FR2495634A1 - Enzyme nouvelle et utilisable en therapeutique - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UNE ENZYME QUI EST UNE POUDRE BLANCHE, INODORE, DE PH COMPRIS ENTRE 4,5 ET 7,5 POUR UNE SOLUTION DE 15000 A 22000UIML DANS DU SERUM PHYSIOLOGIQUE POUR INJECTIONS NE CONTENANT PAS DE DIOXYDE DE CARBONE, LA SOLUTION ETANT CLAIRE ET INCOLORE; UNE SOLUTION DE 50000UI DE CELLE-CI DANS 3ML DE SERUM PHYSIOLOGIQUE POUR INJECTIONS NE CONTENANT PAS DE DIOXYDE DE CARBONE A UNE ABSORPTION LUMINEUSE NON SUPERIEURE A 0,6 A 280NM ET NON SUPERIEURE A 0,37 A 260NM; L'ANALYSE DE LADITE ENZYME DONNANT LES POURCENTAGES D'ACIDES AMINES SUIVANTS: ASP 11,1 0,4; THR 5,8 0,1; SER 6,4 0,2; GLU 9,1 0,2; PRO 5,0 0,5; GLY 6,6 0,2; ALA 7,4 0,1; VAL 7,9 0,5; MET 0,8 0,1; ILE 5,2 0,2; LEU 10,9 0,2; TYR 4,4 0,1; PHE 4,5 0,1; HIS 2,8 0,2; LYS 7,6 0,4; ARG 5,6 0,1; LADITE ENZYME RENFERMANT UNE QUANTITE TOTALE D'HEXONE DE 10,6 0,003; LADITE ENZYME NE CONTENANT PAS PLUS DE 5MG D'ALBUMINE PAR 220000UI ACTIVITES ET LADITE ENZYME AYANT UN POIDS MOLECULAIRE COMPRIS ENTRE 62000 ET 70000 DETERMINE PAR CHROMATOGRAPHIE SUR TAMIS MOLECULAIRE. LA PRESENTE INVENTION CONCERNE EGALEMENT UN PROCEDE DE PREPARATION DE CETTE ENZYME ET UNE UNITE DE DOSAGE LA CONTENANT.

Description

La présente invention concerne une enzyme nouvelle utilisable en théra-

peutique et sa préparation.

On connaît depuis plusieurs années une enzyme appelée hyaluronidase, qui

catalyse l'hydrolyse de l'acide hyaluronique, matière ciment des tissus.

Un grand nombre des préparations de hyaluronidase antérieurement dispo-

nibles contenaient de très grandes quantités d'autres matériaux enzymatique-

ment actifs, outre l'enzyme que l'on pense être effectivement responsable de la catalyse de l'hydrolyse de l'acide hyaluronique. La nature hétérogène de

la hyaluronidase a été discutée dans un article de GREILING et al. (Z.

physiol. Chem., 340, 243, 1965).

On connaît plusieurs procédés de purification de la hyaluronidase (cf.

les descriptions des Brevets britanniques n01,060,513 et 1,425,918) et ce

matériau purifié a été utilisé avec succès dans le traitement de l'infarctus du myocarde et des troubles de la circulation périphérique, y compris ceux

associés à la gangrène.

Cette action extrêmement utile de la hyaluronidase semble être due à son pouvoir de "diffusion", c'est-à-dire, son pouvoir à provoquer une diffusion rapide des fluides injectés dans les tissus, aussi bien que son pouvoir de dissocier les agrégats qui sont responsables ou contribuent à la génèse des infarctus et des troubles circulatoires. On a constaté que les préparations

de hyaluronidase antérieurement connues possédaient une activité d'accroisse-

ment de la permabilité qui se manifestait par une perméabilité capillaire

accrue; nous avons également observé que les préparations connues de hyalu-

ronidase à l'état brut entraînaient une baisse de la pression sanguine.

Toutefois, ces activités sont peu souhaitables lorsque la hyaluronidase est utilisée pour le traitement des infarctus du myocarde et des troubles de la circulation périphérique. _ HOUCK et CHANG (Inflammation, 3, (4)., 447-451, (1979)) ont récemment découvert que les préparations de hyaluronidase contenaient un composant qui

accroissait la perméabilité de la microcirculation dans la peau.

Un des objets de la présente invention est une préparation enzymatique qui peut être obtenue à partir de la hyaluronidase mais qui ne contienne qu'en très faibles proportions le composant qui accroit la perméabilité, et

qui en outre n'entraîne pas de baisse de la pression sanguine.

