DD274355A1 - Verfahren zur herstellung von humanchoriongonadotropin aus rohen schwangerenharn-extrakten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Humanchoriongonadotropin (HCG) aus rohen Schwangerenharn-Extrakten fuer die Anwendung in der Human- und Veterinaermedizin durch spezifische Adsorption des HCG bei p H 5-7 an ein unloesliches Anthrachinonchlortriazin-Farbstoffgel, Auswaschen von unspezifisch gebundenen Ballasteiweissen mit Puffer von p H 7-8 und Elution der gereinigten HCG-Fraktion mit auf p H 6-8 gepufferter 0,2 M bis 1 M Alkalichloridloesung, wobei als Farbstoff besonders Cibacronblau F 3G - A (C.I. 62 211) und als unloeslicher Traeger quervernetztes Dextrangel oder Agarosegel geeignet sind.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Humanchoringonadotropin (HCG) aus rohen Schwangerenharnextrakten, das in der pharmazeutischen Industrie zur Herstellung von Hormonpräparaten für die Human- und Veterinärmedizin sowie in der landwirtschaftlichen Nutztierzucht in Form von Injektionspiäparaten angewendet werden kann.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß im Harn schwangerer Frauen Choriongonadotropin enthalten ist (ASCHHEIM und ZONDEK, Klin. Wschr. 6, 1322 (1927)), das für therapeutische Zwecke angereichert werden muß.

Zur Extraktion von HCG aus Schwangerenharn wurden zahlreiche Methoden beschrieben, die folgende Techniken umfaßten, wie Alkohol- und Acetonfällungen, Benzoesäure-Adsorption (KATZMAN, P.A. DOISY. E.A., J. biol.Chem.98,739(19321; LANDGREBE, F.W.et.al., Quart. J.exp.Physiol.33,309 (1954]) Kaolin-Adsorption mit und ohne Acetonfällung (SCOTT, L.D., Br. J. exp. Path. 21,320 |1941 j; LORAINE, J. A. - Brown, J. B., Acta endocr., Kopenhagen, 17, 250 (1954]), Permutit-Adsorntion (KATZMAN, P.A. et. al., J. biol. Chem. 148,501 (1943), MILTON, R.E., Br. med. J. 2,328 [1946]).

Mit Hilfe dieser Methoden konnten nur relativ rohe HCG-haltige Präparate erhalten werden.

Höher gereinigte Präparate wurden beschrieben durch die kombinierte Anwendung mehrerer Reinigungsschritte, wie fraktionierte Fällungen und Chromatographie an Ionenaustauscher-Harzen (GOT, R.- BOURRILLON, R., Biochem. Biophys. Acta 42,505 [960] sowie Chromatografie an Molekularsiebgelen und lonenaustauschergeien, wie CM-Sephadex^(R) und Sephaciex¹¹" G -100 und G- 200 sowie SE-Sephade><"", Biogel¹"¹ P-150 oder DEAESephadex (VAN HELL et. al., Nature212,261 [1966]; BELL, J.

et. al., Endocrinology 84,298 [1969])

Alle bekannten Methoden sind sehr arbeitsaufwendig und mit hchen Wirkstoffverlusten verbunden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat zum Ziel, ein therapeutisch anwendbares gereinigtes HCG in hoher Ausbeute zu gewinnen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein rationelles Verfahren zur Herstellung von gereinigtem HCG aus rohen Schwangerenharn-Extrakten, durch Entfernung inaktiver Ballaststoffe und Harnpigmente zu entwickeln.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß es möglich ist, HCG aus rohen Schwangerenharn-Extrnkten zu isolieren und anzureichern, wenn in folgender Weise verfahren wird:

Aus einer ballaststoffreichen stark gefärbten in bekannter Weise, z. B. nach der Methode von KATZMAN und DOISY (J. biol. Soc.

98,739 [1932]) erhaltenen HCG-haltigen Lösung läßt sich bei pH 5,0 bis 7,0, vorzugsweise 6,0, HCG von einem trägerfixiertem Anthrachionon-chlortriazin-Farbstoff in Gelform spezifisch adsorbieren, wobei inaktive Ballaststoffe und Harnpigmente zum größten Teil nicht gebunden werden, unspezifisch adsorbierte Ballasteiweiße werden mit einom Puffer von pH 7,0-8,0, vorzugsweise 8,0, abgelöst und herausgewaschen, durch Elution bei erhöhter lonenstärke mit einer gepufferten 0,2 bis 1 M Natrium- oder Kaliumchloridiösung von pH 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 8,0, erhält man die gereinigte HCG-Fraktion. Der Adsorptionsschritt ist sowohl in der chromatografischen Säulentechnik als auch im Batch-Verfahren durchführbar.

Als Farbstoff ist besonders Cibacronblau F 3 G - A (C. 1.62 211) geeignet, als unlöslicher Träger quervernetztes Dextrangel mit einem Wasseraufnahmevermögen von 7-22 ml/g oder Agarosegel zur Säulenchromatografie, Für Cibacronblau F 3G - A ist bisher eine hohe Spezifität nur zu Enzymen mit einer Nukleolid-Bindungstasche, wie Dehydrogenasen und einigen Kinasen, sowie eine unspezifische Affinität zu kationischen Proteinen bekannt.

