DE3148517A1

DE3148517A1 - Neues und therapeutisch wirksames enzym

Info

Publication number: DE3148517A1
Application number: DE19813148517
Authority: DE
Inventors: Lily Arkley Hertfordshire Baxendale; Derek John Dr. Milton Keynes Buckinghamshire Pope
Original assignee: Biorex Laboratories Ltd
Current assignee: Biorex Laboratories Ltd
Priority date: 1980-12-08
Filing date: 1981-12-08
Publication date: 1982-08-12
Also published as: HK31985A; FR2495634B1; DE3148517C2; JPS57122793A; AU7816081A; IT1140318B; SG6985G; ZA818183B; AU548602B2; MY8600030A; IT8125461A0; CA1168610A; FR2495634A1; BE891390A; US4410531A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues und therapeutisch wirksames Enzym und seine Herstellung.

Das Enzym Hyaluronidase, das die Hydrolyse der Hyaluronsäure, die die Bindesubstanz von Geweben darstellt, katalysiert, ist seit vielen Jahren bekannt.

Viele der bisher verfügbaren Hyaluronidase-Präparate enthielten zusätzlich zu dem Enzym, welches als das für die Katalyse der Hyaluronsäure-Hydrolyse wirklich verantwortliche Enzym angesehen wurde, große Mengen anderer enzymatisch aktiver Materialien. Die heterogene Natur der Hyaluronidase wird in einer Arbeit von Greiling et al. (Z.physiol.Chem. 340, 243, 1965) erörtert.

Zur Reinigung der Hyaluronidase sind verschiedene Verfahren bekannt (vgl. GB-PS 1 060 513 und GB-PS 1 425 918 der gleichen Anmelderin), und dieses gereinigte Material wurde erfolgreich für die Behandlung von Myokard-Infarkt und von peripheren Kreislaufstörungen, einschließlich der mit Gangrän einhergehenden, eingesetzt.

Diese äußerst brauchbare Wirkung von Hyaluronidase scheint auf ihrer "ausbreitenden" ("spreading") Fähigkeit zu beruhen, d.h. auf seiner Fähigkeit, die schnelle Diffusion von injizierten Flüssigkeiten durch Gewebe zu fördern, sowie seiner Fähigkeit, Aggregationen, die verantwortlich sind für die Entstehung von Infarkten und Kreislaufstörungen oder dazu beitragen, aufzulösen. Bei bisher bekannten Hyaluronidase-Präparaten wurde außerdem eine permeabilitätserhöhende Wirkung beobachtet, die sich durch steigende Kapillarpermeabilität manifestiert; es wurde auch gefunden, daß bekannte rohe Hyaluronidase-Präparate eine Sen-

kung des Blutdruckes hervorrufen. Solche Wirkungen sind jedoch unerwünscht, wenn Hyaluronidase zur Behandlung von Myokard-Infarkten und peripheren Kreislaufstörungen verwendet wird.
5

Kürzlich wurde von Houck und Chang (Inflammation 3J4) 1979, 447-451) gefunden, daß Hyaluronidase-Präparate einen Bestandteil enthalten, der die Permeabilität der

MikroZirkulation in der Haut erhöht. 10

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Enzympräparat bereitzustellen, das aus Hyaluronidase erhalten werden kann, aber einen stark verminderten Gehalt an der Komponente, die die Permeabilität erhöht, besitzt, *° und das keine Senkung des Blutdruckes hervorruft.

Das erfindungsgemäße Enzym ist ein geruchloses, weißes . Pulver, welches in Lösung bei einer Konzentration von

15.000 bis 22.000 I.E./ml in einer Kohlendioxid-freien, *^u für Injektionszwecke geeigneten Salzlösung einen pH-Wert von 4,5 bis 7,5 zeigt, wobei die Lösung klar und farblos ist, und dessen Lösung bei einer Konzentration von 50.000 I.E./3 ml in einer Kohlendioxid-freien, für Injektionszwecke geeigneten Salzlösung eine Lichtabsorption

von nicht mehr als 0,60 bei 280 nm und von nicht mehr als 0,37 bei 260 nm besitzt, und das die folgenden Aminosäurekonzentrationen in % zeigt:
Asp 11,1 + 0,4; Thr 5,8 + 0,1; Ser 6,4 + 0,2; GIu 9,1 + 0,2; Pro 5,0 + 0,5; GIy 6,6 + 0,2; AIa 7,4 + 0,1; VaI 7,9 + 0,5; — — — —

Met 0,8 +0,1; He 5,2 + 0,2; Leu10,9 + 0,2; Tyr 4,4 + 0,1; Phe 4,5 +0,1; His 2,8 + 0,2; Lys 7,6 + 0,4; Arg 5,6 + 0,1; einen Gesamthexosegehalt von 10,6 + 0,003 % besitzt, nicht mehr als 5 μg Albumin in 220.000 I.E. der Aktivität besitzt und das ein durch Gelfiltration bestimmtes Molekulargewicht von 62.000 bis 70.000 besitzt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung des oben beschriebenen Enzyms, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man rohe Hyaluronidase einer Ammoniumsulfat-Fraktionierung unterwirft durch Zufügen von Ammoniumsulfat zu einer gepufferten Lösung von roher Hyaluronidase bis zu einem Ammoniumsulfat-Sättigungsgrad von ca. 50 %, den erhaltenen Niederschlag verwirft und den überstand auf einen Ammoniumsulfat-Sättigungsgrad von 70 % einstellt, den erhaltenen Niederschlag dialysiert und dann auf ein vernetztes Polyacryl-Divinylbenzol-Harz (z.B. das Harz, das unter dem Warenzeichen "Amberlite" CG 50 erhältlich ist) aufbringt, dann das Harz zuerst mit 0', ΐ M Phosphat-Puffer wäscht und danach mit 0,3 M Phosphat-Puffer eluiert, das Eluat einer GeI-filtration durch ein vernetztes Dextrangel, das keine aktiven Carboxymethylgruppen enthält (z.B. das Harz, das unter dem Warenzeichen "Sephadex" G-75 oder "Sephadex" G-100) erhältlich ist), unterwirft und dann das Enzym isoliert.