L'enzyme produite selon la présente invention est une poudre blanche, inodore, de pH compris entre 4,5 et 7,5 pour une solution de 15 000 à 22 000 ui/ml dans du sérum physiologique pour injections ne contenant pas de dioxyde de carbone, la solution étant claire et incolore; une solution de 50 000 UI de celle-ci dans 3 ml de sérum physiologique pour injections ne contenant pas de dioxyde de carbone a une absorption lumineuse non supérieure à 0,6 à 280 nm et non supérieure à 0,37 à 260 nm; l'analy,-se de ladite enzyme dormant les pourcentages d'acides aminés suivants: Asp 11,1 + 0,4; Thr 5,8 + 0,1; Ser 6,4 + 0,2; Glu 9,1 + 0,2; Pro 5,0 + 0,5; Gly 6,6 + 0,2;Ala 7,4 + 0,1; Val 7,9 + 0,5; Met 0,8 + 0,1; Ile 5,2 + 0,2; Leu 10,9 + 0,2; Tyr 4,4 + 0,1; Phe 4,5 + 0,1; His 2,8 + 0,2; Lys 7,6 + 0, 4; Arg 5,6 + 0,1; ladite enzyme renfermant une quantité totale d'hexose de 10,6 + 0,003;

ladite enzyme ne contenant pas plus de 5 pg d'albumine par 220 000 ULI activi-

tés et ladite enzyme ayant un poids moléculaire compris entre 62 000 et

70 000 déterminé par chromatographie sur tamis moléculaire.

La présente invention donne également un procédé de préparation de l'enzyme décrite ci-dessus, dans lequel de la hyaluronidase à l'état brut est :oumise à un fractionnement au sulfate d'ammoniaque par addition de sul fate d'ammoniaque à une solution tamponnée de hyaluronidase à l'état brut jusqu'à ce que le degré de saturation en sulfate d'ammoniaque soit d'environ 50 %, le précipité obtenu étant mis de côté et la partie surnageante étant amenee a une saturation en sulfate d'ammoniaque de 70 %, le nouveau précipité obtenu étant dyalisé puis appliqué sur une résine divirnybenzène polyacrylicue

réticulée (par exemple la résine disponible sous la Larque déposée "'Amberli-

te" CG 50), après quoi, la résine est d'abord lavée avec une solution phos-

phatée tampon à 0,1 M, puis éluée avec une solution phosphatée tampon à 0, 3 M, l'éluat étant passé dans un tamis moléculaire sur un gel réticulé au dextrane qui ne contienne pas de groupements actifs de -arbo:vmàthyle (par exemple la résine disponible sous la marque déposée "Sephadex" G-75 ou

"Sephadex" G-100), puis l'enzyme est isolée.

Le précipité obtenu par le fractionnement au sulfate d'ammoniaque est

séparé de préférence par centrifugation. Comme indiqué ci-dessus, le précipi-

té obtenu avec un degré de saturation du sulfate d'ammoniaque de 50 % est abandonné, alors que le précipité obtenu avec un degré de saturation du sulfate d'ammoniaque de 70 % est retenu et que, dans ce cas, la solution surnageante est abandonnée. Le précipité retenu est, avant la dialyse, dissous de préférence dans une solution phosphatée tampon à 0,1 M ( pH 6, 0)

et aussi dialysée de préférence contre la même solution phosphatée tampon.

La solution phosphatée tampon à 0,1 M utilisée pour laver la résine a de préférence un pH de 6,0 et la solution phosphatée tampon à 0,3 X utilisée

pour éluer la résine a de préférence un pH de 8,5.

L'éluat obtenu est de préférence dialysé en une solution saturée à 70 % de sulfate d'ammoniaque et le précipité obtenu peut avantageusement tre

séparé par centrifugation.

Pour l'étape suivante de chromatographie sur tamis moléculaire, ce précipité est dissous de préférence dans une quantité minimale d'une solution de chlorure de sodium à 0,1 M. Le filtrat obtenu est de préférence dialysé contre une solution de sulfate d'ammoniaque saturée à 80 %, le précipité

obtenu étant par exemple récupéré par centrifugation.

Bien que l'étape d'éluation utilisant le divinylbenzène polyacrylique reticulé puisse être menée à bien à température ambiante, on comprendra que toutes les autres étapes doivent être effectuées à 40C environ et que lorsque le matériau est temporairement stocké pendant le processus, il doit également

être gardé à 40C environ.

L'enzyme selon la présente invention est dessalée et lyophilisée dans des récipients appropriés, qui sont de préférence en verre. Après avoir été scellés, les récipients sont stockés à une température comprise entre 2 et

C, dans un endroit sec.

Cette enzyme est utile comme aide à la survie du tissu du myocarde après

un infarctus et également dans le traitement de maladies vasculaires périphé-

riques. L'administration se fait par voie intraveineuse ou intraartérielle,

un dosage unitaire contenant habituellement 200 000 UI de l'enzyme.

L'exemple qui suit est donné à titre d'illustration de la présente invention.

Exemple

Etape n1.

Fractionnement par le sulfate d'ammoniaque de l'enzyme à l'état brut.

g de hyaluronidase à l'état brut sont dissous à 40C dans 5 litres d'une solution tampon d'acétate de sodium à 0,1 M (pH 6,0) qui est à 0,1 M par rapport au chlorure de sodium. L'addition est effectuée lentement en remuant doucement afin d'éviter de faire mousser. Du sulfate d'ammoniaque est

alors ajouté lentement, sur une durée de 3 heures; pour obtenir une satura-

tion de 50 X, 1 450 g de sulfate d'ammoniaque sont ajoutés et le mélange remue jusqu'au lendemain. La suspension est centrifugée à 2 500 tours/mn pendant 1 heure et le précipité est écarté. La solution surnageante est amenée à une saturation en sulfate d'ammoniaque de 70 % par addition avec précautions de 700 g de sulfate d'ammoniaque sur une durée de 2 ou 3 heures, en remuant constamment, puis à nouveau remuée jusqu'au lendemain, après quoi la solution est centrifugée à 2 500 tours/mn pendant 1 heure et la solution

surnageante est écartée. Le précipité peut être stocké à 40C.

