DE2047317B2

DE2047317B2 - Verfahren zur Herstellung einer Protease mit der Bezeichnung AM-Protease aus dem Pilz Armillaria mellea, diese Protease selbst und sie enthaltende pharmazeutische Stoffzusammensetzungen

Info

Publication number: DE2047317B2
Application number: DE2047317A
Authority: DE
Inventors: Douglas Alderley Edge Broadbent; Ralph William Cheadle Turner; Peter Leslie Knutsford Walton
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1969-09-26
Filing date: 1970-09-25
Publication date: 1979-08-02
Also published as: CA921848A; NL169499B; US3713981A; CH575963A5; ES384010A1; SE391931B; DE2047317C3; JPS529757B1; IE34463B1; NL7013461A; DK127189B; FR2070093A1; DE2047317A1; IE34463L; BE756369A; NL169499C; FR2070093B1

Description

Es wurde gefunden, daß der reife Fruchtkörper oder der Hut des Pilze* Armillaria mellea eine Quelle für ein Enzym darstellen kann, das eine fibrinogenolytische und fibrinolytische Aktivität besitzt und Antikoagulationseffekte aufweist. Der Pilz Armillaria mellea wächst parasitär oder saprophytisch auf Bäumen und kommt überall in Großbritannien und anderen Ländern der Welt vor.

Eine kurze Beschreibung des Pilzes ist wie folgt: Hut 5 bis 15 cm Durchmesser, zunächst rund, dann abgeflacht und unter Umständen in der Mitte eingesenkt. Die Farbe variiert zwischen gelblich bis tiefbraun. Stengel 7,5 bis 15 cm lang und bis zu 13 mm dick. Ring weißlich. Lamellen weißlich bis fleischfarben, angewachsen oder leicht am Stengel herablaufend . Sporen unter dem Mikroskop farblos, 8 bis 9 X 5 bis 6 μπι. Um die enzymatische Substanz zu isolieren, werden die Fruchtkörper am besten von ungefähr Augsut bis zu den ersten Frösten geerntet. Nach der Ernte sollen die Fruchtkörper bei ungefähr —25° C oder noch tiefer gelagert werden, bis das weiter unten beschriebene Isolationsverfahren ausgeführt wird.

Es wurde gefunden., daß die genannte enzymatische Substanz nicht von allen Species von Armillaria mellea erhältlich ist. Die genannte enzymatische Substanz wurde aus etwas mehr als einem Drittel (etwa 50 aus einer Gesamtzahl von annähernd 140) der Pilzproben erhalten, die 1969 in Großbritannien gesammelt wurden. Der Grund, warum ein Teil der Proben nicht die enzymatische Substanz lieferte, ist unbekannt. Species von Armillaria mellea, die für die Öffentlichkeit zugängig sind und die die genannte enzymatische Substanz liefern, sind: (1) die Species, die von Ministry of Technology, Forest Products Research Laboratories, Princes Risborough, Aylesbury, Buckinghamshire, England als FPRL 6H identifiziert worden ist und von dort auch allgemein erhältlich ist (Numerierung durch die Anmelderin: ACC 3659); und (2) die Species, die durch das Centraalbüro voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande, einfach als »Armillaria mellea« identifiziert wurde und von dort allgemein erhältlich ist (Numerierung durch die Anmelderin: ACC 3253).

Bei dieser enzymatischen Substanz handelt es sich um eine Peptidyl-Peptid-Hydrolase, die in dieser BeSchreibung als »AM-Protease« bezeichnet wird. AM-Protease besitzt die folgenden charakteristischen Eigenschaften:

(1) Sie katalysiert den hydrolytischen Abbau von Fibrinogen und Fibrin (das heißt, daß sie fibrinogenolytische und fibrinolytische Aktivität zeigt). Die Aktivität der AM-Protease wurde in vitro durch die folgenden bekannten Tests bestimmt:

(a) Inkubation von AM-Protease mit gereinigtem Fibrinogen und Zusatz von Thrombin zu entnommenen Proben in bestimmten Zeitabständen. Die Zeit, die für den Verlust der Gerinnungsfunktion erforderlich ist, ist ein Maß für die fibrinogenolytische Aktivität.

(b) Inkubation von vorher hergestelltem Fibringerinnsel mit AM-Protease und Messung der Geschwindigkeit des Verschwindens des Gerinnsels. Diese Messung kann dadurch erleichtert werden, daß man Gerinnsel aus mit J¹²⁵ markiertem Fibrinogen herstellt und das Nachlassen der Radioaktivität mißt. Dies gibt ein Maß für die fibrinolytische Aktivität.

(c) Zusammenmischen von AM-Protease, Thrombin und Fibrinogen und Beobachtung der Lebensdauer des so gebildeten Gerinnsels. Dies gibt ein Maß für die fibrinogenolytische und fibrinolytische Aktivität von AM-Protease.

