DE2047317A1 - Enzyme - Google Patents
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Description
Enzyme
Prioritäten: 26.9-1969 und 7.5.1970 - Großbritannien
Die Erfindung bezieht sich, auf Enzyme und insbesondere auf
eine enzymische Substanz, die eine fibrinogenolytische Und
fibrinolytische Aktivität besitzt» Die genannte enzymische
Substanz besitzt auch Antikoagulationseffekte. Es wird angenommen,
daß diese zum Teil ihren Grund in der fibrinogenolytiachen
Aktivität (das heißt, daß die Antikoagulationseffekte
anscheinend teilweise aus der Zerstörung von Fibrinogen und dem Inhibitionseffekt der Fibrinogenabbauprodukte
auf die Bildung von Fibrin aua dem restlichen Fibrinogen
resultieren) und sum Teil in der Zerstörung anderer Koagulationsfaktoren, die gegenüber einem proteolytischen Angriff eopfindlich sind, wie z.B. die Faktoren Y und VIII, iiaben.
resultieren) und sum Teil in der Zerstörung anderer Koagulationsfaktoren, die gegenüber einem proteolytischen Angriff eopfindlich sind, wie z.B. die Faktoren Y und VIII, iiaben.
Es wurde gefunden, daß der reife FruchtkSrper oder
Hut des Pilzee Armillaria me)lea eine Quelle für
Hut des Pilzee Armillaria me)lea eine Quelle für
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eine brauchbare enzymatische Substanz ist, welche den Gegenstand
dieser Anmeldung bildet. Der Pilz Armillaria mellea wächst parasitär oder saprophytisch auf Bäumen und kommt
überall in Großbritannien und anderen Ländern der Welt vor. Eine kurze Beschreibung des Pilzes ist wie folgt:
Hut 5-15 cm Durchmesser, zunächst rund, dann abgeflacht und u.U. in der Mitte eingeoenkt. Die Farbe variiert zwischen
gelblich bis tief braun. Stengel 7»5~15 cm lang.und bis zu
13 mm dick. Ring weißlich. LammeIlen weißlich bis fleischfarben,
angewachsen oder leicht am Stengel herablaufend. Sporen unter dem Mikroskop farblos, 8-9 x 5-6/fc. Um die enzymatische
Substanz zu isolieren werden die Fruchtkörper am besten von ungefähr August bis zu den ersten Fröaten geerntet.
Nach der Ernte sollen die Fruchtkörper bei ungefähr -250C
oder noch tiefer gelagert werden, bis das weiter unten beschriebene Isolationsverfahren ausgeführt wird.
Es wurde gefunden, daß die genannte enzymatische Substanz
nicht von allen Species von Armillaria mellea erhältlich ist. Die genannte enzymatische Substanz wurde aus etwas mehr als
einem Drittel (etwa 50 aus einer Gesamtzahl von annähernd
140) der Pilzproben erhalten, die 1969 in Großbritannien gesammelt wurden. Der Grund, warum ein Teil der Proben nicht
die enzymatische Substanz lieferte,ist unbekannt. Species
von Armiallaria mellea, die für die Öffentlichkeit zugängig
sind und die die genannte enzymatische Substanz liefern, sind:
(1) die Species, die von Ministry of Technology, Forest Products Research Laboratories, Princes Risborough, Ayleebury,
Buckinghamshire, England als FPHL 6H identifiziert
worden ist und von dort auch allgemein erhältlich ist (Nummerierung durch die Anmelderin: AGC 3659); und
(2) die Species, die durch das Centraalbüro voor Scnimmelculturee,
Ba&rn, Niederlande einfach als "Armillaria mellea" identifiziert wurde und von dort allgemein erhätlich ist
(Nummerierung der Anmelderin: ACC 3253)·
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So wird also gemäß der Erfindung eine enzymatisch^ Substanz
vorgeschlagen, bei der es sich tun eine Peptidyl-Peptid-Hydrolase
(syn. Peptid-Peptido-Hydrolase) handelt, und die in
dieser Beschreibung als "AM-Protease11 bezeichnet wird. AM-Proteaee
besitzt die folgenden charakteristischen Eigenschaften:
(1) Sie katalysiert den hydrolytischen Abbau von Fibrinogen ' und Fibrin (das heißt, daß sie fibrinogenolytische und fibrinolytische
Aktivität zeigt). Die Aktivität von AM-Protease wurde in vitro durch die folgenden bekannten Tests bestimmt:
(a) Inkubation von AM-Protease mit gereinigtem Fibrinogen
und Zusatz von Thrombin zu entnommenen Proben in bestimm- f
ten Zeitabständen. Die Zeit, die für den Verlust der Gerinnungefunktion erforderlich ist, ist ein Maß für die
fibrinogenolytische Aktivität.
(b) Inkubation von vorher hergestelltem Fibringerinsel mit AM-Protease und Messung der Geschwindigkeit des Verschwindens
des Gerinseis. Diese Messung kann dadurch erleichtert werden, daß man Gerinsel aus mit J y markiertere
Fibrinogen herstellt und das Nachlassen der I ,.dioaktivität
mißt. Dies gibt ein Maß für die flbrinolytische Aktivität.
(c) Zusammenmischen von AM-Protease, Thrombin und Fibrinogen
und Beobachtung der Lebensdauer des so gebildeten Gerin- \
sols. Dies gibt ein Maß für die fibrinogenolytische und fibrinoIytische Aktivität von AH-Protease.
In vivo wird die Aktivität von AM-Protease an Versuchstieren
(Xaninchen) dadurch bestimmt, daß ihr Effekt auf den Fibrinogenspiegel
in Tieren und auf den Proteasespiegel im Plasma gemessen wird. Der erstere Effekt kann dadurch bestimmt werden,
da3 nan die Verlängerung der Gerinnungszeit des gesamten
Bluts oder des Plasmas gegenüber der Vergleichs- oder Vor-'bPLandliingsgorinnzeit
nach Zugabe einer* Standardmenge Thrombin mißt. Der· letztere Effekt kann durch ein ähnliches Ver~
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fahren gemessen werden, wie es in 1(b) angegeben ist.
(2) AM-Proteaae verhält eich beim Durchgang durch eine Kolonne
aus vernetzten! Doxtran-Gel ("Sephadex" G I5O; "Sephadex" ist
ein Walirenieichen), welches für Proteine mit einem Molekulargewicht
"bis zu 400.000 durchlässig ist, als einzige Komponente.
Das Volumen des Puffers (Eluationsmittel), in welchem
AN-I5ToI;ease aus der Kolonne austritt, entspricht demjenigen,
das erforderlich ist, ein Protein mit einem Molekulargewicht
von ungefähr 30.000 zu eluieren. Das genannte Eluationsmittel
ist ein 0,3m NaCl 0,05m pH 7,4 Trls/HCl-Puffer, welcher die
folgende Zusammensetzung aufweist (und mit dem die Elution bei ungefähr 2°C ausgeführt wird):
Natriumchlorid 17,5 g/l in Wasser
Trie(hydroxymethyl)aminomethan 6,05 g/l in Wasser
ausreichend m Salzsäure, so daß
ein pH von 7f4 erzielt wird.