Der durch die Ammoniumsulfat-Fraktionierung erhaltene Niederschlag wird vorzugsweise durch Zentrifugieren abgetrennt. Wie oben ausgeführt, wird der mit einem Ammoniumsulf a t-Sättigungsgrad von 50 % erhaltene Niederschlag verworfen, während der mit einem Ammoniumsulfat-Sättigungsgrad von 70 % erhaltene Niederschlag zurückbehalten wird und in diesenv Fall der Überstand verworfen wird. Der zurückbehaltene Niederschlag wird vor der Dialyse vorzugsweise in 0,1 molarem Phosphat-Puffer (pH 6,0) gelöst und auch vorzugsweise gegen den gleichen Phosphat-Puffer dialysiert. '

Der 0,1 molare Phosphat-Puffer, der zum Waschen des Harzes verwendet wird, hat vorzugsweise einen pH-Wert von 6,0 und der 0,3 molare Phosphat-Puffer, der zur Elution des Harzes verwendet wird, hat vorzugsweise einen pH-Wert von 8,5.

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—Π —

Das erhaltene Eluat wird vorzugsweise gegen 70 %ige gesättigte Ammoniumsulfatlösung dialysiert, und der erhaltene Niederschlag kann vorzugsweise durch Zentrifugieren abgetrennt werden.

Für die nachfolgende Stufe der Gelfiltration wird dieser Niederschlag vorzugsweise in einer minimal erforderlichen Menge 0,1 molarer Natriumchloridlösung gelöst. Das erhaltene Filtrat wird vorzugsweise gegen 80 %ige gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung dialysiert, und der erhaltene Niederschlag z.B. durch Zentrifugieren abgetrennt.

.Obgleich die Elutiohsstufe unter Verwendung des vernetzten Polyacryl-Divinylbenzol-Harzes bei etwa Raumtemperatür durchgeführt werden kann, sollten alle übrigen Stufen bei ca. 4⁰C durchgeführt werden, und wenn während des Verfahrens Stoffe vorübergehend gelagert werden, sollten sie auch bei ca. 4⁰C gehalten werden.

Das erfindungsgemäße Enzym wird entsalzt und in geeigneten Behältern, die vorzugsweise aus Glas sind, lyophilisiert. Nach der Versiegelung werden die Behälter bei einer Temperatur von 2 - 8 ⁰C an einem trockenen Platz aufbewahrt.

Dieses Enzym kann als Hilfe für den Fortbestand von inyokardischein Gewebe nach Infarkt und für die Behandlung von peripheren Gefäßkrankheiten verwendet werden. Die Verabreichung kann durch intravenöse oder intraarterielle Injektion erfolgen, wobei eine einzelne Dosierung gewöhnlich 200.000 Einheiten des Enzyms enthält.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung näher:

Beispiel

Stufe 1

Ammoniumsulfat-Fraktionierung des rohen Enzyms

125 g rohe Hyaluronidase werden bei 4⁰C in 5 1 0,1 molarem Natriumacetatpuffer (pH 6,0), der in bezug auf Natriumchlorid 0,1 molar ist, gelöst. Die Zugabe erfolgt langsam unter leichtem Rühren, um ein Schäumen zu verhindern. Dann wird langsam Ammoniumsulfat während einer Dauer von 3 h zugefügt, um eine 50 %ige Sättigung zu ergeben, wobei 1450 g Ammoniumsulfat zugefügt werden, und die Mischung wird über Nacht gerührt. Die Suspension wird bei 2500 upm 1 h lang zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Der Überstand wird durch sorgfältige Zugabe von 700 g Ammoniumsulfat während einer Dauer von 2 bis 3 h unter kontinuierlichem Rühren auf eine Ammoniumsulfat-Sättigung von 70 % gebracht, und dann über Nacht gerührt, worauf die Lösung bei 2500 upm 1 h lang zentrifugiert und der überstand verworfen wird. Der Niederschlag

^0 kann bei 4⁰C aufbewahrt werden.

Stufe 2 Ionenaustausch-Chromatographie

° Der Niederschlag von Stufe 1 wird in ca. 300 ml 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 6,0) gelöst und in einen Dialysebeutel (2,75" χ 2¹; 7 χ 61 cm) gegeben. Das Volumen des Beutels sollte ausreichen, um ein endgültiges Flüssigkeitsvolumen von bis zu 1 1 aufzunehmen. Der Inhalt wird

gegen 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 6,0) dialysiert (3 χ 24 h,

3x51).

