DD270723A5

DD270723A5 - Verfahren zur Herstellung von hochreinem Chymopapain

Info

Publication number: DD270723A5
Application number: DD31628488A
Authority: DD
Inventors: Laszlo Polgar; Jozsef Gaal; Sandor Virag; Laszlo Jozsa; Tibor Vizkeleti; Bence Asboth; Erzsebet Fejer
Original assignee: Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet
Priority date: 1986-12-08
Filing date: 1988-06-01
Publication date: 1989-08-09
Also published as: HU196624B; CU22158A3; CS377388A2; CS271346B2; BG50942A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hochreinem Chymopapain aus rohem Chymopapain. Erfindungsgemaess wird das rohe Chymopapain in Gegenwart eines Reduktionsmittels in Wasser oder einem Puffer geloest. Der klare Ueberstand der Loesung wird einer Gelchromatographie unterzogen, und die das aktive Enzym enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und gefriergetrocknet.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hochreinem Chymopapain mit hoher spezifischer Aktivität aus rohem Chymopapain mittels Gelchromatographie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Chymopapain ist eine Thiolprotease, die zusammen mit dem Papain und der Papalyapeptidase die proteolytische (eiweißabbauende) Komponente des Papaya-Latex bildet. Papaya-Laiex wird aus der noch unreifen Frucht des in den Tropen vorkommenden Baumes Carica papaya gewonnen, indem die Frucht an mehreren Stellen angekratzt und der herausfließende milchartige Saft aufgefangen und dann getrocknet wird.

Das bekannteste und am besten untersuchte Enzym des Latex ist das Papain. Es wurde zuerst von Balls et al. (Balls, A. K., Lineweaver, H. und Thompson, R. R., Science 86,3794 (1937]) kristallisiert. Jansen und Balls wiesen nach (Jansen, E. P. und Balls, A. K., J. Biol. Chem. 137,459-460 [1941]), daß — wenn aus dem Extrakt des Papaya-Latex des Papain durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat entfernt wird—eine andere Thiolprotease in Lösung zurückbleibt. Dieses verhältnismäßig gut lösliche und bei pH 2 stabile Enzym erhielt die Bezeichnung Chymopapain. Durch Erhöhen der Ammoniumsulfatkonzentration kann auch dieses Enzym ausgefällt werden. Das auf diese Weise gewonnene „rohe Chymopapain" ist keine homogene Substanz, wie durch Gelelektrophorese und lonenaustauscherchromatographie nachgewiesen werden konnte (Kahn, I. U. und Polgar, L., Biochem. Biophys. Acta 760,350-356 (1983); europäische Patentschrift Nr.0065395).

Das Chymopapain wird in der klinischen Praxis verbreitet zur Behandlung des Bandscheibenbruches verwendet, da es in entsprechender Menge eingesetzt den Nucleus pulposus der Zwischenwirbelbandscheiben selektiv auflöst (US-PS 3320131). Außer den bei etwa 50% der behandelten Personen auftretenden leichteren Nebenwirkungen sind jedoch in etwa 1 % der Fälle schwere anaphylaktische Störungen zu beobachten (US-PS 4039682; Robinson, C. P., Drugs of Today, Vol. 19, No. 8 [1983], 454-460). Diese sind gemäß der bereits erwähnten europäischen Patentschrift Nr. 0065 395 auf eine der Eiweißkomponenten des heterogenen Chymopapains zurückzuführen. Diese Komponente gibt mit Bariumchlorid einen Niederschlag und kann durch lonenaustauschchromatographie entfernt werden. Nach der erwähnten Patentschrift ist die proteolytisch inaktive Substanz gefärbt und weist einen unangenehmen Geruch auf.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung war die Ausarbeitung eines Verfahrens, das die Nachteile der bisher bekannten Verfahren nicht aufweist und in einfacher, billiger Weise die Herstellung von Chymopapain mit höherer spezifischer Aktivität ermöglicht.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die schädliche Komponente, die mit Bariumchlorid einen Niederschlag ergibt, mittels Gelchromatographie aus dem Chymopapain entfernt werden kann. Das ist technologisch einfacher, billiger und wenigstens zehnmal schneller als die herkömmliche lonenaustauschchromatographie. Die Erfindung beruht weiterhin auf der Erkenntnis, daß die partielle Inaktivierung des Chymopapains während der Gelchromatographie durch d;<n Zusatz von Reduktionsmitteln vermieden werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von hochreinem Chymopapain aus rohem Chymopapain. Für das Verfahren ist charakteristisch, daß das rohe Chymopapain in Gegenwart eines Reduktionsmitteis in Wasser oder einem Puffer gelöst, der klare Überstand der Lösung einer Gelchromatographie unterzogen wird und die das aktive Enzym enthaltenden