(3) AM-Protease verhält sich in der Zelle einer analytischen
4
ultrazentrifuge bei 26 χ 10 g als einzige Komponente ο Der
ultrazentrifuge bei 26 χ 10 g als einzige Komponente ο Der
Sedimentationskoefficient von AM-Protease im 0,3 m NaCl 0,05m
pH 7,4 Tris/HCl-Puffer (siehe oben (2)) beträgt bei 200C,das
ist der S20W-Wert, ungefähr 2,35 x 10"15 sek.
(4) Bei Elektrophorese von AM-Protease in Polyacrylamid-Gel
ist offensichtlich nur eine Komponente vorhanden, und diese Komponente besitzt eine Wanderung entsprechend einem γ -Globulin.
Das Polyacrylamid-Gel hatte ein Acrylamid / Bieacrylaraid-Verhältnis
von 150:1. Die Elektrophorese wurde ungefähr 1 st bei 2 mA/cm ausgeführt. Der verwendete Puffer (pH 4,3,
ß-Alariin/Essigsäure (0,3m)) bestand aus ß-Alanin (26,73 g/l
in Wasser) und war durch Zusatz von Eisessig auf pH 4,3 eingestellt.
(5) Die N-öndständige Aminosäure von AM-Protease ist Isoleucin.
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(6) Ar'I~E'Fobüa3e baut boL pH V Lei.chb Cawain ab uud bildsb
Bruchs bücke, die in Trlehioressigaaure Löslich a.Lnd. Dot*
rad icb viel kleiner a La derjenige, der durch
Chymotrypsin oder Plasmin erzeugt wird, CLe vorurhachb
einen geringen Abbau dan Berunus Albumin oder /'--IrLo-buLLn,
auch böi Längsi'or Enkubablon. GLe vßE'uraaohb ei. nun
starken Abbau von FibcLnogen. SLe hub koine V/irkung auf nl>
>·· drLgai' li'.oiükulare oubübrabö (boiupiüLav/eiat) ιΐ-ίΓ-ActibyLgLy
u.y L- · [«■- i'/u) l.n-me biiy Los be ν, Ä---N-Ace by L-L- Jyss in-me thy Loü bu r,
<" -ti-ρ -1L1O L uo Lfjul f ony L-L-rir.'fcj; \ riin-uo thy Lon lav, «,-if-Ace Ij L-L-b.yr:)£iLn-äbh.ylosfcer
oder L-Trypbophari-äbhyloaLor) ; welch« χα ·
wohnlich dazu verwendet; würden, l.ryp;jLi»uit;Lyf.v oder
sLnarfc.ig;« Kn'iyme zu char.ikberialoren. i>io wiokb auf die ß-Kette
vou oxidiertö:n Insul.in, wobei dio foigüiwlen
gruppen in Erscheinung broben: 'L'yroain, Lysin und in
Ausmaß Leucin. Tn dioav3r Hin.'ii.ohfc untfcrncheLdeb sie sich
(aAehe oben"1 von Trypsin und Chymotrypsin.
Wenn sie durch, das in der Folge beschriebene Isolabionaver■·
fahren erhalten worden isb, dann erscheint AM-Protease als
im wesentlichen homogen, wenn die üblichen biophysikalischen
Kriterien herangezogen werden,· das heißt Sedimentationseigenschaften,
elektrophoretische Eigenschaften und Verhalten bei Gelfiltration und in Ionenaustauschkolormen» In allen
Fällen zeigt sich die Homogenität durch das Auftreten einer schmalen Proteinzone, welche eine symmetrische, nahezu *
Gauss%ache Verteilung um eine Spitze hat. Trotzdem ist es
möglich, daß AM-Protease eine Mischung aus nahe verwandten isofunktioneilen Enzymen ist.
Geaäß der Erfindung wird weiterhin ein Verfahren zur Herstellung
von AM-Protease vorgeschlagen, welches die folgenden Stufen umfaßt:
X. Mahlen oder anderweitige Zerkleinerung von reifen Fruchtkörpern
von Armillaria mellea und Extraktion dieses Materials mit Wasser, um einen wässrigen Extrakt heratistellen;
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IL.Au«füllung unerwünscht bor verunreinigender Probelno aus dem
wUi)iir.'i.gen Extrakt mittel.« mlndeaberia einem mit Weaser mischbaren
organischen Lösungiimi t;t;eL hui ο ine ic* geeigneten Temperatur,
bei einem geeigneten pil und bei eLnor geeigneten IonenkouKtm
bra tion, und Abtrennung dor ausgefallenen Fro to.ine durch
horiröifimilohe
EL L, Auijfäl lung dm- rohen AN-Protftase aus der Lösung durch ZusfttK
mindestens tiitie-.j mil. Wasser mischbaren organisc-hon Lo--.umgfnnlbboLii
zur Lorning (d.h. zur Lösung, die nach der Abtrennung
dar unerwüniKJhbon Proteine bei (2) zurückbleibt);
~ E1/. U;llwi>iiie Reinigung der rohou AM-Procease durch Chroma to-~
^ graphIe; und
V. Peinigung der erhaltenen unreinen AM-Proteaee mittels einer
Molekularsiebtechnik.
Ea wird darauf hingewiesen, daß, sofern nichts anderes ange
geben ist, alle obigen Stufen bei einer Temperatur von ungefähr 2°0 ausgeführt werden. Die obigen Stufen werden nun genauer behandelt·
I Wie bereite erwähnt befinden sich die Fruchtkörper von
Armillaria me1lea während des Spätsommers und Herbsts im
} richtigen Beifestadium. In Großbritannien reifen sie in der
Zeit vom August bis zum November. In diesem Zustand sind die Fruchtkörper gelb bis tiefbraun und ziemlich flach oder
leicht eingesenkt. Wie bereits erwähnt sind die Fruchtkörper, die von den öffentlich zugänglichen Species ACC 3659
(FPRL 6H) und ACC 3253 ("Armillaria mellea" von Centraabureau voor Schimmelculturea, Baarn, Niederlande) Quellen
für AM-Protease.
Die reif en m Fruchtkörper können cait V/asser in einem mechanischen
Mischer bei 2 bis 4-0C homogenisiert v/erdsn. Das resultierende
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BAD
i/'.Hi;
Gemisch wire! dann durch Filtration oder Zeufcrifugation getrennt,
und beide Phasen (d.h. die feat« Phoae und die wässrig«
Phase) werden aufbewahrt« Der grüßt« Teil der AM-Proteaso
geilt bei dieser Stufe in die wäsariße Phesc. Gegebenenfalls
wird die feste Phase entweder (a; ßßfriorgotrocknet, mit
festem Kohlendioxid gemahlen und dann mit Wasser von 2 his 40C
extinhiert oder (b") gemeinsam mit ednem geeigneten Schleif-,
mitte 1 j wie z.B. Sand, und mit Wasser von 2 bis 4°C gemahlen!,
worauf dann das resultierende Gemisch durch Filtration oder Sent.r.1 fugatior getrennt wird. In ,-jedem Fall wird etwas AM-Protenae
im zweiten wässrigen Extrakt erholten. Der wässrige
Extrakt oder die kombinierten wässrigen Extrakte, ^enachdem,
wird bi'iw. werden dann zur Lagerung gefriergetrocknet oder
direkt in der Stufe (2.) verwendet. Der wässrige Extrakt kann i
in einem gewisser, Ausmag dunkel werden. Dies hat seinen ^runr*. vermutlich in der Wirkung einer Polyphenoloxidase«
Dieses Dunkelwerden kann dadurch verhindert werden, daß man iain3r wenn möglich unter Stickstoff arbeitet und dem
Extraktionswasser mindestens einen Tyrosinaseinhibitor zusetzt, wie z.B. Natriumbenzoat oder Natriumsscorbat in einer
10 - bis 10 molaren Konzentration.
II. Mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, die zum
Ausfallen der unerwünschten Proteine verwendet werden können, sind z.B. Alkenole mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen oder
Alkanone mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Äthanol,
n-Propanol, Isopropanol oder Aceton, sowie Mischungen, derselben.
Diese organischen Lösungsmittel können gegebenenfalls gemeinsam mit einem Dialkyläther mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen,
wie z.B. Dläthyläther, verwendet werden. Die
Ausfällung wird im allgemeinen bei -10 bis l.o°C und insbesondere
bei -2 bis 20C und bei einem pH von 5 bis 7, ^e
nach dem verwendeten Lösungsmittel, ausgeführt. Ein Überschuß sii Lösungsmittel sollte nicht verwendet worden^ da
hierdurch, nicht nur die unerwünschten Proteine sondern auch
All-Protease selbst ausgefällt wird. Die unerwünschten Protoino
werden durch, ein herkömr-lichr-s Yar.iV/liren, wie z.B.
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BAD
durch Filtration oder Zentrifugieren, abgetrennt.
III. Geeignete organische Lösungsmittel für die Ausfällung der rohen AM-Protease sind diejenigen, die unter (II.) erwähnt
wurden. Es werden auch ähnliche Temperatur- und pH-Bedingungen wie unter (II.) verwendet. Die rohe AM-Protease,
die ausgefällt wird, wird durch irgendein herkömmliches Verfahren, wie z.B. Filtration oder Zentrifugetion, gesammelt,,
worauf sie vorzugsweise mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie z.B. eiskaltes 70%iges wässriges Äthanol, gewaschen wird.
Die rohe AM-Protease wird dann gegebenenfalls (a) in eiskaltem destllierten Wasser aufgelöst und gefriergetrocknet
oder (b) aufeinanderfolgend bei -2 bis 20C mit trockenem
Äthanol und Difithyläther gewaschen und dann bei -2 bis 2°G
im Vakuum getrocknet.
IV. Die auf diese Weise erhaltene rohe AM-Protease enthält
nachwievor verhältnismäßig große Menge unerwünschter Proteine, von denen einige unter Ausnutzung der unterschiedlichen
Affinitäten von AM-Protease und der unerwünschten Proteine gegenüber chromatographischen Kationenaustauschmaterialien
abgetrennt werden können, wie z.B. Materialien, die Carboxymethylradikale enthalten, die an eine PoIyeaccharidmatrixgebunden
sind, wie z.B. Carboxymethvlcellulose.
Die Kolonne wird mit einem wässrigen Puffer von pH 5 bis 7i wie z.B. pH 6, und bei einer Temperatur von ungefähr
2°C eluiert. Allgemein gesagt, die unreine AM-Protease, die auf diese Welse erhalten wird (welche noch etwas unerwünschte
Proteine enthält) wird nach der Hauptspitze der unerwünschten Proteine eluiert. Die eluierten Fraktionen, die unreine AM-Protease
enthalten, können beispielsweise durch Druckdialyse konzentriert werden.
V. Die verbleibenden unerwünschten proteinhaltigen Verunreinigungen
werden aus der unreinen AM-Protease mittels einer Molekularsiebtechnik bei ungefähr 2°0 entfernt,wo-
aus bei eine Kolonne oder eine Membrane! eine^ vernetzten
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hydrophilen Polymer verwendet wird, das In Bezug auf ein
Molekulargewicht von ungefähr 30.000 Molekularsiebeigenschaften besitzt. Geeignete polymere Materialien sind z.B.
die vernetzten Dextrane, wie z.B. "S ephadex" (Warenzeichen) G75» Polyacrylamid-Gel, wie z.B. "Bio-Gel" (Warenzeichen),
und Agarosen, wie z.B. "Sagarose" (Warenzeichen) oder "Sepharose"
(Warenzeichen). Die unreine AM-Protease aus der Stufe (IV) wird in einem kleinen Volumen eines Puffers mit pH 6 bis 8,
beispielsweise pH 7, wie z.B. einem pH 7 0,3m Hatriumchlorid/Phosphat-Puffer,
bei ungefähr 2°0 aufgelöst und die Lösung wird auf die Kolonne oder Membrane bei ungefähr 2°C
aufgebracht. Die Kolonne wird dann mit dem gleichen oder mit einem ähnlichen Puffer bei ungefähr 2°C eluiert, worauf die
AM-Protease vor den verunreinigenden Proteinen eluiert wird. Das Eluat, welches die AM-Protease enthält, kann durch. Druckdialyse
konzentriert werden. Im Falle einer Membrane, die Proteine enthält, gehen. Lösungsmittel und Elektrolyt durch
die Membrane hindurch, während die AM-Protease nicht hindurchgeht. Es wird bevorzugt zu verhindern, daß die AM-Protease
vollständig austrocknet, da es sonst schwierig ist, sie von
der Membrane zu entfernen. Die Lösung der AM-Protease an der Aufbringseite der Membrane kann durch Druckdialyse konzentriert werden.
Gemäß der Erfindung wird weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von AM-Pro^ease vorgeschlagen, welches die folgenden
Stufen aufweist:
I. Homogenisierung von reifen Fruchtkörpern von Armillaria
mellea mit Wasser in einem mechanischen Mischer bei 2 bis 40C,
Trennung des resultierenden Gemische durch Filtration oder Zentrifugetion, wodurch eine feste Phase und eine wässrige
Phase (A) erhalten wird, nod gegebenenfalls entweder (a) Ge»
friertrocknen der festen Phase, Mahlen des gefriergetrockneten Materials mit festem Kohlendioxid und Extraktion des
resultierenden Materials mit Wasser bei 2 bis 4°0,um eine
wässrige Phase (B) zu erhalten, oder (b) Mahlen der festen Phase mit Sand oder einen ähnlichen Schleifmaterial und mit
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- ίο -
Wasser bei 2 bis 4-0C, und Trennen des resultierenden Gemische durch Filtration oder Zentrifugation, wodurch eine
wässrige Phase (C) erhalten wird; wobei gegebenenfalls immer wenn möglich die Vorgänge unter (l) unter Stickstoff
ausgeführt werden und das Extraktioaawaaeer mindestens einen
üjyrosinaseinhibitor, wie z.B. ffatkumbenzoat oder Hatriumascorbat in 10"* bis 1(T4 molarer Konzentration enthält;
II. Ausfällung der unerwünschten verunreinigenden Proteine aus der wässrigen Phase (A), (B) oder (C) durch Zusatz mindestens eines organischen Lösungsmittels, nämlich eines Alkanols mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen oder eines Alkanons
mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder Mischungen derselben, gegebenenfalls gemeinsam mit einem Dialkyläther mit bis zu
5 Kohlenstoffatomen bei -2 bis 2°C und bei einem pH von
5 bis 7; und Abtrennung der ausgefallenen unerwünschten Proteine durch Filtration oder Zentrifugation; um eine Lösung
herzustellen, die AM-Protease enthält;
III. Ausfällung von roher AM-Protease durch Zusatz zur AM-Protease enthaltenden Losung von mindestens einem organischen
Lösungsmittel, nämlich Alkenole mit bis su 3 Kohlenstoffatomen und Alkanone mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen sowie Gemische
derselben, gegebenenfalls gemeinsam mit einem Dialkyläther mit bis zu 5 Kohlenetoffatomen bei-2 bis 2°G und bei einem
pH von 5 bis 7; und Sammeln der ausgefallenen rohen. AM- .
