CN112795614B - 一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物及其应用 - Google Patents

一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物肽制备技术领域，具体涉及一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物及其应用。本发明提供的复合多肽提取物以低食用价值海参、辣木叶为原料，通过食品加工技术制备得到，该复合多肽提取物具有良好降血糖、降血脂活性。同时，本发明提取工艺简单、整个工艺流程均可达食品级要求，可应用于药品、保健品和食品等领域当中。

Description

一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物及其应用
技术领域
本发明属于生物肽制备技术领域，具体涉及一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物及其应用。
背景技术
在糖尿病是一种与遗传因素和多种环境因素相关的慢性全身代谢性疾病，以2型糖尿病最为复杂，且患病率最高，在我国患病人群中占90%以上。目前，我国约有1.1亿糖尿病患者，是世界上糖尿病患者人数最多的国家。糖尿病通常引发高血脂症，高血脂症也会导致糖尿病的发生发展。因此，糖尿病合并高血脂症非常常见，其引起的危害也非常之大，然而轻度高血脂症通常没有不适感，所以常常被忽略。因此，开发具有降糖控脂活性且无毒副作用的保健食品与药品具有显著的社会经济效益。生物活性肽水溶性好、稳定性好、易吸收，因其特殊的生理功能，包括抗氧化、降血糖、降血压、降血脂、增强免疫以及降尿酸等活性，越来越受到人们的重视，并日趋成为保健药物以及食品工业领域的研究热点。
海参富含蛋白质，是海洋中重要的药食两用资源，位列海八珍之首，更是滋补佳品。世界上大约有1250种海参，其中20种海参具有较高的食用价值，其中仿刺参食用品质上乘，是公认的最有商业价值的海珍品。尽管以仿刺参为原料制备功能性食品因子的报道很多，但是由于其昂贵价格，产品腥味重，海参肽产业化困难，市场推广受阻。包括仿刺参在内的高食用价值海参不适合作为工业上制备海参肽的原料。叶瓜参广泛分布于北极地区、加拿大、俄罗斯、英国、挪威，在我国海参市场有相当大的占有率，产量高，价格低廉，相对于价格昂贵的刺参，是开发海参肽的优质资源。
辣木，是一种快速生长的多年生被子植物，具有环境适应性强、营养丰富全面、多种生物活性等优点。辣木广泛种植于亚洲、非洲热带和亚热带地区，其中包括印度、古巴、埃及、菲律宾、斯里兰卡、泰国等国家，在我国广东、广西、云南、福建、台湾等地均有引种栽培。在印度、菲律宾群岛及部分非洲国家，辣木叶是高营养价值的蔬菜，受到青睐；2012年，辣木叶被国家卫生和计划生育委员会批准作为新资源食品。辣木叶蛋白含有较丰富的供质子或供电子能力的氨基酸、疏水性氨基酸以及酸性氨基酸，是一种优质的植物蛋白。辣木叶资源量丰富，价格低廉，是开发保健食品的优质资源。
但是，目前在海产品、农产品精深加工方面，叶瓜参、辣木叶受关注度低，开发程度低，资源利用率低（叶瓜参仅用作低廉的餐饮配菜；辣木叶仅以其干燥产品的形式在市面上流通）；叶瓜参肽、辣木叶肽体内降血糖、降血脂作用研究尚未有所报导，受关注度低，商品化程度很低。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物及其应用。本发明提供的复合多肽提取物以低食用价值海参、辣木叶为原料，通过食品加工技术制备得到，该复合多肽提取物具有良好降血糖、降血脂活性。并且本发明的提取工艺简单、整个工艺流程均可达食品级要求，可应用于药品、保健品和食品等领域当中。
本发明中提供的一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物，为叶瓜参多肽提取物和辣木叶多肽提取物的复合物。其中，叶瓜参多肽提取物以干叶瓜参为原料，经过温水泡发后绞碎、加水酶解、高温酸提、离心分离等工艺，有针对性地提取叶瓜参中的多肽类物质。辣木叶多肽提取物以干辣木叶为原料，经过粉碎、乙醇脱色去杂、过滤烘干、加水匀浆、酶解、离心分离等工艺，有针对性的提取辣木叶中多肽类物质。将叶瓜参多肽提取物和辣木叶多肽提取物混合后，超滤去杂、减压浓缩、分级醇沉、沉淀复溶、二次减压浓缩，最后喷雾干燥，得到一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物。所述干辣木叶与干叶瓜参的质量比为0.6~1:1。制得的复合多肽提取物的蛋白质含量>70%，在动物水平上具有良好的降糖控脂功效。
本发明提供的具有降糖控脂活性的复合多肽提取物的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）温水泡发干海参：将干叶瓜参用温水浸泡，用去离子水清洗后得到泡发后湿海参；
（2）绞碎湿海参：将步骤（1）所得湿海参绞碎，得到海参肉糜；
（3）加水酶解海参：将步骤（2）所得海参肉糜与去离子水混合，搅拌均匀，升温，加入复合蛋白酶，恒温搅拌进行酶解，得混悬液1；
（4）高温酸提：在混悬液1中加入去离子水，搅拌均匀后加入柠檬酸，调节pH，升温后，高温浸提，得混悬液2；
（5）离心分离海参多肽提取物：将混悬液2离心去渣，取上清液，得提取液3；
（6）粉碎辣木叶：将干辣木叶粉碎后过40目筛；
（7）乙醇去除辣木叶色素：将步骤（6）所得辣木叶粉与乙醇溶液混合，恒温搅拌，过滤弃去上清液，沉淀烘干得辣木叶干粉；
