DE2047317A1

DE2047317A1 - Enzyme

Info

Publication number: DE2047317A1
Application number: DE19702047317
Authority: DE
Inventors: Douglas Alderley Edge Turner Ralph William Cheadle Walton Peter Leslie Knutsford Cheshire Broadbent (Groß bntanmen)
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1969-09-26
Filing date: 1970-09-25
Publication date: 1971-04-15
Also published as: NL169499B; JPS529757B1; DE2047317B2; SE391931B; ES384010A1; CA921848A; FR2070093A1; NL7013461A; DK127189B; CH575963A5; IE34463L; FR2070093B1; IE34463B1; NL169499C; BE756369A; DE2047317C3; US3713981A

Description

Enzyme

Prioritäten: 26.9-1969 und 7.5.1970 - Großbritannien

Die Erfindung bezieht sich, auf Enzyme und insbesondere auf eine enzymische Substanz, die eine fibrinogenolytische Und fibrinolytische Aktivität besitzt» Die genannte enzymische Substanz besitzt auch Antikoagulationseffekte. Es wird angenommen, daß diese zum Teil ihren Grund in der fibrinogenolytiachen Aktivität (das heißt, daß die Antikoagulationseffekte anscheinend teilweise aus der Zerstörung von Fibrinogen und dem Inhibitionseffekt der Fibrinogenabbauprodukte auf die Bildung von Fibrin aua dem restlichen Fibrinogen
resultieren) und sum Teil in der Zerstörung anderer Koagulationsfaktoren, die gegenüber einem proteolytischen Angriff eopfindlich sind, wie z.B. die Faktoren Y und VIII, iiaben.

Es wurde gefunden, daß der reife FruchtkSrper oder
Hut des Pilzee Armillaria me)lea eine Quelle für

101816/1876

eine brauchbare enzymatische Substanz ist, welche den Gegenstand dieser Anmeldung bildet. Der Pilz Armillaria mellea wächst parasitär oder saprophytisch auf Bäumen und kommt überall in Großbritannien und anderen Ländern der Welt vor. Eine kurze Beschreibung des Pilzes ist wie folgt:

Hut 5-15 cm Durchmesser, zunächst rund, dann abgeflacht und u.U. in der Mitte eingeoenkt. Die Farbe variiert zwischen gelblich bis tief braun. Stengel 7»5~15 cm lang.und bis zu 13 mm dick. Ring weißlich. LammeIlen weißlich bis fleischfarben, angewachsen oder leicht am Stengel herablaufend. Sporen unter dem Mikroskop farblos, 8-9 x 5-6/fc. Um die enzymatische Substanz zu isolieren werden die Fruchtkörper am besten von ungefähr August bis zu den ersten Fröaten geerntet. Nach der Ernte sollen die Fruchtkörper bei ungefähr -25⁰C oder noch tiefer gelagert werden, bis das weiter unten beschriebene Isolationsverfahren ausgeführt wird.

Es wurde gefunden, daß die genannte enzymatische Substanz nicht von allen Species von Armillaria mellea erhältlich ist. Die genannte enzymatische Substanz wurde aus etwas mehr als einem Drittel (etwa 50 aus einer Gesamtzahl von annähernd 140) der Pilzproben erhalten, die 1969 in Großbritannien gesammelt wurden. Der Grund, warum ein Teil der Proben nicht die enzymatische Substanz lieferte,ist unbekannt. Species von Armiallaria mellea, die für die Öffentlichkeit zugängig sind und die die genannte enzymatische Substanz liefern, sind:

(1) die Species, die von Ministry of Technology, Forest Products Research Laboratories, Princes Risborough, Ayleebury, Buckinghamshire, England als FPHL 6H identifiziert worden ist und von dort auch allgemein erhältlich ist (Nummerierung durch die Anmelderin: AGC 3659); und

(2) die Species, die durch das Centraalbüro voor Scnimmelculturee, Ba&rn, Niederlande einfach als "Armillaria mellea" identifiziert wurde und von dort allgemein erhätlich ist (Nummerierung der Anmelderin: ACC 3253)·

108818/1876

So wird also gemäß der Erfindung eine enzymatisch^ Substanz vorgeschlagen, bei der es sich tun eine Peptidyl-Peptid-Hydrolase (syn. Peptid-Peptido-Hydrolase) handelt, und die in dieser Beschreibung als "AM-Protease¹¹ bezeichnet wird. AM-Proteaee besitzt die folgenden charakteristischen Eigenschaften:

(1) Sie katalysiert den hydrolytischen Abbau von Fibrinogen ' und Fibrin (das heißt, daß sie fibrinogenolytische und fibrinolytische Aktivität zeigt). Die Aktivität von AM-Protease wurde in vitro durch die folgenden bekannten Tests bestimmt:

(a) Inkubation von AM-Protease mit gereinigtem Fibrinogen

und Zusatz von Thrombin zu entnommenen Proben in bestimm- f ten Zeitabständen. Die Zeit, die für den Verlust der Gerinnungefunktion erforderlich ist, ist ein Maß für die fibrinogenolytische Aktivität.

(b) Inkubation von vorher hergestelltem Fibringerinsel mit AM-Protease und Messung der Geschwindigkeit des Verschwindens des Gerinseis. Diese Messung kann dadurch erleichtert werden, daß man Gerinsel aus mit J ^y markiertere Fibrinogen herstellt und das Nachlassen der I ,.dioaktivität mißt. Dies gibt ein Maß für die flbrinolytische Aktivität.

(c) Zusammenmischen von AM-Protease, Thrombin und Fibrinogen

und Beobachtung der Lebensdauer des so gebildeten Gerin- \ sols. Dies gibt ein Maß für die fibrinogenolytische und fibrinoIytische Aktivität von AH-Protease.

In vivo wird die Aktivität von AM-Protease an Versuchstieren (Xaninchen) dadurch bestimmt, daß ihr Effekt auf den Fibrinogenspiegel in Tieren und auf den Proteasespiegel im Plasma gemessen wird. Der erstere Effekt kann dadurch bestimmt werden, da3 nan die Verlängerung der Gerinnungszeit des gesamten Bluts oder des Plasmas gegenüber der Vergleichs- oder Vor-'bPLandliingsgorinnzeit nach Zugabe einer* Standardmenge Thrombin mißt. Der· letztere Effekt kann durch ein ähnliches Ver~

109816/1876

fahren gemessen werden, wie es in 1(b) angegeben ist.

(2) AM-Proteaae verhält eich beim Durchgang durch eine Kolonne aus vernetzten! Doxtran-Gel ("Sephadex" G I5O; "Sephadex" ist ein Walirenieichen), welches für Proteine mit einem Molekulargewicht "bis zu 400.000 durchlässig ist, als einzige Komponente. Das Volumen des Puffers (Eluationsmittel), in welchem AN-I⁵ToI;ease aus der Kolonne austritt, entspricht demjenigen, das erforderlich ist, ein Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 30.000 zu eluieren. Das genannte Eluationsmittel ist ein 0,3m NaCl 0,05m pH 7,4 Trls/HCl-Puffer, welcher die folgende Zusammensetzung aufweist (und mit dem die Elution bei ungefähr 2°C ausgeführt wird):

Natriumchlorid 17,5 g/l in Wasser

Trie(hydroxymethyl)aminomethan 6,05 g/l in Wasser ausreichend m Salzsäure, so daß

ein pH von 7_f4 erzielt wird.