In vivo wird die Aktivität von AM-Protease an Versuchstieren (Kaninchen) dadurch bestimmt, daß ihr Effekt auf den Fibrinogenspiegel in Tieren und auf den Proteasespiegel im Plasma gemessen wird. Der erstere Effekt kann dadurch bestimmt werden, daß man die Verlängerung der Gerinnungszeit des gesamten Bluts oder des Plasmas gegenüber der Vergleiche- oder Vorbehandlungsgerinnzeit nach Zugabe einer Standardmenge Thrombin mißt. Der letztere Effekt kann durch ein ähnliches Verfahren gemessen werden, wie es in l(b) angegeben ist.

(2) AM-Protease verhält sich beim Durchgang durch eine Kolonne aus vernetzten) Dextran-Gel (»Sephadex« GlSO; »Sephadex« ist ein Warenzeichen), welches für Proteine mit einem Molekulargewicht bis zu 400000 durchlässig ist, als einzige Komponente. Das Volumen des Puffers (Eluationsmüttel), in welchem AM-Protease aus der Kolonne austritt, entspricht demjenigen, das erforderlich ist, ein Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 30000 zu eluieren. Das genannte Eluationsmittel ist ein 0,3m NaCl 0,05m pH 7,4 Tris/HCl-Puffer, welcher die folgende Zusammensetzung aufweist (und mit dem die Eluation bei ungefähr 2° C ausgeführt wird):

Natriumchlorid 17,5 g/l in Wasser

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

6,05 g/I in Wasser ausreichend m Salzsäure, so daß
ein pH von 7,4 erzielt wird.

(3) AM-Protease verhält sich in der Zelle einer analytischen Ultrazentrifuge bei 26 X 10⁴ g als einzige Komponente. Der Sedimentationskoeffizient: von AM-Protease im 0,3 m NaCl 0,05 m pH 7,4 Tris/ HCI-Puffer [siehe oben (2)] beträgt bei 20° C, das ist der S_?0W-Wert, ungefähr 2,35 x 10"¹³ see.

(4) Bei Elektrophorese von AM-Protease in PoIyacrylamid-Gel ist offensichtlich nur eine Komponente vorhanden, und diese Komponente besitzt eine Wanderung entsprechend einem y-Globulin. Das PoIyacrylamid-Gel hatte ein Acrylamid/Bisacrylamid-Verhältnis von 150:1. Die Elektrophorese wurde ungefähr 1 st bei 2 mA/cm² ausgeführt. Der verwendete Puffer (pH 4,3, /3-Alanin/Essigsäure [0,3 m]) bestand aus 0-Alanin (26,73 g/1 in Wasser) und war durch Zusatz von Eisessig auf pH 4,3 eingestellt.

(5) Die N-endständige Aminosäure von AM-Protease ist Isoleucin.

(6) AM-Protease baut bei pH 7 leicht Casein ab und bildet Bruchstücke, die in Trichloressigsäure löslich sind. Der Digestionsgrad ist viel keiner als derjenige, der durch Trypsin, Chymotrypsin oder Plasmin erzeugt wird. Sie verursacht einen geringen Abbau des Serum-Albumin oder y-Globulin, auch bei längerer Inkubation. Sie verursacht einen starken Abbau von Fibrinogen. Sie hat keine Wirkung auf niedriger molekulare Substrate (beispielsweise a-N-Acetylglycyl-L-lysin-methylester, a-N-Acetyl-L-lysinmethylester, a-N-p-Toluolsulfonyl-L-arginin-methylester, ot-N-Acetyl-L-tyrosin-äthylester oder L-Tryptophanäthylester), welche gewöhnlich dazu verwendet werden, trypsinartige oder chymotrypsinartige Enzyme zu charakterisieren. Sie wirkt auf die /3-Kette von oxidiertem Insulin, wobei die folgenden Aminoendgruppen in Erscheinung treten: Tyrosin, Lysin und in beschränktem Ausmaß Leucin. In dieser Hinsicht unterscheidet sie sich auch (siehe oben) von Trypsin und Chymotrypsin.

Gemäß der Erfindung kann AM-Protease dadurch hergestellt werden, daß A entweder folgende Arbeitsschritte angewendet werdet.:

1. Mahlen oder anderweitige Zerkleinerung, von reifen Fruchtkörpern von diese Protease bildenden Vertretern von Armillaria mellea und Extraktion dieses Materials mit Wasser, um einen wäßrigen Extrakt herzustellen;

2. Ausfällung unerwünschter verunreinigender Proteine aus dem wäßrigen Extrakt mittels mindestens eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels bei einer geeigneten Temperatur, bei einem geeigneten pH und bei einer geeigneten Ionenkonzentration, und Abtrennung der ausgefallenen Proteine durch herkömmliche Maßnahmen;

-i 3. Ausfällung der rohen AM-Protease aus der Lösung durch Zusatz mindestens eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels zur Lösung;

4. teilweise Reinigung der rohen AM-Protease to durch Chromatographie; und

5. Reinigung der erhaltenen unreinen AM-Protease mittels einer Molekularsiebtechnik -

oder das B ein die AM-Protease bildender Vertreter von Armillaria mellea auf einem Nährmedium bei un-

Ii gefähr 25° C gezüchtet und hierauf die AM-Protease aus dem erhaltenen Myzelium durch die unter A 1 bis 5 angegebenen Arbeitsschritte gewonnen wird, mit dem Unterschied, daß die reifen Fruchtkörper durch das Myzelium ersetzt werden.