（8）加水匀浆：将步骤（7）所得辣木叶干粉与去离子水混合，均质匀浆得混悬液4，调节pH，升温，恒温搅拌得混悬液5；
（9）酶解辣木叶：在混悬液5中加入胰酶，恒温搅拌进行酶解，灭酶，得混悬液6；
（10）离心分离辣木叶多肽提取物：将混悬液6离心去渣，取上清液，得提取液7；
（11）复配：将步骤（5）所得提取液3和步骤（10）所得提取液7混合，搅拌均匀，得混合提取液8；
（12）超滤去杂：采用超滤膜去除混合提取液8中的多糖，收集小分子滤过液，减压浓缩，得混合提取液9；
（13）分级醇沉：在步骤（12）所得混合提取液9中加入无水乙醇，匀速搅拌后，离心去除沉淀，得到上清液A；将上清液A减压浓缩后，加入无水乙醇，匀速搅拌，二次离心，得沉淀10；
（14）沉淀复溶：将沉淀10与去离子水混合，升温搅拌，得混合提取液11；
（15）减压浓缩：将混合提取液11减压浓缩，得混合提取液12；
（16）喷雾干燥：将混合提取液12进行喷雾干燥，得复合多肽提取物。
进一步地，步骤（1）中，所述温水浸泡条件为：去离子水加入量为干叶瓜参质量的20~30倍，水温为50~60 ℃，浸泡时间为10~14 h；所述清洗海参的去离子水的加入量为干叶瓜参质量的20~30倍，水温为40~50 ℃，浸泡时间为20~30 min，清洗次数为2~4次。
进一步地，步骤（3）中，所述海参肉糜与去离子水料液比为1:1~1:3 g/mL，混合时搅拌速率为200~400 r/min，搅拌时间为40~60 min，升温的最终温度为52~58 ℃，复合蛋白酶的加入量为海参肉糜质量的0.5~2.5 %，酶解温度为52~58 ℃，搅拌速率为120~180 r/min，酶解时间为3~6 h。
进一步地，步骤（4）中，所述去离子水的加入量为海参肉糜质量的2~4倍，所述搅拌条件为：搅拌速率为200~400 r/min，搅拌时间为15~25 min；加入柠檬酸使混合液pH为4.5~5.5，升温至95~105℃，搅拌速率为200~400 r/min条件下提取60~90 min；
进一步地，步骤（5）中，所述离心条件为：离心力为6000~8000 g离心15~25 min。
进一步地，步骤（7）中，所述辣木叶粉与乙醇料液比为1:6~1:10 g/mL，乙醇浓度为85~95 %(v/v)，搅拌速率为200~400 r/min，搅拌温度为35~45℃，搅拌时间为1~3 h，使用100目绢布过滤，烘干温度为50~60℃。
进一步地，步骤（8）中，所述辣木叶干粉与去离子水料液比为1:8~1:14 g/mL，匀浆时剪切速率为2000~4000 rpm，剪切时间5~15 min。所述pH为7.5~8.5，升温至52~58 ℃，搅拌速率为200~400 r/min，搅拌时间为2~4 h。
进一步地，步骤（9）中，所述胰酶的加入量为辣木叶干粉质量的1.5~3.5 %，酶解温度为52~58 ℃，搅拌速率为120~180 r/min，酶解时间为8~12 h，灭酶温度为95~105 ℃，灭酶时间为15~25 min，搅拌速率为200~400 r/min。
进一步地，步骤（10）中，所述离心条件为：离心力为6000~8000 g离心15~25 min。
进一步地，步骤（11）中，搅拌速率为200~400 r/min，搅拌时间为15~25 min。
进一步地，步骤（12）中，所述超滤去杂的超滤膜截留分子量为10000 Da，超滤次数为2~4次，小分子滤过液为分子量<10000 Da的滤过液，减压浓缩温度为50~60℃，混合提取液9固形物含量为18~24 wt%。
进一步地，步骤（13）中，所述无水乙醇为预冷至4~8℃的无水乙醇，所述分级醇沉的步骤为：第一步，加入无水乙醇，使体系中乙醇含量达到6~10 wt%，在60~100 r/min搅拌速率下搅拌2~4 h，6000~8000 g离心力下离心10~20 min，弃去沉淀，上清液A经50~60℃减压浓缩使固形物含量为18~24 wt%；第二步，在上清液A中加入无水乙醇，使体系中乙醇含量达到60~70 wt%，在60~100 r/min搅拌速率下搅拌2~4 h，6000~8000 g离心力下离心10~20min，收集沉淀10。
进一步地，步骤（14）中，所述去离子水的加入量为沉淀10质量的12~16倍，升温至40~50℃，在200~400 r/min搅拌速率下搅拌30~60 min。
进一步地，步骤（15）中，所述减压浓缩温度为50~60℃，混合提取液12固形物含量为20~30 wt%。
本发明还保护了所述的具有降糖控脂活性的复合多肽提取物制备营养健康食品及降糖控脂药品、保健食品中的应用，所述营养健康食品包括代餐粉和固体饮料。
本发明制备的具有降糖控脂活性的复合多肽提取物，根据叶瓜参、辣木叶原料结构组织、蛋白结构特征，分别选取具有良好生理活性的海参以及辣木叶为制备动物蛋白肽与植物蛋白肽的原料，通过简单合适的前处理手段，有针对性地释放其中活性肽段，并将动物蛋白肽（叶瓜参肽）与植物蛋白肽（辣木叶肽）进行复配，一方面通过两者之间的协同增效作用，更有效地在体内起到降低血糖水平、改善脂质代谢作用，是实现兼具降糖控脂功能性因子制备的新途经；一方面通过部分植物蛋白肽（辣木叶肽）的替代，降低生产成本，降低产品腥味，是实现海参肽（叶瓜参肽）商品化的重要突破口。
与现有技术相比，本发明提供的具有降糖控脂活性的复合多肽提取物具有以下优势：