(3) AM-Protease verhält sich in der Zelle einer analytischen

4
ultrazentrifuge bei 26 χ 10 g als einzige Komponente ο Der

Sedimentationskoefficient von AM-Protease im 0,3 m NaCl 0,05m pH 7,4 Tris/HCl-Puffer (siehe oben (2)) beträgt bei 20⁰C,das ist der S₂₀W-Wert, ungefähr 2,35 x 10"¹⁵ sek.

(4) Bei Elektrophorese von AM-Protease in Polyacrylamid-Gel ist offensichtlich nur eine Komponente vorhanden, und diese Komponente besitzt eine Wanderung entsprechend einem γ -Globulin. Das Polyacrylamid-Gel hatte ein Acrylamid / Bieacrylaraid-Verhältnis von 150:1. Die Elektrophorese wurde ungefähr 1 st bei 2 mA/cm ausgeführt. Der verwendete Puffer (pH 4,3, ß-Alariin/Essigsäure (0,3m)) bestand aus ß-Alanin (26,73 g/l in Wasser) und war durch Zusatz von Eisessig auf pH 4,3 eingestellt.

(5) Die N-öndständige Aminosäure von AM-Protease ist Isoleucin.

109816/1876

(6) Ar'I~E'Fobüa3e baut boL pH V Lei.chb Cawain ab uud bildsb Bruchs bücke, die in Trlehioressigaaure Löslich a.Lnd. Dot* rad icb viel kleiner a La derjenige, der durch Chymotrypsin oder Plasmin erzeugt wird, CLe vorurhachb einen geringen Abbau dan Berunus Albumin oder /'--IrLo-buLLn, auch böi Längsi'or Enkubablon. GLe vßE'uraaohb ei. nun starken Abbau von FibcLnogen. SLe hub koine V/irkung auf nl> >·· drLgai' li'.oiükulare oubübrabö (boiupiüLav/eiat) ιΐ-ίΓ-ActibyLgLy u.y L- · [«■- i'/u) l.n-me biiy Los be ν, Ä---N-Ace by L-L- Jyss in-me thy Loü bu r, <" -ti-ρ -¹L¹O L uo Lfjul f ony L-L-rir.'fcj; \ riin-uo thy Lon lav, «,-if-Ace Ij L-L-b.yr:)£iLn-äbh.ylosfcer oder L-Trypbophari-äbhyloaLor) _; welch« χα · wohnlich dazu verwendet; würden, l.ryp;jLi»uⁱt;Lyf.v oder sLnarfc.ig;« Kn'iyme zu char.ikberialoren. i>io wiokb auf die ß-Kette vou oxidiertö:n Insul.in, wobei dio foigüiwlen gruppen in Erscheinung broben: 'L'yroain, Lysin und in

Ausmaß Leucin. Tn dioav3r Hin.'ii.ohfc untfcrncheLdeb sie sich (aAehe oben"¹ von Trypsin und Chymotrypsin.

Wenn sie durch, das in der Folge beschriebene Isolabionaver■· fahren erhalten worden isb, dann erscheint AM-Protease als im wesentlichen homogen, wenn die üblichen biophysikalischen Kriterien herangezogen werden,· das heißt Sedimentationseigenschaften, elektrophoretische Eigenschaften und Verhalten bei Gelfiltration und in Ionenaustauschkolormen» In allen Fällen zeigt sich die Homogenität durch das Auftreten einer schmalen Proteinzone, welche eine symmetrische, nahezu *

Gauss^%ache Verteilung um eine Spitze hat. Trotzdem ist es möglich, daß AM-Protease eine Mischung aus nahe verwandten isofunktioneilen Enzymen ist.

Geaäß der Erfindung wird weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von AM-Protease vorgeschlagen, welches die folgenden Stufen umfaßt:

X. Mahlen oder anderweitige Zerkleinerung von reifen Fruchtkörpern von Armillaria mellea und Extraktion dieses Materials mit Wasser, um einen wässrigen Extrakt heratistellen;

109816/1876

BAD OFUGtNAl

IL.Au«füllung unerwünscht bor verunreinigender Probelno aus dem wUi)iir.'i.gen Extrakt mittel.« mlndeaberia einem mit Weaser mischbaren organischen Lösungiimi t;t;eL hui ο ine ic* geeigneten Temperatur, bei einem geeigneten pil und bei eLnor geeigneten IonenkouKtm bra tion, und Abtrennung dor ausgefallenen Fro to.ine durch horiröifimilohe

EL L, Auijfäl lung dm- rohen AN-Protftase aus der Lösung durch ZusfttK mindestens tiitie-.j mil. Wasser mischbaren organisc-hon Lo--.umgfnnlbboLii zur Lorning (d.h. zur Lösung, die nach der Abtrennung dar unerwüniKJhbon Proteine bei (2) zurückbleibt);

~ E¹/. U;llwi>iiie Reinigung der rohou AM-Procease durch Chroma to-~ ^ graphIe; und

V. Peinigung der erhaltenen unreinen AM-Proteaee mittels einer Molekularsiebtechnik.

Ea wird darauf hingewiesen, daß, sofern nichts anderes ange geben ist, alle obigen Stufen bei einer Temperatur von ungefähr 2°0 ausgeführt werden. Die obigen Stufen werden nun genauer behandelt·

I Wie bereite erwähnt befinden sich die Fruchtkörper von Armillaria me1lea während des Spätsommers und Herbsts im } richtigen Beifestadium. In Großbritannien reifen sie in der Zeit vom August bis zum November. In diesem Zustand sind die Fruchtkörper gelb bis tiefbraun und ziemlich flach oder leicht eingesenkt. Wie bereits erwähnt sind die Fruchtkörper, die von den öffentlich zugänglichen Species ACC 3659 (FPRL 6H) und ACC 3253 ("Armillaria mellea" von Centraabureau voor Schimmelculturea, Baarn, Niederlande) Quellen für AM-Protease.

Die reif en _m Fruchtkörper können cait V/asser in einem mechanischen Mischer bei 2 bis 4-⁰C homogenisiert v/erdsn. Das resultierende

109816/1876

BAD

i/'.Hi;

Gemisch wire! dann durch Filtration oder Zeufcrifugation getrennt, und beide Phasen (d.h. die feat« Phoae und die wässrig« Phase) werden aufbewahrt« Der grüßt« Teil der AM-Proteaso geilt bei dieser Stufe in die wäsariße Phesc. Gegebenenfalls wird die feste Phase entweder (a; ßßfriorgotrocknet, mit festem Kohlendioxid gemahlen und dann mit Wasser von 2 his 4⁰C extinhiert oder (b") gemeinsam mit ednem geeigneten Schleif-, mitte 1 j wie z.B. Sand, und mit Wasser von 2 bis 4°C gemahlen!, worauf dann das resultierende Gemisch durch Filtration oder Sent.r.1 fugatior getrennt wird. In ,-jedem Fall wird etwas AM-Protenae im zweiten wässrigen Extrakt erholten. Der wässrige Extrakt oder die kombinierten wässrigen Extrakte, ^enachdem, wird bi'iw. werden dann zur Lagerung gefriergetrocknet oder direkt in der Stufe (2.) verwendet. Der wässrige Extrakt kann i in einem gewisser, Ausmag dunkel werden. Dies hat seinen ^runr*. vermutlich in der Wirkung einer Polyphenoloxidase« Dieses Dunkelwerden kann dadurch verhindert werden, daß man iain3r wenn möglich unter Stickstoff arbeitet und dem Extraktionswasser mindestens einen Tyrosinaseinhibitor zusetzt, wie z.B. Natriumbenzoat oder Natriumsscorbat in einer 10 - bis 10 molaren Konzentration.

II. Mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, die zum Ausfallen der unerwünschten Proteine verwendet werden können, sind z.B. Alkenole mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen oder Alkanone mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Äthanol, n-Propanol, Isopropanol oder Aceton, sowie Mischungen, derselben. Diese organischen Lösungsmittel können gegebenenfalls gemeinsam mit einem Dialkyläther mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Dläthyläther, verwendet werden. Die Ausfällung wird im allgemeinen bei -10 bis l.o°C und insbesondere bei -2 bis 2⁰C und bei einem pH von 5 bis 7, ^e nach dem verwendeten Lösungsmittel, ausgeführt. Ein Überschuß sii Lösungsmittel sollte nicht verwendet worden^ da hierdurch, nicht nur die unerwünschten Proteine sondern auch All-Protease selbst ausgefällt wird. Die unerwünschten Protoino werden durch, ein herkömr-lichr-s Yar.iV/liren, wie z.B.

109816/1876

BAD

durch Filtration oder Zentrifugieren, abgetrennt.

III. Geeignete organische Lösungsmittel für die Ausfällung der rohen AM-Protease sind diejenigen, die unter (II.) erwähnt wurden. Es werden auch ähnliche Temperatur- und pH-Bedingungen wie unter (II.) verwendet. Die rohe AM-Protease, die ausgefällt wird, wird durch irgendein herkömmliches Verfahren, wie z.B. Filtration oder Zentrifugetion, gesammelt,, worauf sie vorzugsweise mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie z.B. eiskaltes 70%iges wässriges Äthanol, gewaschen wird. Die rohe AM-Protease wird dann gegebenenfalls (a) in eiskaltem destllierten Wasser aufgelöst und gefriergetrocknet oder (b) aufeinanderfolgend bei -2 bis 2⁰C mit trockenem Äthanol und Difithyläther gewaschen und dann bei -2 bis 2°G im Vakuum getrocknet.

IV. Die auf diese Weise erhaltene rohe AM-Protease enthält nachwievor verhältnismäßig große Menge unerwünschter Proteine, von denen einige unter Ausnutzung der unterschiedlichen Affinitäten von AM-Protease und der unerwünschten Proteine gegenüber chromatographischen Kationenaustauschmaterialien abgetrennt werden können, wie z.B. Materialien, die Carboxymethylradikale enthalten, die an eine PoIyeaccharidmatrixgebunden sind, wie z.B. Carboxymethvlcellulose. Die Kolonne wird mit einem wässrigen Puffer von pH 5 bis 7i wie z.B. pH 6, und bei einer Temperatur von ungefähr 2°C eluiert. Allgemein gesagt, die unreine AM-Protease, die auf diese Welse erhalten wird (welche noch etwas unerwünschte Proteine enthält) wird nach der Hauptspitze der unerwünschten Proteine eluiert. Die eluierten Fraktionen, die unreine AM-Protease enthalten, können beispielsweise durch Druckdialyse konzentriert werden.

V. Die verbleibenden unerwünschten proteinhaltigen Verunreinigungen werden aus der unreinen AM-Protease mittels einer Molekularsiebtechnik bei ungefähr 2°0 entfernt,wo-

aus bei eine Kolonne oder eine Membrane! eine^ vernetzten

109816/1876

hydrophilen Polymer verwendet wird, das In Bezug auf ein Molekulargewicht von ungefähr 30.000 Molekularsiebeigenschaften besitzt. Geeignete polymere Materialien sind z.B. die vernetzten Dextrane, wie z.B. "S ephadex" (Warenzeichen) G75» Polyacrylamid-Gel, wie z.B. "Bio-Gel" (Warenzeichen), und Agarosen, wie z.B. "Sagarose" (Warenzeichen) oder "Sepharose" (Warenzeichen). Die unreine AM-Protease aus der Stufe (IV) wird in einem kleinen Volumen eines Puffers mit pH 6 bis 8, beispielsweise pH 7, wie z.B. einem pH 7 0,3m Hatriumchlorid/Phosphat-Puffer, bei ungefähr 2°0 aufgelöst und die Lösung wird auf die Kolonne oder Membrane bei ungefähr 2°C aufgebracht. Die Kolonne wird dann mit dem gleichen oder mit einem ähnlichen Puffer bei ungefähr 2°C eluiert, worauf die AM-Protease vor den verunreinigenden Proteinen eluiert wird. Das Eluat, welches die AM-Protease enthält, kann durch. Druckdialyse konzentriert werden. Im Falle einer Membrane, die Proteine enthält, gehen. Lösungsmittel und Elektrolyt durch die Membrane hindurch, während die AM-Protease nicht hindurchgeht. Es wird bevorzugt zu verhindern, daß die AM-Protease vollständig austrocknet, da es sonst schwierig ist, sie von der Membrane zu entfernen. Die Lösung der AM-Protease an der Aufbringseite der Membrane kann durch Druckdialyse konzentriert werden.

Gemäß der Erfindung wird weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von AM-Pro^ease vorgeschlagen, welches die folgenden Stufen aufweist:

I. Homogenisierung von reifen Fruchtkörpern von Armillaria mellea mit Wasser in einem mechanischen Mischer bei 2 bis 4⁰C, Trennung des resultierenden Gemische durch Filtration oder Zentrifugetion, wodurch eine feste Phase und eine wässrige Phase (A) erhalten wird, nod gegebenenfalls entweder (a) Ge» friertrocknen der festen Phase, Mahlen des gefriergetrockneten Materials mit festem Kohlendioxid und Extraktion des resultierenden Materials mit Wasser bei 2 bis 4°0,um eine wässrige Phase (B) zu erhalten, oder (b) Mahlen der festen Phase mit Sand oder einen ähnlichen Schleifmaterial und mit

109818/1876

- ίο -

Wasser bei 2 bis 4-⁰C, und Trennen des resultierenden Gemische durch Filtration oder Zentrifugation, wodurch eine wässrige Phase (C) erhalten wird; wobei gegebenenfalls immer wenn möglich die Vorgänge unter (l) unter Stickstoff ausgeführt werden und das Extraktioaawaaeer mindestens einen üjyrosinaseinhibitor, wie z.B. ffatkumbenzoat oder Hatriumascorbat in 10"* bis 1(T⁴ molarer Konzentration enthält;