Etape 2 Chromatographie par échange d'ions Le précipité obtenu à l'étape 1 est dissous dans 300 ml environ d'une solution phosphatée tampon à 0,1 M (pH 6,0) et transféré dans une poche à

dialyse (dimensions:7 x 60 cm).

Le v9luine -e la poche doit être suffisant pour pouvoir contenir un v\'lur.e final de liquide de 1 litre. Le contenu est dialysé (3 x 24 H) contre

du phosphate à 0,1 M (pH 6,0) (3 x 5 litres).

La moitié de la solution enzymatique est passée dans une colonne (4,4 x 30 cm) en "Aiberlite" CG 50, à température ambiante, à la vitesse de ml à l'heure. L'autre moitié de la solution peut être gardée 24 heures

dans des récipients en plastique à 40C avant d'être traitée.

La colonne est lavée avec 1 litre d'une solution phosphatée tampon à 0,1 D- (pH 6,0) à la vitesse de 200 ml à l'heure. La solution tampon en excès est enlevée du dessus de la résine et la colonne est alors éluée avec du phosphate à 0,3 M (pH 8,5) à la vitesse de 100 ml à l'heure. Les 1,8 litres initiaux de phosphate élué sont collectés, puis sont collectées des fractions

de 10 ml.

L'activité des protéines et l'activité enzymatique sont mesurées et les fractions appropriées groupées pour donner un rendement maximum en enzyme

avec une activité spécifique minimum totale de 7 500 UI/mg.

La masse est dialysée contre une solution saturée à 70 % de sulfate d'ammoniaque. Le volume total de liquide, à l'intérieur et à l'extérieur de la poche de dialyse, est ajusté à 2 litres et on ajoute 900 mg de sulfate d'ammonium à l'ensemble. La dialyse est poursuivie à + 40C, au moins jusqu'au lendemain, tout en remuant, après quoi la protéine précipitée est centrifugée. Le

précipité peut être stocké à + 40C.

Etape 3 Chromatographie sur tamis moléculaire Le précipité de l'étape 2 est dissous dans un volume minimum d'une

solution de chlorure de sodium à 0,1M (700 mg de protéine devrait se dissou-

dre dans 4 ml d'une solution de chlorure de sodium à 0,1 M pour donner un volume total d'environ 8 ml) et la solution enzymatique est appliquée sur une colonne de "Sephadex" fl75 superfine (80 x 4,4 cm) avec une vitesse de débit n'excédant pas 30 ml à l'heure. On récupère 10 ml de fractions, on mesure

l'activité des protéines et enzymes et on groupe les fractions appropriées.

La masse est dialysée contre 80 % de sulfate d'ammoniaque, 520 g de sulfate d'ammoniaque étant ajoutés à un volume total de 1 litre, puis remués au moins jusqu'au lendemain à + 40C, après quoi le précipité est isolé avec

une centrifugeuse et stocké à + 40C.

Le tableau 1 qui suit donne la gamme normale de résultats obtenus

lorsque l'on utilise la méthode donnée en exemple ci-dessus.

Le tableau 2 qui suit donne les résultats obtenus lors d'un essai de

production particulier en utilisant la méthode donnée en exemple cidessus.

TABLEAU 1

Etape: Activité: Protéine: Unité d'enzymes: : spécifique:-----------------:-------------------.: : (UI/mg): mg: %: total x 10-6: %: Enzyme à état brut: 300-450: 125 000: 100: 38-500: 100: Coupage avec 50-70% de: 1 100 :20-30 000: 16-24: 32-40: 70-80: sulphate d'ammoniaque: 1 700:: :: : Post "amberlite"CG50: 7 500 -: 1700 -: 1,3 -: 10-18: 33-40:

: 10 100: 2100: 1,7:: :

___________________________________--- - - - _ - - - - -- - - - - -- - - - -

Post "Sephadex" G75: 35-50 000: 200-300: 0,16-: 7-12: 16-25:

:: : 0,24:

Electrophorèse dans le gel polyacrylamide

Huit lots d'enzyme ont été étudiés en utilisant l'appareil d'électropho-

rèse dans le gel poylacrylamide de marque Shandon avec un pH de 8,3 Pharmaco-

pée Britannique et avec pH de 4,3. Pour l'électrophorèse avec un pH de 4, 3, on a utilisé un gel acrylamide à 7,5 % à faible porosité, en suivant les instructions du constructeur. Les gels ont été charges avec l'enzyme (10 à kg) dans 10 % de sucrose et acheminés vers l'anode à 4 mA par gel pendant

90 minutes (pH 4,3) ou jusqu'à ce que le marqueur au bromophénol bleu attei-

gne le fond des gels (pH 8,3). Les gels ont été colorés soit avec 1 % de noir de naphtaline dans 7 % d'acide acétique (pH 4,3), soit avec 0,25 % de bleu de Coomassie dans un mélange eau/méthanol/acide acétique (rapport volumique

227/227/46) (pH 8,3), puis décolorés avec un solvant approprié.