（1）本发明提供的具有降糖控脂活性的复合多肽提取物采用动物蛋白肽与植物蛋白肽复配思路，分别选取具有良好生理活性的海参以及辣木叶为制备动物蛋白肽与植物蛋白肽的原料，并从资源量、价格出发，锁定到价格低廉、蛋白含量丰富的叶瓜参，制得的得复合多肽提取物风味良好，富含动物蛋白肽以及植物蛋白肽，并且能有效地在体内起到降低血糖水平、改善脂质代谢作用，是开发药品、保健品和健康食品良好的来源。
（2）本发明提供的具有降糖控脂活性的复合多肽提取物充分依据叶瓜参、辣木叶原料结构组织以及化学成分特点，采用简便的前处理方法、环境友好的乙醇、安全可靠的控制酶解法，分别制备得到叶瓜参肽提取物、辣木叶肽提取物，混合后，采用高效的多肽富集方法，获得蛋白含量高、具有显著降糖控脂功效的复合多肽提取物，整个工艺流程简单易行，无有机试剂添加，无物理场辅助，生产成本低，符合食品级加工要求。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。
所述复合蛋白酶，购于诺维信公司；所述胰酶，购于南宁庞博生物工程有限公司。
本发明所用其他试剂均为常用试剂，均可在常规试剂生产销售公司购买。
实施例1一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物
所述具有降糖控脂活性的复合多肽提取物的制备步骤如下：
（1）温水泡发干海参：使用干叶瓜参质量20倍的去离子水浸泡干叶瓜，浸泡温度为50 ℃，浸泡10 h后，弃去浸泡废水，用温度为40 ℃、质量为干叶瓜参质量20倍的去离子水浸泡湿叶瓜参20 min，弃去浸泡废水，按相同步骤再次清洗湿叶瓜参1次；
（2）绞碎湿海参：将步骤（1）所得湿海参绞碎，得到海参肉糜；
（3）加水酶解海参：将步骤（2）所得海参肉糜与去离子水按照料液比1:1 g/mL进行混合，在200 r/min搅拌速率下搅拌40 min，升温至52 ℃，加入质量为海参肉糜质量0.5%的复合蛋白酶（购于诺维信公司），在120 r/min搅拌速率、52 ℃条件下恒温酶解3 h，得混悬液A1；
（4）高温酸提：在混悬液A1中加入质量为海参肉糜质量2倍的去离子水，在200 r/min搅拌速率下搅拌15 min，加入柠檬酸，调节混合液pH 为4.5，升温至95 ℃，在200 r/min搅拌速率、95 ℃条件下恒温提取60 min得混悬液A2；
（5）离心分离海参多肽提取物：将混悬液A2在6000 g离心15 min，去渣，取上清液，得提取液A3；
（6）粉碎辣木叶：称取质量为干叶瓜参质量0.6倍的干辣木叶，粉碎后过40目筛；
（7）乙醇去除辣木叶色素：将步骤（6）所得辣木叶粉与浓度为85%（v/v）的乙醇溶液按照料液比1:6 g/mL混合，在200 r/min搅拌速率、35 ℃条件下恒温搅拌1 h，100目绢布过滤后，弃去上清液，50℃烘干沉淀，得辣木叶干粉；
（8）加水匀浆：将步骤（7）所得辣木叶干粉与去离子水按照料液比1:8 g/mL混合，在2000 rpm剪切速率下均质匀浆5 min，得混悬液A4，调节pH至7.5，升温至52 ℃，在200 r/min搅拌速率下恒温搅拌2 h，得混悬液A5；
（9）酶解辣木叶：在混悬液A5中加入质量为辣木叶干粉质量1.5%的胰酶（购于南宁庞博生物工程有限公司），在120 r/min搅拌速率、52 ℃条件下恒温酶解8 h，在200 r/min搅拌速率、95 ℃条件下恒温搅拌15 min进行灭酶，得混悬液A6；
（10）离心分离辣木叶多肽提取物：将混悬液A6在6000 g时离心15 min，去渣，取上清液，得提取液A7；
（11）复配：将步骤（5）所得提取液A3和步骤（10）所得提取液A7混合后，在200 r/min搅拌速率下恒温搅拌15 min，得混合提取液A8；
（12）超滤去杂：采用截留分子量为10000 Da的超滤膜纯化混合提取液A8，收集分子量<10000 Da的小分子滤过液，超滤次数为2次，50 ℃减压浓缩，得到固形物含量为18wt%的混合提取液A9；
（13）分级醇沉：在步骤（12）所得混合提取液A9中加入预冷至4℃的无水乙醇，使体系中乙醇含量达到6 wt%，在60 r/min搅拌速率下搅拌2 h后，6000 g离心10 min，弃去沉淀，得到上清液AA；上清液AA经50 ℃减压浓缩后，加入预冷至4 ℃的无水乙醇，使体系中乙醇含量达到60 wt%，在60 r/min搅拌速率下搅拌2 h后，6000 g离心10 min，得沉淀A10；
（14）沉淀复溶：在沉淀A10中加入质量为沉淀A10质量12倍的去离子水，升温至40℃，在200 r/min搅拌速率下恒温搅拌30 min，得混合提取液A11；
（15）减压浓缩：混合提取液A11经50℃减压浓缩，得固形物含量为20 wt%的混合提取液A12；
（16）喷雾干燥：将混合提取液A12进行喷雾干燥，得复合多肽提取物A。
实施例2一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物
所述具有降糖控脂活性的复合多肽提取物的制备步骤如下：
（1）温水泡发干海参：使用干叶瓜参质量25倍的去离子水浸泡干叶瓜，浸泡温度为55 ℃，浸泡12 h后，弃去浸泡废水，用温度为45 ℃、质量为干叶瓜参质量25倍的去离子水浸泡湿叶瓜参25 min，弃去浸泡废水，按相同步骤再次清洗湿叶瓜参2次；
（2）绞碎湿海参：将步骤（1）所得湿海参绞碎，得到海参肉糜；
（3）加水酶解海参：将步骤（2）所得海参肉糜与去离子水按照料液比1:2 g/mL进行混合，在300 r/min搅拌速率下搅拌50 min，升温至55 ℃，加入质量为海参肉糜质量1.5%的复合蛋白酶（购于诺维信公司），在150 r/min搅拌速率、55 ℃条件下恒温酶解4.5 h，得混悬液B1；