Die Arbeitsschritte unter A1 bis 5 können bei einer Temperatur von ungefähr 2° C ausgeführt werden.

' Die durch das vorstehend beschriebene Isolationsverfahren erhaltene AM-Protease erscheint als im wesentlichen homogen, wenn die üblichen biophysi-

r> kaiischen Kriterien herangezogen werden, das heißt Sedimentationseigenschaften, elektrophoretische Eigenschaften und Verhalten bei Gelfiltration und in Ionenaustauschkolonnen. In allen Fällen zeigt sich die Homogenität durch das Auftreten einer schmalen

in Proteinzone, welche eine symmetrische, nahezu Gaußsche Verteilung um eine Spitze hat. Trotzdem ist es möglich, daß AM-Protease eine Mischung aus nahe verwandten isofunktionellen Enzymen ist.

Die beiden oben beschriebenen Möglichkeiten der

π Isolation werden nun genauer behandelt:

Verfahrensweise A

I. Wie bereits erwähnt, befinden sich die Fruchtkörper von Armillaria mellea während des Spätsom-

4(i mers und Herbsts im richtigen Reifestadium. In Großbritannien reifen sie in der Zeit vom August bis zum November. In diesem Zustand sind die Fruchtkörper gelb bis tiefbraun und ziemlich flach oder leicht eingesenkt. Wie bereits erwähnt, sind die Fruchtkörper, die

4-, von den öffentlich zugänglichen Species ACC 3659 (FPRL 6H) und ACC 3253 (»Armillaria mellea« von Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande) Quellen für AM-Protease.

Die reifen Fruchtkörper können mit Wasser in ei-

i(i nem mechanischen Mischer bei 2 bis 4° C homogenisiert werden. Das resultierende Gemisch wird dann durch Filtration oder Zentrifugation getrennt, und beide Phasen (d. h. die feste Phase und die wäßrige Phase) werden aufbewahrt. Der größte Teil der AM-

Vi Protease geht bei dieser Stufe in die wäßrige Phase. Gegebenenfalls wird die feste Phase entweder (a) gefriergetrocknet, mit festem Kohlendioxid gemahlen und dann mit Wasser von 2 bis 4° C extrahiert oder (b) gemeinsam mit einem geeigneten Schleifmittel,

bo wie z. B. Sand, und mit Wasser von 2 bis 4° C gemahlen werden, worauf dann das resultierende Gemisch durch Filtration oder Zentrifugation getrennt wird. In jedem Fall wird etwas AM-Protease im zweiten wäßrigen Extrakt erhalten. Der wäßrige Extrakt oder die

^r₁ kombinierten wäßrigen Extrakte, je nachdem, wird bzw. werden dann zur Lagerung gefriergetrocknet oder direkt in der Stufe (2.) verwendet. Der wäßrige Extrakt kann in einem gewissen Ausmaß dunkel wer-

den. Dies hat seinen Grund vermutlich in der Wirkung einer Polyphenoloxidase. Dieses Dunkelwerden kann dadurch verhindert werden, daß man immer, wenn möglich, unter Stickstoff arbeitet un.j dem Extraktionswasser mindestens einen Tyrosinaseinhibitor zusetzt, wie z. B. Natriurabenzoat oder Natriumascorbat in einer 10""¹- bis lO^-molaren Konzentration.

II. Mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, die zum Ausfällen der unerwünschten Proteine verwendet werden können, sind z. B. Alkanole mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen oder Ajkanone mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Äthanoi, n-Propanol, Isopropanol oder Aceton, sowie Mischungen derselben. Diese organischen Lösungsmittel können gegebenenfalls gemeinsam mit einem Dialkyläther mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Diäthyläther, verwendet werden. Die Ausfällung wird im allgemeinen bei —10 bis 10⁰C und insbesondere bei —2 bis 2° C und bei einem pH von 5 bis 7, je nach dem verwendeten Lösungsmittel, ausgeführt. Ein Überschuß an Lösungsmittel sollte nicht verwendet werden, da hierdurch nicht nur die unerwünschten Proteine, sondern auch AM-Protease selbst ausgefällt wird. Die unterwünschten Proteine werden durch ein herkömmliches Verfahren, wie. z. B. durch Filtration oder Zentrifugieren, abgetrennt.

III. Geeignete organische Lösungsmittel für die Ausfällung der rohen AM-Protease sind diejenigen, die unter (II.) erwähnt wurden. Es werden auch ähnliche Temperatur- und pH-Bedingungen wie unter (II.) verwendet. Die rohe AM-Protease, die ausgefällt wird, wird durch irgendein herkömmliches Verfahren, wie z. B. Filtration oder Zentrifugation, gesammelt, worauf sie vorzugsweise mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. eiskaltes 70%iges wäßriges Äthanol, gewaschen wird. Die rohe AM-Protease wird dann gegebenenfalls (a) in eiskaltem destilliertem Wasser aufgelöst und gefriergetrocknet oder (b) aufeinanderfolgend bei —2 bis 2° C mit trockenem Äthanol und Diäthyläther gewaschen und dann bei -2 bis 2° C im Vakuum getrocknet.

