CN101353370A - 从禽畜血中提取血红蛋白和超氧化物歧化酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的从禽畜血中提取血红蛋白和超氧化物歧化酶的方法，步骤包括新鲜禽畜血抗凝处理后，离心收集血球，溶血后加热处理提取血红蛋白和SOD粗提液；SOD粗提液经热变性，超滤浓缩，丙酮分级沉淀和离子交换剂吸附处理获得SOD精品。本发明方法操作简单，生产成本低廉，适用于大规模工业化生产，可同时提取禽畜血中SOD和血红蛋白，实现了从禽畜血中高效回收多种蛋白质资源。提取的血红蛋白除了含有氯化钠、氯化钾等人体无害的盐以外，不含有铜离子，因此可以为人畜食用，也可用于进一步生产血红素和脱色血球蛋白粉等血红蛋白产品。
Description
技术领域
本发明涉及从禽畜血中提取血红蛋白和超氧化物歧化酶的方法，属于农副产品深加工和生化制品生产领域。
背景技术
禽畜血营养丰富，蛋白含量高达20％左右，有“液体肉“之称。禽畜血可以通过离心分离得到血浆和血球，血浆中主要含有白蛋白，血球中含有血红蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶等，其中血红蛋白占血球总蛋白量的90％以上，SOD占0.3％～0.5％。SOD是体内特异清楚超氧自由基，降低机体的氧化压力，具有抗辐射、抗衰老、消炎等多种生理作用。SOD广泛被用于保健品、化妆品和药品，特别是大宝SOD，推出20来年，以其良好的效果，深受广大消费者喜爱。血红蛋白可用于生产血红素和脱色血球蛋白等食品添加剂，也可以做成鱼虾等水产的高营养饲料添加剂。
目前，已经有两种方法提取SOD，一种方法使用有机溶剂萃取SOD，该方法处理量比较小，生产成本高，无法大规模生产；另一种方法使用铜盐沉淀血红蛋白纯化SOD，该方法生成的血红蛋白含有大量的铜离子，无法被再利用，浪费了大量珍贵的蛋白资源，而且这些蛋白排放还会造成环境污染。
发明内容
本发明的目的是提供一种成本低廉，高效回收各种蛋白质资源的从禽畜血中提取血红蛋白和超氧化物歧化酶的方法。
本发明的从禽畜血中提取血红蛋白和超氧化物歧化酶的方法，包括以下步骤：
1)新鲜禽畜血抗凝处理后，离心取血球，加入1倍～5倍体积的水，搅拌混匀后继续搅拌至溶血，得溶血血球；
2)溶血血球加入单价金属盐，至单价金属盐终浓度为0.01M～3M，调节pH至3.0～7.5，不断搅拌，加热到50～75℃，保温30min～180min，过滤，干燥滤渣，得血红蛋白粉，滤液为超氧化物歧化酶粗提液；
3)在超氧化物歧化酶粗提液中加入可溶性铜盐，至铜离子终浓度为0.01mM～20mM，加热至55～85℃，保温10～120min后，过滤去渣，超滤，得到超氧化物歧化酶浓缩液；
4)调节超氧化物歧化酶浓缩液的pH至4.0～8.5，然后加入浓缩液体积0.5～1.0倍的丙酮，离心取上清液；在上清液中继续加入丙酮，两次加入的丙酮总体积为原浓缩液体积的1.1～2.0倍，离心取沉淀，沉淀即为超氧化物歧化酶粗品；或者将超氧化物歧化酶粗品用水溶解，离心去不溶物，通过阴离子交换剂吸附处理，除去残余杂蛋白，制得超氧化物歧化酶精品。
本发明中，单价金属盐的作用是减弱超氧化物歧化酶和血红蛋白的相互作用，使血红蛋白更容易沉淀去除。上述的单价金属盐可以是氯化钠、氯化钾或两者的混合物。
本发明中，所说的可溶性铜盐可以是硫酸铜，氯化铜或硝酸铜等。
本发明中，步骤3)所说的超滤包括浓缩、脱盐和脱游离铜离子，步骤如下：先超滤膜浓缩；然后不断加水稀释同时超滤膜浓缩脱盐；脱盐后的浓缩液加入EDTA，至EDTA终浓度为0.01～100mM，不断加水稀释同时继续超滤膜浓缩，至透过液无色；上述的超滤膜为截留分子量在1000～30000之间的超滤膜。
EDTA可为乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠或乙二胺四乙酸四钠。
本发明中，吸附用的阴离子交换剂，如DEAE Cellulose、DEAE SepharoseF.F.、Q Sepharose F.F.、DEAE Sephadex A 50等都适用，由于DEAE SepharoseF.F.具有良好的吸附效果和再生效果，优选DEAE Sepharose F.F.为吸附剂。