（4）高温酸提：在混悬液B1中加入质量为海参肉糜质量3倍的去离子水，在300 r/min搅拌速率下搅拌20 min，加入柠檬酸，调节混合液pH 为5.0，升温至100 ℃，在300 r/min搅拌速率、100 ℃条件下恒温提取75 min得混悬液B2；
（5）离心分离海参多肽提取物：将混悬液B2在7000 g离心20 min，去渣，取上清液，得提取液B3；
（6）粉碎辣木叶：称取质量为干叶瓜参质量0.8倍的干辣木叶，粉碎后过40目筛；
（7）乙醇去除辣木叶色素：将步骤（6）所得辣木叶粉与浓度为90%（v/v）的乙醇溶液按照料液比1:8 g/mL混合，在300 r/min搅拌速率、40 ℃条件下恒温搅拌2 h，100目绢布过滤后，弃去上清液，55℃烘干沉淀，得辣木叶干粉；
（8）加水匀浆：将步骤（7）所得辣木叶干粉与去离子水按照料液比1:11 g/mL混合，在3000 rpm剪切速率下均质匀浆10 min，得混悬液B4，调节pH至8.0，升温至55 ℃，在300r/min搅拌速率下恒温搅拌3 h，得混悬液B5；
（9）酶解辣木叶：在混悬液B5中加入质量为辣木叶干粉质量2.5%的胰酶（购于南宁庞博生物工程有限公司），在150 r/min搅拌速率、55 ℃条件下恒温酶解10 h，在300 r/min搅拌速率、100 ℃条件下恒温搅拌20 min进行灭酶，得混悬液B6；
（10）离心分离辣木叶多肽提取物：将混悬液B6在7000 g时离心20 min，去渣，取上清液，得提取液B7；
（11）复配：将步骤（5）所得提取液B3和步骤（10）所得提取液B7混合后，在300 r/min搅拌速率下恒温搅拌20 min，得混合提取液B8；
（12）超滤去杂：采用截留分子量为10000 Da的超滤膜纯化混合提取液B8，收集分子量<10000 Da的小分子滤过液，超滤次数为3次，55 ℃减压浓缩，得到固形物含量为21wt%的混合提取液B9；
（13）分级醇沉：在步骤（12）所得混合提取液B9中加入预冷至6℃的无水乙醇，使体系中乙醇含量达到8 wt%，在80 r/min搅拌速率下搅拌3 h后，7000 g离心15 min，弃去沉淀，得到上清液BA；上清液BA经55 ℃减压浓缩后，加入预冷至6 ℃的无水乙醇，使体系中乙醇含量达到65 wt%，在80 r/min搅拌速率下搅拌3 h后，7000 g离心15 min，得沉淀B10；
（14）沉淀复溶：在沉淀B10中加入质量为沉淀B10质量14倍的去离子水，升温至45℃，在300 r/min搅拌速率下恒温搅拌45 min，得混合提取液B11；
（15）减压浓缩：混合提取液B11经55℃减压浓缩，得固形物含量为25 wt%的混合提取液B12；
（16）喷雾干燥：将混合提取液B12进行喷雾干燥，得复合多肽提取物B。
实施例3 一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物
所述具有降糖控脂活性的复合多肽提取物的制备步骤如下：
（1）温水泡发干海参：使用干叶瓜参质量30倍的去离子水浸泡干叶瓜，浸泡温度为60 ℃，浸泡14 h后，弃去浸泡废水，用温度为50 ℃、质量为干叶瓜参质量30倍的去离子水浸泡湿叶瓜参30 min，弃去浸泡废水，按相同步骤再次清洗湿叶瓜参3次；
（2）绞碎湿海参：将步骤（1）所得湿海参绞碎，得到海参肉糜；
（3）加水酶解海参：将步骤（2）所得海参肉糜与去离子水按照料液比1:3 g/mL进行混合，在400 r/min搅拌速率下搅拌60 min，升温至58 ℃，加入质量为海参肉糜质量2.5%的复合蛋白酶（购于诺维信公司），在180 r/min搅拌速率、58 ℃条件下恒温酶解6 h，得混悬液C1；
（4）高温酸提：在混悬液C1中加入质量为海参肉糜质量4倍的去离子水，在400 r/min搅拌速率下搅拌25 min，加入柠檬酸，调节混合液pH 为5.5，升温至105 ℃，在400 r/min搅拌速率、105 ℃条件下恒温提取90 min得混悬液C2；
（5）离心分离海参多肽提取物：将混悬液C2在8000 g离心25 min，去渣，取上清液，得提取液C3；
（6）粉碎辣木叶：称取质量为干叶瓜参质量1倍的干辣木叶，粉碎后过40目筛；
（7）乙醇去除辣木叶色素：将步骤（6）所得辣木叶粉与浓度为95%（v/v）的乙醇溶液按照料液比1:10 g/mL混合，在400 r/min搅拌速率、45 ℃条件下恒温搅拌3 h，100目绢布过滤后，弃去上清液，60℃烘干沉淀，得辣木叶干粉；
（8）加水匀浆：将步骤（7）所得辣木叶干粉与去离子水按照料液比1:14 g/mL混合，在4000 rpm剪切速率下均质匀浆15 min，得混悬液C4，调节pH至8.5，升温至58 ℃，在400r/min搅拌速率下恒温搅拌4 h，得混悬液C5；
（9）酶解辣木叶：在混悬液C5中加入质量为辣木叶干粉质量3.5%的胰酶（购于南宁庞博生物工程有限公司），在180 r/min搅拌速率、58 ℃条件下恒温酶解12 h，在400 r/min搅拌速率、105 ℃条件下恒温搅拌25 min进行灭酶，得混悬液C6；
（10）离心分离辣木叶多肽提取物：将混悬液C6在8000 g时离心25 min，去渣，取上清液，得提取液C7；
（11）复配：将步骤（5）所得提取液C3和步骤（10）所得提取液C7混合后，在400 r/min搅拌速率下恒温搅拌25 min，得混合提取液C8；
（12）超滤去杂：采用截留分子量为10000 Da的超滤膜纯化混合提取液C8，收集分子量<10000 Da的小分子滤过液，超滤次数为4次，60 ℃减压浓缩，得到固形物含量为24wt%的混合提取液C9；