Die Hälfte der Enzymlösung wird durch eine "Amberlite"

CG50-Säule (4,4 χ- 30 cm) bei Raumtemperatur mit einer Ge-35

schwindigkeit von 150 ml/h durchlaufen gelassen. Der

V Rest der Lösung kann in einem Plastikbehälter 24 h

bei +4⁰C vor der Weiterverarbeitung aufbewahrt werden.

Die Säule wird mit 1 1 0,1 M Phosphat-Puffer ( pH 6,0) mit einer Geschwindigkeit von 200 ml/h gewaschen. Überschüssiger Puffer wird von der Oberfläche des Harzes entfernt -und die Säule dann mit 0,3 M Phosphat-Puffer (pH 8,5) mit einer Geschwindigkeit von 100 ml/h eluiert. Die ersten 1,8 1 des 0,3 M Phopshat-Puffers (pH 8,5) werden gesammelt, und danach 10 ml Fraktionen aufgefangen. Proteingehalt und Enzymaktivität werden gemessen und die geeigneten Fraktionen vereinigt, um eine maximale Enzymausbeute mit einer gesamten spezifischen Mindestaktivität

von 7500 I.E./mg zu erhalten. 15

Die vereinigten Fraktionen werden gegen 70 %ige gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung dialysiert. Das gesamte, innerhalb - und außerhalb des Dialysebeutels befindliche flüssige Volumen wird auf 2 1 eingestellt und 900 mg Ammonium- ^O sulfat werden dem System zugegeben. Die Dialyse wird bei + 4°C mindestens über Nacht unter Rühren fortgeführt, und danach das ausgefallene Protein in einer Tischzentrifuge abgeschleudert. Der Niederschlag kann bei +4⁰C

aufbewahrt werden. 25

Stufe 3 Gelfiltration

Der Niederschlag von Stufe 2 wird in der kleinsten mögli-

chen Menge 0,1 M Natriumchloridlösung gelöst (700 mg Protein sollten sich in 4 ml 0,1 M Natriumchloridlösung unter Bildung eines Gesamtvolumens von ca. 8 ml lösen) und die Enzymlösung auf eine "Sephadex" G75 superfine-

Säule (80 χ 4,4 cm) aufgebracht, wobei die Durchflußrate 35

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30 ml/h nicht überstieg. Es wurden 10 ml Fraktionen gesammelt, Protein und Enzymaktivität bestimmt und die geeigneten Fraktionen vereinigt.

Die vereinigten Fraktionen werden gegen 80 %iges Ammoniumsulfat (520 g Ammoniumsulfat wurden zu 1 1 Gesamtvolumen gegeben) und wenigstens über Nacht bei +4⁰C gerührt, wonach der Niederschlag mittels einer Tischzentrifuge abgetrennt und bei +4⁰C gelagert wird.

Die folgende Tabelle 1 zeigt den Normalbereich der Ergebnisse, die mit der oben beispielhaft beschriebenen Methode erhalten wurden:

Tabelle 1

Stufe	Spezifische Protein	mg	%	Enzym-Einheiten	%' I
Rohes Enzym	Aktivität (I.E./mg)	125.000	100	total χ 10-6	100
50-70% Arnmonium- sulfat Schnitt	300-450	20-30.000	16-24	38-500	70-80
nach "Amberlite" CG 50	1.100 - 1.700	1.700- 2.100	1,3- 1,7	32-40	33-40
nach "Sephadex"G75	7.500 - 10.100	200- 300 i	0,16- 0,24	10-18	16-25
35-50.000	7-12

Die folgende Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse, die mit einem besonderen Ansatz nach der oben beispielhaft beschriebenen Methode erhalten wurden:

Tabelle 2

Stufe	• Hauptfraktion	%ursprüngl. Aktivität	Spezifische Aktivität (ΙΕ/mg)	Nebenfraktionen + verworfene Sub stanzen 3esamtaktivität (106 IE)	Totalak	tivität
Rohes Enzym	Gesamt- · aktivität xlO⁶ Ig	100	436	-	XlO⁶IE
50-70% AmmoniuitBulfat Schnitt	49	67	1,590	0-50% = 12 > 70% = 0	49	I ursprüngl. Aktivität
nach "Amberlite" CG50	33	35	8,390	(1) 4.6) ) 10 (2) 5.1)	45	100
nach "Sephadex" G75	(1) 8.4) ) 17 (2) 8.5)	22	40,400	(1) 1.3) ) 2.4 (2) 1.1)	39	92
(1) 6.3) ) 11 (2) 4.7)	35	80
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1 Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese

8 Enzymansätze wurden unter Verwendung eines Shandon-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-Apparates für analytische Zwecke bei pH 8,3 (B-.P.) und bei pH 4,3 untersucht. Die Elektrophorese bei pH 4,3 wurde unter Verwendung eines kleinporigen 7,5 %igen Acrylamid-Gels nach den vom Hersteller angegebenen Anweisungen durchgeführt. Die Gele wurden mit dem Enzym (10 bis 50 ug) in 10%iger Sucrose beladen und gegen die Anode bei 4 iciA pro Gel 90 min lang (pH = 4,3) oder bis der Bromphenolblau-Anzeiger den Boden des Gels erreichte (pH = 8,3) fließen gelassen. Die Gele wurden entweder mit 1 %igem Naphthalinschwarz "in 7%iger Essigsäure (pH = 4,3) oder mit 0,25 %igem Coomassie-Blau in Wasser/Methanol/ Essigsäure (227/227/46 Volumenanteile) (pH =8,3) gefärbt und mit einem geeigneten Lösungsmittel entfärbt.

