CS271346B2 - Method of high-purity chymopapain production - Google Patents

Description

(57) Řešení se týká způsobu výroby vysoce či stého chymopapainu ze surového chymopapainu. Podle řešení se surový chymopapain rozpustí v přítomnosti redukčního činidla ve vodé pufru. Čirá horní část roztoku se podrobí gelové chromatografi i a frakce, obsahující aktivní enzym se sbírají a suší vymrazováním.

271 346 (11) (13) 82 (51) Int. Cl?

C 12 N 9/50

Vynález se týká způsobu výroby vysoce čistého chymopapinu s vysokou specifickou aktivitou, ze surového chymopapainu pomocí gelové chromatografie.

Chymopapain je thiolproteáza, která spolu s papainem a papalyápeptidázou tvoří proteolytické (bílkoviny odbourávající) složky latexu papáji. Latex papáji se získává z ještě nezralých plodů stromu carica papaya (melounového stromu), který roste v tropech, tím, že se plody na více místech nařezávají a vytékající mléčná šťáva sé zachycuje a nakonec susí. f

Nejznámějši a nejlépe prozkoumaný enzym latexu je papain. Tento byl nejdříve získán Ballsovou et. al. krystalizací (Balíš, A.K., Lineweaver, H. a Thompson, R.R., Science, 86, 3794, 1937). Jensen a Balls dokázali, že - jestliže se z extraktu latexu, získaného z papáji, oddělí papain vysrážením síranem amonným - zbyde v roztoku jiná thiolproteáza. Tento poměrně dobře rozpustný a při pH 2 stabilní enzym získal označení chymopapain. Zvýšením koncentrace síranu amonného lze vysrážet i tento enzym. Tímto způsobem získaný surový chymopapain není homogenní látka, jak se dalo prokázat gelovou elektroforézou a chromatografií využívající iontaměniče. (Kahn, I.U. a Polgár, L., Biochem.8iophys.Acta, 760, 350-356, 1983 ; evropský patent No. 0 065, 395.

Chymopapain se používá v klinické praxi, v širokém měřítku pro léčení zlomenin meziobratlových plotének, neboť, když se použije ve vhodném množství rozpouští selektivně dřeňové jádro (nucleus pulposus) meziobratlových plotének (USP 3 320 131). Kromě lehkých vedlejších účinků objevujících se asi u 50 % léčených pacientů je možné pozorovat asi u 1 \ případů těžké anafylaktické poruchy (přecitlivělost proti cizorodým bílkovinám). (USP 4 039 682; Robinson, C.P., Drugs of Today, Vol. 19, č. 8, 1983, 454-460). Tyto lze odvozovat podle již zmíněného evropského patentu č. 0 065 395 od jedné ze složek bílkovin heterogenního chymopapainu. Tato složka dává s chloridem barnatým sraženinu a může se odstranit iontoměničovou chromatografií. Podle zmíněného patentního spisu je proteolyticky inaktivní látka zbarvená a vykazuje nepříjemný zápach.

Cílem vynálezu je vypracovat způsob, který nevykazuje nedostatky dosud známých způsobů a umožňuje jednoduše a levně vyrobit chymopapain s vysokou specifickou aktivitou.

Vynález spočívá na poznatku, že škodlivé složky, které se sráží chloridem barnatým, je možné odstranit! z chymopapainu gelovou chromatografií. Tato je technologicky jednodušší, levnější a minimálně desetkrát rychlejší než obvyklá iontoměničová chromátografie. Vynález spočívá dále na poznatku, že částečné inaktivaci chymopapinu během gelové chromatografie lze zabránit přísadou redukčních prostředků.

Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby vysoce čistého chymopapainu ze surového chymopapainu.Pro způsob je charakteristické, že se surový chymopapain rozpustí v přítomnosti redukčního činidla ve vodě nebo v pufru. Čirá horní část roztoku se podrobí gelové chromatografií a frakce obsahující aktivní enzym se sbírají a suší vymrazováním. Surový chymopapain se s výhodou rozpustí ve fosforečnanovém nebo acetátovém pufru s hodnotou pH 5 až 7, který obsahuje jako redukční činidlo chyst^in, merkaptoethanol nebo siřičitan sodný. Jako chromatografický sloupec se používá s výhodou sloupec ze Sephadexu G-50 nebo Sephadexu G-25, který byl předem ekvilibrován pufrem nebo roztokem soli, s výhodou fosforečnanovým pufrem obsahujícím cystein. V zájmu efektivní chromatografie se volí sloupec tak, aby jeho délka к průměru byla v poměru 5 až 50 : 1, s výhodou 20 : 1.

Vymražování se provádí při - 30 až - 70 °C, s výhodou při - 40 °C; led se odstraní o sobě známým způsobem vevakuu při tlaku mezi 1,333 Pa až 13,33 Pa, s výhodou 6,665 Pa.

Nepříjemně zapáchající látka, vysrážené chloridem barnatým, se nachází v chromatografickém peaku, který následuje po aktivním enzymu.

2.

Způsob podle vynálezu má následující přednosti:

Oddělení složky bílkovin, zodpovídající za škodlivé vedlejší účinky a poskytující ' s chloridem barnatým sraženinu, cestou dělové chromatografie je levnější, šetrnější a o desetinásobek rychlejší než známé způsoby. Proto je způsob podstatně vhodnější i pro velkoprovoz než iontoměničová chromatografie, která trvá asi 40 hodin. Za tuto dlouhou dobu se enzym nevyhnutelně poškodí. Naproti tomu se gelová chromatografie může .provést během doby kratší než 4 hodiny a poskytuje možnost chránit chemicky enzym pomocí fyziologicky nezávadných, iontových redukčních prostředků. Vzhledem к tomu, že gelová chromatografie vykazuje vyšší účinný stupeň dělení, je získaný produkt daleko čistší, což - jak se dá očekávat - vede к podstatnému oslabení vedlejších účinků.

Vynález je dále vysvětlen blíže pomocí následujících příkladů.

Příklad 1

2,5 g surového chymopapainu se rozpustí ve 135 ml fosforečnanového pufru, obsahujícího 10 mmolů cysteinu (3 mmoly, pH 6,5). Jestliže je roztok zakalený tak se přefiltruje. Po 15 až 30 minutách se 135 ml roztoku chromatografuje na sloupci Sephadexu G-25 (4 x 100 cm) pufrem, který obsahuje 3 mmoly fosforu a 1 mmol cysteinu a vykazuje pH 6,5. První peak (na obr. 1 označený A) obsahuje chymopapain asi 1,3 g. Peak 0 obsahuje nepříjemně páchnoucí látku, která tvoří sraženinu s chloridem barnatým. Enzym nacházející se v peaku A se sterilizuje a lyofilizuje. ,

Aktivita chymopapainu byla v každém případě určována sycením substrátu (Asbóth, d., Polgár, L., Acta Biochim.Acad.Sci., Hung., 12, 223-230, 1977) na p-nitrofenylesteru benzyloxykarbonylglycinu (ZGN) jako substrát v následující reakční směsi:

100 yul ZGN roztoku připraveného s acetonitrilem o koncentraci 1 mg/ml, 2,0 ml 0,1 M acetátového pufru s hodnotou pH 5,5, který obsahuje 1 mmol EOTA, 100 /U1 chymopapinu.

Pro charakterizování preparátu se dále udává změna optické hustoty (extinkce) měřitelná při 25 °C během 1 minuty při vlnové délce 340 nm, kterou vyvolá 1 mg chymopapainu na ml reakční směsi.

Vyrobený enzym má aktivitu 62.

Příklad 2

Pracuje sé způsobem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že sloupec má větší průměr (5 x 100 cm), specifická aktivita :70.

Příklad 3 .

