CN1320111C - 一种制备木瓜凝乳酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种制备木瓜凝乳酶的方法，属生物技术领域。本发明的方法包括以下步骤：粗酶制备，粗酶活力达到100万单位/克以上；精酶制备，精酶活力达到200万单位/克以上；纯化酶制备，纯化酶活力达到300万单位/克以上；在此基础上制得木瓜凝乳酶，木瓜凝乳酶活力达到200万单位/克以上。
Description
技术领域
本发明为制备木瓜凝乳酶的工艺，属生物技术领域。
技术背景
木瓜蛋白酶广泛存在于番木瓜茎叶和果实中，以未成熟果实的乳汁中为最高。因其含量高、稳定性好、蛋白水解能力强，对多种蛋白质均具有很好的降解作用，目前已被广泛应用于各个行业。在食品中，用于肉类嫩化、啤酒澄清、饲料添加剂，饼干松化剂和鱼类加工；在工业上，用于明胶制造、蚕茧脱胶、皮革脱毛等；在医疗卫生方面，用于驱肠虫剂，用于治疗消化不良、各种炎症和水肿，防止腹膜粘连，处理血栓及创伤脱痂。从中提纯的木瓜凝乳酶在治疗骨质增生、检测血型、肿瘤辅助冶疗等方面用途广泛、疗效显著。
近年来，虽然有关木瓜蛋白酶的研究工作已有很多报道，但还是存在着木瓜蛋白酶提纯的纯度低，一般在200万单位/克以下，同时还未有从中提取木瓜凝乳酶。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述缺点，而提供一种制备木瓜凝乳酶的方法，它即提高了木瓜蛋白酶的纯度，同时还能从中提取木瓜凝乳酶。
本发明的方法包括以下步骤：
1、粗酶制备
取新鲜木瓜乳汁，经搅拌使其液化，过滤，加入等量含0.1-0.4mmol/L硫代硫酸钠，0.5-2mmol/L氯化钠和0.01-0.08mmol/L半胱氨酸的溶液，混合均匀后，缓慢加入已溶解的丹宁溶液至浓度达到0.05-0.2％，静置，用盐酸调PH至2.5-5.5，3500转/分离心10-30分，沉淀于50-70℃真空干燥，粉碎后即得粗酶，该粗酶活力达到100万单位/克以上；
2、精酶制备
取上述固体粗酶，加入含0.02-0.06mmol/L半胱氨酸和0.05-2mmol/L硫代硫酸钠的溶液中，该溶液的PH值5.00-8.00，研磨，过滤，滤液用0.05-2mol/L氢氧化钠调PH至7.0-10.0，不断搅动5-20分钟，过滤，滤液中加硫酸铵至40-60％饱和度，20000×g离心30分钟，沉淀用0.05-2mmol/L硫代硫酸钠溶解，再加入硫酸铵至50-60％饱和度，离心，沉淀溶于含0.02-0.06mmol/L半胱氨酸和0.05-2mmol/L硫代硫酸钠的0.05-0.02mol/L磷酸缓冲液，磷酸缓冲液PH值为6.5-8.5，加入氯化钠到终浓度5-20％，室温静置20-40分钟，4℃16-20小时至结晶析出，冰冻干燥，4℃冰箱保存，该精酶活力达到200万单位/克以上；
3、纯化酶制备
取上述冰冻干燥酶于室温下对0.05-0.2mol/L乙酸钠缓冲液透析8-12小时，乙酸钠缓冲液的pH为4.0-6.0，然后上2.0cm×2.0cm的SP-SePhadex50柱进行梯度洗脱，洗脱液为含0.05-2mmol/L硫代硫酸钠的0.1-1.0mol/L乙酸钠溶液，流速为0.1-0.6ml/分；分部收集，透析，冷冻干燥，4℃冰箱保存，该纯化酶活力达到300万单位/克以上；
4、木瓜凝乳酶的制备
取上述冰冻干燥纯化酶于室温下加入含0.02-0.06mmol/L半胱氨酸和0.05-2mmol/L硫代硫酸钠的溶液中，硫代硫酸钠的溶液的pH值为5.00-8.00，研磨，过滤，滤液对0.05-0.2mol/L乙酸钠缓冲液透析8-12小时，乙酸钠缓冲液的pH值为4.0-6.0，然后上2.0cm×2.0cm阳离子交换柱进行梯度洗脱，洗脱液为含0.05-2mmol/L硫代硫酸钠的0.1-1.0mol/L乙酸钠溶液，流速为0.1-0.6ml/分；分部收集，透析，冷冻干燥，4℃冰箱保存，该木瓜凝乳酶活力达到200万单位/克以上。