Les huit lots d'enzyme se sont comportés de manière identique lors de l'électrophorèse. A pH 8,3, l'enzyme (50 ig) migre de 3 à 4 mm à travers le gel sous forme d'une seule bande de protéine. A pH 4,3, l'enzyme (10 à 2511g) migre de 25 à 30 mm à travers le gel sous forme d'une bande de protéine légèrement diffuse. A pH 4,3, 50 g d'enzyme exhibait aussi une bande faible

mineure de protéine qui avait migré de 13 à 15 mm à travers le gel.

TABLEAU 2

Etape: Fraction principale: Fractions secondaires: Activité totale prise en compte:

:---------------------------- --- -: + déchets:-.. . .: -- - - - -- - - -- - -

: Activité: Activité: Activité: Activité: x106 UI:Activité d'origine %: : totale:d'origine: spécifique: totale (106 UI)::: : xlO6 UI: %: (UI/mg):: :: Enzyme à l'état brut: 49: 100: 436: -: 49: 100

_____________________ --------------------- ------------- ----- ---------:: --:

Coupage avec 50-70 %: 33: 67: 1 590: 0-50 % = 12: 45: 92:

:::: > 70 % = 0:::

___________:.........::...................... _ _ _ _ _...................

.._____-_____ ---__ __------:::..DTD: Post "Amberlite":(1) 8,4)::: (1) 4,6):::

CG50: )17: 35: 8 390:) 10 : 39: 80

:(2) 8,5): : : (2) 5,1):

__________________-- __-- _________ --------- ___-------------__ -- - _ - - -- - - - - --- - - - - - - -- -- - -- -- - -- -

Post "Sephadex":(1) 6,3):: : (1) 1,3):::

G75: )11. : 22: 40 400:) 2,4 : 35: 71:

:(2) 4,7): : : (2) 1,1):::

ON ru LAl 0% 4w

On en conclut que, dans les conditions d'électrophorèse énoncées ci-

dessus, l'enzyme était largement homogène. La bande faible de protéine supplémentaire, qui n'est constatée qu'avec un pH 4,3 lorsqu'une grande quantité de protéine (50jg) est appliquée au gel, ne comprend qu'un faible pourcentage de la protéine totale. Le tableau 3 qui suit donne les résultats des mesures du pH et de

l'absorption lumineuse obtenues avec plusieurs lots de la nouvelle enzyme.

TABLEAU 3

Lot: pH: Absorption à 50 000 UI: No.:: ---------------------------------: :: 280 nm: 260 nm:

A: 5,0: 0,52: 0,30:

B: 5,1: 0,58: 0,34:

C: 5,2: 0,55: 0,33:

D: 5,2: 0,49: 0,29:

E: 5,3: 0,46: 0,28:

F: 5,2: 0,54: 0,33:

G: 5,1: 0,60: 0,365:

H: 5,35: 0,53-: 0,32:

Le tableau 4 qui suit donne les résultats obtenus lors de mesures de la

tyrosine contenue dans plusieurs lots de la nouvelle enzyme.

Les tableaux 5 et 6 qui suivent donnent les activités moyennes d'autres enzymes présentes dans le matériau de départ à l'état brut et dans l'enzyme

de la présente invention.

Le tableau 7 suivant donne le contenu en sérum albumine bovine de lots

choisis au hasard d'enzyme selon la présente invention et d'enzyme impure.

Le tableau 8 suivant donne les résultats de tests de stabilité obtenus en stockant l'enzyme dans des fioles en verre à 4 C dans le noir pour des

périodes variables.

TABLEAU 4

Lot No.: de tyrosine par mg.: Activité spécifique: : de protéine (Lowry): (UI/mg. tyrosine):

A: 8,-1: 631 000:

B: 8,8: 612 000:

C: 6,6: 690 000:

P: 8,1: 631 000:

: 7,6: 658 000:

F: 7,8: 595 000:

G: 8,2: 595 000:

H: 7,4: 595 000:

TABLEAU 6

Enzyme: Unites d'enzyme par 220,000 UI d'enzyme active: : selon la présente invention: : Enzyme selon la présente: Enzyme impure: : invention: (420 UI mg-): N-acetyvl hexosaminidase a): 0,29: 1192: Déoxyribonuclease b): 0,18: 16,7: Phosphatase acide a): 0,46: 26,4: Estérase a) 0,04: 7,9 Protase acide b): 0,02: 8,8: Arylsulfatase A) 0,42: 4,2: a) Arylsulfatase B: 0,13: 2,0: 8-glucuronidase a): 9 x 10-5: 1 x 102: a) mol. de produit formé/min. par mg b) unites d'absorption/min. par mg