Die acht Enzymansätze verhielten sich bei der Elektrophorese alle ähnlich. Bei pH = 8,3 wanderte das Enzym (50 μg) 3-4 mm als einzelne Proteinbande in das Gel. Bei pH = 4,3 wanderte das Enzym (10-25 μg) 25 - 30 mm als einzelne, leicht diffuse Proteinbande in das Gel. Bei pH = L)₁^ zeigten 50 μg des Enzyms außerdem auch eine schwache kleine Proteinbande, die 13-15 mm in das

25 Gel gewandert war.

Es wird angenommen, daß unter den obigen Elektrophorese-, Bedingungen das Enzym weitgehend homogen ist. Die zusätzliche schwache Proteinbande, die nur bei pH 4,3 zu sehen ist, wenn große Mengen an Protein (50 \i'g) auf das Gel aufgebracht werden, enthält nur einen kleinen Prozentsatz des Gesamtproteins.

Die folgende Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der pH-Werte und der Lichtabsorptionsmessungen, die mit einigen Proben des neuen Enzyms erhalten wurden:

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-13-

Tabelle

5.	Proben Nr.	pH	Absorption/50.000 IE	260 ηπι
	A	5.0	280 ran	0.30
	B	5.1	0.52	0.34
	C	5.2	0.58	0.33
10	D	5.2	0.55	0.29
	E	5.3"	0.49	0.28
	F G	5.2 5.1	0.46	0.33 0.365
15	- H	5.35	0.54 0.60	0.32
	0.53

25 Die nachfolgende Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse der Messung des Tyrosin-Gehaltes von einigen Proben des neuen Enzyms.

-14-Tabelle 4

Proben Nr.	% Tyrosin/mg Protein (Lowry)	spezifische Aktivi tät (-IS/mg Tyrosin-)
A B C D E F G H	8.1 8.8 6.6 8.1 * 7.6 ' · 7.8 8.2 7.4	631,000 612,000 690,000 631,000 658.000 595,000 595,000 595,000

Die folgenden Tabellen 5 und 6 zeigen die durchschnittlichen Aktivitäten der anderen in dem rohen Ausgangsmaterial enthaltenen Enzyme und des Enzyms gemäß der vorliegenden Erfindung.

	Tabelle 5	N-Acetylhexosaminidase (μ-Mole min"¹)	400-584(5)	neues Enzym
Enzym gemessen in gereinigten Vereinig ten Fraktionen		_-] Arylsulfatase A (uMole min )	1.60-2.50(5)	0.03-0.46(9)
Einheiten der Enzymaktivität/100,000 I.E. von roher Hyaluronidase und des erfindungsgemäßen Enzyms (Zahl der Analysen in Klammern)	Aryl sill fa-hase B (μΜοΙθ min )	0.61-1.32(5) ·	0.10-0.35(9)
roh	Esterase (μΜοΙβ min" )	2.1-6.6(5)	0.04-0.09(9)
— 1 3 ß-Glucuronidase (μΜοΙβ min χ 10 )	3-7(5)	0.01-0.02(9)
Säure-Phosphatase (μΜοΙβ min )	7-21(3)	nicht bestimmt
Säure-Protease (O.D. Einheiten min ')	3.5-4.5(4)	0.10-0.32(5)
Deoxyribonuclease (O.D.Einheiten min )	3.9-10.2(4)	0.01(7)
Enzym gemessen in dispensiertem gefriergetrocknetem neuem Enzym		0.02-0.15(7)
N-Acetylhexosaminidase (IiMoIe min ) Arylsulfatase A (μΜοΙβ min ) Esterase (μΜοΙε min )	0.02-0.22(8) 0.13-0.21(8) 0.03-0.05(8)

·"' ·^:· 3Η85Ί7

-16-Tabelle 6

Enzym	Enzymeinheiten/220.000 I.E. der Aktivität des erfindungs gemäßen Enzyms	unreines Enzym (420 I.E. mg"¹)
N-Acetylhexosamini- dase ^a) Deoxyribonuclease ) Säure-Phosphatase -^a) Esterase ^a' Säure-Protease Arylsulfatase A^a) Arylsulfatase B ß-Glucuronidase a	erfindungsge- . mäßes Enzym	1192 16,7 26,4 7,9 8,8 4,2 2,0 1 χ 10~²
0,29 0,18 0,46 0,04 0,02 0/4Z- 0,13 9 χ 10~⁵

a) Mol gebildetes Produkt/min per mg

b) Absorptionseinheiten/min per mg.

Die folgende Tabelle 7 zeigt den Gehalt an Rinderserum-Albumin von zufällig ausgewählten Proben des erfindungsgemäßen Enzyms und von unreinem Enzym.

·-* -"· 3H8517

-17-

Tabelle

Probe	μg Albumin/220.000 I.E. Enzymaktivität
A B C D E F G	0.31 0.50 0.76 1.00 1.17 2.90 0.26
unreines Enzym A B	457 835

25 Die folgende Tabelle 8 zeigt die Ergebnisse von Stabilitätstests, die bei der Lagerung des Enzyms in Glasampullen bei 4⁰C im Dunklen für verschiedene Zeiträume erhalten wurden.