（13）分级醇沉：在步骤（12）所得混合提取液C9中加入预冷至8℃的无水乙醇，使体系中乙醇含量达到10 wt%，在100 r/min搅拌速率下搅拌4 h后，8000 g离心20 min，弃去沉淀，得到上清液CA；上清液CA经60 ℃减压浓缩后，加入预冷至8 ℃的无水乙醇，使体系中乙醇含量达到70 wt%，在100 r/min搅拌速率下搅拌4 h后，8000 g离心20 min，得沉淀C10；
（14）沉淀复溶：在沉淀C10中加入质量为沉淀C10质量16倍的去离子水，升温至50℃，在400 r/min搅拌速率下恒温搅拌60 min，得混合提取液C11；
（15）减压浓缩：混合提取液C11经60℃减压浓缩，得固形物含量为30 wt%的混合提取液C12；
（16）喷雾干燥：将混合提取液C12进行喷雾干燥，得复合多肽提取物C。
对比例1 一种海参多肽提取物
所述海参多肽提取物的制备步骤如下：
（1）温水泡发干海参：使用干叶瓜参质量30倍的去离子水浸泡干叶瓜，浸泡温度为60 ℃，浸泡14 h后，弃去浸泡废水，用温度为50 ℃、质量为干叶瓜参质量30倍的去离子水浸泡湿叶瓜参30 min，弃去浸泡废水，按相同步骤再次清洗湿叶瓜参3次；
（2）绞碎湿海参：将步骤（1）所得湿海参绞碎，得到海参肉糜；
（3）加水酶解海参：将步骤（2）所得海参肉糜与去离子水按照料液比1:3 g/mL进行混合，在400 r/min搅拌速率下搅拌60 min，升温至58 ℃，加入质量为海参肉糜质量2.5%的复合蛋白酶（购于诺维信公司），在180 r/min搅拌速率、58 ℃条件下恒温酶解6 h，得混悬液D1；
（4）高温酸提：在混悬液D1中加入质量为海参肉糜质量4倍的去离子水，在400 r/min搅拌速率下搅拌25 min，加入柠檬酸，调节混合液pH 为5.5，升温至105 ℃，在400 r/min搅拌速率、105 ℃条件下恒温提取90 min得混悬液D2；
（5）离心分离海参多肽提取物：将混悬液D2在8000 g离心25 min，去渣，取上清液，得提取液D3；
（6）超滤去杂：采用截留分子量为10000 Da的超滤膜纯化提取液D3，收集分子量<10000 Da的小分子滤过液，超滤次数为4次，60 ℃减压浓缩，得到固形物含量为24 wt%的提取液D4；
（7）分级醇沉：在步骤（6）所得提取液D4中加入预冷至8℃的无水乙醇，使体系中乙醇含量达到10 wt%，在100 r/min搅拌速率下搅拌4 h后，8000 g离心20 min，弃去沉淀，得到上清液DA；上清液DA经60 ℃减压浓缩后，加入预冷至8 ℃的无水乙醇，使体系中乙醇含量达到70 wt%，在100 r/min搅拌速率下搅拌4 h后，8000 g离心20 min，得沉淀D5；
（8）沉淀复溶：在沉淀D5中加入质量为沉淀D5质量16倍的去离子水，升温至50 ℃，在400 r/min搅拌速率下恒温搅拌60 min，得提取液D6；
（9）减压浓缩：提取液D6经60℃减压浓缩，得固形物含量为30 wt%的提取液D7；
（10）喷雾干燥：将提取液D7进行喷雾干燥，得海参多肽提取物D。
对比例2 一种辣木叶多肽提取物
所述辣木叶多肽提取物的制备步骤如下：
（1）粉碎辣木叶：干辣木叶粉碎后过40目筛；
（2）乙醇去除辣木叶色素：将步骤（1）所得辣木叶粉与浓度为95%（v/v）的乙醇溶液按照料液比1:10 g/mL混合，在400 r/min搅拌速率、45 ℃条件下恒温搅拌3 h，100目绢布过滤后，弃去上清液，60℃烘干沉淀，得辣木叶干粉；
（3）加水匀浆：将步骤（2）所得辣木叶干粉与去离子水按照料液比1:14 g/mL混合，在4000 rpm剪切速率下均质匀浆15 min，得混悬液E1，调节pH至8.5，升温至58 ℃，在400r/min搅拌速率下恒温搅拌4 h，得混悬液E2；
（4）酶解辣木叶：在混悬液E2中加入质量为辣木叶干粉质量3.5%的胰酶（购于南宁庞博生物工程有限公司），在180 r/min搅拌速率、58 ℃条件下恒温酶解12 h，在400 r/min搅拌速率、105 ℃条件下恒温搅拌25 min进行灭酶，得混悬液E3；
（5）离心分离辣木叶多肽提取物：将混悬液E3在8000 g时离心25 min，去渣，取上清液，得提取液E4；
（6）超滤去杂：采用截留分子量为10000 Da的超滤膜纯化提取液E4，收集分子量<10000 Da的小分子滤过液，超滤次数为4次，60 ℃减压浓缩，得到固形物含量为24 wt%的提取液E5；
（7）分级醇沉：在步骤（6）所得混合提取液E5中加入预冷至8℃的无水乙醇，使体系中乙醇含量达到10 wt%，在100 r/min搅拌速率下搅拌4 h后，8000 g离心20 min，弃去沉淀，得到上清液EA；上清液EA经60 ℃减压浓缩后，加入预冷至8 ℃的无水乙醇，使体系中乙醇含量达到70 wt%，在100 r/min搅拌速率下搅拌4 h后，8000 g离心20 min，得沉淀E6；
（8）沉淀复溶：在沉淀E6中加入质量为沉淀E6质量16倍的去离子水，升温至50 ℃，在400 r/min搅拌速率下恒温搅拌60 min，得提取液E7；
（9）减压浓缩：提取液E7经60℃减压浓缩，得固形物含量为30 wt%的提取液E7；
（10）喷雾干燥：将提取液E7进行喷雾干燥，得辣木叶多肽提取物E。
试验例一、提取物蛋白质含量检测
1. 验材料：实施例1~3，对比例1~2制得的提取物。
2. 试验结果：分试别检测实施例1~3制得的复合肽提取物，对比例1~2制得的提取物中的蛋白质含量进行检测。
3. 试验结果如表1所示。
表1 多肽提取物蛋白质含量检测结果
组别 蛋白质含量/%
