CN112501233B - 一种从富硒辣木中高效提取硒多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从从富硒辣木中高效提取硒多肽的方法，涉及天然产物提取技术领域，该方法包括以下步骤：(1)前处理、(2)提取辣木硒蛋白、(3)一次酶解、(4)二次酶解和(5)纯化；本发明提出了在富硒辣木中高效提取硒多肽，通过前处理、提取辣木硒蛋白、一次酶解、二次酶解和纯化等步骤对硒多肽进行提取，具有工艺简单、易于操作、提取效果好，产率高等优点。
Description
【技术领域】
本发明涉及天然产物提取技术领域，具体涉及一种从富硒辣木中高效提取硒多肽的方法。
【背景技术】
硒是人和动物的必需微量元素之一，硒可以提高免疫力，能加速免疫球蛋白及抗体产生。保护心血管与心肌，降低心血管病与心绞痛的发生率。在抗氧化抗衰老与抗癌防癌等方面有多种作用，并具有降低重金属毒害等特殊生理功能。被国内外科学家们誉为人类“抗癌之王、长寿元素、生命的火种、天然解毒剂、心脏守护神”。硒以无机和有机两种形式存在，同其他微量元素一样，动物对于无机硒和有机硒的利用率差别很大。有机硒会主动穿过肠壁，能有效地把硒元素贮存、积累在靶组织内，供机体利用，而无机硒则被动地扩散通过肠壁，具有强的助氧化作用，对脂肪造成氧化性应激而自我抵消，产生毒副作用，人体对其吸收和利用率低。正是因为无机硒化合物的毒性大、活性低，应用受到限制，因此开发有机硒、寻找生物活性高且毒性小的有机硒化合物并成为补硒剂非常必要。
辣木为辣木科辣木属多年生植物，是原生于印度北部喜马拉雅山南麓的速生树种，耐旱力强，喜生于砂壤土。辣木的根、茎、叶、花、种子、枝和树皮均含有丰富的营养成分和药用成分。辣木含有丰富的辣木黄酮、多糖类化合物、蛋白质、氨基酸和维生素等。
多肽是分子量介于蛋白质和氨基酸之间的活性物质；人们食用的蛋白质要经过消化酶解，对于肠胃较弱的人群，其利用率低，并且，其吸收后并不完全以单个氨基酸为单位进入血液，多数是以低分子量肽的方式进入血液循环；氨基酸虽然是分子量最小的，然经科学分析，氨基酸的消化利用率低于多肽；因此，对于各类体质虚弱者，多肽是最佳营养因子的补充品。
目前，在现有技术中并没有可以高效地得到从富硒辣木中提取得硒以及多肽这两种有益成分共存的方法，本发明应运而生。
【发明内容】
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种在富硒辣木中高效提取硒多肽的方法，通过前处理、提取辣木硒蛋白、一次酶解、二次酶解和纯化等步骤对硒多肽进行提取，具有工艺简单、易于操作、提取效果好，产率高等优点。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
一种从富硒辣木中高效提取硒多肽的方法，包括以下步骤：
(1)前处理：选取辣木叶，清洗后进行干燥处理，然后放入盐酸溶液中浸泡1-2h，取出研磨成浆，得到辣木浆，备用；
(2)提取辣木硒蛋白：在步骤(1)所得辣木浆中加入其重量20-30倍量的水，搅拌均匀得到辣木水溶液，接着在辣木水溶液中加入NaOH溶液拌匀，离心10-20min，收集上清液，即得辣木硒蛋白提取液备用；
(3)一次酶解：将步骤(2)所得辣木硒蛋白提取液的pH调节为6.5-7.0，温度调节为50-53℃，然后在辣木硒蛋白提取液中加入蛋白酶A，恒温搅拌，酶解1-2h，即得酶解液；
(4)二次酶解：将步骤(3)所得酶解液的pH调节为7.5-7.7，温度调节为30-35℃，接着在酶解液中加入蛋白酶B，恒温下搅拌酶解1-2h，得到多肽粗提液；
(5)纯化：在温度为40℃，pH为7.5的条件下，选择2000-3000Da的滤膜将多肽粗提液进行过滤分离，获得分离液后真空浓缩，即可得到硒多肽。
本发明中，进一步地，所述步骤(1)中的干燥处理为：首先将辣木叶置于温度为-6至-12℃条件下预冷冻15-25min，接着在压力为16-18Pa、温度为-15至-20℃条件下进行真空冷冻干燥2-3h。
