CN109055325A - 一种鸭血红细胞sod的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种鸭血红细胞SOD的分离纯化方法，包括步骤：采集新鲜鸭血，加入5‑8％的柠檬酸钠抗凝液，抗凝液与鸭血的体积比为1:5‑8，离心收集红细胞，洗涤，离心，加水搅拌1‑2h；加入重量比分别为4‑5％、0.2‑1％的氯化钠和硫酸铜，加压过滤，再将滤液用截留分子量为4000～6000D的中空纤维膜超滤浓缩；调节PH为5.5‑6.5，于55‑60℃水浴中加热30‑50min,冷却，离心，取上清液，加入预先用2.5mmol/L的磷酸缓冲液平衡的阴离子交换层析柱中，用4.5mmol/L的磷酸缓冲液洗脱，层析后收集得到SOD提取液，经真空冷冻干燥，得到SOD粉。通过多级纯化，大大提高产品纯度及蛋白含量，提取效率高、成本低，适合工业化生产。

Description

一种鸭血红细胞SOD的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及SOD分离提取技术领域，尤其涉及一种鸭血红细胞SOD的分离纯化方法。
背景技术
超氧化歧化酶(SOD)够有效清除氧自由基，提高人体的免疫力，是人体中不可缺少的具有特殊生物活性的酶。随着年龄的增长，人体SOD逐渐减少，体内超氧阴离子自由基堆积，不仅会加速细胞衰老，而且容易导致免疫性疾病、急性炎症与水肿等多种疾病，因此，以SOD为活性成分的药物、食品、保健品、化妆品等备受关注，特别是在医药领域得到了广泛应用。
动物血液是国内外生产SOD的主要来源之一，我国有丰富的禽类血液资源，其中鸭血食用较少，大部分未能开发利用，具有显著的应用价值。动物细胞中提取的SOD主要为CuZn-SOD，现有提取工艺中，最早的溶剂沉淀法使用大量的氯仿等有毒溶剂，成本高，危害较大，后续出现了多种改进工艺，如透析或超滤等，虽可以克服上述缺陷，但是工序复杂，提取的SOD纯度不高，难以实现工业化生产。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供一种鸭血红细胞SOD的分离纯化方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种鸭血红细胞SOD的分离纯化方法，包括步骤：
(S1)采集新鲜鸭血，加入5-8％的柠檬酸钠抗凝液，抗凝液与鸭血的体积比为1:5-8，离心收集红细胞；
(S2)用生理盐水洗涤3次以上，每次洗涤后进行离心，然后加入红细胞体积2-3倍的去离子水，搅拌1-2h，使红细胞破碎，充分溶血；
(S3)加入重量比分别为4-5％、0.2-1％的氯化钠和硫酸铜，加压过滤，再将滤液用截留分子量为3000-6000D的中空纤维膜超滤浓缩，得到SOD浓缩液；
(S4)调节PH为5.5-6.5，于55-60℃水浴中加热30-50min，冷却，离心，去除杂蛋白，然后取上清液，过预先用2-3mmol/L的磷酸缓冲液平衡的阴离子交换层析柱，用5-10mmol/L的磷酸缓冲液洗脱，收集SOD洗脱液，经真空冷冻干燥，得到SOD粉。
优选的，各步骤中，离心处理的时间为15-20min，转速为4500-5500r/min。
优选的，步骤(S4)中，PH调节剂选自浓度为6-8％的盐酸。
优选的，所述阴离子交换层析柱为DEAE-Sepharose F.F色谱柱。
优选的，步骤(S4)还包括，在洗脱液中添加0.1-0.5mol/L的稳定剂，所述稳定剂包括维生素、L-组氨酸、L-精氨酸中的至少一种，进一步，所述维生素采用质量比为1:1的维生素E和K复配。通过添加上述特定的稳定剂，能显著提高SOD的活性和贮存稳定性。
本发明的有益效果：
通过加压过滤、超滤和层析工艺多级纯化，使产品纯度及蛋白含量明显提高，不仅无需使用有机溶剂，而且操作简便，提取效率高、成本低，适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1
(S1)采集新鲜鸭血，加入5％的柠檬酸钠抗凝液，抗凝液与鸭血的体积比为1:5，离心，收集红细胞；
(S2)用红细胞体积3倍的生理盐水洗涤3次，每次洗涤后进行离心，然后加入红细胞体积3倍的去离子水，搅拌1h，充分溶血；
(S3)加入重量比分别为4.5％、0.4％的氯化钠和硫酸铜，加压过滤，再将滤液用截留分子量为5000D的中空纤维膜超滤浓缩，得到SOD浓缩液；
(S4)用7.5％的盐酸调节PH为6.5，于60℃水浴中加热40min，冷却，离心，取上清液，过预先用2.5mmol/L的磷酸缓冲液平衡的DEAE-Sepharose F.F色谱柱，用4.5mmol/L的磷酸缓冲液洗脱，收集SOD洗脱液，经真空冷冻干燥，得到SOD粉。采用GBT5009.171-2003的方法进行活性测定，产品比活力为11000U/mg，用紫外分光光度法测定蛋白含量为96.82％。
实施例2
采用实施例1的方法制备SOD份，不同的是，步骤(S4)中，在洗脱液中添加0.05mol/L的维生素、0.15mol/L的L-组氨酸及0.1mol/L的L-精氨酸，其中述维生素采用质量比为1:1的维生素E和K复配。经活性测定，产品比活力为13500U/mg，蛋白含量为99.79％。可见，添加稳定剂后，产品的比活力和蛋白含量明显提高。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而并非对其进行限制，凡未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明技术方案的保护范围内。

Claims (6)

1.一种鸭血红细胞SOD的分离纯化方法,其特征在于，包括步骤：
(S1)采集新鲜鸭血，加入5-8％的柠檬酸钠抗凝液，抗凝液与鸭血的体积比为1:5-8，离心收集红细胞；
(S2)用生理盐水洗涤3次以上，每次洗涤后进行离心，然后加入红细胞体积2-3倍的去离子水，搅拌1-2h；
(S3)加入重量比分别为4-5％、0.2-1％的氯化钠和硫酸铜，加压过滤，再将滤液用截留分子量为3000-6000D的中空纤维膜超滤浓缩，得到SOD浓缩液；
(S4)调节PH为5.5-6.5，于55-60℃水浴中加热30-50min,冷却，离心，取上清液，过预先用2-3mmol/L的磷酸缓冲液平衡的阴离子交换层析柱，用5-10mmol/L的磷酸缓冲液洗脱，收集SOD洗脱液，经真空冷冻干燥，得到SOD粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，各步骤中，离心处理的时间为15-20min，转速为4500-5500r/min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(S4)中，PH调节剂选自浓度为6-8％的盐酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析柱为DEAE-SepharoseF.F色谱柱。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(S4)还包括，在洗脱液中添加0.1-0.5mol/L的稳定剂，所述稳定剂包括维生素、L-组氨酸、L-精氨酸中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述维生素采用质量比为1:1的维生素E和K复配。
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