复合多肽提取物A 75.24±1.25
复合多肽提取物B 72.49±1.37
复合多肽提取物C 70.29±1.13
海参多肽提取物D 90.12±1.98
辣木叶多肽提取物E 50.45±0.99
由表1可知，本发明实施例1~3制得的复合多肽提取物A、B和C的蛋白质含量均>70%。
试验例二、利用2型糖尿病大鼠模型研究复合多肽提取物体内降糖控脂功效分析
1. 实验动物：雄性SD大鼠，21 d龄，100~110 g，购于广东省医学实验动物中心。
2. 动物饲养环境：室温25±1 ℃，相对湿度55 ± 15 %，每日光照黑暗各12小时，饮用水采用反渗透紫外灭菌水。
3. 动物实验：适应性饲养7天结束后，随机分为8组(每组12只大鼠)：正常组、模型组、二甲双胍组、复合多肽提取物A组(200 mg/kg)、复合多肽提取物B组(200 mg/kg)、复合多肽提取物C组(200 mg/kg)、海参多肽提取物D组(200 mg/kg)、辣木叶多肽提取物E组(200mg/kg)。模型组、二甲双胍组、多肽提取物组连续12周以高脂饲料喂养，在第5周时腹腔注射低剂量链脲佐菌素(25 mg/kg, 3天)进行造模。正常组连续12周以正常饲料喂养，第5周腹腔注射等量生理盐水。造模后连续8周，多肽提取物/二甲双胍组大鼠每日口服相应剂量的多肽提取物/二甲双胍。模型组大鼠造模后连续8周口服生理盐水。在造模后第0周、4周、8周时，禁食12小时后，尾静脉采集血液，用血糖仪和血糖试纸按制造商(欧姆龙)说明测量空腹血糖浓度。在造模前、造模后4周时，禁食12小时后，眼眶取血采集血液，离心分离得到血清。在造模后第7周时，禁食12小时后，灌胃葡萄糖溶液(1.5 g/kg)，用血糖仪和血糖试纸测定口服葡萄糖后0、30、60、90、120和180 min时的血糖值，评价大鼠的葡萄糖耐受能力。
在造模后8周时，禁食12小时后，腹主动脉采血，采用ELISA试剂盒（南京建成）测定血清胰岛素水平，计算胰岛素抵抗指数。用自动生化分析仪(贝克曼库尔AU680，美国)和试剂盒（迈克生物）测定造模前、造模后4周和8周时的血清TG、TC、LDL-C、HDL-C/LDL-C水平，评价血脂水平。
4. 试验结果
试验结果如表2、表3所示。
表2 多肽提取物对2型糖尿病大鼠空腹血糖水平、葡萄糖耐量水平和胰岛素抵抗指数的影响数据表
Figure 514839DEST_PATH_IMAGE001
注：同列中不同字母a、b、c、d表示数据之间具有显著性差异(p＜0.05)，相同字母表示数据之间无显著性差异(p＜0.05)。
表3 多肽提取物对2型糖尿病大血脂水平的影响数据表
Figure 497838DEST_PATH_IMAGE002
注：同列中不同字母a、b、c、d表示数据之间具有显著性差异(p＜0.05)，相同字母表示数据之间无显著性差异(p＜0.05)。
5、复合多肽提取物体内降糖功效结果分析
二甲双胍主要通过减少肝葡萄糖输出和改善外周胰岛素抵抗而降低血糖，具有良好的单药及联合治疗疗效和安全性，是2型糖尿病患者控制高血糖的一线、全程和基本用药。
由表2可知，在造模后，模型组、二甲双胍组和5个多肽提取物组大鼠空腹血糖水平要显著高于正常组(n=12，p＜0.05)，且这七组的空腹血糖水平无显著性差异(n=12，p＞0.05)。在造模后4周时，相比于模型组，二甲双胍组和复合多肽提取物A、B、C组的空腹血糖水平明显下降，海参多肽提取物D组和辣木叶多肽提取物E组的空腹血糖水平均呈现下降趋势，但血糖水平相较于模型组无显著性差异。说明短期干预时，复合多肽提取物以及二甲双胍能有效调控2型糖尿病大鼠血糖水平，相较于单一的海参/辣木叶多肽提取物，在调控血糖方面具有更大的优势和效果。
在造模后8周时，二甲双胍组和5个多肽提取物组的空腹血糖水平均显著低于模型组(n=12，p＜0.05)，说明多肽提取物能显著降低高血糖大鼠空腹血糖水平，具有良好的降血糖活性。在造模后8周时，5个多肽提取物组的空腹血糖水平均显著低于二甲双胍组，说明多肽提取物比二甲双胍的降血糖活性更好。此外，相比于海参多肽提取物D和辣木叶多肽提取物E，复合多肽提取物A、B、C能够更显著的降低空腹血糖水平，说明长期干预时，复合多肽提取物相对于单一的海参/辣木叶多肽提取物具有更好的降血糖活性，海参多肽和辣木叶多肽具有协同增效的作用。
葡萄糖耐受性实验是目前公认的诊断糖尿病的标准之一，葡萄糖耐量是反映短时期内血糖值变化的良好指标，以葡萄糖曲线下面积（AUCOGTT）表示，AUCOGTT越大，表明个体对葡萄糖的耐受能力越小。由表2可知，相比于正常组，模型组大鼠葡萄糖耐受能力显著降低(n=12，p＜0.05)。与模型组相比，二甲双胍组和5个多肽提取物组的大鼠葡萄糖耐受能力显著提高，说明长期干预时，二甲双胍和5个多肽提取物均能改善2型糖尿病大鼠葡萄糖耐受能力，有效改善2型糖尿病。与二甲双胍组相比，复合多肽提取物A、B、C组大鼠的葡萄糖耐受能力没有显著差异。此外，相比于海参多肽提取物D和辣木叶多肽提取物E，复合多肽提取物A、B、C更显著地提高2型糖尿病大鼠葡萄糖耐受能力；复合多肽提取物相对于单一海参/辣木叶多肽提取物具有更好改善2型糖尿病大鼠葡萄糖耐受能力的作用，海参多肽和辣木叶多肽具有协同增效的作用。