本发明中，进一步地，所述步骤(1)中的盐酸溶液的质量分数为1.5-2％。
本发明中，进一步地，所述步骤(2)中加入的NaOH溶液的浓度为0.5-0.6mol/L，辣木水溶液与NaOH的质量比为35-40：1。
本发明中，进一步地，所述步骤(3)中所述的蛋白酶A为碱性蛋白酶和中性蛋白酶，其中，所述碱性蛋白酶与辣木硒蛋白提取液的质量比为1:25，所述中性蛋白酶与辣木硒蛋白提取液的质量比为1:25。
本发明中，进一步地，所述步骤(4)所述的蛋白酶B为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶与辣木硒蛋白提取液的质量比为1:280。
本发明中，进一步地，所述步骤(4)中的浓缩是浓缩至溶液浓度为1.3-1.5g/ml。
一种上述方式从富硒辣木中高效提取硒多肽的方法提取得到的硒多肽，该硒多肽可用于作为营养补充剂添加在食物中，具有抗氧化、提高免疫力、降低血糖等功效。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1.本发明提出了在从富硒辣木中高效提取硒多肽，通过前处理、提取辣木硒蛋白、一次酶解、二次酶解和纯化等步骤对硒多肽进行提取，合理的提取条件结合纯化方法，具有工艺简单、易于操作、提取纯度高等优点，通过本申请提取得到的硒多肽，可用于作为营养补充剂添加在食物中，多肽进入身体后直接作用于全身各细胞，主要控制人体的生长、发育、免疫调整和新陈代谢，人体很多活性物质都是以肽的形式存在的，具有抗氧化、提高免疫力、降低血糖等功效。具有广阔的市场应用前景。
2.本申请首先将用于提取硒多肽的辣木叶进行真空冷冻干燥处理，而在真空冷冻干燥之前还包括预冷冻处理，能够使得辣木叶内部结构形成均匀、颗粒大小适度的结晶结构，再经过真空冷冻干燥后，使得辣木叶内部结构形成很多均匀细密的“空穴”结构，在浸泡于处理液(盐酸溶液)中可以促进处理液中的各种成分充分浸渍到辣木叶内部，通过在酸性溶液中浸泡，使得辣木叶组织结构在酸性条件下变得松散，有利于后续有效成分的析出，再结合将辣木叶进行研磨的操作，能够使其植物蛋白的保护层被初步打破，利于后续辣木硒蛋白的提取操作，然后将其研磨成浆，并加入NaOH，离心收集上清液，将得到的硒蛋白进行酶解，从而将大分子蛋白质转变成易于为人体直接吸收的小分子多肽，该酶解方式包括两次酶解，效仿了人体消化道内的正常消化条件将硒蛋白分割成为特定的水解片段，对水解酶的种类以及用量、酶解的参数进行优化，整个过程条件温和，较其他方式的水解具有很大优势，避免了水解过程中产生环境污染问题以及硒多肽提取率低的问题；水解后得到的硒多肽还通过超滤手段进行纯化，去除硒多肽中含有的大分子蛋白质等物质造成的纯度低和存在异味的问题，可使得多肽纯度高达95％以上。
【具体实施方式】
下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不可以以任何方式限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种从富硒辣木中高效提取硒多肽的方法，具体包括以下步骤：
(1)前处理：选取辣木叶，清洗后进行干燥处理，然后放入盐酸溶液中浸泡1h，取出研磨成浆，得到辣木浆，备用；上述干燥处理为：首先将辣木叶置于温度为-6℃条件下预冷冻15min，接着在压力为16Pa、温度为-15℃条件下进行真空冷冻干燥2h；盐酸溶液的质量分数为1.5％；
(2)提取辣木硒蛋白：在步骤(1)所得辣木浆中加入其重量20倍量的水，搅拌均匀得到辣木水溶液，接着在辣木水溶液中加入NaOH溶液拌匀，离心10min，收集上清液，即得辣木硒蛋白提取液备用；加入的NaOH溶液的浓度为0.5mol/L，辣木水溶液与NaOH的质量比为35：1；