本发明的有益效果是：木瓜蛋白酶提纯的纯度高，一般在200万单位/克以上，同时从中还可提取木瓜凝乳酶。
具体实施方式
实施例1：制备木瓜凝乳酶的方法，步骤为：
1、粗酶制备
取新鲜木瓜乳汁100克，经搅拌使其液化，过滤，加入等量含0.3mmol/L硫代硫酸钠，2mmol/L氯化钠和0.04mmol/L半胱氨酸的溶液，混合均匀后，缓慢加入已溶解的丹宁溶液至浓度达到0.12％，静置，用盐酸调pH至5.5，3500转/分离心30分，沉淀于60℃真空干燥，粉碎后即得粗酶，该粗酶活力达到100万单位/克以上。
2、精酶制备
取上述固定粗酶，加入含0.05mmol/L半胱氨酸和0.09mmol/L硫代硫酸钠的溶液pH6.0中，研磨，过滤，滤液用0.15mol/L氢氧化钠调pH至8.0，不断搅动10分钟，过滤，滤液中加硫酸铵至50％饱和度，20000×g离心30分钟，沉淀用0.08mmol/L硫代硫酸钠溶解，再加入硫酸铵至50％饱和度，离心，沉淀溶于含0.03mmol/L半胱氨酸和1mmol/L硫代硫酸钠的0.08mol/L磷酸缓冲液pH 6.8，加入氯化钠到终浓度9％，室温静置28分钟，4℃19小时至结晶析出，冰冻干燥，4℃冰箱保存，该精酶活力达到200万单位/克以上。
3、纯化酶制备
取上述冰冻干燥酶于室温下对0.09mol/L乙酸钠缓冲液pH4.8透析10小时，然后上SP-SePhadex50柱2.0cm×2.0cm进行梯度洗脱，洗脱液为含0.08mmol/L硫代硫酸钠的0.7mol/L乙酸钠溶液，流速为0.5ml/分。分部收集，透析，冷冻干燥，4℃冰箱保存，得纯化酶。该纯化酶活力达到300万单位/克以上。
4、木瓜凝乳酶的制备
取上述冰冻干燥纯化酶于室温下加入含0.04mmol/L半胱氨酸和1mmol/L硫代硫酸钠的溶液pH6.0中，研磨，过滤，滤液对0.08mol/L乙酸钠缓冲液pH5.0透析8小时，然后上阳离子交换柱2.0cm×2.0cm进行梯度洗脱，洗脱液为含1mmol/L硫代硫酸钠的0.12mol/L乙酸钠溶液，流速为0.5ml/分。分部收集，透析，冷冻干燥，4℃冰箱保存，该木瓜凝乳酶活力达到200万单位/克以上。
实施例2：制备木瓜凝乳酶的方法，步骤为：
1、粗酶制备
取新鲜木瓜乳汁100克，经搅拌使其液化，过滤，加入等量含0.25mmol/L硫代硫酸钠，1mmol/L氯化钠和0.03mmol/L半胱氨酸的溶液，混合均匀后，缓慢加入已溶解的丹宁溶液至浓度达到0.15％，静置，用盐酸调pH至4.5，3500转/分离心25分，沉淀于55℃真空干燥，粉碎后即得粗酶，该粗酶活力达到100万单位/克以上。
2、精酶制备
取上述固定粗酶，加入含0.03mmol/L半胱氨酸和0.08mmol/L硫代硫酸钠的溶液PH6.0中，研磨，过滤，滤液用1.5mol/L氢氧化钠调pH至9.0，不断搅动15分钟，过滤，滤液中加硫酸铵至55％饱和度，20000×g离心25分钟，沉淀用0.09mmol/L硫代硫酸钠溶解，再加入硫酸铵至55％饱和度，离心，沉淀溶于含0.04mmol/L半胱氨酸和1.5mmol/L硫代硫酸钠的1.0mol/L磷酸缓冲液pH 7.2，加入氯化钠到终浓度10％，室温静置30分钟，4℃18小时至结晶析出，冰冻干燥，4℃冰箱保存，该精酶活力达到200万单位/克以上。
3、纯化酶制备