*
κ gegebenenfalls aber
Protease durch Filtration oder Zentrifugation; undI vorzugsweise Waschen der AM-Protease mit eiskaltem 70%igen wässrigen Äthanol; und hierauf gegebenenfalls entweder (a) Auflösen der rohen AM-Protease in eiskaltem destillierten Wasser
und Gefriertrocknung der Lösung oder (b) aufeinanderfolgendes Waschen der rohen AM-Protease bei -2 bis 2°C mit trockenem Äthanol und Diäthyläther und Trocknen des Produkte im
Vakuum bei -2 bis 2°C;
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-4!
auf einem ehr oma to graphischen Kationentuistauschmaterial, welches
Carboücymeth^lradikale enthält, die an eine Polysaocharidrnatrix
gebunden sind, wie z.B. Carboscyrcechylcellulosa; wobei
das genannte Material mit einem wässrigen Fuffer vow pH 5 bis 7i beispielsweise pH 6, bei ungefähr 2°G eluiert wild;
und Konzentraticm der eluierten Fraktionen, die die AM-Protease
enthalten, durch Druckdialyse; und
V* Reinigung der auf dies« Weise erhaltenen unrei.nen AM-Protease
durch Auflösen in einem·kleinen Volumen eines Puffers
vom pE 6 bis 8, beispielsweise pH 7t bei ungefähr 2°0 und
Aufbringen der resultierenden Lösung bei ungefähr 20C auf
eine Kolonne oder Membrane aus einem vernetzten hydrophilen Polymer, das in Bezug auf ein Molekulargewicht von ungefähr |
30.000 Molekular&iebeigenschaften aufweist; und hierauf entweder
Elution der Kolonne mit dem gleichen oder einem ähnlichen Puffer bei ungefähr 2°G und Konzentration des AM-Proteatse
enthaltenden Eluats durch Druckdialyse oder, im Falle der genannten Membrane, Hindurchführen der verunreinigenden
Proteine und des größten Teils des Lösungsmittels und des Elektrolyts durch die Membrane und Bückgewinnung der
resultierenden Lösung von AM-Protease von der Aufbringseite
der Membrane und gegebenenfalls Konzentration dieser Lösurg durch Druckdialyse.
Gemäß der Erfindung wird weiterhin vein Verfahren zur Herstellung
von AM-Frotease vorgeschlagen, bei welchem das I Mycel von Armillaria mellea auf einem Nährmedium bei ungefähr
25°0 gezüchtet und dann die AM-Protease aus dem
resultierenden Mycel durch eines der oben beschriebenen Verfahren isoliert wird, wobei der Unterschied darin besteht,
daß die reifen JPruchtkorper durch das erhaltene Mycel ersetzt werden.
Das Mycel "kann durch Oberflächenkultur bei 25°C auf einen
Kährraedium gezüchtet werden, das Mals und Würze enthält.
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Als geeignete Species von Armillaria mellea sollen beispielsweise diejenigen erwähnt werden, die von der Anmelderin mit
ACC 3253 und 3659 bezeichnet wurden·
Die AM-Protease v/ird vorzugsweise in wässriger Lösung bei ungefähr -25°0 gelagert.
Gemäß der Erfindung werden weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen vorgeschlagen« die AM-Protease und ein inertes,
nicht-giftiges, pharmazeutisch brauchbares Verdünnungsmittel .
oder Trägermitte] enthalten.
Die genannten pharmazeutischen Zusammensetzungen können eine
Fora aufweisen, die sich für systemische intravenöse oder
intraarteriale Infusion oder lokale intravenöse oder intraarteriale Injektion eignen. Geeignete Zusammensetzungen sdnd
sterile injizierbare wässrige Lösungen, die 0,05 bis 1,0 mg
AM-Protease/ml, beispielsweise 0,25 mg AK-Protease/mlienthalten. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten übliche Verdünnungsmittel oder Träger
und können durch übliche Verfahren hergestellt werden. Sie enthalten gegebenenfalls ein Stabilisierungsmittel, wie z.B.
das menschliche Plasma Albumin, und sie können gegebenenfalls auch bekannte analgetiache Mittel enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können für folgendes verwendet werden:
(1) die Behandlung von arterieller Thrombose;
(2) die Behandlung von arterieller Eabolia, wie z.B. Embolie
in den Renalarterien oder mesenteriechen Arterien und
insbesondere in den Beinarterien und in der Aorta an der Eifurkation;
(3) die Behandlung von Tiefvenenthrombose; und
(4) die Behandlung von Pulmonarembolie
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Es erscheint zweckmäßig, die Verwendungsweise der All-Protease
in Beaug auf die (a) systemische Therapie und die (b) lokale
intravaskulare Perfusion zu diskutieren.
(a) Systemische Therapie mit AM-Protease.
Die Resistenz des menschlichen Tlasmaa gegenüber AM-Protease
ändert sich von Individuum zu Individuum und zwischen Tieren verschiedener Species. Die Resistenz ändert sich auch bei
den einzelnen menschlichen Patienten während der systetiischen
Behandlung mit AM-Protease. Eine Beladungsdosis ist erforderlich,
um den größten Teil des im Kreislauf befindlichen Inhibitors λ
auszuschalten. Diese Dosis wird hauptsächlich durch vorherige Titration des Plasmas des Patienten in vitro und such durch
Titration in vivo bestimmt, indem die Reaktion von steigenden Fraktionen der gewählten Dosis an AH-Protease während
der intravenösen Infusion beobachtet wird. Die Reaktion,die
gemessen wird, ist die Verlängerung der Gerinnungezeit, die durch die AM-Protease hervorgerufen wird, die einen Über
schuß gegenüber der von dem Inhibitor beeinflußten darstellt. In den meisten Fällen beträgt diese Beladungsdosis 0,05 bis
5 mgAg/st Att-Proteaee.
