SE456245B - Enzympreparation innehallande krillhyaluronidas - Google Patents
Enzympreparation innehallande krillhyaluronidasInfo
- Publication number
- SE456245B SE456245B SE8603051A SE8603051A SE456245B SE 456245 B SE456245 B SE 456245B SE 8603051 A SE8603051 A SE 8603051A SE 8603051 A SE8603051 A SE 8603051A SE 456245 B SE456245 B SE 456245B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- hyaluronidase
- enzyme
- activity
- gel
- beta
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 claims abstract description 47
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 29
- 241000239366 Euphausiacea Species 0.000 claims abstract description 16
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 9
- 102000009066 Hyaluronoglucosaminidase Human genes 0.000 description 46
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 20
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 16
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 16
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 12
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108050009363 Hyaluronidases Proteins 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 5
- 101100256850 Drosophila melanogaster EndoA gene Proteins 0.000 description 5
- HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N methyl alpha-D-mannoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- DBTMGCOVALSLOR-DEVYUCJPSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](CO)O[C@H](O)[C@@H]2O)O)O[C@H](CO)[C@H]1O DBTMGCOVALSLOR-DEVYUCJPSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 229920001543 Laminarin Polymers 0.000 description 3
- 239000005717 Laminarin Substances 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- NFCRBQADEGXVDL-UHFFFAOYSA-M cetylpyridinium chloride monohydrate Chemical compound O.[Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 NFCRBQADEGXVDL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 3
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N phenolphthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2C(=O)O1 KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- YCPXWRQRBFJBPZ-UHFFFAOYSA-N 5-sulfosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C1O YCPXWRQRBFJBPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- 102000002268 Hexosaminidases Human genes 0.000 description 2
- 108010000540 Hexosaminidases Proteins 0.000 description 2
- 102000003918 Hyaluronan Synthases Human genes 0.000 description 2
- 108090000320 Hyaluronan Synthases Proteins 0.000 description 2
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013494 PH determination Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N alpha-D-mannose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229960001927 cetylpyridinium chloride Drugs 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 2
- 229940089982 healon Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- FXJYOZKDDSONLX-UHFFFAOYSA-N phenolphthalein-mono-beta-glucuronic acid Natural products O1C(C(O)=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CC=C(C2(C3=CC=CC=C3C(=O)O2)C=2C=CC(O)=CC=2)C=C1 FXJYOZKDDSONLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004243 retinal function Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239370 Euphausia superba Species 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 125000000188 beta-D-glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 229960002246 beta-d-glucopyranose Drugs 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000010200 folin Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000002566 glucosaminyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L potassium sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- 229940074439 potassium sodium tartrate Drugs 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000011006 sodium potassium tartrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 150000008501 α-D-glucopyranosides Chemical group 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/947—Microorganisms using protozoa
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
456 245 I samband med uppfinningen är hyaluronsyra den viktigaste glykosaminoglykanen. Den består av repeterande enheter av disackariden: (1 -> 4)-g-beta-D-glukopyranosyluronsyra- (1 -> 3)-2-acetamid-2-decxy-beta-D-glukopyranos.
Definitionsmässigt är hyaluronidas ett enzym med förmåga att bryta ner kolhydratkedjan i hyaluronsyra till kortare fragment, företrädesvis tetrasackarider. Fragmentering till enkla mono- eller disackaridenheter är dock ej utesluten.
Det är föredraget att använda termen hyaluronidas för enzymer med preferens för hyaluronsyra, även om det före- kommer att termen användes för andra hyaluronsyraspjälkande enzym med preferens för andra GAG. Ett hyaluronidas skall alltså ha förmåga att spjälka någon av hyaluronsyrans glykosidbindningar, d v s vara antingen ett glukuronidas (såsom beta-(1,3)-glukuronidas med frisättning av glukuronysylgrupper) eller ett hexosaminidas (såsom beta-(1,4)-glukosaminidas med frisättning av amíderade glukosaminylgrupper). Glukuronidaser och hexosaminidaser kan vara av endo- eller exotyp. Det är känt att hyaluronidas kan verka på i huvudsak tvà olika sätt. Antingen sker en hydro- lytisk spjälkning (hydrolas, exempelvis testikelhyaluronidas) eller också sker spjälkningen som en eliminationsreaktion (eliminas, exempelvis bakteriellt hyaluronidas från Streptomyces).
För en översikt över hyaluronidaser se Meyer K et al (9).