IV. Die auf diese Weise erhaltene rohe AM-Protease enthä'v nach wie vor verhältnismäßig große Mengen unerwünschter Proteine, von denen einige unter Ausnutzung der unterschiedlichen Affinitäten von AM-Protease und der unerwünschten Proteine gegenüber chromatographischen Kationenaustauschmaterialien abgetrennt werden können, wie z. B. Materialien, die Carboxymethylradikale enthalten, die an eine Polysaccharidmatrix gebunden sind, wie z. B. Carboxymethylcellulose. Die Kolonne wird mit einem wäßrigen Puffer von pH 5 bis 7, wie z. B. pH 6, und bei einer Temperatur von ungefähr 2 ° C eluiert. Allgemein gesagt, die unreine AM-Protease, die auf diese Weise erhalten wird (welche noch etwas unerwünschte Proteine enthält), wird nach der Hauptspitze der unerwünschten Proteine eluiert. Die eluierten Fraktionen, die unreine AM-Protease enthalten, können beispielsweise durch Druckdialyse konzentriert werden.

V. Die verbleibenden unerwünschten proteinhaltigen Verunreinigungen werden aus der unreinen AM-Protease mittels einer Molekularsiebtechnik bei ungefähr 2° C entfernt, wobei eine Kolonne oder eine Membrane aus einem vernetzten hydrophilen Polymer verwendet wird, das in bezug auf ein Molekulargewicht von ungefähr 30000 Molekularsiebeigenschaften besitzt. Geeignete polymere Materialien sind z. B. die vernetzten Dextrane, wie z. B. »Sephadex« (Warenzeichen) G75, Polyacrylamid-Gel, wie z. B. »Bio-Gel« (Warenzeichen), und Agarosen, wie z. B. »Sagarose« (Warenzeichen) oder »Sepharose« (Warenzeichen). Die unreine AM-Protease aus der Stufe (IV) wird in einem kleinen Volumen eines Puffers mit pH 6 bis 8, beispielsweise pH 7, wie z. B. einem pH 7 0,3 m Natriumchlorid/Phosphat-Puffer, bei ungefähr 2° C aufgelöst und die Losung wird auf die Kolonne oder Membrane bei ungefähr 2° C aufgebracht.

lu Die Kolonne wird dann mit dem gleichen oder mit einem ähnlichen Puffer bei ungefähr 2° C eluiert, worauf die AM-Protease vor den verunreinigenden Proteinen eluiert wird. Das Eluat, welches die AM-Protease enthält, kann durch Druckdialyse konzen-■> triert werden. Im Falle einer Membrane, die Proteine enthält, gehen Lösungsmittel und Elektrolyt durch die Membrane hindurch, während die AM-Protease nicht hindurchgeht. Es wird bevorzugt zu verhindern, daß die AM-Protease vollständig austrocknet, da es sonst

_'i> schwierig ist, sie von der Membrane zu entfernen. Die Lösung der AM-Protease an der Aufbringseite der Membrane kann durch Druckdialyse konzentriert werden.

,. Verfahrensweise B

Bei dieser Verfahrensweise wird das Myzelium von Armillaria mellea auf einem Nährmedium bei ungefähr 25° C gezüchtet, worauf die AM-Protease aus dem erhaltenen Myzelium wie bei der Verfahrens-

jij weise A isoliert wird, mit dem Unterschied, daß die reifen Fruchtkörper durch das Myzelium ersetzt werden. Das Myzelium kann durch Oberflächenkultur bei 25° C auf einem Nährmedium gezüchtet werden, das Mais und Würze enthält. Als geeignete Species von

γ, Armillaria mellea sollen beispielsweise diejenigen erwähnt werden, die von der Anmelderin mit ACC 3253 und 3659 bezeichnet wurden.

Die AM-Protease wird zweckmäßigerweise in wäßriger Lösung bei ungefähr — 25 ° C gelagert.

Die Erfindung betrifft weiterhin die durch eines der vorstehenden Verfahren erhältliche AM-Protease selbst, sowie pharmazeutische Stoffzusammensetzungen mit fibrinogenolytischen, fibrinolytischen und antikoagulierenden Eigenschaften, die diese AM-Pro-

4-, tease und ein inertes, nicht-giftiges, pharmazeutisch anwendbares Verdünnungs- oder Trägermittel aufweist.

In der DE-OS1442134 ist ein in vivo antikoagulierendes Mittel beschrieben, das aus dem Gift der Viper

-,o Ancistrodon Rhodostoma gewonnen wird. Gemäß der Erfindung kann von einem viel billigeren und überall verfügbaren Ausgangsmaterial ausgegangen werden, was einen wesentlichen Fortschritt darstellt. Außerdem wird durch die vorliegende Erfindung das Arzneimittelspektrum erweitert.

