CN104232647A - 具有抑制神经胶质瘤作用的miRNA及其构建的载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种应用遗传工程的方法在细胞内获得高效表达miRNAs的构建方案，以及用该方案获取的重组腺病毒和真核表达质粒在肿瘤治疗药物制备中的用途。用定向克隆、同源重组、转染、慢病毒包装等技术，获得重组慢病毒和真核表达质粒，即在同源重组位点插入miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p前体片段，所获得重组慢病毒和真核表达载体能在胶质瘤等肿瘤细胞内复制增殖；插入的片段在肿瘤细胞内高效表达成熟的miRNAs，升高肿瘤细胞内以上3个分子的表达水平。该慢病毒和真核表达质粒在肿瘤治疗药物中具有独特的实用价值。

Description

具有抑制神经胶质瘤作用的miRNA及其构建的载体和应用

技术领域

本发明属于与肿瘤相关的miRNA技术领域，涉及具有抑制神经胶质瘤作用的miRNA及其构建的载体和应用。

背景技术

miRNAs是一类广泛存在于病毒、植物及动物细胞中长度约为22nt的序列高度保守的非编码单链RNA，其表达具有组织及时相特异性，在调控生物生长发育、细胞分化、增殖、凋亡、压力应激及免疫等多种生命活动中发挥重要功能。miRNAs与靶基因mRNA3’UTR或5’UTR互补对其进行转录后调控，主要通过诱导mRNA降解或者抑制基因翻译机制实现。

近年来，miRNAs在各类疾病中的研究成为热点，尤其是miRNAs在肿瘤形成中的作用越来越引起关注。目前报道显示多种肿瘤中都存在着miRNAs的异常表达，如胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、白血病、膀胱癌、胶质瘤等，其在肿瘤形成中扮演着类似抑癌基因及癌基因的双重角色，具有重要的肿瘤生物学意义。肿瘤中表达水平升高的miRNAs能负性调控肿瘤抑制基因及与细胞分化有关基因从而促进肿瘤形成，这类miRNAs作用类似癌基因；同样，表达水平降低的miRNAs能负性调控具有促肿瘤形成活性的各种蛋白，进而抑制肿瘤形成发展，这类miRNAs作用类似抑癌基因。

多项研究发现：50％以上的miRNAs位于染色体不稳定区，这些区域异常表达的miRNAs调控癌基因及抑癌基因的表达，参与肿瘤的发生及形成；使用生物信息学方法分析人类基因组中大约有一千余个miRNAs，其对人类基因组中近30％的基因进行调控；并且目前进行功能鉴定的肿瘤相关miRNAs只有数十个，已知的调控胶质瘤形成的miRNAs数目更少。可见，miRNAs是人类基因组中一大类重要的调控基因，miRNAs之间及miRNAs与其靶基因之间存在着复杂的调控网络，我们对其了解仍然很少。因此，对该领域深入探索或许可获得肿瘤形成机制研究及治疗的突破。

2005年，在胶质母细胞瘤与垂体腺瘤中首次报道了miRNAs的异常表达，其后胶质瘤中miRNAs的功能引起广泛关注。随着这类小分子在胶质瘤中功能的揭示，人们对胶质瘤形成机制有了进一步了解并寄希望于将其开发作为治疗胶质瘤新的靶点。miR21是目前在胶质瘤中研究最为深入的小分子，其参与调控肿瘤细胞凋亡、侵袭、增殖及耐药，这些作用都是通过调控其下游靶分子TGFBR2/3、RECK、PDCD、LRRF1P1而实现，这表明miRNAs作用类似于上游的一个多功能调节开关控制着下游一系列的基因通路，微调其状态将对细胞造成复杂的影响。与此印证，在胶质瘤中随后发现细胞周期、血管形成、肿瘤扩散、干细胞更新这些重要的肿瘤形成过程也受到miRNAs的调控。不仅如此，部分miRNAs分子在胶质瘤组织中具有特异性表达，而且与肿瘤的恶性程度相关，提示这些小分子可以作为胶质瘤诊断及预后的分子标志。可见，miRNAs在胶质瘤形成中发挥着重大作用。

发明内容

本发明解决的问题在于提供具有抑制神经胶质瘤作用的miRNA及其构建的载体和应用，该miRNA是神经胶质瘤的抑癌基因，可应用于神经胶质瘤的诊断和治疗。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种神经胶质瘤的抑癌基因，为以下三种miRNA：miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p中的一种或几种，其核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.1～SEQ.ID.NO.3所示。