Hyaluronidas har använts inom ett stort antal olika applika- tionsomràden och finns kommersiellt tillgängligt från ett flertal olika fabrikanter. De olika applikationsomràdena har som gemensam nämnare att man vill påverka hyaluronsyraomsätt- ningen i ett givet hyaluronsyrainnehållande system och kan vara antingen in vivo eller också in vitro. In vivo har enzymet föreslagits vid olika terapeutiska behandlingar.
Sålunda har man föreslagit att använda enzymet tillsammans med läkemedel, varvid hyaluronidaset ökar läkemedlets spridning i en vävnad (hyaluronidas kallas även 456 245 för 'spreading factor'). I samband med terapi anses enzymet även ha positiva effekter på 1) hjärtinfarkter (5), 2) retinala funktionen (14) och 3) i kombination med cytostatika vid behandling av cancertumörer (1). In vitro har man använt enzymet för att depolymerisera hyaluronsyra, t ex i ett cellfritt system, eller för att stimulera hyaluronsyra- syntetas i t ex cellodlingssammanhang (11).
Någon tillfredsställande råvarukälla för hyaluronidas har inte funnits. Enzymet har huvudsakligen erhållits från bovina testiklar, bakterier och blodiglar. Dessa ràvarors innehåll av hyaluronidas har varit relativt lågt, varför priset på hyaluronidaspreparationer med acceptabel renhet för bruk in vivo varit högt. Ett behov av billiga och bättre hyaluronidaspreparationer finnes.
Uppfinningens hyaluronidaspreparationer kännetecknas av att de innehåller hyaluronidas som finns i de inledningsvis nämnda skaldjuren. Förutom från krill kan krillhyaluronidas potentiellt även isoleras från odlingsmedier för celler vilka med rekombinant-teknik förmåtts att producera enzymet.
Våra hittills utförda studier av krillhyaluronidaser har en molvikt på 8 x 104, såsom 80 000 1 3 000 dalton och ett pH-optimum 4,5 - 6,0. De kan ha ett pI (isoelektrisk punkt) i pH-intervallet 4 - 6 med eventuell förekomst av isoenzymer.
De kan vara glykoprotein med Con A-bindande förmåga (d v s ha terminala monosackaridrester med alfa-D-mannopyranosid- eller alfa-D-glykopyranosidstruktur). Den hittills funna enzymaktiviteten tyder på att krillhyaluronidas uppvisar endoglukuronidasaktivitet d v s är ett endoglukuronidas. Det kan inte uteslutas att kommande studier kommer att visa att krillhyaluronidaser även kan ha andra specificiteter som möjliggör att de effektivt kan bryta ner hyaluronsyra.
Uppfinningens hyaluronidaspreparationer uppvisar en hyaluronidasaktivitet på mer än 20, 50 eller 100 U/mg protein från råvarukällan (d v s krillprotein). Det är _ .-. I .- -e-. ' ,,,_._____,, .__ L-. ... 456 245 möjligt att framställa preparationer med aktiviteter över 250 U/mg protein från råvarukällan. Aktiviteterna ovan skall vara mätta enligt den metod som anges i exemplifieringen.
Prepareringen av uppfinningens hyaluronidaser kan ske genom att man extraherar färsk eller färskfrusen krill som homo- geniserats. Extraktionen bör ske med ett vattenhaltigt medium såsom vatten. Från det erhållna extraktet kan man sedan isolera enzymet ifråga genom att utnyttja separa- tionsmetoder som bygger på de tidigare nämnda egenskaperna hos krillhyaluronidaser. Man kan utnyttja kromatografiska metoder som_affinítets-, gel- och jonbyteskromatografi, HPLC, FPLC, kromatofokusering etc eller preparativ elektro- fores. Även dialys och ultra- och membranfiltrering är potentiellt användbara. Extraktionen och homogeniseringen ovan utföres med fördel i kyla under eller nära +4 °C. Det är även fördelaktigt att avlägsna lipider från det erhållna vattenextraktet (råextrakt) genom att extrahera detta med ett lipidlösande lösningsmedel innan råextraktet renas ytterligare. Isolering av krillhyaluronidas framgår ytter- ligare av exemplifieringen.
Kríllhyaluronidaserna enligt uppfinningen kan potentiellt användas på för hyaluronidaser gängse sätt. Se ovan.
I en preparation enligt uppfinningen kan isolerade krill- hyaluronidaser föreligga i frystorkad form, såsom frys- eller spraytorkad form. Den kan även föreligga blandad med, löst i eller på annat sätt inkorporerad i olika för ända- målet lämpliga vehiklar såsom vatten (t ex fysiologisk koksaltlösning) etc.