(3)一次酶解：将步骤(2)所得辣木硒蛋白提取液的pH调节为6.5，温度调节为50℃，然后在辣木硒蛋白提取液中加入蛋白酶A，恒温搅拌，酶解1h，即得酶解液；所述的蛋白酶A为碱性蛋白酶和中性蛋白酶，其中，所述碱性蛋白酶与辣木硒蛋白提取液的质量比为1:25，所述中性蛋白酶与辣木硒蛋白提取液的质量比为1:25；
(4)二次酶解：将步骤(3)所得酶解液的pH调节为7.5，温度调节为30℃，接着在酶解液中加入蛋白酶B，恒温下搅拌酶解1h，得到多肽粗提液；所述的蛋白酶B为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶与辣木硒蛋白提取液的质量比为1:280；
(5)纯化：在温度为40℃，pH为7.5的条件下，选择2000Da的滤膜将多肽粗提液进行过滤分离，获得分离液后真空浓缩至溶液浓度为1.3g/ml，即可得到硒多肽。
实施例2
本实施例提供一种从富硒辣木中高效提取硒多肽的方法，包括以下步骤：
(1)前处理：选取辣木叶，清洗后进行干燥处理，然后放入盐酸溶液中浸泡1.5h，取出研磨成浆，得到辣木浆，备用；上述干燥处理为：首先将辣木叶置于温度为-10℃条件下预冷冻20min，接着在压力为17Pa、温度为-17℃条件下进行真空冷冻干燥2.5h；盐酸溶液的质量分数为1.7％；
(2)提取辣木硒蛋白：在步骤(1)所得辣木浆中加入其重量25倍量的水，搅拌均匀得到辣木水溶液，接着在辣木水溶液中加入NaOH溶液拌匀，离心15min，收集上清液，即得辣木硒蛋白提取液备用；加入的NaOH溶液的浓度为0.5mol/L，辣木水溶液与NaOH的质量比为37：1；
(3)一次酶解：将步骤(2)所得辣木硒蛋白提取液的pH调节为6.6，温度调节为52℃，然后在辣木硒蛋白提取液中加入蛋白酶A，恒温搅拌，酶解1.5h，即得酶解液；所述的蛋白酶A为碱性蛋白酶和中性蛋白酶，其中，所述碱性蛋白酶与辣木硒蛋白提取液的质量比为1:25，所述中性蛋白酶与辣木硒蛋白提取液的质量比为1:25；
(4)二次酶解：将步骤(3)所得酶解液的pH调节为7.6，温度调节为32℃，接着在酶解液中加入蛋白酶B，恒温下搅拌酶解1.5h，得到多肽粗提液；所述的蛋白酶B为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶与辣木硒蛋白提取液的质量比为1:280；
(5)纯化：在温度为40℃，pH为7.5的条件下，选择2500Da的滤膜将多肽粗提液进行过滤分离，获得分离液后真空浓缩至溶液浓度为1.4g/ml，即可得到硒多肽。
实施例3
本实施例提供一种从富硒辣木中高效提取硒多肽的方法，包括以下步骤：
(1)前处理：选取辣木叶，清洗后进行干燥处理，然后放入盐酸溶液中浸泡2h，取出研磨成浆，得到辣木浆，备用；上述干燥处理为：首先将辣木叶置于温度为-12℃条件下预冷冻25min，接着在压力为18Pa、温度为-20℃条件下进行真空冷冻干燥3h；盐酸溶液的质量分数为2％；
(2)提取辣木硒蛋白：在步骤(1)所得辣木浆中加入其重量30倍量的水，搅拌均匀得到辣木水溶液，接着在辣木水溶液中加入NaOH溶液拌匀，离心20min，收集上清液，即得辣木硒蛋白提取液备用；加入的NaOH溶液的浓度为0.6mol/L，辣木水溶液与NaOH的质量比为40：1；
(3)一次酶解：将步骤(2)所得辣木硒蛋白提取液的pH调节为7.0，温度调节为53℃，然后在辣木硒蛋白提取液中加入蛋白酶A，恒温搅拌，酶解2h，即得酶解液；所述的蛋白酶A为碱性蛋白酶和中性蛋白酶，其中，所述碱性蛋白酶与辣木硒蛋白提取液的质量比为1:25，所述中性蛋白酶与辣木硒蛋白提取液的质量比为1:25；
(4)二次酶解：将步骤(3)所得酶解液的pH调节为7.7，温度调节为35℃，接着在酶解液中加入蛋白酶B，恒温下搅拌酶解2h，得到多肽粗提液；所述的蛋白酶B为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶与辣木硒蛋白提取液的质量比为1:280；