Die Anwendung von Cibacronblau F 3G - A und verwandter Farbstoffe zur Anreicherung ist nur bei nukleotidabhängigen

Enzymen sowie bei einigen Plasma- und Zellproteinen gelungen, so daß ein Effekt zur Reinigung von Protochormonen nicht zu erwarten war.

Das HCG kann aus dem Eluat in bekannter Weise nach Dialyse und Sterilfiltration durch Lyophilisiercng oder nach

Konzentrierung mittels Ultrafiltration durch Alkohol-oder Acetonfällung gewonnen werden.

Der Reinheitsgrad des HCG, berechnet auf Festsubstanz, steigt so überraschend durch den einen erfindungsgemäßen

Reinigungsschritt von etwa 70IE/mg auf 2000-4 OOOIE/mg, d.h. also auf das 30-60fache, an. Bei 280nm beträgt E?im^{S =} 0,4-0,6 (Wasser). Die Substanz ist pyrogenfei.

Die biologische Testung der HCG-Aktivität und der pyrogenen Verunreinigungen erfolgt nach dem 2. Arzneibuch der DDR.

Ausführungsbeispiel

3750ml einer nach der Methode von KATZMAN und DOISY (J. biol. Soc. 98,739 [1932]) erhaltenen HCG-haltigen Lösung vom pH-Wert 6,0 mit einer HCG-Aktivität von 1500IE/ml (entspr. 5,6 Mio IE HCG) und einem E₂₈OOt_n- Wert von 18,4 werden über Nacht bei 4°C über eine Chromatografiesäule (0 6,5cm) filtriert, die 750rnl mit 0.008M Natriumphosphat Puffer, pH 6,0, äquilibriertes Blaugel enthält.

Das b ungelbgeiä'bte Filtrat enthält den größten Teil der Ballaststoffe und Harnpigmente. Die Säule wird mit 6000 ml 0,008 M Natriur, hosphat-Puffer, pH 8,0. nachgewaschen bis E₂MrIm im Durchlauf auf einen Wert unter 0,020 abgesunken ist.

Die Elution des HCG erfolgt mit 3000ml 0,008M Natriumphosphat-Puffer, pH 8,0, der 0,7 M an Natriumchlorid ist. Die Fraktionen mit den höchsten Extinktionen bei 280nm werden vereinigt und ergeben 1022ml (E₂eonm = 0,747).

Nac'i Dialyse und Sterilfiltration erhält man durch Lyophilisierung 1,942g einer farblosen Substanz mit einer spezifischen

HCG-Aktivität von 2400IE/mg (= 4,66Mio IE, entspr. 83,3% Aktivitätsausbeute).

Die Substanz ist bei der Prüfung auf pyrogene Verunreinigungen nach dem 2. AB-DDR pyrogenfrei. E ^u.1 ^0/f° (280nm)

1 cm

beträgt 0,403.

Das Blaugel wird in bekannter Weise hergestellt (KOPPER-SCHLÄGER, G. - BÖHME, H.-J. - HOFMANN, E. in: FIECHTER, A

(Hrsg.): Chromatography, Akademie-Verlag, Berlin 1983, S. 113) indem man eine Lösung von 3,75g Cibacronblau F 3G-A in 188ml Wasser bei 6CC zu einer wäßrigen Suspension von 37,5g quervernetztem Dextran - mit feiern

Wasseraufnahmevermögen von 10 ml/g-gequollen in 1300 ml Wasser, zutropft. Nach Zugabe von 168 g NaCI wird 1 Stunde bei 6O⁰C gerührt. Dann gibt man 18,5g Natriumcarbonat zu und rührt 2 Stunden bei 80°C. Nach dem Abkühlen wird das Blaugel abgesaugt, mit 25I Wasser, 11 Methanol und nochmals 101 Wassei gewaschen. Abschließend wird mit dem o.g. Puffer äquilibriert.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von Humanchoriongonadotropin aus rohen Schwangerenharnextrakten, dadurch gekennzeichnet.- daß das HCG aus einer ballaststoffreichen stark gefärbten HCG-haltigen Lösung bei einem pH-Weit 5,0 bis 7,0, vorzugsweise 6,0, von einem trägerfixierten Anthrachinonchlortriazin-Farbstoff in Gelform spezifisch adsobiert wird, unspezifisch gebundene Ballasteiweiße mit einem Puffer von pH 7,0 bis 8,0, vorzugsweise 8,0, ausgewaschen werden und die gereinigte HCG-Fraktion durch Elution mit gepufferter Alkalichloridlösung von pH 6,0 bis 8,0, vorzugweise 8,0, gewonnen wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Anthrachinonchlortriazin-Farbstoff Cibacronblau F 3G-A und als unlöslicher Träger quervernetztes Dextrangel mit einem Wasseraufnahmevermögen von 7-22 ml/g oder Agarosegel verwendet werden.

3. Verfahren nach Punkt 1 uns 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffer 0,001 bis 0,02, vorzugsweise 0,008 M Natriumphosphatpufferlösung verwendet, die zur Elution noch mit 0,2 M bis 1 M NaCI versetzt ist.