnnwymienna	3102	1103	72	91	<0,1	<0,2	<0,1
sepharose L-Ala-L-FenSc	947	1245	89	ND	ND	ND	ND
dializa	858	1587	88	100	ND	<0,1	<0,1
suszenie przez wymożenie	972	1265/	69	ND	<0,1	ND	ND

ND - nie oznaczone

- białko ustalono na podstawie całej suchej ma^^.

Dwa preparaty chymopapainy oznaczono tego samego dnia przy użyciu prób BAPNA metoda nr 1 i metoda nr 2. Zawartość białka ustalono na podstawie całej suchej masy. Chymopapaina A pochodziła z oczyszczania metodą taką jak opisano w przykładzie XXVII. Chymopapaina B pochodziła z oczyszczania metodą opisaną w przykładzie XXVIII (końcowe frakcje zebrano w tetratiooiadie sodu). Wyniki oznaczeń przeprowadzonych w próbie potrójnej przedstawiono w tabeli 10.

Tabela 10

Preparat chymopapainy	Aktywność specyficzna BAPNA (jedd.mugl)
Oznaczenie metodą 1	Oznaczenie meto^ 2
A	855	2227
B	1261	3591

Chymopapainę oczyszczoną jak opisano w przykładzie XXVIII i dializowaną w atmosferze azotu jak opisano w tym przykładzie, liofilizowano i magazynowano w temperaturze -20°C. Wysuszona przez wymrożenie chymopapaina miała aktywność specyficzną przeciw BAPNA (1 mM) w temperaturze 37°C i pH 6,0 wooszoco 1345 jednostek na mg.

Dla sporządzenia 100 fiolek kompozycji zawierającej oczyszczoną chymopapainę sporządzono 43,75 g roztworu bazowego, jak opisano niżej. Roztwór ten utrzymywano w temperaturze 4-12°C w trakcie całego przerobu.

Jedoowodziao chlorowodorku L-/ + cysteiny (166 mg) dodano do około 30 g wody do iniekcji dla uzyskania stężenia 22 mM w końcowej objętości. Odczyn roztworu doprowadzono do pH 5,0-5,5 za pomocą NaOH (1 M) lub HCl (0,1 M). Roztwór cysteiny dodano do oczyszczonej chymopapainy (358 mg) dla uzyskania stężenia końcowego 11000 jednostek/ml w końcowej objętości. Odczyn mieszanego roztworu doprowadzono do ph 5,9-6,1 za pomocą NaOH (1 M) lub HCL (1 M) i uzupełniono do 43,75 g wodą do iniekcji. Roztwór sterylizowano przez przepuszczenie dwa filtry w szeregu o wielkości porów 0,2 mikrometra. 0,4 g porcje roztworu napełniono do 100 X 5 ml fiolek szklanych. Fiolki zatkano, wodę usunięto przez wymrożenie pod obniżonym ciśnieniem, a fiolki zawierające liofilizowany produkt zamknięto pod próżnią.

Każda fiolka zawiera biały bezpostaciowy proszek zawierający 3,27 mg chymopapainy i 1,52 mg chlorowodorku cysteinianu sodu (nominalnie 4000 jednostek i 8pmoli odpowiednio z dopuszczalnym 10% przekroczeniem). Kompozycje na ogół rozprowadza się tuż przed użyciem przez dodanie 2 ml wody do iniekcji otrzymując roztwór do iniekcji nominalnie zawierający 4000 jednostek chymopapainy i 4 mM L-cysteiny.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,,00 zł.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób oczyszczania chymopapainy polegający na A. a) inkubowaniu wodnego roztworu surowej chymopapainy z substancją podstawową chromatografii i b) eluowaniu chymopapainy eluentem lub B.l. wytrącaniu wodnej mieszaniny zawierającej surową chymopapainę, 2. oddzielaniu wodnego roztworu surowej chymopapainy od mieszaniny i 3. zobojętnianiu i ewentualnym odsalaniu roztworu surowej chymopapainy lub C. i) wytrącaniu wodnej mieszaniny zawierającej surową chymopapainę, ii) oddzielaniu wodnego roztworu surowej chymopapainy od mieszaniny, iii) zobojętnianiu i ewentualnym odsalaniu roztworu surowej chymopapainy, iv) inkubowaniu roztworu otrzymanego z etapu (iii) z substancją podstawową i v) eluowaniu chymopapainy eluentem, znamienny tym, że w A. a) i C. iv) jako substancję podstawową chromatografii stosuje się substancję o powinowactwie chromatograficznym ukierunkowanym na miejsce aktywne zawierającą kowalencyjnie sprzężone podłoże substancji podstawowej, ewentualnie przez czynnik odległościowy z końcem N peptydu odwracalnie inhibitującego chymopapainę, przy czym peptyd wiąże się z miejscem aktywnym cząsteczki chymopapainy, a w B. 1. wodną mieszaninę zawierającą surową chymopapainę wytrąca się przy wartości pH od 1,2 do 1,8.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się co najmniej jeden etap chromatografii kationowymiennej.

   * * *