Die genannten pharmazeutischen Zusammensetzungen können eine Form aufweisen, die sich für systematische intravenöse oder intra&rterielle Infusion oder lokale intravenöse oder intraarterielle Injektion

_b() eignet. Geeignete Zusammensetzungen sind sterile injizierbare wäßrige Lösungen, die 0,05 bis 1,0 mg AM-Protease/ml, beispielsweise 0,25 mg AM-Prot°ase/ml, enthalten. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten übliche

_h5 Verdünnungsmittel oder Träger und können durch übliche Verfahren hergestellt werden. Sie enthalten gegebenenfalls ein Stabilisierungsmittel, wie z. B. das menschliche Plasma Albumin, und sie können gege-

benenfalls auch bekannte analgetische Mittel enthalten.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können für folgendes verwendet werden:

(1) Die Behandlung von arterieller Thrombose;

(2) die Behandlung von arterieller Embolie, wie z. B. Embolie in den Renalarterien oder mesenterischen Arterien und insbesondere in den Beinarterien und in der Aorta an der Bifurkation;

(3) die Behandlung von Tiefvenenthrombose; und

(4) die Behandlung von Pulmonarembolie.

Es erscheint zweckmäßig, die Verwendungsweise der AM-Protease in bezug auf die (a) systematische Therapie und die (b) lokale intravaskuiare Perfusion zu diskutieren.

(a) Systematische Therapie mit AM-Protease.
Die Resistenz des menschlichen Plasmas gegenüber

AM-Protease ändert sich von Individuum 711 Individuum und zwischen Tieren verschiedener Species. Die Resistenz ändert sich auch bei den einzelnen menschlichen Patienten während der systematischen Behandlung mit AM-Protease. Eine Beladungsdosis ist erforderlich, um den größten Teil des im Kreislauf befindlichen Inhibitors auszuschalten. Diese Dosis wird hauptsächlich durch vorherige Titration des Plasmas des Patienten in vitro und auch durch Titration in vivo bestimmt, indem die Reaktion von steigenden Fraktionen der gewählten Dosis an AM-Protease während der intravenösen Infusion beobachtet wird. Die Reaktion, die gemessen wird, ist die Verlängerung der Gerinnungszeit, die durch die AM-Protease hervorgerufen wird, die einen Überschuß gegenüber der von dem Inhibitor beeinflußten darstellt. In den meisten Fällen beträgt diese Beladungsdosis 0,05 bis 5 mg/kg/st AM-Protease.

Wenn eine optimale AM-Protease-Plasmaaktivität erzeugt ist, dann muß diese durch intermittierende intravenöse Dosierung von AM-Protease aufrechterhalten werden. Die ist nötig, da anscheinend Inhibitor in den Kreislauf zurückkehrt, der verursacht, daß Gerinnungszeiten sich wieder auf die normalen Werte einstellen, was einen Verlust von enzymatischer Aktivität anzeigt. Es wurde beobachtet, daß die thrombolytische Aktivität aufrechterhalten wird, wenn man annähernd 10% der Anfangsdosis der AM-Protease stündlich während der nächsten 2 st verabreicht und wenn man hierauf auf weniger als 1 % der Anfangsdosis an AM-Protease alle 2 bis 3 st zurückgeht. Die Verringerung der Dosis, die erforderlich ist, die Aktivität aufrechtzuerhalten, hat ihren Grund vermutlich in einem Abfall der Geschwindigkeit der Rückkehr des Inhibitors in den Kreislauf. Die Dauer der Behandlung mit AM-Protease hängt vom Alter der Thrombose oder der Thrombosen und ihrer Größe ab. Die systematische Behandlung wird solange fortgesetzt, bis es Anzeichen einer klinischen Verbesserunggibt, d. h. Rückkehr der Pulsation und Verbesserung der Farbe des Glieds, in welchem der Kreislauf durch eine Arterienthrombose beeinflußt war.

(b) Lokale intravaskuiare Perfusion von AM-Protease.

Eine lokale Perfusion von AM-Protease ist in den Fällen angezeigt, in denen eine thrombotische Occlusion einer großen peripheren Vene besteht oder in thrombosierten Gefäßen, die bei der Scribner-Umleitung für Nierendialyse verwendet werden, oder in einem geeigneten Segment einer Arterie, die durch eine Thrombose blockiert worden ist. Ein solches Verfahren zur lokalen Perfusion besitzt den Vorteil, daß die verwendete Dosis beträchtlich geringer ist als bei der systematischen Therapie, d. h. etwa '/,„ bis V₁₀₀ der ^ri systematischen Dosis. Auch besteht keine Notwendigkeit, den Inhibitorspiegel im Blut des Patienten zu bestimmen. Es kann deshalb eine Standarddosis gegeben werden, beispielsweise können 5 bis 10 ml (enthaltend V^ bis V_11x, der systematischen Dosis) in einen in Katheter injiziert werden, der sich in einem Teil der Vene befindet, der distal zur Occlusion liegt. Dieser kann 10 min belassen werden, bevor der Inhalt des Katheters angesaugt wird. Dieses Verfahren wird 2- oder 3mal wiederholt und in den meisten Fällen ist ι ί dann die Thrombose aufgelöst. Das gleiche Verfahren kann für eine zugängige Arterie verwendet werden, die durch eine Thrombose vollständig occludiert ist, wobei der Unterschied jedoch darin besteht, daß der Katheter nahe beim occl udierten Abschnitt eingeführt -'Ii wird.