TABLEAU 5

Enzyme mesurée dans le bain de purification : Unités d'enzyme active par 100 000 UI de hyaluronidase à l'état : brut et de l'enzyme selon la présente invention : (nombre d'analyses entre parenthèses) : à l'état brut: nouvelle enzyme: N-acétylhexosaminidase (pmoles min-1): 400-584 (5) : 0,03-0,46 (9) Arylsulfatase A (pmoles min-1): 1,60-2,50 (5): 0,10-0,35 (9): Arylsulfatase B (pmoles min-1): 0,61-1,32 5): 0,04-0,09 (9) Estérase p:moles min) 2,1-6,6 (5): 0,01-0,02 (9): B-glucuronidase (pmoles min-1 x 103): 3-7 (5) non détectée: Phosphatase acide (Mmoles min -): 7-21 (3): 0, 10-0,32 (5): Protéase acide (unités O.D. min-1): 3,5-4,5 (4): 0,01 (7) Déoxyribonucléase (unités O.D. min-): 3,9-10,2 (4): 0,02-0,15 (7): Enzyme mesurée dans la nouvelle enzyme: préparée et lyophilisee N-acétyl hexosaminidase (pmoles min-1) Arylsulfatase A (pmoles min) Estérase (pmoles min 1)

f - -

0,02-0,22

0,13-0,21

0,03-0,05

(8) (8) (8) N %0 LnI b. - -

TABLEAU 7

: Lot: g. d'albumine par 220 000 UI: :: d'enzyme active:

:......:...........:

: A: 0,31:

: B: 0,50:

: C: 0,76:

: D: 1,00:

: E: 1,17:

: F: 2,90:

: G: 0,26:

::..................:

: Enzyme: : impure:

: A: 457

: B: 835

Etudes cliniques Etudes d'innocuité et de pharmacologie sur l'homme On a administré à sept patients présumés atteints d'un infarctus du

myocarde, l'enzyme (200 000 UI) par voie intraveineuse, lors d'études ouver-

tes. La demi-vie de l'enzyme dans le sérum a été déterminée, et la chimie sanguine, l'hématologie et l'électrocardiogramme (ECG) ont été monitorés chez ces patients. La chimie sanguine, l'hématologie et l'ECG ont également été

monitorés pour des essais en double aveugle.

Demi-vie dans le sérum L'activité enzymatique disparaissait rapidement dans le sérum, avec des demi-vies allant de 2,5 à 5,7 minutes chez les sept patients étudiés. On ne connaît pas la raison de cette disparition rapide mais c'est peut-etre le

résultat de la liaison de l'enzyme aux substrats des tissus.

Chimie sanguine L'enzyme n'a entraîné aucun changement dans la créatine Kinase (CK et son isoenzyme du myocarde la CKI), l'hydroxybutyratedéhydrogénase (HBD) l'aspartate-aminotransferase (AST), l'alamineaminotransférase (ALT), la 1]

TABLEAU 8

: UI par fiole :,avant/après stockage : Période de : stockage en : mois : % d'activité au: : départ: : A

:0 B

: C : D : E : F : G : H : I : J : K : L : M : N : O : P : Q : R : S : T

: 52000/55000

: 48600/30000

: 51600/45000

: 52100/50000

: 49000/60000

: 59400/61000

: 60000/47300

60000/50300

: 50000/48000

: 57000/51000

: 48000/51000

: 51000/46000

: 47500/48200

: 63000/59700

: 54500/45700

: 56300/46600

65000/65000

: 59500/63500

: 55800/47500

: 54300/50800

: 5

18,5 18,3 19,2 21,5 21,3 12,7 16,2 ,4 ,3 19,1 18,9 14,9 12,0 12,4 12,2 : Lot s

: 106

: 62

: 87

: 96

: 122

: 79

: 84

: 96

: 89

: 106

: 90

: 101

: 95

: 84

: 83

: 100

: 85

: 94

?hosatae aicalinr (PAL), le sodium, le potassium, le calcium, l'urée, la

crZatini:.. la _' rubline, l'urate ou les protéines totales, chez les pa-

tints e l'::tude ouverte, bien qu'il n'ait pas été possible de faire toutes ec...alyseschez tous les patients. Certains résultats d'analyse étaient

D au-delà de i nor"mle à cause de l'infarctus du myocarde, mais une comparai-

son de l'incidence des changements de la CK, l'HBD, l'AST, l'ALT, le Na, le K, i'urée et la créatinine dans l'étude en double aveugle a montré qu'il n'y avoit pas de différeice, dans l'incidence ou la gravité de ces changements

dans le groupe recevant l'enzyme et celui recevant un placebo.

Héimatologie Dans l'étude ouverte, l'enzyme n'a eu aucun effet sur l'hémoglobine (Hb), la numération globulaire des leucocytes, la numération globulaire des

hématies, le volume moyen cellulaire (VMC), la formule sanguine, les plaquet-

tes sanguines, la vitesse de sédimentation de l'grythrocyte (VSE), le temps de réaction de la thrombine ou taux de prothrombine, bien qu'il n'ait pas été

possible d'effectuer toutes ces ananlyses chez tous les patients. La numéra-

tion globulaire des leucocytes et la VSE étaient élevées chez ces patients, mais une comparaison de l'incidence et de l'étendue de ces changements dans étude en double aveugle a montré qu'il n'y avait pas de différences entre

le groupe recevant l'enzyme et celui recevant le placebo.

Electrocardiogramme Pour diverses raisons techniques ou autres, il n'a pas été possible d'obtenir des résultats valables de l'électrocardiogramme sur les sept patients de l'étude ouverte. Toutefois, les résultats des études en double aveugle ont montré que l'enzyme réduisait de façon notable le développement de l'onde Q, entretenait les ondes R et réduisait le développement des

anomalies QRS.