Wenn eine optimale AM-Protease-Plasmaaktivität erzeugt ist,
dann muß diese durch intermittierende intravenöse Dosierung \
von AM-Protease aufrechterhalten werden. Dies ist nötig, da anscheinend Inhibitor in den Kreislauf zurückkehrt, der
verursacht, daß die Gerinnungszeiten sich wieder auf die normalen Werue einstellen, was einen Verlust von enzymatischer Aktivität anzeigt. Es wurde beobachtet, daß die
thrömbolytische Aktivität aufrechterhalten wird, wenn man
annähernd 10$ der Anfangsdosis der AH-Protease stündlich
während der nächsäen 2 st verabreicht und wenn man hierauf auf weniger als Λ% der Anfangsdose an AM-Protease alle 2
bis 3 st zurückgeht. Die Verringerung der Dosis, die erforderlich ist, die Aktivität aufrecht zu erhalten, hat ihren
Grund vermutlich in einem Abfall der Geschwindigkeit der
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Rückkehr des Inhibitors in den Kreislauf. Die Dauer der Behandlung mit AH-Protease hängt vom Alter der Thrombose
oder der Thrombosen und ihrer Größe ab. Die systemische Behandlung wird solange fortgesetzt, bis es Anzeichen einer
klinischen Verbesserung gibt, d.h. Bäckkehr der Pulsation und Verbesserung der Farbe des Glieds, In welchem der Kreislauf
durch eine Arterienthromboee beeinflußt war.
(b) Lokale intravaskulare Perfusion von AM-Protease.
Eine lokale Perfusion von AW-Protease ist in den Fällen angezeigt, in denen eine thrombotische Occlusion einer großen
perlphären Vene besteht oder in thrombosierten Gefäßen, die bei der ScribnezvUmleitung für Hierendialyse verwendet werden,
oder in einem geeigneten Segment einer Arterie, die durch eine Thrombose blockiert worden 1st. Ein solches Verfahren
zur lokalen Perfusion besltst den Vorteil, daß die verwendete Dosis beträchtlich geringer ist als bei der systemischen
Therapie, d.h. etwa 1/10 bis 1/100 dar systemischen Dosis.
Auch besteht keine Notwendigkeit den Inhibitorspiegel im Blut des Patienten tu bestimmen. Es kann deshalb eine Standarddosis gegeben werden, beispielsweise können 5 bis 10 ml
(enthaltend 1/80 bis 1/100 der systemischen Dosis) in einen Katheter injiziert werden, der sich in einem Teil der Vene
befindet, der distal zur Occlusion liegt. Dieser kann 10 min belassen werden, bevor der Inhalt des Katheters angesaugt
wird. Dieses Verfahren wird 2- oder 3mal wiederholt und In den meisten Fällen ist dann die Thrombose aufgelöst.
Das gleiche Verfahren kann für eine zugängige Arterie verwendet werden, die durch eine Thrombose vollständig occludiert ist, wobei der Unterschied jedoch darin steht, daß
der Katheter nahe beim occludierten Abschnitt eingeführt wird.
Die von Armillaria mellea erhaltene AM-Protease enthält ein
Metall. Es'wurde gefunden, daß die Anwesenheit eines Metalls,
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aber nicht unbedingt das Metall, das in der von Armillaria
mellea erhaltenes. Substanz vorliegt, für die enzymatische Aktivität wesentlich ist. Das Apoenzya kann erhalten werden
durch Behandlung des Haloenzyms, d.h. AM-Protease, mit
10"** m Ethylendiamintetraessigsäure CpE 7) während 30 min
bei 4-0C. Die überschüssige Ethylendiamintetraessigsäure
wird durch Dialyse gegen einen 0,05 m pH 7 A Tris/HOl-Puffer
beseitigt, der die folgende Zusammensetzung besitzt:
Trie(hydroxymethyl)aminomethan 6,05 g/l in Wasser
ausreichend m Salzsäure, so daß pH 7 entsteht.
Die enzymatische Aktivität kann durch Behandlung des Apoenzyms in einen wässrigen Medium mit 0o++, Zn++, Hi++, Fe++
und (in diesen Fall wird die enzymatische Aktivität wieder in geringeren Ausmaß zurückerhalten) Gu++ wieder hergestellt
werden; die durch diese Behandlung erhaltenen Produkte werden in der folge als "modifizierte AM-Proteasen" bezeichnet.
Gemäß der Erfindung wird weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung vorgeschlagen, die modifizierte AM-Protease
und ein inertes, nicht-giftiges, pharmazeutisch zulässiges
Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.
Geeignete Zusammensetzungen und Verabreichungsweisen sind diejenigen Zusammensetzungen und Verabreichungsweisen die f
oben bei der AH-Protease selbst beschrieben wurden.
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Beispiel 1
Strife I
100 g reife leuchtkörper von Armillaria mellea wurden in
einem M.S.E.-nAtomix"-ttLscher ("Atomix" ist ein Warenzeichen)
bei 2°C mit 130 ml Wasser homogenisiert. Das Homogenisat
wurde mit weiteren 150 ml Wasser gemischt, das Gemisch wurde
bei 2°0 30 min gerührt und dann zentrifugiert. Das Zentrifugat (flüssige Phase) wurde bei 2°C gehalten, bis die weitere
Verarbeitung durchgeführt wurde (siehe unten). Der feste Rückstand wurde gefriergetrocknet» das Produkt wurde mit
festem Kohlendioxid in ein feineres Pulver gemahlen, das Gemisch wurde mit 150 ml Wasser bei 2°0 extrahiert, und der
Extrakt wurde zentrifugiert. Das Zentrifugat (flüssige Phase) wurde mit dem oben erwähnten Zentrifugat vereinigt. (Kommentar zu dieser Stufe: Der wässrige Extrakt kann direkt in
der nächsten Stufe verwendet oder zur Lagerung gefriergetrocknet werden. Der größte Teil der AM-Protease, ungefähr
t werden bei der Homogenisation mit Wasser extrahiert).
Stufe II
Die wässrige Lösung wurde mit m Essigsäure auf pH 6,0 eingestellt und die Lösung wurde in einem Kühlbad auf 2°C abgekühlt. 450 ml Äthanol mit 2°C wurden langsam der wässrigen
Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde während dieser Zugabe gut gerührt, wobei jedoch darauf geachtet wurde, ein Schäumen
zu vermeiden. Die Temperatur wurde auf 20C gehalten. Nach
beendeter Zugabe wurde das Gemisch 1 st auf 2°C gehalten
und die Ausfällung, die eich gebildet hatte, wurde durch Zentrifugation (2000 g) während 30 min bei 2°C abgetrennt.
Der feste Bückstand wurde verworfen, und das Zentrifugat wurde in der Stufe III verwendet.
Stufe III
Das Zentrifugat aus der Stufe II wurde in ein Kühlbad eingebracht und 450 ml Äthanol wurden langsam zugegeben.
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Die Temperatur wurde während dieser Zugabe auf -5°C fallen
gelassen. Wie in der Stufe II wurde das Gemisch gut gerührt, wobei jedoch ein Schäumen vermieden wurde. Fach beendeter
Zugabe wurde das Gemisch 1 st bei -5°C gerührt. Es wurde
dann zentrifugiert und das Zentrifuget wurde verworfen. Der
feste Bückstand wurde in 75 al einer Mischung aus 70 Vol.-%
Äthanol und 30 Vol.-56 Wasser bei -5°C suspendiert und die
Suspension wurde zentrifugiert. Der feste Bückstand wurde bei 2°C in 30 ml Wasser aufgelöst, die,Lösung wurde einer
Hülsengefrierung bel-70°C zugeführt und|gefriergetrocknet.