Die von Armillaria mellea erhaltene AM-Protease enthält ein Metall. Es wurde gefunden, daß die Anwesenheit eines Metalls, aber nicht unbedingt des Metalls, das in der von Armillaria mellea erhaltenen Sub-.»". stanz vorliegt, für die enzymatische Aktivität wesentlich ist. Das Apoenzym kann erhalten werden durch Behandlung des Haloenzyms, d. h. AM-Protease, mit 10"³ m Äthylendiamintetraessigsäure (pH 7) während 30 min bei 4° C. Die überschüssige Äthylendisn amintetraessigsäure wird durch Dialyse gegen einen 0,05 m pH 7,4 Tris/HCl-Puffer beseitigt, der die folgende Zusammensetzung besitzt:

Tris-(hydroxymethyi)-aminomethan 6,05 g/l in Wasser ausreichend m Salzsäure, so daß pH 7 entsteht. γ. Die enzymatische Aktivität kann durch Behandlung des Apoenzyms in einem wäßrigen Medium mit Co⁺⁺ , Zn ^{+ +} , Ni^{+ +} , Fe¹⁺ und (in diesem Fall wird die enzymatische Aktivität wieder in geringerem Ausmaß zurückerhalten) Cu⁺⁺ wieder hergestellt werden.

Beispiel 1
Stufe I

100 g reife Fruchtkörper von Armillaria mellea wurden in einem M. S. E.-»Atomix«-Mischer (»Ato-

4-, mix« ist ein Warenzeichen) bei 2° C mit 150 ml Wasser homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit weiteren 150 ml Wasser gemischt, das Gemisch wurde bei 2 ° C 30 min gerührt und dann zentrifugiert. Das Zentrifugat (flüssige Phase) wurde bei 2 ° C gehalten,

-,11 bis die weitere Verarbeitung durchgeführt wurde (siehe unten). Der feste Rückstand wurde gefriergetrocknet, das Produkt wurde mit festem Kohlendioxid in ein feineres Pulver gemahlen, das Gemisch wurde mit 150 ml Wasser bei 2° C extrahiert, und der Extrakt wurde zentrifugiert. Das Zentrifugat (flüssige Phase) wurde mit dem oben erwähnten Zentrifugat vereinigt. (Kommentar zu dieser Stufe: Der wäßrige Extrakt kann direkt in der nächsten Stufe verwendet oder zur Lagerung gefriergetrocknet werden. Der

M) größte Teil der AM-Protease, ungefähr 75%, werden bei der Homogenisation mit Wasser extrahiert).

Stufe Π

Die wäßrige Lösung wurde mit m Essigsäure auf hs pH 6,0 eingestellt und die Lösung wurde in einem Kühlbad auf 2° C abgekühlt. 450 ml Äthanol mit 2°C wurden langsam der wäßrigen Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde während dieser Zugabe gut ge-

rührt, wobei jedoch darauf geachtet wurde, ein Schäumen zu vermeiden. Die Temperatur wurde auf 2° C gehalten. Nach beendeter Zugabe wurde das Gemisch 1 st auf 2° C gehalten und die Ausfällung, die sich gebildet hatte, wurde durch Zentrifugation (2000 g) während 30 min bei 2° C abgetrennt. Der feste Rückstand wurde verworfen, und das Zentrifugat wurde in der Stufe III verwendet.

Stufe III

Das Zentrifugat aus der Stufe II wurde in ein Kühlbad eingebracht und 450 ml Äthanol wurden langsam zugegeben. Die Temperatur wurde während dieser Zugabe auf —5° C fallen gelassen. Wie in der Stufe II wurde das Gemisch gut gerührt, wobei jedoch ein Schäumen vermieden wurde. Nach beendeter Zugabe wurde das Gemisch 1 st bei —5° C gerührt. Es wurde dann zentrifugiert und das Zentrifugat wurde verworfen. Der feste Rückstand wurde in 75 ml einer Mischung aus 70 Vol.-% Äthanol und 30 VoI.-% Wasser bei —5° C suspendiert und die Suspension wurde zentrifugiert. Der feste Rückstand wurde bei 2 ° C in 30 ml Wasser aufgelöst, die Lösung wurde einer Hülsengefrierung bei —70° C zugeführt und dann gefriergetrocknet. (Kommentar zu dieser Stufe: Ungefähr 90 bis 95% der Ausgangsaktivität werden in dieser Stufe zurückerhalten, und das gefriergetrocknete Material stellt etwa 5 Gew.-% des festen Ausgangsmaterials in dieser Stufe dar, d. h. desjenigen, das aus dein wäßrigen Extrakt erhalten worden war).