Uppfinningen framgår av bifogade patentkrav som ingår som en del i beskrivningen. 456 245 Uppfinningen skall nu åskàdliggöras med det vetenskapliga arbete som möjliggjort densamma. Exemplifieringen tjänar inte till att på något sätt begränsa uppfinningen, utan det förutsättes att ett stort antal variationer inom ramen för uppfinningen finnes. ššzsšililsaëslašel Material Bovint testikelhyaluronidas, 5-sulfosalicylsyra (S-2130), fenoftalein glukuronsyra (P-0376), laminarin (L-9634). metyl alfa-D-mannopyranosid (M-6882) var från SIGMA (USA). Hyaluron- syra (Healonø) var från Pharmacia AB (Sverige). Ultrafiltre- ringscell och membraner (YM10) var fràn Amicon Corp (USA).
Tris-hydroxymetyl-aminometan (TRIS), 3,5-dinitrosalicylsyra, kalium-natrium tartrat (C4H406KNa'4H20), cetylpyridiniumklorid monohydrat var från Merck (USA). Con A Sepharoseø, Superoseø 6 prep grade, Agarose A, Polyakrylamid Gradientgeler (PAA 4/30), Gel Filtration Kit, Isoelectric focusing Calibration Kit (pH 3 - 10) och Pharmalyteo (pH 3 e 10) var fràn Pharmacia AB (Sverige). Kromatografi- och elektroforesutrustning erhàllen från Pharmacia AB var K 16/20 och K 16/100 kolonner, envägs- monitor (UV-1), spänningsaggregat för elektrofores (EPS S00/400), gelelektrofores apparatur (GE-4), elektrofores- aggregat för konstant spänning (ECPS 3000/150), Volthour- integrator (VH-1), spänningsaggregat för avfärgning (DPS), gelavfärgningsapparat (GD-4), Superoseø HR 10/30 kolonn och Mono Q HR 5/5 anjonbyteskolonn ansluten till FPLC~system.
Metoder A- EEÉEEEÉEEEÉES-ëX_EÉE§EEëëE-ÉEÉE_ëEill Krill, Euphausia superba, fångad under den antarktiska sommaren och omedelbart frusen och lagrad vid ca 456 245 « -20 - -40 °C placeras i +4 °C. När krillen är nästan tinad blandas 100 g av den med 200 ml anjoniserat vatten. Blandningen homogeniseras och centrifugeras därefter till klarhet. Överfasen (extraktet) dekanteras och filtreras. Filtratet behandlas sedan med tredubbla volymen av ett lipidlösande lösningsmedel. Efter fasseparation tas vattenfasen till vara och användes enligt B. Arbetet utfördes i kylrum vid ca +4 °C.
Affinitetskromatogrgfi på Con A Segargâgf Kommersiellt tillgänglig Con A Sepharose° tvättades med buffert (20 mn Tnxs-Hcl, pa 7,5, 1 mn Mn2+, 1 mm Mg2+, 1 mM Ca2+, 1 M NaCl) och packades i en K 16/20 kolonn till en höjd av 15,5 cm vilket svarade mot en bäddvolym på omkring 31 ml. Kolonnen ekvilibrerades sedan med den nyss nämnda bufferten vid rumstemperatur. 15 - 30 ml råextrakt från A med samma saltstyrka som bufferten applicerades pâ kolonnen och eluerades med 200 ml buffert enligt ovan (ca 6 bäddvolymer) med en flödes- hastighet på 13 ml/h. Därefter skedde desorption med hjälp av buffert innehållande 5 t (w/v) metyl-alfa-D- mannopyranosid. Elueringen följdes kontinuerligt vid 280 nm till dess att inget Uv-adsorberande material kunde påvisas i eluenten. De uppsamlade fraktionerna (2 ml/fraktion) bestämdes med avseende på hyaluronidas- aktivitet och de aktiva fraktionerna sammanslogs och koncentrerades med hjälp av ett Amicon-filter (YM 10). êsèšilëæssias Ungefärligen 4 ml (ca 2 % av bäddvolymen) av det erhållna koncentratet från B applicerades vid +4 OC i kylrum på en Superoseø 6 prep grade kolonn K 16/100 (1,6 cm x 100 cm) jämviktad med buffert S0 mM TRIS-HCl pH 7,5). Kolonnen eluerades med samma buffert och i; -_,_.f.