取上述冰冻干燥酶于室温下对0.06mol/L乙酸钠缓冲液pH5.2透析12小时，然后上SP-SePhadex50柱2.0cm×2.0cm进行梯度洗脱，洗脱液为含0.1mmol/L硫代硫酸钠的0.7mol/L乙酸钠溶液，流速为0.6ml/min。分部收集，透析，冷冻干燥，4℃冰箱保存，该纯化酶活力达到300万单位/克以上。
4、木瓜凝乳酶的制备
取上述冰冻干燥纯化酶于室温下加入含0.03mmol/L半胱氨酸和0.8mmol/L硫代硫酸钠的溶液pH5.5中，研磨，过滤，滤液对0.1mol/L乙酸钠缓冲液PH5.5透析12小时，然后上阳离子交换柱2.0cm×2.0cm进行梯度洗脱，洗脱液为含0.8mmol/L硫代硫酸钠的0.15mol/L乙酸钠溶液，流速为0.5ml/分。分部收集，透析，冷冻干燥，4℃冰箱保存，该木瓜凝乳酶活力达到200万单位/克以上。
Claims (1)
1、一种制备木瓜凝乳酶的方法，步骤为：
1)、粗酶制备
取新鲜木瓜乳汁，经搅拌使其液化，过滤，加入等量含0.1-0.4mmol/L硫代硫酸钠，0.5-2mmol/L氯化钠和0.01-0.08mmol/L半胱氨酸的溶液，混合均匀后，缓慢加入已溶解的丹宁溶液至浓度达到0.05-0.2％，静置，用盐酸调PH至2.5-5.5，3500转/分离心10-30分钟，沉淀于50-70℃真空干燥，粉碎后即得粗酶，该粗酶活力达到100万单位/克以上；
2)、精酶制备
取上述固体粗酶，加入含0.02-0.06mmol/L半胱氨酸和0.05-2mmol/L硫代硫酸钠的溶液中，该溶液的PH值5.00-8.00，研磨，过滤，滤液用0.05-2mol/L氢氧化钠调PH至7.0-10.0，不断搅动5-20分钟，过滤，滤液中加硫酸铵至40-60％饱和度，20000×g离心30分钟，沉淀用0.05-2mmol/L硫代硫酸钠溶解，再加入硫酸铵至50-60％饱和度，离心，沉淀溶于含0.02-0.06mmol/L半胱氨酸和0.05-2mmol/L硫代硫酸钠的0.05-0.02mol/L磷酸缓冲液，磷酸缓冲液PH值为6.5-8.5，加入氯化钠到终浓度5-20％，室温静置20-40分钟，4℃16-20小时至结晶析出，冰冻干燥，4℃冰箱保存，该精酶活力达到200万单位/克以上；
3)、纯化酶制备
取上述冰冻干燥酶于室温下对0.05-0.2mol/L乙酸钠缓冲液透析8-12小时，乙酸钠缓冲液的pH为4.0-6.0，然后上2.0cm×2.0cm的SP-SePhadex50柱进行梯度洗脱，洗脱液为含0.05-2mmol/L硫代硫酸钠的0.1-1.0mol/L乙酸钠溶液，流速为0.1-0.6ml/分；分部收集，透析，冷冻干燥，4℃冰箱保存，得纯化酶，该纯化酶活力达到300万单位/克以上；
4)、取上述冰冻干燥纯化酶于室温下加入含0.02-0.06mmol/L半胱氨酸和0.05-2mmol/L硫代硫酸钠的溶液中，该溶液的pH值为5.00-8.00，研磨，过滤，滤液对0.05-0.2mol/L乙酸钠缓冲液透析8-12小时，乙酸钠缓冲液的pH值为4.0-6.0，然后上2.0cm×2.0cm阳离子交换柱进行梯度洗脱，洗脱液为含0.05-2mmol/L硫代硫酸钠的0.1-1.0mol/L乙酸钠溶液，流速为0.1-0.6ml/分；分部收集，透析，冷冻干燥，4℃冰箱保存，得木瓜凝乳酶，该木瓜凝乳酶活力达到200万单位/克以上。
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Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN116196237B (zh) * | 2023-05-04 | 2023-07-28 | 山东博科医用材料有限公司 | 一种抗氧化的缓释酶制剂 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DD270723A5 (de) * | 1986-12-08 | 1989-08-09 | Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet | Verfahren zur Herstellung von hochreinem Chymopapain |