所述表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体，至少包含表达miRNAmiR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p中的一种miRNA成熟体的前体序列。

所述的表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体，所述的前体序列的核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.4～SEQ.ID.NO.6所示。

所述的miRNA miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p的前体序列的核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.7～SEQ.ID.NO.9所示。

所述的表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体，是将前体序列分别克隆于真核穿梭质粒载体pENTR3C中，获得pENTR3C-miR载体；

再将pENTR3C-miR载体与pLenti6.3/V5-DEST经LR同源重组，将前体序列克隆到pLenti6.3/V5-DEST中，获得pLenti6.3/V5-DEST-miR载体。

基于所述pLenti6.3/V5-DEST-miR载体的重组慢病毒，是将pLenti6.3/V5-DEST-miR载体与衣壳载体和包装载体共转染HEK293T细胞，收集培养上清，过滤后得到的重组慢病毒。

所述的神经胶质瘤的抑癌基因在制备肿瘤诊断试剂中的应用。

所述的神经胶质瘤的抑癌基因在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体在制备抗神经胶质瘤药物中的应用。

所述的重组慢病毒在制备抗神经胶质瘤药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供神经胶质瘤的抑癌基因为miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p，其中miR-483-5p、miR-219-5p的表达可以使肿瘤细胞增殖减慢，而且能够抑制体内肿瘤体积、重量的生长，可应用于制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是制备抗神经胶质瘤药物、诊断试剂中的应用。

本发明提供神经胶质瘤的抑癌基因的真核表达载体，并基于该载体构建了慢病毒，通过在真核表达载体pLenti6.3/V5-DEST同源重组位点分别插入miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p这3个分子的前体序列片段，所获得的重组慢病毒和真核表达载体能在胶质瘤等肿瘤细胞内复制增殖；插入的片段在肿瘤细胞内高效表达成熟的miRNAs，升高肿瘤细胞内以上3个分子的表达水平。该慢病毒和真核表达质粒在肿瘤治疗药物中具有独特的实用价值。

本发明与化学合成的miRNAs模拟剂相比，以慢病毒和真核表达载体表达成熟miRNAs具有高效的基因表达及模拟体内生物合成过程，能够产生明显的基因治疗效果。

附图说明

图1-1～1-3为Real-time PCR显示miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p在不同病理级别胶质瘤(Ⅱ级:T1-T3；Ⅲ级:T4-T6；Ⅳ级:T7-T9)及胶质瘤细胞系(U87、U251、SHG44)中表达水平显著低于正常脑组织(N1、N2、N3)。

图2为miR真核表达载体及慢病毒穿梭载体构建图谱。

图3为XbaⅠ酶切鉴定分析目的基因片段DNA序列成功连接入慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST。

图4为表达miR-483-5p慢病毒及阴性对照慢病毒分别感染或不感染(blank)胶质瘤细胞U251、U87，用blasticidin筛选12天后在倒置荧光显微镜荧光视野及暗视野下拍摄的细胞图片，细胞放大倍数为200倍。

图5-1～5-3为Real-time PCR显示重组慢病毒感染胶质瘤细胞U87可以明显升高细胞中miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p的表达。

图6-1～6-3为Real-time PCR显示重组慢病毒感染胶质瘤细胞U251可以明显升高细胞中miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p的表达。

图7-1～7-2为表达miR-483-5p、miR-219-5p可以使肿瘤细胞U87、U251增殖减慢。

图8为表达miR-483-5p可以使肿瘤细胞U87在48h内增殖增快。

图9为表达miR-483-5p可以明显抑制裸鼠移植瘤体积的生长。

图10为表达miR-483-5p可以明显抑制裸鼠移植瘤重量的生长。

图11为表达miR-483-5p的U87细胞及对照细胞在裸鼠体内形成肿瘤进行HE染色和PCNA免疫组化染色。

具体实施方式

本发明提供的miRNA是通过在胶质母细胞瘤和瘤旁正常脑组织中miRNA表达差异谱中筛选出的，包括差异表达最为显著的miR-483-5p、miR-219-5p和miR-338-3p；并对筛选的miRNA通过构建表达载体进行转染，验证了其抑癌作用。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、差异表达miRNA的筛选