-',. «~ 456 245 flödeshastigheten 12 ml/h. Elueringen följdes spektro~ fotometriskt vid 280 nm. De erhållna fraktionerna (2 ml/fraktion) bestämdes med avseende på hyaluronidas- aktivitet och fraktionerna med aktivitet sammanslogs. ÉÉQQ De sammanslagna fraktionerna från steg C :enades ytterligare på en stark anjonbytarkolonn (Mono Q HR 5/5) jämviktad vid rumstemperatur med samma buffert som i steg C. 4 ml av de sammanslagna fraktionerna från steg C applicerades pà kolonnen och proteinerna eluera- des med en stegvis gradient av NaCl från 0 - 0,18 M, 0,18 - 0,34 M, 0,34 - 1,0 M. Fraktionerna (1 ml/fraktion) bestämdes med avseende på hyaluronidas-, beta-glukuronidas- och endo(1,3)-beta-D-glukanasaktivitet. De aktiva fraktionerna svarande mot respektive enzym sammanslogs var för sig. äsëëëfßæèaa-sy-ëzsšeaeeiësësësixissë En enkel plaquemetod enligt Richman et al (12) användes för att bestämma hyaluronidasaktivitet. I korthet innebär den att hyaluronsyra (Healon°) inkorporerades i en 1,5 % (w/v) agarosgel. Från brunnar upptagna i gelen tilläts enzymet diffundera ut i gelen under 20 timmar vid 37 GC. Den odigererade hyaluronsyran fälldes sedan genom att cetylpyridiniumklorid tillsattes, varvid efter cirka 30 minuter klara cirklar uppkom runt respektive brunn. Cirklarnas diameter var proportionella mot logaritmen av koncentrationen av den till respektive brunn satta enzymlösningen. Testikelhyaluronidas användes som referens för att få en standardkurva.
Bestämning utfördes på de sammanslagna fraktionerna från respektive steg A - D ovan. 45§ 245 _ 3 _ Bestämning av beta-glukuronidas Denna aktivitet bestämdes enligt en metod beskriven av Fishman et al (4). En serie rör fylldes med 0,8 ml 0,1 M NaAc pH 4,5 + 0,1 ml fenolftalein mono-beta- glukuronsyra pH 7,6 och inkuberades under 5 minuter vid 37 OC. Vid bestämda tidsintervall sattes till varje rör 0,1 ml enzymlösning från steg D ovan och till blankprovet 0,1 ml destillerat vatten. Rören inkuberades i 30 minuter vid 37 OC. Enzymreaktionen stoppades genom addering av 5,0 ml 0,2 É glycin, 0,2 M Na0H, varefter rören kyldes och UV-adsorptionen lästes vid rumstemperatur vid 540 nm. Antalet /umol frisatt fenolftalein beräknades med hjälp av standardkurva. En unit (U) enzym klyver en /umol fenolftalein mono-beta-glukuronsyra per minut vid 37 °c och ps 4,5. êssëëfßainstsznzaêelllâlzësafulzzslelsëaëë Denna enzymaktivitet bestämdes enligt en metod beskriven av Turkiewicz et al (13). Substratet som användes var laminarin vilket består av beta-D-glukosrester huvudsak- ligen sammanbundna via 1,3-bindningar. Enzymaktiviteten uttrycks som /umol frisatt glukos per minut. Den frisatta glukosen mättes med 3,5-dinitrosalicylsyra såsom beskrivits av Bernfeld (2). 0,5 ml enzymlösning från steg D ovan buffrad med Na-fosfat (10 mM pH 6,2) inkuberades med 0,5 ml substratlösning (1 mg laminarin/ml i fosfatbufferten) under 10 minuter vid 50 OC. 1,0 ml 3,5-dinitrosalicylsyra reagens adderades omedelbart därefter, och rören sattes i ett kokande vattenbad för att värmas under 5 minuter. Slutligen kyldes proven och 8,0 ml destillerat vatten tillsattes. Absorbansen lästes omgående vid 540 nm. Antalet /umol frisatt glukos beräknades från en standardkurva och enzymaktivi- teten uttrycktes som unit (/umol/tidsenhet). m 456 245 §s§$ëæa¿§s-ë!_e:9se¿a Proteinkoncentrationerna i olika enzympreparationer bestämdes enligt Lowry et al (8) med hjälp av BSA som referensprotein. glektrofores pà gradientgel av polyakrylamid (g-PAG§l Elektroforesbufferten var 40 mM TRIS-HCl, 20 mM NaAc, 2 mM EDTA, pH 8,4. Provsammansättningen var: 56 /ul koncentrerat protein, 15 /ul 50 % (w/v) sukros och 5 /ul 0,1 % (w/v) bromfenolblått. 