Fraktionen gesammelt und gefriergetrocknet werden. Das rohe Chymopapaln wird zweckmäßig in Phosphat- oder Acetatpuffer

des pH-Wertes von 5-7 gelöst, der als Reduktionsmittel Cystein, Mercaptoäthanol oder Natriumsulfit enthält. Alschromatographische Säule findet zweckmäßig eine Säule aus Sephadex G-50 oder Sephadex G-25 Verwendung, die vorher miteinem Puffer oder einer Salzlösung, vorzugsweise mit cysteinhaltigem Phosphatpuffer, äquilibriert wird. Im Interesse einereffektiven Chromatographie wird die Säule so gewählt, daß sich Länge zu Durchmesser wie 5-50:1, vorzugsweise wie 20:1,verhalten.

Das Einfrieren erfolgt bei -20 bis -7O⁰C, vorzugsweise bei -40°C; das Eis wird im Vakuum bei einem Druck zwischen 1,333Pa

und 13,33Pa, vorzugsweise 6,665Pa, in an sich bekannter Weise entfernt.

Die mit Bariumchlorid einen Niederschlag ergebende, unangenehm riechende Substanz befindet sich in dem

chromatographischen Peak, das auf das aktive Enzym folgt.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat folgende Vorteile. Die Entfernung der für die schädlichen Nebenwirkungen verantwortlichen, mit Bariumchlorid einen Niederschlag ergebenden Eiweißkomponente auf gelchrorru.tographischem Wege ist billiger, schonender und um das Zehnfache schneller als die

bekannten Verfahren. Deshalb ist das Verfahren auch für die großbetriebliche Durchführung wesentlich geeigneter als dielonenaustauschchromatographie, die etwa 40 Stunden dauert. In dieser langen Zeit wird das Enzym unvermeidlich geschädigt.

Die Gelchromatographie hingegen kann innerhalb von weniger als 4 Stunden durchgeführt werden und bietet die Möglichkeit,

das Enzym auf chemischem Wego—durch phyclologisch unschädliche, ionische Reduktionsmittel—zu schützen. Da die

Gelchromatographie einen höheren Abtrennwirkungsgrad aufweist, ist das erhaltene Produkt viel reiner, was—wie zu erwarten

ist—zu einer wesentlichen Abschwächung der Nebenwirkungen führt.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert. Ausfuhrungsbeispiele Beispiel 1

2,5g rohes Chymopapain werden in 135ml 1OmMoI Cystein enthaltendem Phosphatpuffer (3mMol, pH6,5) gelöst. Wenn die

Lösung trübe ist, so wird sie filtriert. Nach 15-30 Minuten werden die 135 ml Lösung an einer mit Sephadex G-25 (4 x 100cm) mit

einem Puffer Chromatographien, der 3mMol Phosphat und 1 mMol Cystein enthält und einen pH-Wert von 6,5 aufweist. Daserste Peak (in Fig. 1 mit A bezeichnet) enthält das Chymopapain, etwa 1,3g.

Das Peak B enthält die mit Bariumchlorid einen Niederschlag bildende, unangenehm riechende, inaktive Substanz. Das im Peak A befindliche Enzym wird sterilfiltriert und lyophilisiert. Die Aktivität des Chymopapains wurde in jedem Falle durch Substratsättigu.-j (Asboth, B., Polgär, L., Acta Biochim. Biophys. Acad. Sei. Hung. 12,223-230 [1977]) an Benzyloxycarbonylglycin-p-nitrophenylester (ZGN) als Substrat in folgendem Reaktionsgemisch bestimmt:

100 μ! einer mit Acetonitril bereiteten ZGN-Lösung von 1 mg/ml Konzentration.