♦ · m *

9 ft d ·

-18-Tabelle 8

Probe	Lagerung	. Lagerzeit in Monaten	% der ur sprünglichen Aktivität
A	52000/55000	5	106
B	48600/30000	19	62
C	51600/45000	19	87
D	52100/50000	17	96
E	49000/60000	18.5	122
F	59400/61000	18.3	103
G	60000/47300	19.2	79
H	60000/50300	19	84
I	50000/48000	21.5	96
J	57000/51000	21.3	89
K	48000/51000	12.7	106
L	51000/46000	16.2	90
M	47500/48200	15.4	101
N	63000/59700	15.3	95
0	• 54500/45700	19.1	84
P	56300/46600	18.9	"83
Q	65000/65000	14.9	100
R	59500/63500	12.0	107
S	55800/47500	12.4	85
T	54300/50800	12.2	94

·'■ ·^:· 3U8517

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1 Klinische Untersuchungen

Humanpharmakologische und Sicherheits-Untersuchungen

Sieben Patienten mit vermutetem Myokard-Infarkt wurde das Enzym (200.000 I.E.) intravenös in einem offenen Versuch injiziert. Die Serumhalbwertszeit des Enzyms wurde bestimmt und die Blutchemie, Hämatologie und das ECG wurden an diesen Patienten überwacht. Die Blutchemie, Hämatologie und das ECG wurden ebenfalls als Teil eines Doppelblindversuches überwacht.

Serum-Halbwertszeit: Die Enzymaktivität verschwand rasch . aus dem Serum, mit Halbwertszeiten von 2,5 bis 5,7 min, beobachtet an den sieben Patienten. Der Grund für diese rasche Abnahme ist /Bekannt, kann aber das Ergebnis der Bindung des Enzyms an Gewebesubstrat sein.

Blutchemie: Das Enzym ergab keine Veränderungen in der Kreatinkinase'(CK und sein myokardisches Isoenzym CKMB), Hydroxybutyratdehydrogenase (HBD), Aspartataminotransferase (AST), Alaninaminotransferase (ALT), alkalischer Phosphcttase (ALP) , Natrium, Kalium, Calcium, Harnstoff, Kreatinin, Bilirubin, Urat oder dem Gesamtprotein bei den Patienten der offenen Studie, obgleich es nicht möglich war, die gesamte Analytik bei allen Patienten zu messen. Einige Anälysenergebnisse waren außerhalb des normalen Bereichs als Ergebnis des Myokard-Infarkts, aber ein Vergleich des Auftretens der Veränderungen in CK, HBD, AST, ALT, Natrium, Kalium, Harnstoff und Creatinin im Doppelblindversuch zeigte keine Differenz im Auftreten oder der Schwere dieser Veränderungen bei den Enzym- und Placebo-Gruppen.

Hämatologie: In der offenen Studie hatte das Enzym keinen Effekt auf Hämoglobin (Hb), die Zahl der weißen Blutkörperchen (WBC), die Zahl der roten Blutkörperchen (RBC), das gepackte Zellenvolumen (PCV), die Differentialzählung, die Plättchen, Erythrocytensedimentationsgeschwindigkeit (ESR), die Thrombinzeit oder das Prothrombin-Verhältnis, obgleich es nicht möglich war, alle Analysenwerte bei allen Patienten zu bestimmen. WBC und ESR waren bei diesen Patienten erhöht, aber ein Vergleich des Auftretens und des Ausmaßes dieser Veränderungen im Doppelblindversuch zeigten keine unterschiede zwischen den Enzym- und Placebo-Gruppen.

ECG-Daten: Aus technischen und anderen Gründen war es nicht möglich, mit den sieben Patienten des offenen Versuches geeignete ECG-Daten zu erhalten. Die ECG-Daten der DoppeIblindversuche zeigten jedoch, daß das Enzym die Q-Wellenentwicklung bedeutend reduzierte, die R-Wellen aufrechterhielt und die Entwicklung von QRS-Abnormalitäten reduziertet

Klinische Versuche:

Protokolle:

Es wurden drei Doppelblindversuche ausgeführt, die alle _auf einem ähnlichen Protokoll basierten. Die hauptsächlichen Maßnahmen waren:

a) 200.000 Einheiten des Enzyms (Wirksamkeit ^ 40.000 Einheiten/mg) oder Placebo (normale Salzlösung) wur-

den innerhalb von 6 h seit Beginn der Symptome in einer langsamen intravenösen Injektion Patienten mit Myokard-Infarkt verabreicht.

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b) Alle Patienten mit typischen Symptomen wurden in die Untersuchung einbezogen und ein unterstützender Beweis für die Diagnose eines akuten Myokard-Infarkts wurde gemäß der WHO-Richtlinien erhalten.

c) Abgesehen von der einen Enzym/Placebo-Injektion, wurden alle Patienten gemäß der normalen Krankenhauspraxis behandelt.

d) Die Patienten wurden bis zur Entlassung aus dem Krankenhaus beobachtet und bis zu 6 Monaten.

e) Patienten wurden von der Untersuchung ausgeschlossen,

wenn

a) ihnen die Injektion mehr als 6 h nach dem Beginn der Symptome verabreicht wurde,

b) wenn sie bei der Aufnahme mit Heparin, Digoxin oder Antibiotika behandelt wurden,

c) den WHO-Kriterien für einen aktuten Myokard-Infarkt nicht genügten.

Drei Untersuchungen wurden vervollständigt mit den folgenden Abweichungen von der ursprünglichen Planung:

A. Diese Untersuchung schloß 483 Patienten ein, die Symptome von Myokard-Infarkt zeigten und denen das Enzym/Placebo in der Unfallabteilung gegeben wurde.