15 - 30 /ul av provberedningen (40 /ug protein) applicerades på preekvilibrerad gel (70 V i 1 timme). Elektrofores- betingelserna var 150 V (35 mA/gel) i 20 minuter (”run in") följt av 100 V (25 mA/gel) i ca 5 timmar. Proteinerna fixerades med hjälp av elektrofores vid 24 V under 30 min i isopropanol/ättikssyralösning (25 % resp 10 % (v/v)). Gelerna infärgades med 0,2 % (w/v) Coomassie brilliant blue i metanol/ättikssyralösning (25 % resp 10 % (v/v)) under 2 timmar. Avfärgning utfördes under 45 minuter i samma lösning, fast utan färgämne. šëeeè§ë§s¿§ë_š9ëe§e:;es_lš§El Gjutning av geler och fokuseringsbetingelser skedde enligt tillverkaren (10). En 1 mm tjock polyakrylamidgel (5 % (w/v) akrylamid totalt och 3 % tvärbindare), innehållande Pharmalytew pH 3 - 10 gjöts. Elektrodlös- ningarna bestod av 0,1 M svavelsyra (anod) och l M NaOH (katod). Innan provpàsättning prefokuserades gelen under 500 Vh vid konstant spänning 30 W. 20 /ul av koncentrerad och avsaltad slutpool fràn steg D inne; hållande 50 /ug protein applicerades pà gelen. Fokuse- ringen fick fortgå i 5 000 Vh (3,5 h) vid konstant spänning på 30 W (Vmax = 2 500 V). Efter fokuseringen 456 245 _10.. fixerades proteinerna och Pharmalyte° avlägsnades med 5 % (w/v) 5-sulfosalicylsyra och 10 % (w/v) triklorättik- syra under 60 minuter. Gelen tvättades sedan under 30 min med en avfärgningslösning bestående av 30 8 (v/v) metanol och 10 % (v/v) ättiksyra. Proteinfärgningen utfördes med 0,2 % (wlv) Coomassie brilliant blue upplöst i avfärgningslösningen. Vid avfärgningen skedde många byten av tvättlösningar.
Hyaluronidasaktivitet mätt med zymogram En substratgel gjöts genom att blanda 2 ml Healon° (10 mg/ml), 3 ml Na-citratbuffert (pH 5,3, 0,15 M NaCl, 0,02 % NaN3) och 5 ml 2 % agarose A. Blandningen upp- hettades under omröring i'ca 2 minuter, varefter den hälldes på en 8 x 8 cmz Gel Bond film. g-PAGE utfördes som ovan. Omedelbart efter det att elektroforesen var avslutad inkuberades gelen under 15 minuter med citrat- bufferten. Elektrofores- och substratgelen vända mot varandra placerades sedan på en glasplatta. Den erhållna trelagrade "sandwichen" placerades i en fuktkammare där den fick stå vid 37 OC i 24 timmar. Odigererad hyaluron- syra fälldes sedan med cetylpyridiniumklorid.
För IEF hälldes substratlösningen direkt på IEF-gelen efter elektrofokusering. Plattan placerades i en fuktkammare och fick sedan stå vid 37 OC i 24 timmar.
Den odigererade hyaluronsyran fälldes enligt ovan. ÉQEÉEYÄYÉÉÉÉPÉÉÉÉEBÅEQ Molekylvikter bestämdes med hjälp av gelfiltrering på en Superoseo 12 HR 10/30 kolonn ansluten till ett FPLC-system. Kolonnen var jämviktad med 50 mM TRIS-Hcl pH 7,5 innehållande 0,15 M NaCl, ferritin (440 000), aldolas (158 000), BSA (67 000), ovalbumin (43 000) och chymotrypsin (25 000) användes som referensproteiner.
Elutionsvolymerna avsatta mot log MW gav en rät linje. n n ¿4ss 245 _ 11 _ M. Bestämning av pH-optimum Hyaluronidasaktiviteten bestämdes i olika substratgeler (se E) i vilka pH justerats till olika värden med en 0,05 M citrat-fosfatlösning.
Resultat och diskussion I steg B renades hyaluronidas med hjälp av affinitetskromato- grafi pà Con A Sepharoseø. Denna adsorbent är känd för att specifikt interagera med glykoproteiner uppvisande terminala alfa-D-glukopyranosid- eller alfa-D~mannopyranosidrester.
Eftersom hyaluronidas, beta-glukuronidas och endo(l,3)-beta-D- glukanas band starkt till kolonnen indikerar detta att dessa enzymer uppvisar någon av dessa terminala sockerrester. De bundna proteinerna desorberades från kolonnen med 5 % metyl alfa-D-mannopyranosid.
I steg C eluerades de tre enzymerna tillsammans. Steget innebar en kraftig rening från andra proteiner.