胰岛素抵抗是2型糖尿病的病理生理基础，是指器官、组织或细胞对胰岛素的敏感性或反应性降低，胰岛素不能发挥正常作用，葡萄糖摄取和利用的效率降低。二甲双胍是提高胰岛素的敏感性而增加外周葡萄糖的利用，改善胰岛素抵抗的一线口服降糖药。由表2可知，造模后8周，模型组的大鼠胰岛素抵抗指数显著高于正常组(n=12，p＜0.05)，说明出现了胰岛素抵抗。相比于模型组，二甲双胍组的大鼠胰岛素抵抗指数出现降低但效果不显著，5个多肽提取物组的大鼠胰岛素抵抗指数显著降低。相比于二甲双胍组，海参多肽提取物D组和辣木叶多肽提取物E组的大鼠胰岛素抵抗指数出现降低，但无显著差异。复合多肽提取物A、B、C组的大鼠胰岛素抵抗指数显著低于二甲双胍组，说明复合多肽提取物比二甲双胍以及单一海参/辣木叶多肽提取物，具有更好的改善胰岛素抵抗的功效，海参多肽和辣木叶多肽具有协同增效的作用。
从空腹血糖水平、葡萄糖耐量水平和胰岛素抵抗指数可以看出，复合多肽提取物具有良好的降血糖活性、提高葡萄糖耐受性以及改善胰岛素抵抗的作用。相比于海参多肽提取物D和辣木叶多肽提取物E，复合多肽提取物A、B、C体现出更好的改善2型糖尿病的功效，说明两种不同结构特征的多肽经过复配后，出现了协同增效的作用。
6、复合多肽提取物体内降血脂功效结果分析
2型糖尿病患者体内糖脂代谢紊乱，常合并代谢综合征的一个或多个临床表现，如血脂异常、肥胖症等。高血脂症是一种由于机体脂肪代谢或运转异常而导致的以高甘油三酯血症、高胆固醇血症或两者兼有为表征的代谢性疾病。甘油三酯（TG）是人体内含量最多的脂类，机体内大部分组织均可以利用甘油三酯供给能量。胆固醇（TC）存在于血液脂蛋白中，其存在形式包括高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。充分和持续控制血脂水平可预防和/或延迟2型糖尿病及其相关并发症的发生。
由表3可知，在造模前，正常组、模型组、二甲双胍组和5个多肽提取物组大鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C/LDL-C水平无显著性差异(n=12，p＞0.05)。在造模后4周时，相比于模型组，二甲双胍组和5个多肽提取物组的大鼠血清TG、TC、LDL-C水平明显下降，HDL-C/LDL-C水平明显上升，说明血脂水平得到了明显的改善。此外，二甲双胍组和复合多肽提取物A、B、C组的大鼠血清TG、TC和LDL-C水平恢复至正常组水平。相比于海参多肽提取物D和辣木叶多肽提取物E，复合多肽提取物A、B、C更显著地改善了2型糖尿病大鼠的高血脂症状。说明短期干预时，复合多肽提取物以及二甲双胍能有效调控2型糖尿病大鼠血脂水平，相较于单一的海参/辣木叶多肽提取物，在调控血脂方面具有更大的优势和效果。
在造模后8周时，相比于模型组，二甲双胍组和5个多肽提取物组的的大鼠血清TG、TC、LDL-C水平明显下降，HDL-C/LDL-C水平明显上升，并且二甲双胍组和复合多肽提取物A、B、C组的大鼠血清TG、TC和LDL-C水平维持在正常组水平，而海参多肽提取物D组和辣木叶多肽提取物E组的大鼠血清TG、TC和LDL-C水平仍高于正常组水平。此外，在造模后8周时，复合多肽提取物A、B、C组的大鼠血清HDL-C/LDL-C水平显著高于二甲双胍组。说明长期干预时，复合多肽提取物能有效调控2型糖尿病大鼠血脂水平，相较于二甲双胍以及单一的海参/辣木叶多肽提取物，在调控血脂方面具有更大的优势和效果。
从血清TG、TC、LDL-C和HDL-C/LDL-C水平可以看出，复合多肽提取物具有良好的降血脂活性。相比于海参多肽提取物D和辣木叶多肽提取物E，复合多肽提取物A、B、C体现出更好的改善高血脂症的功效，说明两种不同结构特征的多肽经过复配后，出现了协同增效的作用。
从以上结果可以看出，复合多肽提取物具有良好的降糖控脂活性。相比于海参多肽提取物D和辣木叶多肽提取物E，复合多肽提取物A、B、C组体现出更好的降糖控脂的功效，说明两种不同结构特征的多肽经过复配后，出现了协同增效的作用。
综上所述，采用本发明的制备方法制得的叶瓜参多肽和辣木叶多肽，出现了协同增效的作用，有效实现了复合多肽降糖控脂活性的提升，制备的具有良好降糖控脂活性的复合多肽提取物，通过部分植物蛋白肽（辣木叶肽）的替代，降低了生产成本及产品腥味，是实现海参肽（叶瓜参肽）商品化的重要突破口，有利于提高叶瓜参和辣木叶资源利用率，有利于工业化生产，实现叶瓜参和辣木叶的高值化利用。通过本发明实施例可见，整个制备工艺流程简单、各环节均可达食品级要求，制备成本低。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物，其特征在于，所述复合多肽提取物由叶瓜参多肽提取物和辣木叶多肽提取物复配而成，所述叶瓜参多肽提取物以干叶瓜参为原料，辣木叶多肽提取物以干辣木叶为原料；
所述干辣木叶与干叶瓜参的质量比为0.6~1:1；
所述具有降糖控脂活性的复合多肽提取物的制备步骤如下：
所述叶瓜参多肽提取物的制备方法具体包括以下步骤：
（1）温水泡发：将干叶瓜参用温水浸泡，用去离子水清洗后得到泡发后湿海参；
（2）绞碎：将步骤（1）所得湿海参绞碎，得到海参肉糜；
（3）加水酶解：将步骤（2）所得海参肉糜与去离子水混合，搅拌均匀，升温，加入复合蛋白酶，购于诺维信公司，恒温搅拌进行酶解，得混悬液1；
（4）高温酸提：在混悬液1中加入去离子水，搅拌均匀后加入柠檬酸，调节pH，升温后，高温浸提，得混悬液2；
（5）离心分离：将混悬液2离心去渣，取上清液，得提取液3；
所述辣木叶多肽提取物的制备方法具体包括以下步骤：
（6）粉碎：将干辣木叶粉碎后过40目筛；
（7）乙醇去除辣木叶色素：将步骤（6）所得辣木叶粉与乙醇溶液混合，恒温搅拌，过滤弃去上清液，沉淀烘干得辣木叶干粉；
（8）加水匀浆：将步骤（7）所得辣木叶干粉与去离子水混合，均质匀浆得混悬液4，调节pH，升温，恒温搅拌得混悬液5；
（9）酶解：在混悬液5中加入胰酶，恒温搅拌进行酶解，灭酶，得混悬液6；