B. Dieser Versuch sollte ursprünglich 60-80 akzeptierbare Patienten als Versuchsstudie enthalten, wurde aber auf 193 Patienten ausgedehnt. Obgleich alle Patienten der Unfallabteilung umfaßt werden sollten, wurden nur die einbezogen, welche nach der Überführung in die Herzstation überlebten, weil ihnen dort das Enzym/Placebo 3^ verabreicht wurde. Die Ärzte entschieden auch, jeden Patienten über 70 Jahre auszuschließen.

C. Die vorgeschlagene Versuchsmenge war 100, aber nur 79 Patienten wurden umfaßt und von diesen hatten 71 einen bestätigten Infarkt.

Die hauptsächliche Bewertung der Enzymwirkung beruhte auf der Patienten-Sterblichkeit, die ein klarer, definierter Endpunkt ist. Andere Bewertungen der Effekte des Enzyms waren 35 Haupt-ECG (Studie C) oder 12 Haupt-ECG (Studie B) und die Messung der Infarktgröße unter Verwendung von CK-Isoenzymen und myokardischem Abtasten (Studie C).

Ergebnisse:

A. Es wurden alle Patienten in der Unfallabteilung mit vermuteten Myokard-Infarkten erfaßt, einschließlich von Extremfällen mit kardiogenem Schock oder nicht-meßbarem

Blutdruck.

483 Patienten (240 Enzym, 243 Placebo) wurden erfaßt.

Auf der Grundlage einer "beabsichtigten Behandlung" ergab sich eine statistisch signifikante Erniedrigung der Sterblichkeit bei den Enzym-behandelten Patienten.

Insgesamt starben 72 Patienten (27 Enzym (11 %), 45 Placebo (19%), χ² = 5,02, ρ<0,05). 128 Patienten (61 Enzym, 67 Placebo) hatten keinen bestätigten Myokard-Infarkt. Keiner dieser Patienten mit Enzym starb"und 5 Patienten der Placebo-Gruppe starben.

Diese Ergebnisse zeigen, daß das Enzym bei der Verwendung auf der Grundlage einer "beabsichtigten Behandlung" sicher ist, und das ist von großer Wichtigkeit, weil viele Fälle eine Behandlung erfordern bevor eine Diagnose auf Myokard-Infarkt bestätigt werden kann.

355 Patienten (179 Enzym, 176 Placebo) hatten einen bestätigten Myokard-Infarkt und 33 dieser Patienten

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(13 Enzym, 20 Placebo) fielen aus dem Versuchsschema, weil sie Heparin, Digoxin oder Antibiotika erhielten oder das Versuchsmaterial mehr als 6 h nach dem Beginn der Symptome erhielten. Es ist jedoch nicht notwendig, diese Ausnahmen jetzt in Betracht zu ziehen, und alle 355 Patienten mit Infarkt sind in den folgenden Ergebnissen berücksichtigt.

Bei den mit Enzym behandelten Patienten zeigte sich eine bemerkenswerte Senkung der Sterblichkeit und insgesamt starben 67 Patienten mit Infarkt (27 Enzym (15%); 40 Placebo (23%), χ² = 3,39, p< 0,10). Es wurde eine Gruppe von Patienten mit "hohem Risiko" identifiziert (97 Enzym, 101 Placebo), die entweder einen systolischen Blutdruck ^ 90 mm Hg und/oder einen zurückbehaltenen Herzkammerfehler hatten und/oder über 65 Jahre alt waren. 57 dieser Patienten starben (22 Enzym (23%), 35 Placebo (35%), χ² = 3,45, ρ < 0,10).

11 dieser Patienten mit "hohem Risiko" hatten einen nicht meßbaren Blutdruck bei ihrer Einlieferung ins Krankenhaus (7 Enzym, 4 Placebo), und diese Patienten hatten eine extrem geringe Aussicht. Wenn diese Patienten von der Sterblichkeitanalyse ausgenommen werden, dann sind die Sterblichkeitsdaten der Patienten mit Myokard-Infarkt, aber mit einem anfänglich meßbaren Blutdruck die folgenden:

Gruppe	Enzym tot / gesamt (%)	Placebo tot/gesamt (%)
alle Patienten Patienten mit "hohem Risiko"	21/172 (12 %) 16/90 (18 %)	37/172 (22 %)* 32/97 (33%)**

* x² = 5,3, ρ < 0,025 x² = 5,66, p<0,02

W ft

-24-

Obgleich ein größerer Prozentsatz der Patienten in der Enzymgruppe als in der Placebogruppe überlebte, waren die bei der Entlassung aus dem Krankenhaus und nach 6 Monaten verschriebenen Arzneimittel ähnlich.

B. 193 Patienten (97 Enzym, 96 Placebo) wurden erfaßt. 18 Patienten (8 Enzym, 10 Placebo) hatten keinen Myokard-Infarkt, 39 Patienten (19 Enzym, 20 Placebo) hatten einen möglichen Infarkt oder eine schwere Angina und 136 Patienten (70 Enzym, 66 Placebo) hatten einen bestätigten Infarkt. 10 dieser Patienten (5 in jeder Gruppe) wurden aus dem Versuch herausgenommen, weil sie dem Versuchsplan nicht entsprachen. Die Merkmale der Vorbehandlung der Enzym- und der Placebogruppen waren ähnlich. 13 Patienten mit bestätigtem Infarkt starben (5/56 Enzym (7,7 %; 8/61 Placebo (13,1%)). Infolge der geringen Zahl der Patienten ist dieser unterschied statistisch nicht signifikant, aber die Ergebnisse lassen darauf schließen, daß das Enzym einen klinisch bedeutsamen Nutzen besitzt. Vier Patienten mit vermutetem Infarkt starben (1/19 Enzym (5,3 %), 3/20 Placebo (15 %)).