(Kommentar zu dieser Stufe: Ungefähr 90 bis 95% der Ausgangsaktivität werden in dieser Stufe zurückerhalten, und
das gefriergetrocknete Material stellt etwa 5 Gew.~% des
festen Ausgangsmaterials in dieser Stufe dar, d'.h* desjenigen, das aus dem wässrigen Extrakt erhalten worden
war).
Stufe IV
100 g mikrogranulare "Whatman"-Carboxymethylcellulose (CM 52;
"Whatman" ist ein Warenzeichen) wurden mit einem pH 6,0 0,025 m Katriumcitrat-Puffer gewaschen bis die Waschflüssigkeiten einen pH von 6,0 besaßen. Der Puffer war dadurch hergestellt worden, daß eine Lösung von 7,35 g/l Trinatriumcitrat-dihydrat in Wasser durch Zugabe.von 2 m Salzsäure
auf pH 6,0 eingestellt wurde. Die ins Gleichgewicht gebrachte Carboxymethylcellulose wurde dann in eine 2,5 x 30 cm-Kolonne eingebracht. 2 al einer Lösung von 200 mg des gefriergetrockneten Produkte der Stufe III im oben erwähnten
Citratpuffer wurden in die Kolonne bei 2°C eingebracht. Die
Kolonne wurde bei 20C mit dem Citratpuffer, der in einer
Menge von ungefähr 20 ml/st verwendet wurde, eluiert, und 5 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Das Eluat wurde auf
Lichtabsorbtion bei 28OmA. untersucht. Hierdurch wurden
alle Proteinspitzen ermittelt (Proteine zeigen eine Spitzenabsorbtion bei 280 m/t ). Die enzymatisch Aktivität, d.h.
die proteolytische Aktivität, wurde durch das unter(l)(c) angegebene Verfahren ermittelt. Eine große Spitze eines
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UV-absorbierenden Material·, das keine proteolytische Aktivität zeigte, ging den proteolytisch aktiven Fraktionen
(d.h. die Jenigen, die AW-Proteaae enthalten) vorher, und
an den letzteren Fraktionen echloß sich, weiteres UV-absorbierendes, nioht-proteolytisches Material an. Die zusammengefaßten Fraktionen wurden durch Druckdialyse bei 20C tanter
Verwendung von nAmioonR UNIO-Membranen ("Amicon" ist ein
Warenzeichen) konzentriert. (Kommentar zu dieser Stufe: In Abhängigkeit von der Qualität der Carboxymethylcellulose,
die sich etwas ändert, kann das proteinhaltige Material einschließlich AM-Protease als diskrete Spitze mit einer ungefähr 20-fachen Reinigung oder, sofern ungünstigere Bedingungen herrschen, mit einer 5- bis 10-fachen Reinigung erhalten werden. Bis zu 90% der auf die Kolonne aufgegebenen
AM-Protease werden zurückerhalten· Es kann notig sein, die
Salzkonzentration des Eluiermittele zu ändern, um die
variablen Eigenschaften von verschiedenen Lieferungen der Carboxymethylcellulose. zu kompensieren).
Stufe Y
10 g "Sephadex" G75 ("Sephadex" ist ein eingetragenes Warenzeichen) in Ferienform wurden 24 st in einem Überschuß
eines 0,15 a Natriumchlorid 0,05m Natriumphosphat-Puffers mit einem pH von 7,0 quellen gelassen· Dieser Puffer besaß
die folgende Zusammensetzung:
Natrium-dihydrogen-phoephat-dihy- „ 8 ,χ ^ Wasser
drat ' 6^
Lösung mit 2m Natriumhydroxidlösung auf pH 7,0 eingestellt.
Das gequollene Material wurde in eine 1,5 x 20 cm-Kolonne
gepackt, und die Kolonne wurde mit ungefähr 100 ml Phoaphatpuffer alt 2°C 2 et lang gewaschen. 2 ml der konzentrierten Probe des Eluats der Stufe IY wurden auf die Kolonne
aufgegeben: Die Kolonne wurde bei 2°C mit dem obigen Phosphatpuüfer bei ungefähr 20 ml/st eluiert, und es wurden
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2 ml-Fraktion gesammelt. Die proteolytische Aktivität der
Fraktionen wurde wie oben bei Stufe IT ermittelt, und die Aktivität wurde in der ersten Spitze des eluierten Proteins
gefunden. Hieran schloß sich eine weitere Proteinspitze an, die nicht proteolytisch war. Die aktiven Fraktionen
wurden kombiniert, gegen Wasser mit 2°C dialysiert und gefriergetrocknet.' Das auf diese Weise erhaltene gefriergetrocknete
Produkt war AM-Protease. (Kommentar zu dieser Stufe: Die erreichte Reinigung liegt zwischen dem
2- und 5-Fachen; im allgemeinen ist sie niedriger, wenn die Stufe IV sehr wirksam ist).
Die in allen fünf Stufen erreichte Reinigung war 300- bis
500-fach; es wurden ungefähr 70% der ursprünglichen proteolytischen
Aktivität zurückgewonnen.
Ein Mycelinoculum von Armillaria mellea ACC 3253 wurde wie
folgt hergestellt:
45 ml eines 2%igen Malzagars in einer 200 ml fassenden
flachen medizinischen Flasche wurde mittels einer sterilen Schlinge aus einer Mutt*>rkultur von Armillaria mellea
(gehalten auf einem Malgagar in einem Eeagenzröhrchen)
inokuliert. Die Flasche und ihr Inhalt wurden 14· !Tage *
lang bei 25°C inkubiert. 30 ml steriles destilliertes
Wasser wurden der Flasche zugegeben, und das Luftmycel wurde mit einer sterilen Nadel abgerieben, um eine Mycelsuspension
herzustellen.
200 g gekochte Maisflocken wurden in 2 1 fassende Glasbecher eingebracht. Uhgehopfte Brauerwürze (spezifisches
Gewicht 1,182) wurde dann in einer ausreichenden Menge zugesetzt,.bis die Oberfläche des Halses erreicht war.
Die Öffnung eiies jeden B-schers wurde mit einer Aluminium-
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folie verdeckt, und dann wurden die Becher mit ihrem Inhalt in einen Autoklaven mit 1200C und mit einem Druck von 1,05 kg/
cm eingebracht. Nach dem Abkühlen wurde weitere Würze zugegeben, um den Würzenspiegel bis zur Oberseite des Halses anzuheben* Die Becher und der Inhalt wurden 20 min in einen
Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wu?de das Kais/Würze-Medium mit 5 ml der Kycel-Suspension von Armillaria mellea '
inokuliert und dann im Dunkeln 12 Wochen und dann im Licht 4 Wochen bei 25°C inkubiert. Die Oberflächenmycelschicht,
die sich gebildet hatte, wurde abgekratzt, und mit festem
Kohlendioxid gemahlen, um ein Pulver herzustellen. Ein Phosphatpuffer mit einem pH von 7 »4 (2 ml) wurde zugegeben.