Essais cliniques Protocoles Trois études en double aveugle ont été effectuées, toutes basées sur un même protocole. Les dispositions principales étaient les suivantes: a) 200 000 unités de l'enzyme (activité > 40 000 unités/mg) ou du placebo

(solution saline normale) étaient administrées aux patients atteints d'infar-

ctus du myocarde sous forme d'une lente injection intraveineuse dans les 6

heures suivant la première apparition des symptomes.

b) Tous les patients présentant des symptomes typiques étaient intégrés à l!'tude et la preuve du diagnostic d'infarctus aigu du myocarde était obtenue

d'après les directives de l'OMS.

c) Mise à part l'injection d'enzyme ou de placebo, les patients recevaient le

traitement hospitalier habituel.

1 3 d) Les patients étaient mis sous surveillance continue jusqu'à leur sortie de

l'hôpital et pendant une durée maximum de 6 mois.

e) Les patients étaient exclus de l'analyse si: a) l'injection était pratiquée plus de six heures après la première apparition des symptomes; b) ils étaient traités à l'héparine, à la digoxine ou aux antibiotiques lors de leur admission; c) ils ne répondaient pas aux critères d'infarctus aigu du myocarde tels

que définis par l'OMS.

Trois études ont été menées à bien et les dérogations suivantes ont été trouvées par rapport à ce schéma de départ:

A. Cette étude comportait 483 patients qui présentaient les symptomes d'in-

farctus du myocarde et l'enzyme ou le placébo leur ont été administrés dans

*le service des accidentés.

-15 B. Cette étude devait initialement être faite en tant qu'étude pilote et

porter sur 60 à 80 patients acceptables, mais elle fut étendue à 119 pa-

tients. Bien que tous les patients se présentant au Service des accidentés aient pu être pris en compte, seuls ceux survivant au transfert dans le service de cardiologie ont été pris en compte car c'est là qu'ils recevaient l'enzyme ou le placebo. Les médecins avaient également décidé d'exclure tous

les patients de plus de 70 ans.

C. Le nombre proposé d'essais était de 100, mais seuls 79 patients ont été

pris en compte et 71 présentaient un infarctus déclaré.

La principale évaluation de l'effet de l'enzyme porte sur la mortalité, qui est une limite d'efficacité claire et définitive. D'autres estimations des effets de l'enzyme ont été faites par 15 ECG (Etude C) ou 12 ECG (Etude B) et par la mesure de la taille de l'infarctus par analyse des isoenzymes CK

et du myocarde (Etude C).

Résultats

A. Tous les patients se présentant au Service des accidentés avec une suspi-

cion d'infarctus du myocarde ont été pris en compte, y compris ceux "in

extremis" en choc cardiogénique ou avec une pression sanguine imprenable.

483 patients (enzyme = 240, placebo = 243) ont été pris en compte. Sur

la base d'une "intention de traitement", on constate une réduction statisti-

quement significative de la mortalité chez les patients traités par l'enzy-

me; au total, 72 patients sont morts (enzyme = 27 (11 %), placebo = 45 (19 %), x = 5,02, p<0,05). 128 patients (enzyme = 61, placebo = 67) n'ont pas eu confirmation d'infarctus du myocarde. Aucun de ces patients ayant reçu

l'enzyme n'est mort et 5 patients du groupe du placebo sont morts.

Les résultats démontrent que l'enzyme est sans danger à utiliser sur la base d'une "intention de traitement"; ceci est très important car dans de nombreux cas, le traitement doit débuter avant même la confirmation de

diagnostic d'infarctus du myocarde.

355 patients (enzyme = 179, placebo = 176) ont eu confirmation d'infarc-

tus du myocarde et 33 de ces patients (enzyme = 13, placebo = 20) étaient en infraction par rapport aux règles du protocole d'essai car on leur avait administré de l'héparine, de la digoxine ou des antibiotiques, ou parce qu'ils avaient reçu le traitement d'essai plus de 6 heures après le début des symptomes. Toutefois, ces exclusions ne sont pas maintenant considérées comme nécessaires et l'ensemble des 355 patients atteints d'infarctus sont pris en

compte dans les résultats qui suivent.

Il y a eu une réduction considérable de la mortalité chez les patients traités avec l'enzyme et au total 67 patients atteints d'infarctus sont morts (enzyme = 27 (15 %); placebo = 40 (23 %),X = 3,39, p<0,10). On a identifié un groupe de patients à "haut risque" (enzyme = 97, placebo = 101) ayant soit une pression sanguine systolique inférieure à 90 mm Hg et/ou défaillance ventriculaire gauche et/ou plus de 65 ans. 57 de ces patients sonut norts

(enzyme = 22 (23 %), placebo = 35 (35 %);X 2 = 3,45, p<0,10).