首先采用miRNA基因表达谱芯片检测了3例胶质母细胞瘤和瘤旁正常脑组织中miRNAs表达谱的差异。具体方法如下：

分别提取组织样品中的RNA(符合OD260/280要求)，然后每个样本取1μg总RNA作为模板制备Hy3或Hy5标记的miRNA靶物，再与芯片杂交(具体采用丹麦Exiqon公司生产的miRNAs基因表达谱芯片，编号：208101－A)，使用Agilent G2505B型扫描仪对杂交图谱进行扫描，将获得的荧光信号数据再使用SAM 3.0软件进行差异显著性分析，将fold change>2、P<0.05表达差异miRNA作为显著改变的miRNA。

结果上述筛选中共发现91个较之周围正常脑组织差异表达miRNAs，且多为表达上调(58个)，表达下调的miRNAs为33个，表达较为显著的一部分miRNAs如表1所示。

表1.胶质母细胞瘤与正常脑组织差异表达miRNAs

其中，miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p差异表达最为显著，然而其功能现有技术中尚不清楚，尤其是在胶质瘤中。

miR-483-5p的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，miR-219-5p的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，miR-338-3p的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

2、miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p在不同病理级别胶质瘤及细胞系中的表达情况

1)采集12例胶质瘤切除术后人脑胶质瘤组织样本和6例脑外伤后脑血肿清除术后正常脑组织样本，采集时间为2008年3月至2010年12月。组织标本自术中取出后分成小块速冻于液氮30s，然后储存于-70℃冰箱备用。人脑胶质瘤标本均为首次接受手术治疗的原发性胶质瘤病例，术前未接受化疗和/或放疗。

2)胶质瘤细胞培养：U251(胶质母细胞瘤，Ⅳ级)、U87(胶质母细胞瘤，Ⅳ级)和SHG-44(恶性星形细胞瘤，Ⅲ-Ⅳ级)均采用含10％胎牛血清高糖DMEM培养基，在37℃、饱和湿度及5％CO2条件下培养。

3)将冻存的胶质瘤、正常脑组织及培养的各胶质瘤细胞抽提RNA，用分光光度仪测量260nm和280nm的吸光值，计算RNA的浓度及OD260/280比值，保证其比值在1.8-2.0之间。

4)miRNAs逆转录

RT体系的配制：

1μg总RNA,2μl5×RT buffer,0.5μl Stem-loop RT引物(4μM)，dNTP混合物及RNase Inhibitor各0.25μl，1μl RevertAidTM M-MuLV RT(200U/μl)，DEPC水补足10μl。

运行RT程序：16℃，30min；42℃，60min；70℃，10min；4℃，hold。

5)Real-time PCR检测miRNAs的表达水平

10μl 2×SYBR Green预混试剂,1μl RT模板,上/下游引物各2/1μl,无菌去离子水补齐20μl。miRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，以snRNA U6作为内参。

反应程序：1.95℃，10s；2.95℃，10s；3.60℃，35s；第2、3步重复循环40次。

Real-time PCR检测的miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p在胶质瘤、正常脑组织及培养的各胶质瘤细胞中的表达水平分别如图1-1、1-2、1-3所示。其中N1～N3为正常脑组织，T1～T9为脑胶质瘤组织样本，U87、U251、SHG44为培养的各胶质瘤细胞，可以明显看出三种miRNA在不同病理级别胶质瘤及细胞系中表达水平显著低于正常脑组织；与正常脑组织相比，在所有胶质瘤组织中三种miRNA表达均减少，而且其表达量与胶质瘤病理级别之间相关联；这表明三种miRNA是与脑胶质瘤紧密相关，可以作为脑胶质瘤的分子诊断标志物。

3、肿瘤细胞miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p的表达质粒载体的构建

为了进一步表明miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p在胶质瘤发生发展中的作用，首先构建了以上3个分子各自的真核表达质粒载体及慢病毒表达质粒载体。具体如下(参见图2)：

1)PCR扩增表达成熟miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p分子的片段：

表达成熟miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p分子的前体序列分别如SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6所示。