Der Puffer bestand aus 0,1m Natriumdihydrogenphosphatlösung und 0,1$ a Natriumchloridlösung, die durch Zugabe von
2m Natriumhydroxid lösung auf pH 7,4 eingestellt waren. Das
Gemisch wurde zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde aufbewahrt. Auf diese Weise wurde eine wässrige
Lösung erhalten, die AK-Protease enthielt.
100 Kl der genannten wässrigen Lösung, die die AM-Protease
enthielt, wurden zu 0,5 ml einer Lösung von menschlichem Fibrinogen (95# gerinnungsfähiges Prodein; 3 mg/ml in
Phosphat/Kochsalz-Puffer; 0,1 m Phosphat, pH 7,4)j worauf
sich der Zusatz von 10/11 einer Lösung von Rinderthrombin (500 N.I.H -Einheiten/ml) im gleichen Puffer anschloß. Das gebildete Gerinsel war in ungefähr 90 sek
aufgelöst. Dieses Resultat zeigt, daß die genannte wässrige Lösung ein fibrlnolytlsches Enzya enthielt.
* The National Institutes of Health, Bethesda, Maryland,
U.S.A.
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Claims (1)
- Patentansprüche1. AM-Protease.2. Verfahren zur Herstellung von AM-Protease, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:I. Mahlen oder anderweitige Zerkleinerung von reifen Fruchtkörpern von Armillaria mellea und Extraktion dieses Materials mit Wasser, um einen wässrigen Extrakt herzustellen;II. Ausfällung unerwünschter verunreinigender Proteine aus dem wässrigen Extrakt mittels mindestens eines mit Wasser misch- ( baren organischen Lösungsmittel bei einer geeigneten Temperatur, bei einem geeigneten pH und bei einer geeigneten Ionenkonzentration, und Abtrennung der ausgefallenen Proteine durch herkömmliche Maßnahmen}III. Ausfällung der rohen AM-Proteaa· aus der Losung durch Zusatz mindestens eines mit Wasser Mischbaren organischen Lösungsmittels zur Lösung. . ·IV. teilweise Reinigung der rohen AM-Protease durch Chromatographie; undV. Reinigung der erhaltenen unreinen AH-Protease mittels einer Molekularsiebtechnik.3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fruchtkörper von Armillaria mellea ACC 3659 oder 3253 stammen.4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3« dadurch gekennzeich net, daß in der in Anspruch 2 angegebenen Stufe I die Fruchtkörper mit Wasser in einen mechanischen Mischer bei 2 bis 4°0 homogenisiert .werden und das resultierende Gemisch durch Filtration oder Zentrifugation getrennt wird.109116/18765. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die bei der genannten !Trennung erhaltene feste Phase entwederI. gefriergetrocknet, mit festem Kohlendioxid gemahlen und dann mit Wasser bei 2 bis 4°C extrahiert wird oderII. gemeinsam mit einem geeigneten Schleifmaterial, wie z.B. Sand, und mit Wasser bei 2 bis 4-0C gemahlen wird und das resultierende Gemisch durch Filtration oder Zentrifugation getrennt wird.6. Verfahren nach Anspruch 2, 4 oder 5» dadurch gekennzeichnet, daß die in Anspruch 2 angegebene Stufe I immer wenn möglich unter Stickstoff ausgeführt wird, und dass das Extraktionswasser mindestens einen Tyrosinaseinhibltor, beispielsweise Hatriumbenzoat oder tfatriumascorbat in einer-7> -4
10 bis 10 molaren Konzentration, enthält.7· Verfahren nach Anspruch 2, 4, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei der in Anspruch 2 angegebene Stufe I der erhaltene wässrige Extrakt zur Lagerung gefriergetrocknet wird.8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Stufe II das organische Lösungsmittel oder die organischen Lösungsmittel aus Alkanolen mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen und Alkanonen mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Äthanol, n-Propanol, Isopropanol oder Aceton, oder Gemischen daraus ausgewählt werden, wobei das Lösungsmittel gegebenenfalls auch noch einen Dialkyläther mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Diäthyläther, enthält, wobei das Verfahren bei -10 bis 100C und insbesondere bei -2 bis 2°C und be4-einem pH von 5 bis 7 ausgeführt wird und wobei die ausgefallenen unerwünschten Proteine durch übliche Methoden, wie z.B. Filtration oder Zentrifugation, entfernt werden.109816/18769· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe III das organische Lösungsmittel oder die organischen Lösungsmittel aus Alkanolen mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen und Alkanonen mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Äthanol, n-Propanol, Isopropanol oder Aceton, oder Gemischen derselben ausgewählt werden, wobei das Lösungsmittel gegebenenfalls auch einen Dialkyläther mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Diäthyläther, enthalt, wobei das Verfahren bei -10 bis 10°C und insbesondere bei -2 bis 2°C und bei einem pH von 5 bis ausgeführt wird, und wobei bei diesem Verfahren, die ausgefallene rohe AM-Protease durch irgendein herkömmliches Verfahren, wie z.B. filtration oder Zentrifugation, gesammelt wird, worauf sie gegebenenfallsjaber vorzugsweise mit einem " geeigneten Lösungsmittel, wie z.B. eiskaltes 70%iges (V/V) wässriges Äthanol, gewaschen wird.10. Verfahren nach Anspruch 9* dadurch gekennzeichnet, 4daß die erhaltene rohe AM-Protease entweder:I. in eiskaltem destillierten Wasser aufgelöst und dann gefriergetrocknet oder11. sukzessive bei -2 bis 20C mit trockenem Äthanol und Diäthyläther gewaschen und dann im Vakuum bei -2 bis 2°C getrocknet wird.II. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, i daß in Stufe IV die rohe AM-Protease durch Chromatographie auf einem chromatographischen Kationenaustauschmaterial, welches an eine Polysaccharidmatrix gebundene Carboxymethylradikale enthält, wie z.B. auf Carboxymethylcellulose, teilweise gereinigt wird, wobei das Material mit einem wässrigen Puffer von pH 5 bis 7, wie z.B. pH 6, bei ungefähr 2°C eluiert wird.109816/187612. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet daß die eluierten Fraktionen, die AM-Protease enthalten, durch Druckdialyse konzentriert werden.13· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe V die unreine AM-Protease mittels einer Molekularsiebtechnik bei ungefähr 2°C gereinigt wird, wobei eine Kolonne oder eine Membrane aus einem vernetzteil hydrophilen Polymer verwendet wird, das in Bezug auf ein Molekulargewipht von ungefähr 30.000 Molekularsiebeigenschaften aufweist.Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer ein veraetztes Dextran, ein Polyacrylamidgel oder eine Agarose verwendet wird15» Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die unreine AM-Pr<>tease in einem kleinen Volumen eines Puffers mit pH 6 bis 8 bei ungefähr 2°G aulgelöst wird und die resultierende Lösung bei ungefähr 20O auf eine Kolonne oder Membrane aufgegeben wird, und daß die Kolonne entweder mit dem gleichen oder mit einem ähnlichen Puffer bei ungefähr 2°C eluiert wird und das AM-Protease enthaltende Eluat durch Druckdialyse konzentriert wird, oder daß, im Falle einer Membrane, die verunreinigenden Proteine und der größte Teil des Lösungsmittels und des Elektroyts durch die Membrane hindurchgeföhrt werden und die resultierende Lösung von AM-Protease von der Aufbringseite der Membrane abgenommen wird.16. Verfahren nach Anspruch 15t dadurch gekennzeichnet, daß die resultierende Lösung von AM-Protease durch Druckdialyse konzentriert wird.17· Verfahren zur Herstellung von AM-Protease, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:109816/1876I. Homogenisierung von reifen Fruchtkörpern von Armillaria mellea mit Wasser in einem mechanischen Mischer bei 2 bis 4-0C, Trennung des resultierenden Gemische durch Filtration oder Zentrifugation, wodurch eine feste Phase und eine wässrige Phase (A) erhalten wird, und gegebenenfalls entweder (a) Gefriertrocknen der festen Phase, Mahlen des gefriergetrockneten Materials mit festem Kohlendioxid und Extraktion des resultierenden Materials mit Wasser bei 2 bis 4°O, um eine wässrige Phase (B) zu erhalten, oder (b) Mahlen der festen Phase mit Sand oder einem ähnlichen Schleif material und mit Vasser bei 2 bis 40C, und Trennen des resultierenden Gemische durch Filtration der Zentrifugation, wodurch eine wässrige Phase (C) erhalten wird; wobei gegebenenfalls (jimmer wenn möglich die Vorgänge unter (I) unter Stickstoff ausgeführt werden und das Extraktionswasser mindestens einen Tyrosinaseinhibitor, wie z.B. Hatriumbenzoat oder Batriumascorbat in 10 bis 10 molarer Konzentration, enthält;II. Ausfällung der unerwünschten verunreinigenden Proteine aus der wässrigen Phase (A), (B) oder (C) durch Zusatz mindestens eines organischen Lösungsmittels, nämlich eines Alkanols mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen oder eines Alkanons mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder Mischungen derselben, gegebenenfalls gemeinsam mit einem Dialkyläther mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen bei -2 bis 2°C und bei einem pH von 5 bis 7 t und Abtrennung der ausgefallenen unerwünschten Proteine durch Filtration oder Zentrifugation; um eine Lösung herzustellen, die AM-Protease enthält;III. Ausfällung von roher AM-Protease durch Zusatz zur AM-Protease enthaltenden Lösung von mindestens einem organischen Lösungsmittel, nämlich Alkanols mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen und Alkanone mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen sowie Gemische derselben, gegebenenfalls gemeinsam mit einem Dialkyläther mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen bei -2 bis 2°C und bei einem pH von 5 bis 7; und Sammeln der ausgefallenen rohen AM-Protease durch Filtration oder Zentrifugation; und gegebenen-109816/1876falls aber vorzugsweise Waschen der AM-Frotease mit eiskaltem 70%igen wässrigen Äthanol; und hierauf gegebenenfalls entweder (a) Auflösen der rohen AM-Frotease in eiskaltem destilliertem Wasser und Gefriertrocknung der Losung oder (b) aufeinanderfolgendes Waschen der rohen AM-Protease bei -2 bis 2°C mit trockenem Äthanol und Biäthyläther und Trocknen des Produkts ia Vakuum bei -2 bis 2°C;XY. teilweise Reinigung der AM-Frotease durch Chromatographie auf einem chromatographischen Kationenauatauachmaterial, welches Carobxymethylradikale enthält, die an eine Polysaccharide matrix gebunden sind, wie z.B. Carboxymethylcellulose, wobei das genannte Material mit einen wässrigen Puffer vom pH 5 bis 7, beispielsweise pH 6, bei ungefähr 2°C*eluiert wird; νφά Konzentration der eluierten Traktionen, die die All-Protease enthalten, durch Druckdialyse; undW Reinigung der auf diese Weise erhaltenen unreinen AM-Protease durch AufIosen in einem kleinen Volumen eines Puffers vom pH 6 bis 8 bei ungefähr 200C undAufbringen der resultierenden Lösung bei ungefähr 2°C auf eine Kolonne oder Membrane aus einem vernetzten hydrophilen Polymer, das in Bezug auf ein Molekulargewicht von ungefähr 30.000 Molekularsiebeigenschaften aufweist; und hierauf ent- L· weder Elution der Kolonne mit dea gleichen oder einem ähnlichen Puffer bei ungefähr 2°C und Konzentration des AM-Protease enthaltenden Eluats durch Druckdialyse oder, im Falle der genannten Membrane, Hindurchführen der verunreinigenden Proteine und des größten Teils des Lösungsmittels oder des Elektrolyts durch die Membrane und Rückgewinnung der resultierenden Lösung von AM-Frotease von der Aufbringseite der Membrane und gegebenenfalls Konzentration dieser Lösung durch Druckdialyse·109816/18761ε. Verfahren atur Herstellung von AM-Protease, dadurch gekennzeichnet, daß «an das Eforcel von Armillara mellea auf einem Hähnaedium bei ungefähr 25°O züchtet und hierauf die AM-Protease aus dem erhaltenen Itsrcel durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 17 isoliert, mit dem Unterschied, daß die reifen Fruehtkörper durch das erhaltene Israel ersetzt werden.19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Mycel durch eine Oberflächenkultur bei ungefähr 25°C auf einem Hais und Würze enthaltenden Nährmedium gezüchtet wird.20. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeich- i net, daß sie AM-Protease und ein inertes nicht-giftiges, pharmazeutisch zulässiges Terdünnungs- oder Trägermittel enthält.21. Zusammensetzung' nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet , daß sie eine für systemische intravenöse oder intraarteriale Infusion oder lokale intravenöse oder intraarteriale Injektion geeignete Form aufweist.22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Form einer sterilen injizierbaren wässrigen Lösung von AM-Protease aufweist.23· Lösung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß I sie 0,05 bis 1,0 ag AM-Protease/ml, beispielsweise 0,25 mg AM-Protease/ml, enthalt.24. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß sie das menschliche Plasma Albu- * rafcn enthält.25· Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie em bekanntes analgetisches Mittel enthält.109816/187626. Das Apoenzym, das der AM-Protease entspricht.27. Verfahren zur Herstellung des der AM-Protease entsprechenden Apoenzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man AM-Protease bei pH 0,7 mit einer 10 molaren Äthylendlamintetraessigsäure mit pH 7 beL ungefähr 40C behandelt und hierauf den Überschuß der genannten Säure durch Dialyse gegen 0,05 πι pH 7>^"Tris/HCl-Puffer entfernt. .28c Verfahren zur Herstellung einer modifizierten AM-Protease, dadurch gekennzeichnet, daß man das der AM-Protease entsprechende Apoenzym in einem wässrigen Medium mit Co++, Zn , Ni , Pe+ oder Cu"*'* behandelt.
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