本发明中的阴离子交换剂吸附处理方法有两种，一种就是常用的柱层析方法，该方法需要把阴离子交换剂预先装柱，才能使用，而且使用几次后需要重新装柱才能恢复通量，操作复杂，对操作人员技术要求较高；另一种方法不装柱，直接把阴离子交换剂倒入SOD粗品溶液中吸附杂蛋白，然后回收交换剂，该方法通量大，生产周期短，重复性高，操作简单方便，便于掌握。
本发明调节超氧化物歧化酶(SOD)粗品溶液pH到4.0～8.5，即为SOD等电点附近，使SOD在离子交换剂中吸附力较弱而没有吸附在离子交换剂上面，杂蛋白被吸附在离子交换剂，这样使得离子交换吸附的通量大大增加，操作更简单，使SOD产量达日产公斤级规模。
本发明方法操作简单，生产成本低廉，适用于大规模工业化生产，可同时提取禽畜血中SOD和血红蛋白，实现了从禽畜血中高效回收多种蛋白质资源。提取的血红蛋白除了含有氯化钠、氯化钾等人体无害的盐以外，不含有铜离子，因此可以为人畜食用。也可用于进一步生产血红素和脱色血球蛋白粉等血红蛋白产品，从而实现了禽畜血的综合利用，无浪费。
具体实施方案
实施例1
屠宰场取新鲜猪血一吨，加预溶解3.33kg三水柠檬酸钠、1.2kg柠檬酸、5kg葡萄糖的水溶液抗凝处理，离心，得血球400kg，加800kg水搅拌1小时，用盐酸调节pH至3.0，加氯化钠210kg，搅拌溶解后，缓慢加热到60℃，保温60min后，压滤。滤渣烘干得血红蛋白130kg。滤液加入硫酸铜5kg，搅拌溶解后加热到75℃保温30min，冷却到室温后，压滤去渣，得蓝色滤液1吨。滤液用截留分子量20000的超滤膜超滤浓缩，浓缩到100kg左右时加入100kg水，继续超滤浓缩，重复五次，最后浓缩到体积100kg，加入0.2M的乙二胺四乙酸二钠水溶液100kg，继续超滤浓缩到100kg，加水100kg后继续超滤浓缩，重复五次，浓缩到100kg，清夜无明显蓝色，此时脱盐脱游离铜离子基本完全。浓缩液用1M盐酸调节pH至4.0，然后加入-20℃预冷的丙酮80L，搅拌半小时后离心，取上清液继续加入-20℃预冷的丙酮120L，搅拌15min后离心取沉淀即为SOD粗品。SOD粗品用水溶解后离心去渣，然后直接通过预装5L DEAE Sepharose F.F.的层析柱，收集通过液即为SOD精品溶液，冷冻干燥得50g精品SOD，比活6300U/mg蛋白(活力测定参照GB5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定》，蛋白浓度测定用双缩脲法，下同)。
实施例2
屠宰场取新鲜鸭血10kg，迅速加入柠檬酸钠400g抗凝，离心后得血球4.5L，加4.5L水搅拌1小时，用盐酸调节pH至5.5，加氯化钾5g，搅拌溶解后，缓慢加热到50℃，保温180min后，压滤。滤渣烘干得血红蛋白1.4kg。滤液加入硫酸铜2.25g，搅拌溶解后加热到85℃保温10min，冷却到室温后，压滤去渣，得蓝色滤液8L。滤液用截留分子量3000的超滤膜超滤浓缩，浓缩到500ml～800ml时加入800ml水，继续超滤浓缩，重复五次，最后浓缩到体积500ml，加入乙二胺四乙酸1.86g，搅拌溶解，加水1L后继续超滤浓缩至500ml，重复五次，浓缩到500ml，清夜无明显蓝色，此时脱盐脱游离铜离子基本完全。浓缩液调节pH到6.0后，加入4℃预冷丙酮250ml，搅拌半小时后离心，取上清液继续加入丙酮750ml，搅拌15min后离心取沉淀即为SOD粗品，该粗品比活为3000U/mg蛋白。SOD粗品用水溶解后离心去渣，直接通过预装并且用水平衡好的500mlDEAE Sepharose F.F.的层析柱，收集通过液即为SOD精品溶液，冷冻干燥得0.6g精品SOD，比活6700U/mg蛋白。
实施例3
屠宰场取新鲜牛血500kg，草酸钾抗凝处理，离心后得血球200kg，加1000kg水搅拌1小时，用磷酸调节pH至3.0，加无碘食盐700g，搅拌溶解后，缓慢加热到60℃，保温180min后，过滤。滤渣烘干得血红蛋白60kg。滤液加入1M氯化铜溶液11ml，搅拌均匀后加热到55℃保温120min，冷却到室温后，压滤去渣，得蓝色滤液1100kg。滤液用截留分子量1000的超滤膜超滤浓缩，用实施例1相同的方法脱盐，脱游离铜离子后，浓缩到50kg。浓缩液调节pH至8.5，加入4℃预冷丙酮40L，搅拌半小时后离心，取上清液继续加入丙酮60L，搅拌半小时后离心取沉淀即为SOD粗品。SOD粗品用水溶解后离心去渣，清液中加入预处理好的DEAE纤维素5L，过滤回收DEAE纤维素，并用水洗涤，收集滤液跟洗涤液合并即为SOD精品溶液，用截留分子量为3000的超滤膜浓缩然后冷冻干燥得30g产品SOD，比活力为5000U/mg蛋白。