Stufe IV

100 g mikrogranulare »Whatmane-Carboxymethylccllulose (CM 52; »Whatman« ist ein Warenzeichen) wurden mit einem pH 6,0 0,025 m Natriumcitrat-Puffer gewaschen bis die Waschflüssigkeiten einen pH von 6,0 besaßen. Der Puffer war dadurch hergestellt worden, daß eine Lösung von 7,35 g/l Trinatriumcitrat-dihydrat in Wasser durch Zugabe von 2 m Salzsäure auf pH 6,0 eingestellt wurde. Die ins Gleichgewicht gebrachte Carboxymethylcellulose wurde dann in eine 2,5 X 30 cm-Kolonne eingebracht. 2 ml einer Lösung von 200 mg des gefriergetrockneten Produkts der Stufe III im oben erwähnten Citratpuffer wurden in die Kolonne bei 2° C eingebracht. Die Kolonne wurde bei 2 ° C mit dem Citratpuffer, der in einer Menge von ungefähr 20 ml/st verwendet wurde, eluiert, und 5 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Das Eluat wurde auf Lichtabsorption bei 280 τημ untersucht. Hierdurch wurden alle Proteinspitzen ermittelt (Proteine zeigen eine Spitzenabsorption bei 280 ηιμ). Die enzymatische Aktivität, d. h. die proteolytische Aktivität, wurde durch das unter (Ic) angegebene Verfahren ermittelt. Eine große Spitze eines UV-absorbierenden Materials, das keine proteolytische Aktivität zeigte, ging den proteolytisch aktiven Fraktionen (d. h. diejenigen, die AM-Protease enthalten) vorher, und an den letzteren Fraktionen schloß sich weiteres UV-absorbierendes, nicht-proteolytisches Material an. Die zusammengefaßten Fraktionen wurden durch Druckdialyse bei 2° C unter Verwendung von »Amicon« UMIO-Membranen (»Amicon« ist ein Warenzeichen) konzentriert (Kommentar zu dieser Stufe: In Abhängigkeit von der Qualität der Carboxymethylcellulose, die sich etwas ändert, kann das proteinhaltige Material einschließlich AM-Protease als diskrete Spitze mit einer ungefähr 20fachen Reinigung oder, sofern ungünstigere Bedingungen herrschen, mit einer 5- bis lOfachen Reinigung erhalten werden. Bis zu 90% der auf die Kolonne aufgegebenen AM-Protease werden zurückerhalten. Es kann nötig sein, die Salzkonzentration des Eluiermittels zu ι ändern, um die variablen Eigenschaften von verschiedenen Lieferungen der Carboxymethylcellulose zu kompensieren).

Stufe V

in 10 g »Sephadex« G75 (»Sephadex« ist ein eingetragenes Warenzeichen) in Perlenform wurden 24 st in einem Überschuß eines 0,15 m Natriumchlorid 0,05 m Natriumphosphat-Puffers mit einem pH von 7,0 quellen gelassen. Dieser Puffer besaß die folgende r, Zusammensetzung:

Natriumchlorid 8,53 g/l in Wasser

Natrium-dihydrogen-

phosphat-dihydrat 7,8 g/l in Wasser

Lösung mit 2 m Natriumhydroxidlösung
_>ii auf pH 7,0 eingestellt.

Das gequollene Material wurde in eine 1,5 X 20 cm-Kolonne gepackt, und die Kolonne wurde mit ungefähr 100 ml Phosphatpuffer mit 2° C 2 st lang gewaschen. 2 ml der konzentrierten Probe _>-, des Eluats der Stufe IV wurden auf die Kolonne aufgegeben: Die Kolonne wurde bei 2° C mit dem obigen Phosphatpuffer bei ungefähr 20 ml/st eluiert, und es wurden 2 ml-Fraktion gesammelt. Die proteolytische Aktivität der Fraktionen wurde wie oben bei Stufe tu IV ermittelt, und die Aktivität wurde in der ersten Spitze des eluierten Proteins gefunden. Hieran schloß sich eine weitere Proteinspitze an, die nicht proteolytisch war. Die aktiven Fraktionen wurden kombiniert, gegen Wasser mit 2° C dialysicrt und gefriergetrockj-, net. Das auf diese Weise erhaltene gefriergetrocknete Produkt war AM-Protease. (Kommentar zu dieser Stufe: Die erreichte Reinigung liegt zwischen dem 2- und 5fachen; im allgemeinen ist sie niedriger, wenn die Stufe IV sehr wirksam ist).

,„ Die in allen fünf Stufen erreichte Reinigung war 300- bis 500fach; es wurden ungefähr 70% der ursprünglichen proteolytischen Aktivität zurückgewonnen.