II. Ausfällung der unerwünschten verunreinigenden Proteine aus der wässrigen Phase (A), (B) oder (C) durch Zusatz mindestens eines organischen Lösungsmittels, nämlich eines Alkanols mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen oder eines Alkanons mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder Mischungen derselben, gegebenenfalls gemeinsam mit einem Dialkyläther mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen bei -2 bis 2°C und bei einem pH von 5 bis 7; und Abtrennung der ausgefallenen unerwünschten Proteine durch Filtration oder Zentrifugation; um eine Lösung herzustellen, die AM-Protease enthält;

III. Ausfällung von roher AM-Protease durch Zusatz zur AM-Protease enthaltenden Losung von mindestens einem organischen Lösungsmittel, nämlich Alkenole mit bis su 3 Kohlenstoffatomen und Alkanone mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen sowie Gemische derselben, gegebenenfalls gemeinsam mit einem Dialkyläther mit bis zu 5 Kohlenetoffatomen bei-2 bis 2°G und bei einem pH von 5 bis 7; und Sammeln der ausgefallenen rohen. AM- . * κ gegebenenfalls aber

Protease durch Filtration oder Zentrifugation; undI vorzugsweise Waschen der AM-Protease mit eiskaltem 70%igen wässrigen Äthanol; und hierauf gegebenenfalls entweder (a) Auflösen der rohen AM-Protease in eiskaltem destillierten Wasser und Gefriertrocknung der Lösung oder (b) aufeinanderfolgendes Waschen der rohen AM-Protease bei -2 bis 2°C mit trockenem Äthanol und Diäthyläther und Trocknen des Produkte im Vakuum bei -2 bis 2°C;

IV. teilweise Reinigung der AM-Protease durch Chromatographie

109*16/1*71

-4!

auf einem ehr oma to graphischen Kationentuistauschmaterial, welches Carboücymeth^lradikale enthält, die an eine Polysaocharidrnatrix gebunden sind, wie z.B. Carboscyrcechylcellulosa; wobei das genannte Material mit einem wässrigen Fuffer vow pH 5 bis 7i beispielsweise pH 6, bei ungefähr 2°G eluiert wild; und Konzentraticm der eluierten Fraktionen, die die AM-Protease enthalten, durch Druckdialyse; und

V* Reinigung der auf dies« Weise erhaltenen unrei.nen AM-Protease durch Auflösen in einem·kleinen Volumen eines Puffers vom pE 6 bis 8, beispielsweise pH 7t bei ungefähr 2°0 und Aufbringen der resultierenden Lösung bei ungefähr 2⁰C auf eine Kolonne oder Membrane aus einem vernetzten hydrophilen Polymer, das in Bezug auf ein Molekulargewicht von ungefähr | 30.000 Molekular&iebeigenschaften aufweist; und hierauf entweder Elution der Kolonne mit dem gleichen oder einem ähnlichen Puffer bei ungefähr 2°G und Konzentration des AM-Proteatse enthaltenden Eluats durch Druckdialyse oder, im Falle der genannten Membrane, Hindurchführen der verunreinigenden Proteine und des größten Teils des Lösungsmittels und des Elektrolyts durch die Membrane und Bückgewinnung der resultierenden Lösung von AM-Protease von der Aufbringseite der Membrane und gegebenenfalls Konzentration dieser Lösurg durch Druckdialyse.

Gemäß der Erfindung wird weiterhin _vein Verfahren zur Herstellung von AM-Frotease vorgeschlagen, bei welchem das I Mycel von Armillaria mellea auf einem Nährmedium bei ungefähr 25°0 gezüchtet und dann die AM-Protease aus dem resultierenden Mycel durch eines der oben beschriebenen Verfahren isoliert wird, wobei der Unterschied darin besteht, daß die reifen JPruchtkorper durch das erhaltene Mycel ersetzt werden.

Das Mycel "kann durch Oberflächenkultur bei 25°C auf einen Kährraedium gezüchtet werden, das Mals und Würze enthält.

109816/1876

Als geeignete Species von Armillaria mellea sollen beispielsweise diejenigen erwähnt werden, die von der Anmelderin mit ACC 3253 und 3659 bezeichnet wurden·

Die AM-Protease v/ird vorzugsweise in wässriger Lösung bei ungefähr -25°0 gelagert.

Gemäß der Erfindung werden weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen vorgeschlagen« die AM-Protease und ein inertes, nicht-giftiges, pharmazeutisch brauchbares Verdünnungsmittel . oder Trägermitte] enthalten.

Die genannten pharmazeutischen Zusammensetzungen können eine Fora aufweisen, die sich für systemische intravenöse oder intraarteriale Infusion oder lokale intravenöse oder intraarteriale Injektion eignen. Geeignete Zusammensetzungen sdnd sterile injizierbare wässrige Lösungen, die 0,05 bis 1,0 mg AM-Protease/ml, beispielsweise 0,25 mg AK-Protease/mlienthalten. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten übliche Verdünnungsmittel oder Träger und können durch übliche Verfahren hergestellt werden. Sie enthalten gegebenenfalls ein Stabilisierungsmittel, wie z.B. das menschliche Plasma Albumin, und sie können gegebenenfalls auch bekannte analgetiache Mittel enthalten.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können für folgendes verwendet werden:

(1) die Behandlung von arterieller Thrombose;

(2) die Behandlung von arterieller Eabolia, wie z.B. Embolie in den Renalarterien oder mesenteriechen Arterien und insbesondere in den Beinarterien und in der Aorta an der Eifurkation;

(3) die Behandlung von Tiefvenenthrombose; und

(4) die Behandlung von Pulmonarembolie

109816/1876

Es erscheint zweckmäßig, die Verwendungsweise der All-Protease in Beaug auf die (a) systemische Therapie und die (b) lokale intravaskulare Perfusion zu diskutieren.

(a) Systemische Therapie mit AM-Protease.

Die Resistenz des menschlichen Tlasmaa gegenüber AM-Protease ändert sich von Individuum zu Individuum und zwischen Tieren verschiedener Species. Die Resistenz ändert sich auch bei den einzelnen menschlichen Patienten während der systetiischen Behandlung mit AM-Protease. Eine Beladungsdosis ist erforderlich, um den größten Teil des im Kreislauf befindlichen Inhibitors λ auszuschalten. Diese Dosis wird hauptsächlich durch vorherige Titration des Plasmas des Patienten in vitro und such durch Titration in vivo bestimmt, indem die Reaktion von steigenden Fraktionen der gewählten Dosis an AH-Protease während der intravenösen Infusion beobachtet wird. Die Reaktion,die gemessen wird, ist die Verlängerung der Gerinnungezeit, die durch die AM-Protease hervorgerufen wird, die einen Über schuß gegenüber der von dem Inhibitor beeinflußten darstellt. In den meisten Fällen beträgt diese Beladungsdosis 0,05 bis 5 mgAg/st Att-Proteaee.