I de ces patients à "haut risque" présentaient une pression sanguine imprenable lors de l'admission à l'h8pital (enzyme = 7, placebo = 4) et ces

patients firent l'objet d'un diagnostic très défavorable. Lorsque Ces pa-

tients furent exclus de l'analyse de mortalité, les données concernant la mortalité chez les patients atteints d'infarctus du myocarde mnais avec une pression sanguine de départ mesurable sont alors les suivantes: : Groupe: Enzyme: Placebo: :: décès/total (%): dcès/total (%:

:..... : ...:.......:

: tous les patients: 21/172 (12 %): 37/172 (22 %)*: patients à haut risque 16/90 (18 %) 32/9 (33 : patients à haut risque: 16/90 (18 %): 32/9. 7 (33 %)**: * X = 5,3, p < 0,025 ** X = 5,66, p< 0,02 Bien qu'un plus grand pourcentage de patients aient survécu dans le groupe enzyme que dans le groupe placebo, les médicaments prescrits à la

sortie de l'h3pital et au bout de 6 mois ont été similaires.

B. 193 patients (enzyme = 97, placebo = 96) ont été pris en compte. 18 patients (enzyme = 8, placebo = 10) n'ont pas eu d'infarctus du myocarde, 39 patients (enzyme = 19, placebo = 20) avaient un Infarctus possible ou une angine de poitrine grave et 136 patients (enzyme = 70, placebo-- 66) un infarctus confirmé. 10 de ces patients (5 dans chaque groupe) ont été écartés car ils étaient en infraction avec le protocole d'essai. Les caractéristiques de prétraitement des groupes enzyme et placebo étaient les mêmes. 13 patients atteints d'infarctus confirmé sont morts (enzyme =5/56 (7,7 %); placebo = 8/61 (13,1 %). Cette différence n'est pas statistiquement significative à cause du petit nombre de patients, mais les résultats suggèrent que l'enzyme a une action bénéfique cliniquement significative. 4 patients suspectés

d'infarctus sont morts (enzyme = 1/19 (5,3 %), placebo = 3/20 (15 %)).

L'analyse des électrocardiogrammes avant et après traitement a montré que le traitement par l'enzyme réduisait de façon significative l'étendue du développement de l'onde Q et le développement des anomalies du complexe QRS (phase initiale du complexe ventriculaire). Il y a également eu réduction de

la perte des ondes R mais sans signification statistique.

C. 79 patients (enzyme = 39, placebo = 40) ont été pris en compte. Le groupe "enzyme" contenait de façon significative plus de patients atteints de choc cardiogénique, défaillance cardiaque, hypoperfusion périphérique, congestion pulmonaire et altération hémodynamique que dans le groupe "placebo" au moment de l'admission à l'étude. 8 patients (enzyme = 4, placebo = 4) n'ont pas eu d'infarctus du myocarde. 7 patients sont morts à l'hôpital, 5 dans le groupe enzyme et 2 sous placebo. 4 des 5 morts du groupe enzyme faisaient partie de la catégorie "à haut risque", les deux morts du groupe placebo se trouvant

dans les patients à faible risque.

L'analyse des données de 35 ECG provenant de connexions "vulnérables" (chaque patient servant pour son propre contrôle) a montré que le développement de l'onde Q et la réduction de l'onde R entre le premier et le 3ème jour après l'infarctus étaient réduits de façon significative chez les patients traités

par l'enzyme, comparés aux patients sous placebo.

Effets secondaires Les seuls effets secondaires rapportés ont été un cas d'éruption disparu dans les 3 jours et 10 patients ayant de brefs épisodes de frissons ou de tremblements intervenant entre 1/2 heure et 2 heures après l'injection. Dans le premier cas, le patient recevait d'autres médicaments (lorazepam et cyclizine) et dans les derniers cas on pense que cette réaction a pu être due

à la méthode et à la rapidité d'injection.

Discussion L'infarctus du myocarde est une affection grave qui, en particulier chez le patient agé présentant des complications comme l'oedème pulmonaire et la congestion veineuse, peut être fatale. Dans les années 1977 à 1979, le nombre _- ducès par infarctus aigu du nmyocarde (statistiques de Mortalité OPCS) -Dpassait les 100 00; par an. Il est impossible de faire des corrélations

:re ces chiffres et les présentes études, qui ne couvraient que des pa-

tients admis à l'hôpital et o ces derniers étaient suivis pour une durée rn::iu ds 6 mois. Toutefois, meme une réduction de un pour cent du taux de

-rta.ité annuelle sauverait plus de 1000 vies.

L'étude A a été bâtie et effectuée pour représenter aussi fidèlement que

cissible l'admiision et le traitement normaux de patients suspectés d'infarc-

tus du myocarde. Une confirmation en a été obtenue en établissant que le pourcentage de décès à l'hôpital dans le groupe placebo était proche du taux

Je mortalité antérieur en hôpital. Dans ces conditions, pour tous les pa-

tients pris en compte sur la base "intention de traitement", le taux de mortalité à 6 mois fut ramené de 19 % dans le groupe placebo à 11 % dans le groupe traité avec l'enzyme. Chez les patients à infarctus confirmé, 23 % sont morts dans le groupe placebo, contre 15 % chez les patients traités avec l'enzyme. Cette réduction du taux de mortalité d'environ 35 % pourrait sauver

plusieurs nilliers de vies si l'usage de l'enzyme était généralisé.

Les deux autres études comportaient un plus faible nombre de patients et, dans l'une d'elles (étude C), les caractéristiques de prétraitement des

patients des groupes placebo et enzyme étaient significativement différentes.