实施例4
屠宰场收集新鲜猪血一吨，迅速加入4kg柠檬酸钠抗凝处理，离心得血球400kg，加400kg水搅拌10min，用硫酸调节pH7.5，加1M的氯化钾溶液80L，搅拌均匀后，缓慢加热到75℃，保温50min后，过滤。滤渣晒干得血红蛋白130kg。滤液加入1M硝酸铜溶液140ml，搅拌溶解后加热到80℃保温10min，冷却到室温后，压滤去渣，得蓝色滤液750kg。滤液用截留分子量为30000的中空纤维超滤膜超滤浓缩，浓缩到100kg左右时以接近超滤清液流速的速度连续加入300kg水同时不断超滤，最后浓缩到体积60kg，加入200mM的乙二胺四乙酸四钠水溶液60kg，继续超滤浓缩到60kg，以接近超滤清液流速的速度连续加入300kg水同时不断超滤，最后浓缩到60kg，清液无明显蓝色，此时脱盐脱游离铜离子基本完全。浓缩液调节pH值7.0，加入4℃预冷丙酮50L，搅拌30min后离心，取上清继续加入丙酮60L，搅拌30min后离心取沉淀。沉淀用水溶解后离心去渣，冷冻干燥得粗品SOD的120g，比活力3000U/mg蛋白。
实施例5
屠宰场取新鲜猪血300kg，抗凝后迅速离心得血球150kg，加500kg水搅拌半小时得溶血血球，用盐酸调节pH至5.5，加氯化钠5kg，氯化钾5kg，搅拌溶解后，缓慢加热到65℃，保温30min后，压滤。滤渣烘干得蛋白粉60kg，该蛋白粉大部分为血红蛋白(含量70％以上)。滤液加入五水硫酸铜400g，搅拌溶解后加热到80℃保温15min，冷却到室温后，离心去渣，得蓝色滤液。滤液用截留分子量5000的超滤膜超滤浓缩，浓缩到50kg左右时加入100kg水，继续超滤浓缩，重复五次，最后浓缩到体积50kg，加入0.02mM乙二胺四乙酸四钠的水溶液500kg，加水200kg后继续超滤浓缩到50kg，重复加水超滤五次，浓缩到30kg，此时清液无明显蓝色，脱盐脱游离铜离子基本完全。浓缩液调节pH至5.5，加入-20℃预冷丙酮15L，搅拌15min后离心，上清继续加入丙酮16.5L，搅拌15min后离心取沉淀即为SOD粗品。SOD粗品用水溶解后离心去渣，在粗品溶液中直接1L处理好的DEAE Sephdex凝胶，静置十分钟或过滤回收凝胶，并且用水洗涤凝胶，滤液跟洗涤液，浓缩，冷冻干燥得15g精品SOD，比活力7000U/mg蛋白。
Claims (4)
1.从禽畜血中提取血红蛋白和超氧化物歧化酶的方法，其特征是包括以下步骤：
1)新鲜禽畜血抗凝处理后，离心取血球，加入1倍～5倍体积的水，搅拌混匀后继续搅拌至溶血，得溶血血球；
2)溶血血球加入单价金属盐，至单价金属盐终浓度为0.01M～3M，调节pH至3.0～7.5，不断搅拌，加热到50～75℃，保温30min～180min，过滤，干燥滤渣，得血红蛋白粉，滤液为超氧化物歧化酶粗提液；
3)在超氧化物歧化酶粗提液中加入可溶性铜盐，至铜离子终浓度为0.01mM～20mM，加热至55～85℃，保温10～120min后，过滤去渣，超滤，得到超氧化物歧化酶浓缩液；
4)调节超氧化物歧化酶浓缩液的pH至4.0～8.5，然后加入浓缩液体积0.5～1.0倍的丙酮，离心取上清液；在上清液中继续加入丙酮，两次加入的丙酮总体积为原浓缩液体积的1.1～2.0倍，离心取沉淀，沉淀即为超氧化物歧化酶粗品；或者将超氧化物歧化酶粗品用水溶解，离心去不溶物，通过阴离子交换剂吸附处理，除去残余杂蛋白，制得超氧化物歧化酶精品。
2.根据权利要求1所述的从禽畜血中提取血红蛋白和超氧化物歧化酶的方法，其特征是所说的单价金属盐为氯化钠、氯化钾或两者的混合物。
3.根据权利要求1所述的从禽畜血中提取血红蛋白和超氧化物歧化酶的方法，其特征是所说的可溶性铜盐是硫酸铜，氯化铜或硝酸铜。
4.根据权利要求1所述的从禽畜血中提取血红蛋白和超氧化物歧化酶的方法，其特征是步骤3)所说的超滤包括浓缩、脱盐和脱游离铜离子，步骤如下：先超滤膜浓缩；然后不断加水稀释同时超滤膜浓缩脱盐；脱盐后的浓缩液加入EDTA，至EDTA终浓度为0.01～100mM，不断加水稀释同时继续超滤膜浓缩，至透过液无色；上述的超滤膜为截留分子量在1000～30000之间的超滤膜。
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