I steg D kunde de tre enzymaktiviteterna separeras från varandra genom jonbyteskromatograri på Mono Q. Tre protein- toppar erhölls vilka betecknades med I, II och III (I eluerades först och III sist). Fraktionerna för respektive topp analyserades enligt ovan med avseende på hyaluronidas-, beta-glukuronidas- och endo(1,3)-beta-D-glukanasaktivitet.
Toppen III innehöll hög hyaluronidasaktivitet vilken var omöjlig att påvisa i topparna I och II. Beta-glukuronidas- aktiviteten var associerad med toppen I, under det att endo(1,3)-beta-D-glukanasaktiviteten fanns i topp II och till viss del i topp III.
Det isolerade hyaluronidaset studerades ytterligare med avseende pà renhet, isoelektrisk punkt, pH-optima och molekylvikt. 456 245 , 4 -12- 1 I G-PAGE visade toppen III ett huvudprotein som var lätt förorenat av ett mindre antal andra komponenter. Ett hyaluron- syrazymogram på separationsgelen visade att huvudbandet var associerat med hyaluronidasaktivíteten.
Isoelektrofokuseringsmönstret i kombination med hyaluronsyra- zymogram demonstrerade hög enzymaktivitet i pH-omrâdet 4 - 6. Aktiviteten var associerad med flera band vilket kan indikera förekomst av isoenzymer. pH-optimum för hyaluronidasaktiviteten bestämdes till intervallet pH 4,5 - 6.
Tabell 1: Bestämning av pH-optimum Eg Cirkel diameter (mm) 3,0 0 3,7 5 4,3 8,0 4,7 9,0 5'3 9'0 pH-optimum 6,0 9,0 7 0 7,0 \ Molvikten för hyaluronidas befanns vara 80 000 dalton (1 3 000 dalton).
För beta-glukuronidas och endo(1,3)-beta-D-glukanas bestämdes molvikterna till 70 000 respektive 80 000 dalton.
Specifik aktivitet och utbyte följdes för hyaluronidas under de olika reningsstegen. _ .:,.-;- . 456 245 e 13 - Tabell 2: Rening av hyaluronidas Steg Protein Hyaluronidas aktivitet Renhxnnad Ira/ml total U/mg total z mg units Ráextrakt 45 1 350 3,4 4 650 100 1 üx1A~ kztnatografï 10 48 25 1 230 26 7,5 Superoseø 6 gelfiltrering 1,1 14 102 1 446 31 30 FTEC MONO Q jonbytare 0,22 3,7 295 1 085 23 87 Endohexosaminidasaktivitet mätt enligt Linker (7) kunde ej påvisa nâgra frisatta mängder av N-acetylglukosamin vilket indikerar att vårt studerade hyaluronidas skulle kunna vara ett endoglukuronidas.
Referenslista 1. Baumgartner G et al Hyaluronidase as supplement to cytostatic therapy.
J Exp Clin Cancer Res 4, (1985) s 3 2. Bernfeld P Amylases, X and ß Methods in Enzymol vol 1 (1955) s 149 - 158 3. Chen C-S et al Polysaccharidase and glycosidase activities of Antarctic krill (EuEhausia sugerba).
J Food Biochem 5 (1981) p 63 - 68 ~ -'-' m 456 245 - 10. ll.
Fishman W et al Application of an improved glucuronidase assay method for the study of human blood -glucuronidase J Biol Chem 173 (1948) s 449 - 56.
Flint E J et al Effect of GL enzyme (A highly purified form of hyaluronidase) on mortality after myocardial infarction.
Lancet, April 17 (1982) s 871 - 74.
Hellgren L, Mohr V och Vincent J Enzyme compositions for cleaning, the use thereof and preparation of the composition.
EP-A-107,634 Linker A Bergmeyer Methods of enzymatic analysis, third edition vol IV, enzymes 2, s 257 - 261 Lowry O H et al Protein measurement with the Folin phenol reagent.
J Biol Chem 193 (1951) s 265 - 275 Meyer et al Hyaluronidases The enzymes (1960) s 447 - 460 Pharmacia Fine Chemicals Isoelectric focusing, principles and methods.
Philipson L H et al Effect of hyaluronidase treatment of intact cells on hyaluronate synthetase activity.
Biochemistry 24 (1985) s 7899 - 7906 12. 13. 14. 456 245 _ 15 _ Richman P G et al A convenient plate assay for the quantitation of hyaluronidase in Hzmenogtera venoms.
Anal Biochem 109 (1980) s 376 - 381 Turkiewicz M et al Purification and partial characterization of an endo-(1,3)-beta-D-glucanase from Eughausia sugerba Dana (Antarctic Krill).
Polar Biol 4 (1985) s 203 - 211 Winkler B 5 et al Hyaluronidase and retinal function.