Wenn eine optimale AM-Protease-Plasmaaktivität erzeugt ist, dann muß diese durch intermittierende intravenöse Dosierung \ von AM-Protease aufrechterhalten werden. Dies ist nötig, da anscheinend Inhibitor in den Kreislauf zurückkehrt, der verursacht, daß die Gerinnungszeiten sich wieder auf die normalen Werue einstellen, was einen Verlust von enzymatischer Aktivität anzeigt. Es wurde beobachtet, daß die thrömbolytische Aktivität aufrechterhalten wird, wenn man annähernd 10$ der Anfangsdosis der AH-Protease stündlich während der nächsäen 2 st verabreicht und wenn man hierauf auf weniger als Λ% der Anfangsdose an AM-Protease alle 2 bis 3 st zurückgeht. Die Verringerung der Dosis, die erforderlich ist, die Aktivität aufrecht zu erhalten, hat ihren Grund vermutlich in einem Abfall der Geschwindigkeit der

109816/1S76

Rückkehr des Inhibitors in den Kreislauf. Die Dauer der Behandlung mit AH-Protease hängt vom Alter der Thrombose oder der Thrombosen und ihrer Größe ab. Die systemische Behandlung wird solange fortgesetzt, bis es Anzeichen einer klinischen Verbesserung gibt, d.h. Bäckkehr der Pulsation und Verbesserung der Farbe des Glieds, In welchem der Kreislauf durch eine Arterienthromboee beeinflußt war.

(b) Lokale intravaskulare Perfusion von AM-Protease.

Eine lokale Perfusion von AW-Protease ist in den Fällen angezeigt, in denen eine thrombotische Occlusion einer großen perlphären Vene besteht oder in thrombosierten Gefäßen, die bei der ScribnezvUmleitung für Hierendialyse verwendet werden, oder in einem geeigneten Segment einer Arterie, die durch eine Thrombose blockiert worden 1st. Ein solches Verfahren zur lokalen Perfusion besltst den Vorteil, daß die verwendete Dosis beträchtlich geringer ist als bei der systemischen Therapie, d.h. etwa 1/10 bis 1/100 dar systemischen Dosis. Auch besteht keine Notwendigkeit den Inhibitorspiegel im Blut des Patienten tu bestimmen. Es kann deshalb eine Standarddosis gegeben werden, beispielsweise können 5 bis 10 ml (enthaltend 1/80 bis 1/100 der systemischen Dosis) in einen Katheter injiziert werden, der sich in einem Teil der Vene befindet, der distal zur Occlusion liegt. Dieser kann 10 min belassen werden, bevor der Inhalt des Katheters angesaugt wird. Dieses Verfahren wird 2- oder 3mal wiederholt und In den meisten Fällen ist dann die Thrombose aufgelöst. Das gleiche Verfahren kann für eine zugängige Arterie verwendet werden, die durch eine Thrombose vollständig occludiert ist, wobei der Unterschied jedoch darin steht, daß der Katheter nahe beim occludierten Abschnitt eingeführt wird.

Die von Armillaria mellea erhaltene AM-Protease enthält ein Metall. Es'wurde gefunden, daß die Anwesenheit eines Metalls,

109816/1878

aber nicht unbedingt das Metall, das in der von Armillaria mellea erhaltenes. Substanz vorliegt, für die enzymatische Aktivität wesentlich ist. Das Apoenzya kann erhalten werden durch Behandlung des Haloenzyms, d.h. AM-Protease, mit 10"** m Ethylendiamintetraessigsäure CpE 7) während 30 min bei 4-⁰C. Die überschüssige Ethylendiamintetraessigsäure wird durch Dialyse gegen einen 0,05 m pH 7 A Tris/HOl-Puffer beseitigt, der die folgende Zusammensetzung besitzt:

Trie(hydroxymethyl)aminomethan 6,05 g/l in Wasser ausreichend m Salzsäure, so daß pH 7 entsteht.

Die enzymatische Aktivität kann durch Behandlung des Apoenzyms in einen wässrigen Medium mit 0o⁺⁺, Zn⁺⁺, Hi⁺⁺, Fe⁺⁺ und (in diesen Fall wird die enzymatische Aktivität wieder in geringeren Ausmaß zurückerhalten) Gu⁺⁺ wieder hergestellt werden; die durch diese Behandlung erhaltenen Produkte werden in der folge als "modifizierte AM-Proteasen" bezeichnet.

Gemäß der Erfindung wird weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung vorgeschlagen, die modifizierte AM-Protease und ein inertes, nicht-giftiges, pharmazeutisch zulässiges Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.

Geeignete Zusammensetzungen und Verabreichungsweisen sind diejenigen Zusammensetzungen und Verabreichungsweisen die f oben bei der AH-Protease selbst beschrieben wurden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

109816/1876

Beispiel 1 Strife I

100 g reife leuchtkörper von Armillaria mellea wurden in einem M.S.E.-ⁿAtomix"-ttLscher ("Atomix" ist ein Warenzeichen) bei 2°C mit 130 ml Wasser homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit weiteren 150 ml Wasser gemischt, das Gemisch wurde bei 2°0 30 min gerührt und dann zentrifugiert. Das Zentrifugat (flüssige Phase) wurde bei 2°C gehalten, bis die weitere Verarbeitung durchgeführt wurde (siehe unten). Der feste Rückstand wurde gefriergetrocknet» das Produkt wurde mit festem Kohlendioxid in ein feineres Pulver gemahlen, das Gemisch wurde mit 150 ml Wasser bei 2°0 extrahiert, und der Extrakt wurde zentrifugiert. Das Zentrifugat (flüssige Phase) wurde mit dem oben erwähnten Zentrifugat vereinigt. (Kommentar zu dieser Stufe: Der wässrige Extrakt kann direkt in der nächsten Stufe verwendet oder zur Lagerung gefriergetrocknet werden. Der größte Teil der AM-Protease, ungefähr t werden bei der Homogenisation mit Wasser extrahiert).

Stufe II

Die wässrige Lösung wurde mit m Essigsäure auf pH 6,0 eingestellt und die Lösung wurde in einem Kühlbad auf 2°C abgekühlt. 450 ml Äthanol mit 2°C wurden langsam der wässrigen Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde während dieser Zugabe gut gerührt, wobei jedoch darauf geachtet wurde, ein Schäumen zu vermeiden. Die Temperatur wurde auf 2⁰C gehalten. Nach beendeter Zugabe wurde das Gemisch 1 st auf 2°C gehalten und die Ausfällung, die eich gebildet hatte, wurde durch Zentrifugation (2000 g) während 30 min bei 2°C abgetrennt. Der feste Bückstand wurde verworfen, und das Zentrifugat wurde in der Stufe III verwendet.

Stufe III

Das Zentrifugat aus der Stufe II wurde in ein Kühlbad eingebracht und 450 ml Äthanol wurden langsam zugegeben.