(5)纯化：在温度为40℃，pH为7.5的条件下，选择3000Da的滤膜将多肽粗提液进行过滤分离，获得分离液后真空浓缩至溶液浓度为1.5g/ml，即可得到硒多肽。
试验例
为了说明本申请的实用价值，申请人分几组做以下对比试验：
第一组：实施例2所述的方法制得的硒多肽；
第二组：去掉真空冷冻干燥的步骤，其他方式严格按照实施例2进行；
第三组：去掉盐酸溶液中浸泡的步骤，其他方式严格按照实施例2进行；
第四组：将酶解的操作换为：将步骤(2)所得辣木硒蛋白提取液的pH调节为7.0，温度调节为53℃，然后在辣木硒蛋白提取液中加入木瓜蛋白酶，恒温搅拌，酶解2h，即得多肽粗提液；其他方式严格按照实施例2进行；
第五组：去掉纯化的步骤，其他方式严格按照实施例2进行；
第六组：将真空冷冻干燥步骤换为常温自然干燥3h，其他方式严格按照实施例2进行。
比较上述组别中硒多肽的提取效果，记录数据如表1所示：
表1硒多肽提取效果对比表
从表1可知，通过本申请的方式从富硒辣木中提取硒多肽的提取率最高，且得到的硒多肽纯度最高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种从富硒辣木中高效提取硒多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)前处理：选取辣木叶，清洗后进行干燥处理，然后放入盐酸溶液中浸泡1-2h，取出研磨成浆，得到辣木浆，备用；
(2)提取辣木硒蛋白：在步骤(1)所得辣木浆中加入其重量20-30倍量的水，搅拌均匀得到辣木水溶液，接着在辣木水溶液中加入NaOH溶液拌匀，离心10-20min，收集上清液，即得辣木硒蛋白提取液备用；
(3)一次酶解：将步骤(2)所得辣木硒蛋白提取液的pH调节为6.5-7.0，温度调节为50-53℃，然后在辣木硒蛋白提取液中加入蛋白酶A，恒温搅拌，酶解1-2h，即得酶解液；
(4)二次酶解：将步骤(3)所得酶解液的pH调节为7.5-7.7，温度调节为30-35℃，接着在酶解液中加入蛋白酶B，恒温下搅拌酶解1-2h，得到多肽粗提液；
(5)纯化：在温度为40℃，pH为7.5的条件下，选择2000-3000Da的滤膜将多肽粗提液进行过滤分离，获得分离液后真空浓缩，即可得到硒多肽；
所述步骤(1)中的干燥处理为：首先将辣木叶置于温度为-6至-12℃条件下预冷冻15-25min，接着在压力为16-18Pa、温度为-15至-20℃条件下进行真空冷冻干燥2-3h；
所述步骤(3)中所述的蛋白酶A为碱性蛋白酶和中性蛋白酶；所述步骤(4)所述的蛋白酶B为胰蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的一种从富硒辣木中高效提取硒多肽的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的盐酸溶液的质量分数为1.5-2％。
3.根据权利要求1所述的一种从富硒辣木中高效提取硒多肽的方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入的NaOH溶液的浓度为0.5-0.6mol/L，辣木水溶液与NaOH的质量比为35-40：1。
4.根据权利要求1所述的一种从富硒辣木中高效提取硒多肽的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶与辣木硒蛋白提取液的质量比为1:25，所述中性蛋白酶与辣木硒蛋白提取液的质量比为1:25。
5.根据权利要求1所述的一种从富硒辣木中高效提取硒多肽的方法，其特征在于，所述胰蛋白酶与辣木硒蛋白提取液的质量比为1:280。
6.一种采用权利要求1-5任一项所得的从富硒辣木中高效提取硒多肽的方法提取得到的硒多肽。
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