而考虑到同源重组的需要，还需要扩增合成包括上游和下游两端侧翼序列在内的含有以上miRNAs前体序列的片段；

以人基因组DNA为模板，分别扩增如SEQ.ID.NO.7、SEQ.ID.NO.8、SEQ.ID.NO.9所示的前体序列片段。

扩增引物序列分别如下：

miR-483-5p的上下游扩增引物为：

5’-CGGGGATCCGTGAAATGGGCTCACAGGAT-3’，

5’-CCGGAATTCTGTCCCTGAGCTTGGACTCT-3’；

miR-219-5p的上下游扩增引物为：

5’-CGGGGATCCCGTGCTTGCTAGTCCACCTT-3’，

5’-CCGGAATTCTGTTTGGGATTTAGGGGTTG-3’；

miR-338-3p的上下游扩增引物为：

5’-CGGGGATCCGACACCCACTTTGCAGGTTT-3’，

5’-CCGGAATTCGGCACAGGGTACTGGGTAGA-3’。

2)以上扩增的SEQ.ID.NO.7、SEQ.ID.NO.8、SEQ.ID.NO.9所示的前体序列片段经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后连接入真核穿梭质粒载体pENTR3C(美国Invitrogen公司)，获得新的质粒载体pENTR 3C-miRNAs；用限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ对该质粒进行双酶切鉴定，并将酶切鉴定正确的克隆进行测序鉴定。

3)经LR同源重组将含有以上前体序列片段重组入真核表达载体pLenti6.3/V5-DEST：以0.8μl pENTR 3C-miRNAs(10ng/μl)与4μlpLenti6.3/V5-DEST(50ng/μl)在3.2μl PH 8.0TE buffer及2μl 5×LR clonaseⅡenzyme Mix混合液中于室温静置过夜。

4)取重组产物2μl转化感受态细胞DH5α，涂布于含Amp抗性的LB平板，37℃培养过夜；

5)抽提质粒经XbaI酶切鉴定，并挑选酶切正确的质粒送测序验证插入序列的正确性，得到三种pLenti6.3/V5-DEST-miR载体：pLenti6.3/V5-DEST-miR-219-5p、pLenti6.3/V5-DEST-miR-338-3p，pLenti6.3/V5-DEST-miR-483-5p；XbaⅠ酶切鉴定分析如图3所示，可以看到各DNA片段均连接成功。

4、重组慢病毒的构建

分别将含以上3个分子序列的载体pLenti6.3/V5-DEST-miR，与衣壳载体psPAX2和包装载体pMD2.G，同时经Lipofectamin2000转染HEK293T细胞，分别于48h、72h收集培养上清，使用滤器滤过，-70℃存储。获得过表达miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p的抗癌重组慢病毒。

5、重组慢病毒转染胶质瘤细胞并筛选稳定表达miRNAs的细胞

1)加入含有8μg/ml聚凝胺(polybrene)的1:1体积病毒上清与DMEM完全培养液混合液感染胶质瘤细胞(U87/U251)，以最小杀细胞浓度稻瘟霉素(blasticidin)(U87：8μg/ml/U251：2μg/ml)筛选稳转细胞，每三天更换一次培养液，持续四周，存活的细胞即为稳定稳定表达miRNAs的细胞，筛选12天后在倒置荧光显微镜荧光视野及暗视野下拍摄的细胞图片如图4所示。

2)Real-time PCR验证miRNAs的表达(此处是指成熟的miRNAs)

miRNAs表达加工过程分为三个步骤。首先由RNA polymerase II催化生成长约1kb具有5’7-甲基鸟嘌呤帽和3’poly A尾及局部发夹结构的原始miRNA(pri-miRNAs)；经由核酸酶Drosha和DGCR8剪切，pri-miRNA产生约70bp长的pre-miRNA，接下来被Ran-GTP依赖性核浆转运子Exportin5转运出细胞核；在细胞质内，经Dicer酶剪切成一个双链RNA，包含两条miRNA分子，大多数情况下其中一条miRNA*迅速降解，另一条即为具有功能的成熟miRNA。因此，以上miRNAs成熟体的表达检测首先需要特异性反转录引物反转录并延伸成熟miRNAs，再使用特异性的Real-time PCR正向引物及通用反向引物检测其表达量。

各miRNAs的反转录引物及Real-time PCR反应引物序列如下：

miR-483-5p检测的上下游引物为：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCCCT-3’，

5’-TGGCGAAGACGGGAGGAAAG-3’；

miR-219-5p检测的上下游引物为：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGAATT-3’，

5’-GCCGCTGATTGTCCAAACGCA-3’；

miR-338-3p检测的上下游引物为：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAACAA-3’，

5’-GCCCGTCCAGCATCAGTGATT-3’；

Real-time PCR通用反向引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’

如图5-1～5-3所示，与对照相比较，重组了miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p的慢病毒在转染了U87之后，能够显著的提高肿瘤细胞中miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p的表达。

如图6-1～6-3所示，与对照相比较，重组了miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p的慢病毒在转染了U215之后，能够显著的提高肿瘤细胞中miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p的表达。