Die Analyse der Vor- und Nachbehandlungs-Elektrokardiogramme zeigte, daß die Enzymbehandung das Ausmaß der Q-Wellenentwicklung und die Entwicklung von Abnormalitäten des QRS-Komplexes bedeutend reduzierte. Es zeigte sich auch eine Reduktion des Ausfalls der R-Wellen, aber dies erreichte keine statistische Bedeutung.

^⁰C. 79 Patienten (39 Enzym, 40 Placebo) wurden erfaßt. Zur Zeit der Aufnahme in den Versuch enthielt die Enzymgruppe bedeutend mehr Patienten mit kardiogenem Schock, Herzfehler, peripherer Hypoperfusion, pulmonaler Stauung (pulmonary congestion) und hämodynamischer Beeinträchtigung als die.Placebogruppe. Bei 8 Patienten (4 Enzym, 4 Placebo) wurde gefunden, daß sie keinen Myokard-Infarkt hatten.

Sieben Patienten starben im Krankenhaus, 5 in der Enzymgruppe und 2 mit verabreichtem Placebo. 4 von den 5 Todesfällen der Enzymgruppe waren aus der Kategorie mit "hohem Risiko", die zwei Todesfälle in der Placebogruppe

5 waren unter den Patienten mit geringerem Risiko.

Die Analyse von 35 Leit-ECG-Daten von "anfälligen" Leit-ECGs (jeder Patient fungierte als seine eigene Kontrolle) zeigte, daß die Q-Wellenentwicklung und der R-Wellenverlust zwischen dem ersten und dem dritten Tag nach dem Infarkt bei den mit Enzym behandelten Patienten im Vergleich zu den Patienten mit Placebo ■ bedeutend reduziert waren.

15 Nachteilige Reaktionen

Die einzigen festgestellten nachteiligen Reaktionen waren ein Fall von Ausschlag, der sich innerhalb von 3 Tagen klärte, und 10 Patienten mit kurzem Auftreten von

²^ Schüttelfrost oder Kälteschauer zwischen 0,5 und 2 h nach der Injektion. Im ersten Fall erhielt der Patient andere Arzneimittel (Lorazepant und Cyclizin) und in den letzteren Fällen wird angenommen, daß diese Reaktion von der Methode und der Geschwindigkeit der Reaktion her-

²⁵ rührt.

Diskussion

Myokard-Infarkt ist eine ernste Erkrankung, die, insbeson-

30 -<vnTtv

dere bei älteren Patienten/^Komplikationen, wie z.B. pulmonalem ödem und Venenstau, tödlich sein kann. Im Jahr 1977-1979 lag die Zahl der Todesfälle infolge von akuten Myokard-Infarkt (OPCS Mortality Statistics) weit über IQO.OQO pro Jahr. Es ist unmöglich, diese Zahlen mit den vorliegenden Untersuchungen zu vergleichen,

weil diese nur Patienten im Krankenhaus erfassen und bei denen die Patienten nur für maximal 6 Monate beobachtet wurden. Es würde jedoch schon eine Reduzierung der jährlichen Sterblxchkeitsrate um 1 % über 1.000 Leben

5 retten.

Die Untersuchung A wurde geplant und durchgeführt, um so gut wie möglich die normale Aufnahme und Behandlung von Patienten mit vermuteten Myokard-Infarkt zu erfassen.

Die Bestätigung dafür wurde durch die Feststellung erhalten, daß der Prozentsatz der Todesfälle im Krankenhaus für die Placebogruppe nahe der Todesrate vor dem Krankenhausaufenthalt lag: Unter diesen Bedingungen wurde die Todesrate für alle Patienten, die auf der Grundlage einer "beabsichtigten Behandlung" erfaßt wurden, nach 6 Monaten von 19 % in der Placebogruppe auf 11 % in der mit Enzym behandelten Gruppe gesenkt. Von Patienten mit bestätigtem Infarkt starben 23 % in der Placebogruppe, verglichen mit 15 % mit Enzymbehandlung. Diese Verminderung der Sterblichkeitsrate um etwa 35 % könnte die Rettung von vielen Tausend Leben ergeben, wenn das Enzym allgemein verwendet würde.

Die anderen zwei Untersuchungen beinhalteten geringere Zahlen von Patienten und in einer (der Studie C) waren die Merkmale der Patientenvorbehandlung in den Placebo- und den Enzymgruppen deutlich verschieden. In der anderen Untersuchung (Studie B) betrug die Sterblxchkeitsrate nach 4 Monaten in der Placebogruppe 13 %, und in der Enzym- ^O gruppe 7,7 %. Diese beiden Zahlen sind viel geringer als die in der Studie A, aber auch sie zeigen bei Verwendung des Enzyms eine Verminderung der Sterblichkeit nach 4 Monaten um 41%.

3U8517

Ein bestätigender Beweis für den günstigen Einfluß des Enzyms auf das Myokard wurde in diesen beiden letzteren zwei Studien durch Prüfung der Elektrokardiogramme vor und nach der Injektion festgestellt.