2,8 ml 0,1 M Acetatpuffer des pH· Wertes 5,5, der 1 mMol EDTA enthält,

100μΙ Chymopapain.

Zur Charakterisierung der Präparate wird im folgenden die bei 25⁰C innerhalb einer Minute an der Wellenlänge von 340nm

meßbare Änderung der optischen Dichte (Extinktion) angegeben, die 1 mg Chymopapain pro ml Reaktionsgrimisch hervorruft.

Das hergestellte Enzym hat die Aktivität 62. Beispiel 2 Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß die Säule einen größeren Durchmesser hat

(5 χ 100cm). Spezifische Aktivität: 70.

Beispiel 3

Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß eine kurze und schnelle Säule verwendet wird (10 χ 16cm). Hier tritt keine Trennung der mit Bariumchlorid einen Niederschlag ergebenden Substanz von dem Chymopapain ein. Spezifische Aktivität: 42.

Beispiel 4 Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß der zum Gelchroi latographieren verwendete Puffer kein Cystein enthält. Spezifische Aktivität: 51. Beispiel 5 Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß eine konzentriertem Lösung aus dem Chymopapain bereitet wird (Eiweißgehalt 5%—Gew.-/Vol.-%). Spezifische Aktivität: 55 Beispiel 6 Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß die Isolierung nicht bei Raumtemperatur,

sondern bei 2-1O⁰C vorgenommen wird. Spezifische Aktivität: 65

Beispiel 7 Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß statt Sephadex G-25 Sephadex G-50 verwendet

wird. Spezifische Aktivität: 53.

Beispiel 8 Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß die Konzentration des Phosphatpuffers nicht

3mM, sondern 1OmM beträgt. Spezifische Aktivität: 63

Beispiel 9

"dan arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß statt des Phosphatpuffers mit pH 6,5 ein Acetatpuffer mit dem pH-Wert 5,5 verwendet wird. Spezifische Aktivität:

Beispiel 10

Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß der Puffer nicht 1 mM Cystein, sondern 5mM Cystein enthält. Spezifische Aktivität:

Beispiel 11

Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß man der die aktive Substanz enthaltenden Fraktion (Peak A) bezogen auf die vorhandenen Eiweiße 10Ma.-% Cystein zusetzt. Spezifische Aktivität:

Beispiel 12

Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Woise mit dem Unterschied, daß man als Reduktionsmittel statt des Cysteine Natriumsulfit verwendet. Spezifische Aktivität:

Beispiel 13

Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß von allen drei chromatographischen Peaks eine Probe von je 1 ml Volumen genommen wird und zu jeder Probe 0,2 ml η Ssfcsäure und 0,2 ml 12%ige Bariumchloridlösung gegeben werden. Ein Niederschlag entsteht nur in der Fraktion B.

Beispiel 14

Die Aktivität des als Referenz verwendeten Präparates Chimodiactin" (Smith Laboratories Inc., USA) wird auf die in Beispiel 1 angegebene Weise gemessen. Sie beträgt

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Chymopapain aus rohem Chymopapain, dadurch gekennzeichnet, daß das rohe Chymopapain in Gegenwart eines Reduktionsmittels in Wasser oder einem Puffer aufgelöst, der klare Überstand der Lösung einer Gelchromatographie unterzogen wird und die das aktive Enzym enthaltenden Fraktionen gesammelt und gefriergetrocknet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Reduktionsmittel Cystein, Mercaptoäthanol oder Natriumsulfit verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Puffer ein Phosphat- oder Acetatpuffer eines zwischen 5 und 7 liegenden pH-Wertes verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß als chromatographische Säule Sephadex G-50 oder Sephadex G-25 verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis zwischen Länge und Durchmesser der verwendeten Säule zwischen 5:1 und 50:1, vorzugsweiie bei 20:1, liegt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Gefriertrocknung in an sich bekannter Weise, vorzugsweise bei 40⁰C und einem Druck von 6,665Pa, durchgeführt wird.