（10）离心分离：将混悬液6离心去渣，取上清液，得提取液7；
所述复合多肽提取物的制备方法具体包括以下步骤：
（11）复配：将步骤（5）所得提取液3和步骤（10）所得提取液7混合，搅拌均匀，得混合提取液8；
（12）超滤去杂：采用超滤膜去除混合提取液8中的多糖，收集小分子滤过液，减压浓缩，得混合提取液9；
（13）分级醇沉：在步骤（12）所得混合提取液9中加入无水乙醇，匀速搅拌后，离心去除沉淀，得到上清液A；将上清液A减压浓缩后，加入无水乙醇，匀速搅拌，二次离心，得沉淀10；
（14）沉淀复溶：将沉淀10与去离子水混合，升温搅拌，得混合提取液11；
（15）减压浓缩：将混合提取液11减压浓缩，得混合提取液12；
（16）喷雾干燥：将混合提取液12进行喷雾干燥，得复合多肽提取物。
2.根据权利要求1所述的一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物，其特征在于，步骤（1）中，所述温水浸泡条件为：去离子水加入量为干叶瓜参质量的20~30倍，水温为50~60℃，浸泡时间为10~14 h；所述清洗海参的去离子水的加入量为干叶瓜参质量的20~30倍，水温为40~50 ℃，浸泡时间为20~30 min，清洗次数为2~4次。
3.根据权利要求1所述的一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物，其特征在于，步骤（3）中，所述海参肉糜与去离子水料液比为1:1~1:3 g/mL，混合时搅拌速率为200~400 r/min，搅拌时间为40~60 min，升温的最终温度为52~58 ℃，复合蛋白酶的加入量为海参肉糜质量的0.5~2.5 %，酶解温度为52~58 ℃，搅拌速率为120~180 r/min，酶解时间为3~6 h。
4.根据权利要求1所述的一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物，其特征在于，步骤（4）中，所述去离子水的加入量为海参肉糜质量的2~4倍，所述搅拌条件为：搅拌速率为200~400 r/min，搅拌时间为15~25 min；加入柠檬酸使混合液pH为4.5~5.5，升温至95~105℃，搅拌速率为200~400 r/min条件下提取60~90 min；步骤（5）中，所述离心条件为：离心力为6000~8000 g，离心15~25 min。
5.根据权利要求1所述的一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物，其特征在于，步骤（7）中，所述辣木叶粉与乙醇料液比为1:6~1:10 g/mL，乙醇浓度为85~95 % (v/v)，搅拌速率为200~400 r/min，搅拌温度为35~45℃，搅拌时间为1~3 h，使用100目绢布过滤，烘干温度为50~60℃。
6.根据权利要求1所述的一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物，其特征在于，步骤（8）中，所述辣木叶干粉与去离子水料液比为1:8~1:14 g/mL，匀浆时剪切速率为2000~4000rpm，剪切时间5~15 min；所述pH为7.5~8.5，升温至52~58 ℃，搅拌速率为200~400 r/min，搅拌时间为2~4 h。
7.根据权利要求1所述的一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物，其特征在于，所述步骤（9）中胰酶的加入量为辣木叶干粉质量的1.5~3.5 %，酶解温度为52~58 ℃，搅拌速率为120~180 r/min，酶解时间为8~12 h，灭酶温度为95~105 ℃，灭酶时间为15~25 min，搅拌速率为200~400 r/min；
步骤（10）中，所述离心条件为：离心力为6000~8000 g，离心15~25 min；所述步骤（11）中，所述的搅拌过程中的搅拌速率为200~400 r/min，搅拌时间为15~25 min；
步骤（12）中，所述超滤去杂的超滤膜截留分子量为10000 Da，超滤次数为2~4次，小分子滤过液为分子量<10000 Da的滤过液，减压浓缩温度为50~60℃，混合提取液9固形物含量为18~24 wt%。
8.根据权利要求1所述的一种具有降糖控脂活性的复合多肽提取物，其特征在于，步骤（13）中，所述无水乙醇为预冷至4~8℃的无水乙醇，所述分级醇沉的步骤为：
第一步，加入无水乙醇，使体系中乙醇含量达到6~10 wt%，在60~100r/min搅拌速率下搅拌2~4 h，6000~8000 g离心力下离心10~20 min，弃去沉淀，上清液A经50~60℃减压浓缩使固形物含量为18~24 wt%；
第二步，在上清液A中加入无水乙醇，使体系中乙醇含量达到60~70 wt%，在60~100 r/min搅拌速率下搅拌2~4 h，6000~8000 g离心力下离心10~20 min，收集沉淀10；
所述步骤（14）中，去离子水的加入量为沉淀10质量的12~16倍，升温至40~50℃，在200~400 r/min搅拌速率下搅拌30~60 min；
所述步骤（15）中，减压浓缩温度为50~60℃，混合提取液12固形物含量为20~30wt%。
9.权利要求1~8任一项所述的复合多肽提取物在制备营养健康食品及降糖控脂药品、保健食品中的应用，所述营养健康食品包括代餐粉和固体饮料。
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