109816/1876

Die Temperatur wurde während dieser Zugabe auf -5°C fallen gelassen. Wie in der Stufe II wurde das Gemisch gut gerührt, wobei jedoch ein Schäumen vermieden wurde. Fach beendeter Zugabe wurde das Gemisch 1 st bei -5°C gerührt. Es wurde dann zentrifugiert und das Zentrifuget wurde verworfen. Der feste Bückstand wurde in 75 al einer Mischung aus 70 Vol.-% Äthanol und 30 Vol.-56 Wasser bei -5°C suspendiert und die Suspension wurde zentrifugiert. Der feste Bückstand wurde bei 2°C in 30 ml Wasser aufgelöst, die,Lösung wurde einer Hülsengefrierung bel-70°C zugeführt und|gefriergetrocknet. (Kommentar zu dieser Stufe: Ungefähr 90 bis 95% der Ausgangsaktivität werden in dieser Stufe zurückerhalten, und das gefriergetrocknete Material stellt etwa 5 Gew.~% des festen Ausgangsmaterials in dieser Stufe dar, d'.h* desjenigen, das aus dem wässrigen Extrakt erhalten worden war).

Stufe IV

100 g mikrogranulare "Whatman"-Carboxymethylcellulose (CM 52; "Whatman" ist ein Warenzeichen) wurden mit einem pH 6,0 0,025 m Katriumcitrat-Puffer gewaschen bis die Waschflüssigkeiten einen pH von 6,0 besaßen. Der Puffer war dadurch hergestellt worden, daß eine Lösung von 7,35 g/l Trinatriumcitrat-dihydrat in Wasser durch Zugabe.von 2 m Salzsäure auf pH 6,0 eingestellt wurde. Die ins Gleichgewicht gebrachte Carboxymethylcellulose wurde dann in eine 2,5 x 30 cm-Kolonne eingebracht. 2 al einer Lösung von 200 mg des gefriergetrockneten Produkte der Stufe III im oben erwähnten Citratpuffer wurden in die Kolonne bei 2°C eingebracht. Die Kolonne wurde bei 2⁰C mit dem Citratpuffer, der in einer Menge von ungefähr 20 ml/st verwendet wurde, eluiert, und 5 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Das Eluat wurde auf Lichtabsorbtion bei 28OmA. untersucht. Hierdurch wurden alle Proteinspitzen ermittelt (Proteine zeigen eine Spitzenabsorbtion bei 280 m/t ). Die enzymatisch Aktivität, d.h. die proteolytische Aktivität, wurde durch das unter(l)(c) angegebene Verfahren ermittelt. Eine große Spitze eines

101816/1876

UV-absorbierenden Material·, das keine proteolytische Aktivität zeigte, ging den proteolytisch aktiven Fraktionen (d.h. die Jenigen, die AW-Proteaae enthalten) vorher, und an den letzteren Fraktionen echloß sich, weiteres UV-absorbierendes, nioht-proteolytisches Material an. Die zusammengefaßten Fraktionen wurden durch Druckdialyse bei 2⁰C tanter Verwendung von ⁿAmioon^R UNIO-Membranen ("Amicon" ist ein Warenzeichen) konzentriert. (Kommentar zu dieser Stufe: In Abhängigkeit von der Qualität der Carboxymethylcellulose, die sich etwas ändert, kann das proteinhaltige Material einschließlich AM-Protease als diskrete Spitze mit einer ungefähr 20-fachen Reinigung oder, sofern ungünstigere Bedingungen herrschen, mit einer 5- bis 10-fachen Reinigung erhalten werden. Bis zu 90% der auf die Kolonne aufgegebenen AM-Protease werden zurückerhalten· Es kann notig sein, die Salzkonzentration des Eluiermittele zu ändern, um die variablen Eigenschaften von verschiedenen Lieferungen der Carboxymethylcellulose. zu kompensieren).

Stufe Y

10 g "Sephadex" G75 ("Sephadex" ist ein eingetragenes Warenzeichen) in Ferienform wurden 24 st in einem Überschuß eines 0,15 a Natriumchlorid 0,05m Natriumphosphat-Puffers mit einem pH von 7,0 quellen gelassen· Dieser Puffer besaß die folgende Zusammensetzung:

Natriumchlorid 8,53 g/l in Wasser

Natrium-dihydrogen-phoephat-dihy- „ ₈ ,_χ ^ _Wasser drat ' ⁶^

Lösung mit 2m Natriumhydroxidlösung auf pH 7,0 eingestellt.

Das gequollene Material wurde in eine 1,5 x 20 cm-Kolonne gepackt, und die Kolonne wurde mit ungefähr 100 ml Phoaphatpuffer alt 2°C 2 et lang gewaschen. 2 ml der konzentrierten Probe des Eluats der Stufe IY wurden auf die Kolonne aufgegeben: Die Kolonne wurde bei 2°C mit dem obigen Phosphatpuüfer bei ungefähr 20 ml/st eluiert, und es wurden

109116/1876

2 ml-Fraktion gesammelt. Die proteolytische Aktivität der Fraktionen wurde wie oben bei Stufe IT ermittelt, und die Aktivität wurde in der ersten Spitze des eluierten Proteins gefunden. Hieran schloß sich eine weitere Proteinspitze an, die nicht proteolytisch war. Die aktiven Fraktionen wurden kombiniert, gegen Wasser mit 2°C dialysiert und gefriergetrocknet.' Das auf diese Weise erhaltene gefriergetrocknete Produkt war AM-Protease. (Kommentar zu dieser Stufe: Die erreichte Reinigung liegt zwischen dem 2- und 5-Fachen; im allgemeinen ist sie niedriger, wenn die Stufe IV sehr wirksam ist).

Die in allen fünf Stufen erreichte Reinigung war 300- bis 500-fach; es wurden ungefähr 70% der ursprünglichen proteolytischen Aktivität zurückgewonnen.

Beispiel 2

Ein Mycelinoculum von Armillaria mellea ACC 3253 wurde wie folgt hergestellt:

45 ml eines 2%igen Malzagars in einer 200 ml fassenden flachen medizinischen Flasche wurde mittels einer sterilen Schlinge aus einer Mutt*>rkultur von Armillaria mellea (gehalten auf einem Malgagar in einem Eeagenzröhrchen)

inokuliert. Die Flasche und ihr Inhalt wurden 14· !Tage *

lang bei 25°C inkubiert. 30 ml steriles destilliertes Wasser wurden der Flasche zugegeben, und das Luftmycel wurde mit einer sterilen Nadel abgerieben, um eine Mycelsuspension herzustellen.

200 g gekochte Maisflocken wurden in 2 1 fassende Glasbecher eingebracht. Uhgehopfte Brauerwürze (spezifisches Gewicht 1,182) wurde dann in einer ausreichenden Menge zugesetzt,.bis die Oberfläche des Halses erreicht war. Die Öffnung eiies jeden B-schers wurde mit einer Aluminium-

101116/1876

folie verdeckt, und dann wurden die Becher mit ihrem Inhalt in einen Autoklaven mit 120⁰C und mit einem Druck von 1,05 kg/

cm eingebracht. Nach dem Abkühlen wurde weitere Würze zugegeben, um den Würzenspiegel bis zur Oberseite des Halses anzuheben* Die Becher und der Inhalt wurden 20 min in einen

Autoklaven mit 120⁰C eingebracht.

Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wu?de das Kais/Würze-Medium mit 5 ml der Kycel-Suspension von Armillaria mellea ' inokuliert und dann im Dunkeln 12 Wochen und dann im Licht 4 Wochen bei 25°C inkubiert. Die Oberflächenmycelschicht, die sich gebildet hatte, wurde abgekratzt, und mit festem Kohlendioxid gemahlen, um ein Pulver herzustellen. Ein Phosphatpuffer mit einem pH von 7 »4 (2 ml) wurde zugegeben. Der Puffer bestand aus 0,1m Natriumdihydrogenphosphatlösung und 0,1$ a Natriumchloridlösung, die durch Zugabe von 2m Natriumhydroxid lösung auf pH 7,4 eingestellt waren. Das Gemisch wurde zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde aufbewahrt. Auf diese Weise wurde eine wässrige Lösung erhalten, die AK-Protease enthielt.

100 Kl der genannten wässrigen Lösung, die die AM-Protease enthielt, wurden zu 0,5 ml einer Lösung von menschlichem Fibrinogen (95# gerinnungsfähiges Prodein; 3 mg/ml in Phosphat/Kochsalz-Puffer; 0,1 m Phosphat, pH 7,4)j worauf sich der Zusatz von 10/11 einer Lösung von Rinderthrombin (500 N.I.H -Einheiten/ml) im gleichen Puffer anschloß. Das gebildete Gerinsel war in ungefähr 90 sek aufgelöst. Dieses Resultat zeigt, daß die genannte wässrige Lösung ein fibrlnolytlsches Enzya enthielt.

* The National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, U.S.A.

109116/1876

Claims

Patentansprüche

1. AM-Protease.

2. Verfahren zur Herstellung von AM-Protease, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:

I. Mahlen oder anderweitige Zerkleinerung von reifen Fruchtkörpern von Armillaria mellea und Extraktion dieses Materials mit Wasser, um einen wässrigen Extrakt herzustellen;

II. Ausfällung unerwünschter verunreinigender Proteine aus dem wässrigen Extrakt mittels mindestens eines mit Wasser misch- ( baren organischen Lösungsmittel bei einer geeigneten Temperatur, bei einem geeigneten pH und bei einer geeigneten Ionenkonzentration, und Abtrennung der ausgefallenen Proteine durch herkömmliche Maßnahmen}

III. Ausfällung der rohen AM-Proteaa· aus der Losung durch Zusatz mindestens eines mit Wasser Mischbaren organischen Lösungsmittels zur Lösung. . ·

IV. teilweise Reinigung der rohen AM-Protease durch Chromatographie; und

V. Reinigung der erhaltenen unreinen AH-Protease mittels einer Molekularsiebtechnik.

3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fruchtkörper von Armillaria mellea ACC 3659 oder 3253 stammen.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3« dadurch gekennzeich net, daß in der in Anspruch 2 angegebenen Stufe I die Fruchtkörper mit Wasser in einen mechanischen Mischer bei 2 bis 4°0 homogenisiert .werden und das resultierende Gemisch durch Filtration oder Zentrifugation getrennt wird.

109116/1876

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die bei der genannten !Trennung erhaltene feste Phase entweder

I. gefriergetrocknet, mit festem Kohlendioxid gemahlen und dann mit Wasser bei 2 bis 4°C extrahiert wird oder

II. gemeinsam mit einem geeigneten Schleifmaterial, wie z.B. Sand, und mit Wasser bei 2 bis 4-⁰C gemahlen wird und das resultierende Gemisch durch Filtration oder Zentrifugation getrennt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 2, 4 oder 5» dadurch gekennzeichnet, daß die in Anspruch 2 angegebene Stufe I immer wenn möglich unter Stickstoff ausgeführt wird, und dass das Extraktionswasser mindestens einen Tyrosinaseinhibltor, beispielsweise Hatriumbenzoat oder tfatriumascorbat in einer

-7> -4
10 bis 10 molaren Konzentration, enthält.

7· Verfahren nach Anspruch 2, 4, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei der in Anspruch 2 angegebene Stufe I der erhaltene wässrige Extrakt zur Lagerung gefriergetrocknet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Stufe II das organische Lösungsmittel oder die organischen Lösungsmittel aus Alkanolen mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen und Alkanonen mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Äthanol, n-Propanol, Isopropanol oder Aceton, oder Gemischen daraus ausgewählt werden, wobei das Lösungsmittel gegebenenfalls auch noch einen Dialkyläther mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Diäthyläther, enthält, wobei das Verfahren bei -10 bis 10⁰C und insbesondere bei -2 bis 2°C und be4-einem pH von 5 bis 7 ausgeführt wird und wobei die ausgefallenen unerwünschten Proteine durch übliche Methoden, wie z.B. Filtration oder Zentrifugation, entfernt werden.

109816/1876

9· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe III das organische Lösungsmittel oder die organischen Lösungsmittel aus Alkanolen mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen und Alkanonen mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Äthanol, n-Propanol, Isopropanol oder Aceton, oder Gemischen derselben ausgewählt werden, wobei das Lösungsmittel gegebenenfalls auch einen Dialkyläther mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Diäthyläther, enthalt, wobei das Verfahren bei -10 bis 10°C und insbesondere bei -2 bis 2°C und bei einem pH von 5 bis ausgeführt wird, und wobei bei diesem Verfahren, die ausgefallene rohe AM-Protease durch irgendein herkömmliches Verfahren, wie z.B. filtration oder Zentrifugation, gesammelt wird, worauf sie gegebenenfallsjaber vorzugsweise mit einem " geeigneten Lösungsmittel, wie z.B. eiskaltes 70%iges (V/V) wässriges Äthanol, gewaschen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9* dadurch gekennzeichnet, ⁴daß die erhaltene rohe AM-Protease entweder:

I. in eiskaltem destillierten Wasser aufgelöst und dann gefriergetrocknet oder

11. sukzessive bei -2 bis 2⁰C mit trockenem Äthanol und Diäthyläther gewaschen und dann im Vakuum bei -2 bis 2°C getrocknet wird.

II. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, i daß in Stufe IV die rohe AM-Protease durch Chromatographie auf einem chromatographischen Kationenaustauschmaterial, welches an eine Polysaccharidmatrix gebundene Carboxymethylradikale enthält, wie z.B. auf Carboxymethylcellulose, teilweise gereinigt wird, wobei das Material mit einem wässrigen Puffer von pH 5 bis 7, wie z.B. pH 6, bei ungefähr 2°C eluiert wird.

109816/1876

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet daß die eluierten Fraktionen, die AM-Protease enthalten, durch Druckdialyse konzentriert werden.

13· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe V die unreine AM-Protease mittels einer Molekularsiebtechnik bei ungefähr 2°C gereinigt wird, wobei eine Kolonne oder eine Membrane aus einem vernetzteil hydrophilen Polymer verwendet wird, das in Bezug auf ein Molekulargewipht von ungefähr 30.000 Molekularsiebeigenschaften aufweist.

Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer ein veraetztes Dextran, ein Polyacrylamidgel oder eine Agarose verwendet wird

15» Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die unreine AM-Pr<>tease in einem kleinen Volumen eines Puffers mit pH 6 bis 8 bei ungefähr 2°G aulgelöst wird und die resultierende Lösung bei ungefähr 2⁰O auf eine Kolonne oder Membrane aufgegeben wird, und daß die Kolonne entweder mit dem gleichen oder mit einem ähnlichen Puffer bei ungefähr 2°C eluiert wird und das AM-Protease enthaltende Eluat durch Druckdialyse konzentriert wird, oder daß, im Falle einer Membrane, die verunreinigenden Proteine und der größte Teil des Lösungsmittels und des Elektroyts durch die Membrane hindurchgeföhrt werden und die resultierende Lösung von AM-Protease von der Aufbringseite der Membrane abgenommen wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15t dadurch gekennzeichnet, daß die resultierende Lösung von AM-Protease durch Druckdialyse konzentriert wird.

17· Verfahren zur Herstellung von AM-Protease, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:

109816/1876

I. Homogenisierung von reifen Fruchtkörpern von Armillaria mellea mit Wasser in einem mechanischen Mischer bei 2 bis 4-⁰C, Trennung des resultierenden Gemische durch Filtration oder Zentrifugation, wodurch eine feste Phase und eine wässrige Phase (A) erhalten wird, und gegebenenfalls entweder (a) Gefriertrocknen der festen Phase, Mahlen des gefriergetrockneten Materials mit festem Kohlendioxid und Extraktion des resultierenden Materials mit Wasser bei 2 bis 4°O, um eine wässrige Phase (B) zu erhalten, oder (b) Mahlen der festen Phase mit Sand oder einem ähnlichen Schleif material und mit Vasser bei 2 bis 4⁰C, und Trennen des resultierenden Gemische durch Filtration der Zentrifugation, wodurch eine wässrige Phase (C) erhalten wird; wobei gegebenenfalls (j

immer wenn möglich die Vorgänge unter (I) unter Stickstoff ausgeführt werden und das Extraktionswasser mindestens einen Tyrosinaseinhibitor, wie z.B. Hatriumbenzoat oder Batriumascorbat in 10 bis 10 molarer Konzentration, enthält;

II. Ausfällung der unerwünschten verunreinigenden Proteine aus der wässrigen Phase (A), (B) oder (C) durch Zusatz mindestens eines organischen Lösungsmittels, nämlich eines Alkanols mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen oder eines Alkanons mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder Mischungen derselben, gegebenenfalls gemeinsam mit einem Dialkyläther mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen bei -2 bis 2°C und bei einem pH von 5 bis 7 t und Abtrennung der ausgefallenen unerwünschten Proteine durch Filtration oder Zentrifugation; um eine Lösung herzustellen, die AM-Protease enthält;

III. Ausfällung von roher AM-Protease durch Zusatz zur AM-Protease enthaltenden Lösung von mindestens einem organischen Lösungsmittel, nämlich Alkanols mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen und Alkanone mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen sowie Gemische derselben, gegebenenfalls gemeinsam mit einem Dialkyläther mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen bei -2 bis 2°C und bei einem pH von 5 bis 7; und Sammeln der ausgefallenen rohen AM-Protease durch Filtration oder Zentrifugation; und gegebenen-

109816/1876

falls aber vorzugsweise Waschen der AM-Frotease mit eiskaltem 70%igen wässrigen Äthanol; und hierauf gegebenenfalls entweder (a) Auflösen der rohen AM-Frotease in eiskaltem destilliertem Wasser und Gefriertrocknung der Losung oder (b) aufeinanderfolgendes Waschen der rohen AM-Protease bei -2 bis 2°C mit trockenem Äthanol und Biäthyläther und Trocknen des Produkts ia Vakuum bei -2 bis 2°C;

XY. teilweise Reinigung der AM-Frotease durch Chromatographie auf einem chromatographischen Kationenauatauachmaterial, welches Carobxymethylradikale enthält, die an eine Polysaccharide matrix gebunden sind, wie z.B. Carboxymethylcellulose, wobei das genannte Material mit einen wässrigen Puffer vom pH 5 bis 7, beispielsweise pH 6, bei ungefähr 2°C*eluiert wird; νφά Konzentration der eluierten Traktionen, die die All-Protease enthalten, durch Druckdialyse; und

W Reinigung der auf diese Weise erhaltenen unreinen AM-Protease durch AufIosen in einem kleinen Volumen eines Puffers vom pH 6 bis 8 bei ungefähr 20⁰C und

Aufbringen der resultierenden Lösung bei ungefähr 2°C auf eine Kolonne oder Membrane aus einem vernetzten hydrophilen Polymer, das in Bezug auf ein Molekulargewicht von ungefähr 30.000 Molekularsiebeigenschaften aufweist; und hierauf ent- L· weder Elution der Kolonne mit dea gleichen oder einem ähnlichen Puffer bei ungefähr 2°C und Konzentration des AM-Protease enthaltenden Eluats durch Druckdialyse oder, im Falle der genannten Membrane, Hindurchführen der verunreinigenden Proteine und des größten Teils des Lösungsmittels oder des Elektrolyts durch die Membrane und Rückgewinnung der resultierenden Lösung von AM-Frotease von der Aufbringseite der Membrane und gegebenenfalls Konzentration dieser Lösung durch Druckdialyse·

109816/1876

1ε. Verfahren atur Herstellung von AM-Protease, dadurch gekennzeichnet, daß «an das Eforcel von Armillara mellea auf einem Hähnaedium bei ungefähr 25°O züchtet und hierauf die AM-Protease aus dem erhaltenen Itsrcel durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 17 isoliert, mit dem Unterschied, daß die reifen Fruehtkörper durch das erhaltene Israel ersetzt werden.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Mycel durch eine Oberflächenkultur bei ungefähr 25°C auf einem Hais und Würze enthaltenden Nährmedium gezüchtet wird.

20. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeich- i net, daß sie AM-Protease und ein inertes nicht-giftiges, pharmazeutisch zulässiges Terdünnungs- oder Trägermittel enthält.

21. Zusammensetzung' nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet , daß sie eine für systemische intravenöse oder intraarteriale Infusion oder lokale intravenöse oder intraarteriale Injektion geeignete Form aufweist.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Form einer sterilen injizierbaren wässrigen Lösung von AM-Protease aufweist.

23· Lösung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß I sie 0,05 bis 1,0 ag AM-Protease/ml, beispielsweise 0,25 mg AM-Protease/ml, enthalt.

24. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß sie das menschliche Plasma Albu- * rafcn enthält.

25· Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie em bekanntes analgetisches Mittel enthält.

109816/1876

26. Das Apoenzym, das der AM-Protease entspricht.

27. Verfahren zur Herstellung des der AM-Protease entsprechenden Apoenzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man AM-Protease bei pH 0,7 mit einer 10 molaren Äthylendlamintetraessigsäure mit pH 7 beL ungefähr 4⁰C behandelt und hierauf den Überschuß der genannten Säure durch Dialyse gegen 0,05 πι pH 7>^"Tris/HCl-Puffer entfernt. .

28c Verfahren zur Herstellung einer modifizierten AM-Protease, dadurch gekennzeichnet, daß man das der AM-Protease entsprechende Apoenzym in einem wässrigen Medium mit Co++, Zn , Ni , Pe⁺ oder Cu"*'* behandelt.