Dans l'autre étude (étude B), le taux de mortalité à 4 mois dans le groupe placebo était de 13,0 % et de 7,7 % dans le groupe enzyme. Ces deux chiffres

sont très inférieurs à ceux de l'étude A mais ils montrent aussi une réduc-

tion de 41 % de la mortalité à 4 mois par utilisation de l'enzyme.

Une preuve confirmant les effets bénéfiques de l'enzyme sur le myocarde

apparaît dans ces deux dernières études lorsqu'on examine les électrocardio-

grammes avant et après injection.

Conclusions

L'enzyme selon la présente invention, administrée en une seule injec-

tion, s'est avérée sans danger et bien tolérée lorsqu'elle était administrée à des patients suspectés d'infarctus du myocarde. Sur la base de "l'intention de traitement" et chez des patients avec un infarctus du myocarde confirmé,

en particulier chez ceux à haut risque, il y a eu une diminution significati-

ve de la mortalité chez les patients traités avec l'enzyme par rapport aux

patients recevant le placebo.

L'enzyme selon la présente invention est présentée de préférence sous forme lyophilisée dans une fiole contenant environ 220 000 UI d'enzymes actives, la dose-unité étant de 200 000 UI. Les 20 000 UI de différence sont destinées à couvrir les pertes pendant l'injection. Chaque fiole comportera aussi 150 à 350 g d'acétate de sodium B.P. (Pharmacopée Britannique). Les

17 2495634

fioles devront 9tre gardées dans un endroit sec aux environs de 4%C.

Pour l'utilisation de l'enzyme, les contenus de la fiole sont dissous

dans 2,2 ml d'infusé intraveineux, de chlorure de sodium B.P., sans secouer.

La solution est aspirée lentement dans une seringue en plastique et on injecte 2,0 ml en intraveineuse à vitesse lente et constante. e

Claims (8)

REVENDICATIONS

1. Une enzyme qui est une poudre blanche, inodore, de pH compris entre

4,5 et 7,5 pour une solution de 15 000 à 22 000 ui/ml dans du sérum physiolo-

gique pour injections ne contenant pas de dioxyde de carbone, la solution étant claire et incolore; une solution de 50 000 UI de celle-ci dans 3 mrl de sérum physiologique pour injections ne contenant pas de dioxyde de carbone a une absorption lumineuse non supérieure à 0,6 à 280 nm et non supérieure à 0,37 à 260 nm; l'analyse de ladite enzyme donne les pourcentages d'acides aminés suivant: Asp 11,1 + 0,4; Thr 5,8 + 0,1; Ser 6,4 + 0,2; Glu 9,1 + 0,2; Pro 5,0 + 0,5; Gly 6,6 + 0,2; Ala 7,4 + 0,1; Val 7,9 + 0,5; Met 0,8 + 0,1; Ile 5,2 + 0,2; Leu i0,9 + 0,2; Tyr 4,4 + 0, 1; Phe 4,5 + 0,1; His 2,8 + 0,2; Lys 7,6 + 0,4; Arg 5,6 + 0,1; ladite enzyme renfermant une quantité totale d'hexose de 10,6 + 0,003 %;

ladite enzyme ne contenant pas plus de 5 pg d'albumine par 220 000 UI activi-

tés et ladite enzyme ayant un poids moléculaire compris entre 62 000 et

000 déterminé par chromatographie sur tamis moléculaire.

2. Procédé de préparation de l'enzyme selon la revendication 1, dans lequel de la hyaluronidase à l'état brut est soumise à un fractionnement au sulfate d'ammoniaque par addition de sulfate d'ammoniaque à une solution

tamponnée de hyaluronidase à l'état brut jusqu'à ce que le degré de satura-

tion en sulfate d'ammoniaque soit d'environ 50 %, le précipité obtenu étant mis de coté et la partie surnageante étant amenée à une saturation en sulfate d'ammoniaque de 70 %, le nouveau précipité obtenu étant dyalisé puis appliqué sur une résine divinylbenzène polyacrylique réticulée après quoi, la résine est d'abord lavée avec une solution phosphatée tampon à 0,1 M, puis éluée avec une solution phosphatée tampon à 0,3 M, l'éluat étant passé dans un tamis moléculaire sur un gel réticulé au dextrane qui ne contienne pas de

groupements actifs de carboxyméthyle, puis l'enzyme est isolée.

3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le précipité obtenu par

le fractionnement au sulfate d'ammoniaque est séparé par centrifugation.

4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, dans lequel le précipité à dialyser est dissous dans une solution phosphatée tampon à 0,IM (pH 6,0) et

dialysé contre la même solution tampon.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel

la solution phosphatée tampon à 0,1M utilisée pour laver la résine a un pH de 6,0.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel

la solution phosphatée tampon à 0,3M utilisée pour éluer la résine a un pH de 8,5.

19 2495634

7. Forme d'unité de dosage comprenant approximativement 220 000 UI de

l'enzyme selon la revendication 1 sous forme lyophilisée.

8. Forme d'unité de dosage selon la revendication 9, qui contient

additionnellement 150 à 350 ug d'acétate de sodium.

BIOREX LABORATORIES LIMITED

Par Procuration,

CABINET S C O P I