,Arch Ophtalmol 103 (1985) s 1743 - 46.
Claims (1)
1. Glykosaminoglykandegraderande enzympreparation k ä n n e t e c k n a d a v att den innehåller krillhyaluronídas med en molvikt på 8 x 104 dalton och ett pH-optimum i intervallet 4,5 - 6 och att den uppvisar en hyaluronidasaktivitet på mer än 20 U per mg protein från rávarukällan.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8603051A SE456245B (sv) | 1986-07-09 | 1986-07-09 | Enzympreparation innehallande krillhyaluronidas |
| EP87850203A EP0257003B1 (en) | 1986-07-09 | 1987-06-22 | An enzyme preparation capable of degrading glycosaminoglycan, and a method for producing said preparation |
| DE87850203T DE3787773D1 (de) | 1986-07-09 | 1987-06-22 | Zum Abbau von Glycosaminoglycan fähige Enzymzusammensetzung und Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzung. |
| AT87850203T ATE95836T1 (de) | 1986-07-09 | 1987-06-22 | Zum abbau von glycosaminoglycan faehige enzymzusammensetzung und verfahren zur herstellung dieser zusammensetzung. |
| US07/065,591 US4904594A (en) | 1986-07-09 | 1987-06-23 | Enzyme preparation capable of degrading glycosamino-glycan, and a method for producing said preparation |
| JP62170825A JPS6324885A (ja) | 1986-07-09 | 1987-07-08 | グリコサミノグリカンを分解できる酵素製剤及び該酵素製剤の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8603051A SE456245B (sv) | 1986-07-09 | 1986-07-09 | Enzympreparation innehallande krillhyaluronidas |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE8603051D0 SE8603051D0 (sv) | 1986-07-09 |
| SE8603051L SE8603051L (sv) | 1988-01-10 |
| SE456245B true SE456245B (sv) | 1988-09-19 |
Family
ID=20365076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE8603051A SE456245B (sv) | 1986-07-09 | 1986-07-09 | Enzympreparation innehallande krillhyaluronidas |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4904594A (sv) |
| EP (1) | EP0257003B1 (sv) |
| JP (1) | JPS6324885A (sv) |
| AT (1) | ATE95836T1 (sv) |
| DE (1) | DE3787773D1 (sv) |
| SE (1) | SE456245B (sv) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO164844C (no) * | 1988-10-24 | 1990-11-21 | Norsk Hydro As | Fremgangsmaate ved utvinning av enzymer fra krepsdyr. |
| CA2071898A1 (en) * | 1989-10-27 | 1991-04-28 | Diane M. Snow | Inhibition of cell growth by keratan sulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate and other glycans |
| JPH05728A (ja) * | 1991-06-25 | 1993-01-08 | Hightech Seiko Kk | トレイ・チエンジヤー装置におけるトレイ供給方法およびトレイ・チエンジヤー装置 |
| US7947270B2 (en) * | 1992-05-22 | 2011-05-24 | Arcimboldo Ab | Removing dental plaque with krill enzymes |
| GB2293824B (en) * | 1994-10-04 | 1998-11-18 | Ashok Meluttukez Krishnapillai | Extraction and purification of hyaluronidase from crustacean waste |
| DE19501378A1 (de) * | 1995-01-18 | 1996-08-08 | Heinz Dieter Cullmann | Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen |
| US5747027A (en) * | 1995-04-07 | 1998-05-05 | The Regents Of The University Of California | BH55 hyaluronidase |
| US6610292B2 (en) | 1995-11-22 | 2003-08-26 | Ista Pharmaceuticals, Inc. | Use of hyaluronidase in the manufacture of an ophthalmic preparation for liquefying vitreous humor in the treatment of eye disorders |
| US5866120A (en) * | 1995-11-22 | 1999-02-02 | Advanced Corneal Systems, Inc. | Method for accelerating clearance of hemorrhagic blood from the vitreous humor with hyaluronidase |
| CA2323199A1 (en) * | 1998-03-09 | 1999-09-16 | Ista Pharmaceuticals, Inc. | Use of corneal hardening agents in enzyme orthokeratology |
| CA2491555C (en) * | 2002-07-10 | 2012-09-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Solid-phase and solution-phase synthesis of glycosylphosphatidylinositol glycans |
| MXPA03011987A (es) | 2003-12-19 | 2005-06-23 | Osio Sancho Alberto | Metodo para el tratamiento de la presbicia induciendo cambios en el poder y fisiologia corneal. |
| KR102114111B1 (ko) | 2012-08-10 | 2020-05-25 | 오시오 코포레이션 디/비/에이 율리아 헬스 | 안과적 상태 치료시의 컨택트 렌즈 사용 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6033474B2 (ja) * | 1978-05-11 | 1985-08-02 | 藤沢薬品工業株式会社 | 新規なヒアルロニダ−ゼｂｍｐ−８２３１およびその製造法 |
| US4410531A (en) * | 1980-12-08 | 1983-10-18 | Biorex Laboratories Limited | Enzyme derived from hyaluronidase |