Schlußfolgerungen

Es wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Enzym in einer einzigen intravenösen Injektion verabreicht bei Patienten mit vermutetem Myokard-Infarkt sicher und gut verträglich ist. Auf der Grundlage einer "beabsichtigten Behandlung" und bei Patienten mit bestätigtem Myokard-Infarkt, insbesondere solchen mit einem "hohen Risiko", wurde eine deutliche Verringerung der Sterblichkeit bei den mit dem Enzym behandelten Patienten gefunden, verglichen mit den mit Placebo behandelten Patienten.

Das erfindungsgemäße Enzym liegt vorzugsweise in lyophilisierter Form in einer Ampulle vor, die eine Enzymaktivitat von ca. 220.000 I.E. enthält, wobei die Dosierungseinfe/hUt 200.000 I.E. beträgt. Der Überschuß von 20.000 I.E. soll die Verluste während der Injektion abdecken. Jede Ampulle enthält vorzugsweise auch 150 bis 350 μg Natriumacetat B.P.. Die Ampullen sollten an einem

25 trockenen Platz bei ca. 4⁰C aufbewahrt werden.

Zur Verwendung des Enzyms wird der Inhalt einer Ampulle in 2,2 ml Natriumchlorid zur intravenösen Infusion (B.P.) ohne Schütteln gelöst. Die Lösung wird langsam in eine Plastik-Injektionsspritze aufgezogen und 2 ml intravenös mit einer langsamen und konstanten Geschwindigkeit injiziert.

Claims

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing. H. Liska 8000 MÜNCHEN 86, DEN ^ POSTFACH 860 820 H/SM/HS MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22 Biorex Laboratories Limited, Biorex House, Canonbury Villas, London, N1 2HB, England . . Neues und therapeutisch wirksames Enzym Patentansprüche

1. Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß es ein geruchloses, weißes Pulver ist, in Lösung bei einer Konzentration von 15.000. bis 22.000 I.E./ml in einer Kohlendioxid-freien, für Injektionszwecke geeigneten Salzlösung einen pH-Wert von 4,5 bis 7,5 zeigt, wobei die Lösung klar und farblos ist, und dessen Lösung bei einer Konzentration von 50.000 I.E./3 ml in einer Kohlendioxid-freien, für Injektionszwecke geeigneten Salzlösung eine Lichtabsorption von nicht mehr als 0,60 bei 280 nm und von nicht mehr als 0,37 bei 260 nm besitzt, und daß die folgenden Aminosäurekonzentratxonen in % zeigt:

'"""' ■""" '"'.'~ 3H8517

1 Asp 11,1 + 0,4; Thr 5,8 + 0,1; Ser 6,4 + 0,2; GIu 9,1 + 0,2; Pro 5,0 + 0,5; GIy 6,6 + 0,2; Ala 7,4 + 0,1; VaI 7,9 + 0,5; Met 0,8 + 0,1; He 5,2 + 0,2; Leu 10,9+ 0,2; Tyr 4,4 + 0,1; 5 Phe 4,5 + 0,1; His 2,8 + 0,2; Lys 7,6+0,4; Arg 5,6 + 0,1;

einen Gesamthexosegehalt von 10,6 + 0,003 % besitzt, nicht mehr als 5 ug Albumin in 220.000 I.E. der Aktivität besitzt und das ein durch Gelfiltration bestimmtes Molekulargewicht von 62.000 bis 70.000 besitzt.

2. Verfahren zur Herstellung des Enzyms nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man rohe Hyaluronidase einer Ammoniumsulfat-Fraktionierung unterwirft durch Zufügen von Ammoniumsulfat zu einer gepufferten Lösung von roher Hyaluronidase bis zu einem Ammoniumsulfat-Sättigungsgrad von ca. 50 %, den erhaltenen Niederschlag verwirft und den Überstand auf einen Ammoniumsulfat-Sättigungsgrad von 70 % einstellt, den erhaltenen Niederschlag dialysiert und dann auf ein vernetztes Polyacryl-Divinylbenzol-Harz aufbringt, dann das Harz zuerst mit 0,1 M Phosphat-Puffer wäscht und danach mit 0,3 M Phosphat-Puffer eluiert, das Eluat einer Gelfiltration durch ein vernetztes Dextrangel, das keine aktiven Carboxymethylgruppen enthält, unterwirft und dann das Enzym isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

daß der durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung erhaltene Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der zu dialysierende Niederschlag in 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 6,0) gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert wird.

* * ft «ο «

— 3—

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der 0,1 M Phosphat-Puffer, der zum Waschen des Harzes verwendet wird, einen pH-Wert von 6,0 besitzt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der 0,3 M Phosphat-Puffer, der zur Elution des Harzes verwendet wird, einen pH-Wert von 8,5 besitzt.

7. Das in den Beispielen beschriebene Verfahren zur Herstellung des Enzyms nach Anspruch 1.

8. Enzym nach Anspruch 1, erhalten durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 7.

9. Pharmazeutische Verabreichungsform, enthaltend

ca. 220.000 I.E. des Enzyms nach Anspruch 1 in lyophilisierter Form.
20

10. Pharmazeutische Verabreichungsform nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich 150 bis 350 μg Natriumacetat enthält.

11. Enzym nach Anspruch 1 oder 8 zur Verwendung in der Therapie von Myokard-Infarkt.