这表明重组慢病毒随着病毒的扩增也将miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p进行了扩增。

6、重组慢病毒介导miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p抑制胶质母细胞瘤细胞生长的体外研究

四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖：取上述筛选获得的稳定表达miRNAs的胶质瘤细胞分别在24h、48h、72h、96h、120h、144h时间点检测各孔OD值，绘制细胞生长曲线。

U87、U215胶质母细胞瘤细胞96h内的细胞扩增曲线分别如图7-1、7-2所示，可以看到miR-483-5p、miR-219-5p均能够抑制两种细胞的增殖，而且在72h后具有显著差距(p<0.05)，而miR-338-3p未能够表现出抑制细胞增殖的作用。而miR-483-5p的特异性抑制剂anti-miR-483-5p转染U251细胞24h后存活细胞的数目明显多于对照组细胞，显著促进了细胞的生长(P<0.05)(图8)。

7、重组慢病毒介导miR-483-5p抑制胶质母细胞瘤细胞生长的体内研究

1)人脑胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型的建立：上述稳定表达对照空质粒及miR-483-5p的U87细胞，常规消化后，使用不含FBS的DMEM培养基洗涤细胞两次，计数后将细胞制成浓度为1.5×10⁶个细胞/100μl的悬浮液。

将两种肿瘤细胞分别接种于裸鼠左、右侧肋部皮下，接种细胞数目为1.5×10⁶个，每组10只裸鼠。

2)接种后，每日观察裸鼠一般状况及肿瘤生长状况，定期观测裸鼠皮下生长肿瘤的长径及短径，每4日一次。

接种细胞后第24天用颈椎脱臼法处死所有动物，迅速从皮下剥离瘤块称量瘤重。

按以下公式计算肿瘤体积，根据肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线：肿瘤体积＝长径×短径²×0.5。根据测得瘤重，按以下公式计算肿瘤抑制率：肿瘤抑制率＝(1-U87-miRNAs组平均瘤重/U87对照组平均瘤重)×100％。

裸鼠移植瘤体积的生长、裸鼠移植瘤重量的生长的曲线如图9、图10所示，可以看到miR-483-5p可以明显抑制裸鼠移植瘤的生长，可应用于肿瘤的治疗。

并取肿瘤组织固定于5％多聚甲醛溶液中，石蜡包埋，组织切片，HE染色及PCNA抗原免疫组化染色，进行组织病理检查。如图11所示，表达miR-483-5p的U87细胞较对照组细胞在裸鼠体内形成肿瘤PCNA免疫组化染色阳性率低。

上述检测结果表明，miR-483-5p、miR-219-5p使肿瘤细胞U87、U251增殖减慢，而且能够抑制体内肿瘤体积、重量的生长，可应用于制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是制备抗神经胶质瘤药物、诊断试剂中的应用。

Claims (10)

1.一种神经胶质瘤的抑癌基因，其特征在于，为以下三种miRNA：miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p中的一种或几种，其核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.1～SEQ.ID.NO.3所示。

2.表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体，其特征在于，至少包含表达miRNAmiR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p中的一种miRNA成熟体的前体序列。

3.如权利要求2所述的表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体，其特征在于，所述的miRNA miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p的前体序列的核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.4～SEQ.ID.NO.6所示。

4.如权利要求2所述的表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体，其特征在于，所述的miRNA miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p的前体序列的核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.7～SEQ.ID.NO.9所示。

5.如权利要求4所述的表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体，其特征在于，是将前体序列分别克隆于真核穿梭质粒载体pENTR3C中，获得pENTR3C-miR载体；

再将pENTR3C-miR载体与pLenti6.3/V5-DEST经LR同源重组，将前体序列克隆到pLenti6.3/V5-DEST中，获得pLenti6.3/V5-DEST-miR载体。

6.基于权利要求5所述pLenti6.3/V5-DEST-miR载体的重组慢病毒，其特征在于，是将pLenti6.3/V5-DEST-miR载体与衣壳载体和包装载体共转染HEK293T细胞，收集培养上清，过滤后得到的重组慢病毒。

7.权利要求1所述的神经胶质瘤的抑癌基因在制备肿瘤诊断试剂中的应用。

8.权利要求1所述的神经胶质瘤的抑癌基因在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.权利要求6所述的表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体在制备抗神经胶质瘤药物中的应用。

10.权利要求6所述的重组慢病毒在制备抗神经胶质瘤药物中的应用。