| CN1047340A (zh) * | 1989-04-28 | 1990-11-28 | 布茨公司 | 治疗剂 |
| CN1088614A (zh) * | 1992-12-24 | 1994-06-29 | 中国科学院昆明植物研究所 | 番木瓜蛋白酶精酶纯化工艺 |
| CN1285403A (zh) * | 2000-08-11 | 2001-02-28 | 华南农业大学 | 壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的制备 |
| CN1400307A (zh) * | 2002-09-06 | 2003-03-05 | 华南理工大学 | 番木瓜细胞培养生产木瓜凝乳蛋白酶的方法 |
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DD270723A5 (de) * | 1986-12-08 | 1989-08-09 | Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet | Verfahren zur Herstellung von hochreinem Chymopapain |
| CN1047340A (zh) * | 1989-04-28 | 1990-11-28 | 布茨公司 | 治疗剂 |
| CN1088614A (zh) * | 1992-12-24 | 1994-06-29 | 中国科学院昆明植物研究所 | 番木瓜蛋白酶精酶纯化工艺 |
| CN1285403A (zh) * | 2000-08-11 | 2001-02-28 | 华南农业大学 | 壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的制备 |
| CN1400307A (zh) * | 2002-09-06 | 2003-03-05 | 华南理工大学 | 番木瓜细胞培养生产木瓜凝乳蛋白酶的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 木瓜蛋白酶的加工工艺及应用 赵元藩 丁认全，云南师范大学学报，第19卷第5期 1999 * |
| 木瓜蛋白酶的生产工艺研究 乙引 谭爱娟 刘宁 王利民，贵州农业科学，第28卷第5期 2000 * |
| 木瓜蛋白酶的纯化和性质 乙引 张显强 唐金刚 罗在柒，贵州师范大学学报(自然科学版)，第20卷第1期 2002 * |
| 降低木瓜蛋白酶灰分的探讨 陈孜 任国梅 黎婉玲 谭见容，广州医药，第29卷第2期 1998 * |
| 降低木瓜蛋白酶灰分的探讨 陈孜 任国梅 黎婉玲 谭见容，广州医药，第29卷第2期 1998;木瓜蛋白酶的纯化和性质 乙引 张显强 唐金刚 罗在柒，贵州师范大学学报(自然科学版)，第20卷第1期 2002;木瓜蛋白酶的加工工艺及应用 赵元藩 丁认全，云南师范大学学报，第19卷第5期 1999;木瓜蛋白酶的生产工艺研究 乙引 谭爱娟 刘宁 王利民，贵州农业科学，第28卷第5期 2000 * |
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