| SE454566B (sv) * | 1984-04-24 | 1988-05-16 | Lars G I Hellgren | Farmaceutisk komposition innehallande en verksam mengd av vattenlosliga proteinaser som extraherats fran ett vattenlevande djur valt av ordningen euphausiaceae eller slektet mallotus |
-
1986
- 1986-07-09 SE SE8603051A patent/SE456245B/sv not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-06-22 DE DE87850203T patent/DE3787773D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-22 EP EP87850203A patent/EP0257003B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-22 AT AT87850203T patent/ATE95836T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-06-23 US US07/065,591 patent/US4904594A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-08 JP JP62170825A patent/JPS6324885A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3787773D1 (de) | 1993-11-18 |
| EP0257003A3 (en) | 1990-02-28 |
| EP0257003A2 (en) | 1988-02-24 |
| EP0257003B1 (en) | 1993-10-13 |
| SE8603051D0 (sv) | 1986-07-09 |
| JPS6324885A (ja) | 1988-02-02 |
| US4904594A (en) | 1990-02-27 |
| ATE95836T1 (de) | 1993-10-15 |
| SE8603051L (sv) | 1988-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ghuysen et al. | Structure of the cell wall of Staphylococcus aureus, strain Copenhagen. I. Preparation of fragments by enzymatic hydrolysis | |
| Kaplan et al. | Phosphohexosyl components of a lysosomal enzyme are recognized by pinocytosis receptors on human fibroblasts. | |
| English et al. | A cell wall-degrading endopolygalacturonase secreted by Colletotrichum lindemuthianum | |
| Bielicki et al. | Human liver iduronate-2-sulphatase. Purification, characterization and catalytic properties | |
| Fan et al. | Isolation and characterization of two cyanogenic β-glucosidases from flax seeds | |
| SE456245B (sv) | Enzympreparation innehallande krillhyaluronidas | |
| Freeman et al. | Human liver sulphamate sulphohydrolase. Determinations of native protein and subunit M r values and influence of substrate agylcone structure on catalytic properties | |
| Myers et al. | Partial purification and some properties of a cellulase from Helix pomatia | |
| HIMENO et al. | β-Glucuronidase of bovine liver purification, properties, carbohydrate composition | |
| Bernier et al. | The turnip lysozyme | |
| Slomiany et al. | Glycosulfatase activity of Helicobacter pylori toward gastric mucin | |
| Heuermann et al. | Purification and characterization of a sialidase from Clostridium chauvoei NC08596 | |
| Freeman et al. | Human liver N-acetylglucosamine-6-sulphate sulphatase. Catalytic properties | |
| Neiderhiser et al. | The purification and properties of the glycoproteins of pig gallbladder bile | |
| Roggentin et al. | Purification and characterization of sialidase from Clostridium sordellii G12 | |
| Gao et al. | A highly selective ginsenoside Rb1-hydrolyzing β-D-glucosidase from Cladosporium fulvum | |
| Dijkerman et al. | The role of the cellulolytic high molecular mass (HMM) complex of the anaerobic fungus Piromyces sp. strain E2 in the hydrolysis of microcrystalline cellulose | |
| Coleman et al. | Characterization of a fungal glycoprotein that elicits a defence response in French bean | |
| ITOH et al. | Purification and characterization of α-galactosidase from watermelon | |
| Uda et al. | Purification and Characterization of β-N-Acetylhexosaminidase from the Ascidian, Halocynthia roretzi | |
| BEYDEMİR et al. | Purification of glucose 6-phosphate dehydrogenase from goose erythrocytes and kinetic properties | |
| Karlstam et al. | Purification and partial characterization of a novel hyaluronic acid-degrading enzyme from Antarctic krill (Euphausia superba) | |
| D'ANIELLO et al. | The purification and characterization of α-l-fucosidase from the hepatopancreas of Octopus vulgaris | |
| Tanaka et al. | Purification and characterization of a sialidase from Bacteroides fragilis SBT3182 | |
| Günata et al. | Hydrolysis of monoterpenyl-β-D-glucosides by cloned β-glucosidases from Bacillus polymyxa |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 8603051-7 Effective date: 19920210 Format of ref document f/p: F |