Pracuje se způsobem popsaným v příkladu 1 s tím rozdílem, že se použije krátký a rychlý sloupec (10 x 16 cm). Zde nedochází к dělení látky dávající s chloridem barnatým sraženinu od chymopapainu. Specifická aktivita :42.

Příklad 4

Pracuje se způsobem popsaným v příkladu 1 s tím rozdílem, že pufr používaný ke gelové chromatografii neobsahuje žádný cystein. Specifická aktivita :51.

Příklad 5

Pracuje se způsobem popsaným v příkladu 1 s tím rozdílem, že se připraví koncentrovaný roztok z chymopapainu (obsah hílkovin 5 4 - hmotnost/obj. - 4). Specifická aktivita :55. .

CS 271546 82

Příklad 6

Pracuje se způsobem.popsaným v příkladu 1 s tím rozdílem, že se izolace neprovádí při teplotá místnosti, nýbrž při 2 až 10 °C. Specifická .aktivita :65.

Příklad 7 ‘

Pracuje se způsobem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že se místo Sephadexu G-25 použije Sephadex G-50. Specifická aktivita :53.

Příklad 8

Pracuje se způsobem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že koncentrace fosforečnanového pufru nečiní 3 mmoly, nýbrž 10 mmolů. Specifická aktivita :63.

Příklad 9

Pracuje se způsobem popsaným v příkladu nového pufru s pH 6,5 použije acetátový pufr

Příklad 10 .

Pracuje se způsobem popsaným v příkladu cysteinu, nýbrž 5 mmolů cysteinu. Specifická

Přílad 11

Pracuje se způsobem popsaným v příkladu jící aktivní látku (peak A), vztaženo na přítomné Specifická aktivita :63.

s tím rozdílem, Že se místo fosforečnas hodnotoupH 5,5. Specifická aktivita :67.

s tím rozdílem, že pufr neobsahuje 1 mmol aktivita :64.

1, s tím rozdílem, že se к frakci, obsahubílkovlny přidá 10 t hmot, cysteinu.

Příklad 12 _%

Pracuje se způsobem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že se jako redukční Činidlo místo cysteinu použije siřičitan sodný. Specifická aktivita ; 60.

Příklad 13

Pracuje se způsobem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že se od všech tří frakcí reprezentovaných chromatografickými peaky odebere vzorek vždy o objemu 1 ml a ke každému vzorku se přidá 0,2 ml n kyseliny solné a 0,2 ml 12¾ roztoku chloridu barnatého. Sraženina vznikne pouze ve frakci 8.

Příklad 14 o

Aktivita preparátu Chimodiactinu použitého jako referenční preparát se měří způsobem uvedeným v příkladu 1. Aktivita činí 28.

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Claims (6)

1. Způsob výroby chymopapainu ze surového chymopapainu, vyznačující se* tím, že se surový chymopapain rozpustí v přítomnosti-redukčního činidla ve vodě nebo pufru, čirá horní část roztoku se podrobí gelové chromatografií a frakce obsahující aktivní enzym se sbírají a suší vymrazováním.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako redukční činidlo použije cystein, merkaptoethanol nebo siřičitan sodný.

3. Způsob podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se jako pufr použije fosforečnanový nebo acetátový pufr s hodnotou pH pohybující se mezi 5 až 7.

CS 271346 02

4. Způsob podle jednoho z bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se jako chromatografický sloupec použije sloupec Sephadexu G-50 nebo Sephadexu G-25.

5. Způsob podle jednoho z bodu 1 až 4, vyznačující se tím, že poměr mezi délkou a průměrem použitého sloupce se pohybuje mezi 5 : 1 až 50 : 1, s výhodou 20 : 1.

6. Způsob podle jednoho z bodu 1 až 5, vyznačující se tím, že se sušení vymražováním provádí o sobě známým způsobem, s výhodou při - 40 °C a tlaku 6,665 Pa.