Beispiel 2

Ein Mycelinoculum von Armillaria mellea ACC 3253 wurde wie folgt hergestellt:

45 ml eines 2%igen Malzagars in einer 200 ml fassenden flachen medizinischen Flasche wurde mittels

-,ο einer sterilen Schlinge aus einer Mutterkultur von Armillaria mellea (gehalten auf einer Malzagar in einem Reagenzröhrchen) inokuliert. Die Flasche und ihr Inhalt wurden 14 Tage lang bei 25° C inkubiert. 30 ml steriles destilliertes Wasser wurden der Flasche zuge-

^ geben, und das Luf tmycel wurde mit einer sterilen Nadel abgerieben, um eine Mycelsuspension herzustellen.

200 g gekochte Maisflocken wurden in 2 1 fassende Glasbecher eingebracht Ungehopfte Brauerwürze

_b0 (spezifisches Gewicht 1,182) wurde dann in einer ausreichenden Menge zugesetzt, bis die Oberfläche des Maises erreicht war. Die öffnung eines jeden Bechers wurde mit einer Aluminiumfolie verdeckt, und dann wurden die Becher mit ihrem Inhalt in einen Autokla-

_b5 venmitl20° C und mit einem Druck von 1,05 kg/cm² eingebracht. Nach dem Abkühlen wurde weitere Würze zugegeben, um den Würzenspiegel bis zur Oberseite des Maises anzuheben. Die Becher und der

Inhalt wurden 20 min in einen Autoklaven mit 120° C eingebracht.

Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Mais/Würze-Medium mit 5 ml der Mycel-Suspension von Armillaria mellea inokuliert und dann im Dunkeln 12 Wochen und dann im Licht 4 Wochen bei 25° C inkubiert. Die Oberflächenmycelschicht, die sich gebildet hatte, wurde abgekratzt, und mit festem Kohlendioxid gemahlen, um ein Pulver herzustellen. Ein Phosphatpuffer mit einem pH vom 7,4 (2 ml) wurde zugegeben. Der Puffer bestand aus 0,1 m Natriumdihydrogenphosphatlösungund0,15 m Natriumchloridlösung, die durch Zugabe von 2 m Natriumhydroxidlösung auf pH 7,4 eingestellt waren. Das Gemisch wurde zentrifugiert und die überste-

hende Flüssigkeit wurde aufbewahrt. Auf diese Weise wurde eine wäßrige Lösung erhalten, die AM-Protease enthielt.

100 μΐ der genannten wäßrigen Lösung, die die

'■ AM-Protease enthielt, wurden zu 0,5 ml einer Lösung von menschlichem Fibrinogen (95% gerinnungsfähiges Protein; 3 mg/ml in Phosphat/Kochsalz-Puffer; 0,1 m Phosphat, pH 7,4) zugegeben, worauf sich der Zusatz von 10 ml einer Lösung von Rinderthrombin

in (500 N. I. H*-Einheiten/ml) im gleichen Puffer anschloß. Das gebildete Gerinnsel war in ungefähr 90 sek aufgelöst. Dieses Resultat zeigt, daß die genannte wäßrige Lösung ein fibrinolytisches Enzym enthielt.

I') The National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, U.S.A.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer Protease mit der Bezeichnung AM-Protease, welche die in der Beschreibung angegebenen Eigenschaften (1) bis (6) aufweist, dadurch gekennzeichnet,

daß A entweder folgende Arbeitsschritte angewendet werden:

1. Mahlen oder anderweitige Zerkleinerung ι ο von reifen Fruchtkörpern von diese Protease bildenden Vertretern von Armillaria mellea und Extraktion dieses Materials mit Wasser, um einen wäßrigen Extrakt, herzustellen,

2. Ausfällung unerwünschter verunreinigender ι ^r> Proteine aus dem wäßrigen Extrakt mittels mindestens eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels bei einer geeigneten Temperatur, bei einem geeigneten pH und bei einer geeigneten Ionenkonzentra- >i> tion, und Abtrennung der ausgefallenen Proteine durch herkömmliche Maßnahmen,

3. Ausfällung der rohen AM-Protease aus der Lösung durch Zusatz mindestens eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungs- r. mittels zur Lösung,

4. teilweise Reinigung der rohen AM-Protease durch Chromatographie, und

5. Reinigung der erhaltenen unreinen Protease mittels einer Molekularsiebtechnik m

oder daß B ein die AM-Protease bildender Vertreter von Armillaria mellea auf einem Nährmedium bei ungefähr 25° C gezüchtet und hierauf die AM-Protease aus dem erhaltenen Myzelium durch die unter A 1 bis 5 angegebenen Arbeite- ei schritte gewonnen wird, mit dem Unterschied, daß die reifen Fruchtkörper durch das Myzelium ersetzt werden.

2. Eine nach Anspruch 1 herstellbare AM-Protease.

3. Pharmazeutische Stoffzusammensetzung mit fibrinogenolytischen, fibrinolytischen und antikoagulierenden Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet, daß sie die AM-Protease gemäß Anspruch 2 und ein inertes, nicht-giftiges, pharma- 4^ zeutisch anwendbares Verdünnungs- oder Trägermittel aufweist.